JP2013517776A - タンパク質の生成を改善するための方法および組成物 - Google Patents

タンパク質の生成を改善するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、培養中の真核細胞に有益な組成物、及びその使用、及び細胞の成長、生存率及び組換えタンパク質の発現を促進させる際にそれらを使用するための方法に関する。本発明に開示される方法は、例えば、細胞生存率を向上させるために、及び培養中で育てられる細胞の細胞増殖の速度を加速させるのに有用である。１つの態様において、本発明の補足物は、細胞培養から組換えタンパク質の収量を向上させるか又は高めるために有用である。
【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１０年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／２９８，１００号の利益を主張するものであり、その全体は引用によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、培養中の真核細胞に有益な組成物とその使用、および、細胞の成長、生存率、ならびに、組み換えタンパク質の発現を促進する際に使用される方法に関する。
生物学的プロセスの調査は、生物体全体に満たない細胞、組織および器官でのそれらのプロセスの調査を必要とする。長年にわたって、これらの細胞、組織および器官は、生物体から分離され、エキソビボまたはインビトロの様式での生存を維持する条件下で独立的に研究されてきた。典型的には、細胞、組織または器官は、生物体から取り除かれ、研究されている生存および／または生物学的プロセスを維持する培地で維持される。細胞、組織、器官の様々な多様性を考慮すると、インタクトな生物体以外で、それらの生存、成長、および、生物学的な特性を維持する培地の処方は重要ではない。多くの細胞および組織は、完全には理解されていない理由のため、培養で維持するのが難しい。加えて、細胞と組織は、生物医学研究および生物製剤ベースの薬物の鍵である、組み換えタンパク質、ワクチン、ウイルスストック（ｖｉｒｕｓ ｓｔｏｃｋｓ）および他の生成物のインビトロでの製造に関係するプロセスでしばしば使用される。したがって、インビトロとエキソビボでの条件下での、細胞、組織および器官の培養の成長と生存を維持する条件および培地成分を特定する必要がある。
そのような細胞成分には、例えば、アルブミン、トランスフェリン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｔｒａｎｓｆｅｒｅｅｓ）、スーパーオキシドジスムターゼ、ラクトフェリン、および、成長因子が挙げられる。
アルブミンは血漿中で見られる最も豊富なタンパク質である。それは哺乳動物の肝臓で生成され、様々な能力で機能する。アルブミンは、血清タンパク質の約２分の１を含む、可溶性の単量体タンパク質である。アルブミンは、主に、ステロイド、脂肪酸、および、甲状腺ホルモンのための担体タンパク質として機能し、細胞外液量を安定させる役割を果たす。アルブミンは分子量６７，０００の球状の非グリコシル化血清タンパク質であり、５または６の内部ジスルフィド結合を含有する。アルブミンは、新生タンパク質が粗面小胞体から放される前に取り除かれるＮ末端ペプチドを有するプレプロアルブミン（ｐｒｅｐｒｏａｌｂｕｍｉｎ）として合成される。生成物、つまり、プロアルブミンは、分泌されたアルブミンを生成するために、ゴルジ小胞で順に開裂される。
アルブミンは、血管内コンパートメントと体内組織の間の体液の適切な分布に必要とされる浸透圧を維持するのに必要不可欠である。アルブミンは、同様に、複数の疎水性のステロイドホルモンを非特異的に結合することによって血漿担体として、および、ヘミンと脂肪酸のための輸送タンパク質として作用する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、１−２０％総量で基本培地に一般的に加えられるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の成分であるため、細胞培地中の補足物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として長く使用されてきた。ＢＳＡは多くの定義された無血清の主成分である培地処方中の主要な成分である。というのも、ＢＳＡは容易に入手可能で、比較的廉価で、比較的容易に均一に精製することができるからである。アルブミンの代表源は、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、および、他の哺乳類種に由来する血漿を含む。
ヒトへの臨床的な用途を対象とした組み換えタンパク質、ワクチンおよび他の生成物の大量生産の到来により、これらの生成物の製造中に使用される製剤に関するさらに厳密な必要条件が課された。生成物の安全性に影響を与える病原体を保護する動物性の物質の脅威のために、多くの既存の組み換え生成プロセスが修正されたことで、全プロセスで使用される物質または培養成分すべてが動物性の生成物を欠いている。すなわち、細胞培養成分は、全ての動物源から分離されたか精製されたはずがない。したがって、動物界全体から直接的なこれらの補足物の精製に対する代替策として、培地の補足物の組み換え生成が好ましい。これに応じて、ヒトと他の種からの細胞培養成分は、組み換え手段を用いて、定義された組織培地を用いて、および、高く特徴づけられた培養細胞を用いて、製造することができ、それらはウイルスと毒素がないことが証明されている。
組み換えタンパク質ベースの細胞培養成分を調製する１つの方法は、タンパク質を過剰発現させ、その後、タンパク質を精製するために酵母または植物を操作することである。ヒトにも感染しかねない植物ウイルスの例が存在しないため、植物由来の組み換えタンパク質は、治療用途を意図したヒトタンパク質の組み換えタンパク質生成のための、細胞培養成分の源として特に魅力的である。
幹細胞を成長および分化させるだけでなく、ヒトの治療用タンパク質の組み換え生成を維持する組み換え細胞培養成分の需要が高く、このような生成物が次々と成功を収めて市場における将来性が非常に大きいことから、組み換え細胞培養成分を生成するもっと効果的な方法が望ましい。特に、タンパク質の組み換え生成と幹細胞の成長および分化のための既存のプロセスは、緩慢で、高価で、骨が折れる。一つには、これらのプロセスは、細胞の成長速度と、組み換え宿主細胞または幹細胞の生存率の割合とにそれぞれ関連する、基本的な態様によって限定されている。これらの制限の重要な態様は、ｉ）細胞の複雑な混合物から単細胞クローンを急速に分離し発展させる能力、ｉｉ）急速に、とりわけ、低密度で、かつ、無血清培地で細胞の成長を促進する能力、ｉｉｉ）バイオリアクター中で高密度で細胞の成長と生存率を持続させる能力、ｉｖ）高い生存率を維持しながら、細胞および細胞バンクを凍結保存および解凍する能力、ｖ）幹細胞培養物を、効果的に成長および分化させる能力を含む。従って、これらのニーズに対処するとともに、培養中の細胞の成長と生存率の改善を可能にする、改良された培地と培養条件が必要とされている。本発明の補足および方法は、生存率と細胞増殖の速度とを改善することによって、これらのニーズを満たし、哺乳動物の細胞培養生成プロセスから得られる組み換え生成物の収量と質の改善をもたらすこともできる。
本発明は、植物由来の組み換え細胞培養成分タンパク質が、標準的な精製タンパク質よりも大きな程度まで培地で成長させた哺乳動物細胞に加えられる際に、細胞の成長と生存率を驚くべきほど改善したという実証に部分的には基づいている。そのような植物由来の細胞培養成分は、組織と細胞の培養に役立つ補足物を作るために使用されてもよい。
本出願で開示される方法と補足は、例えば、細胞の生存率を改善するために、および、培養で成長させた細胞の細胞増殖速度を早める際に、有用である。１つの態様では、本発明の補足は、細胞培養物からの組み換えタンパク質の収量を改善するか高めるのに役立つ。本発明によって提供されるさらなる改善は、以下に詳細に記載される。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞の細胞増殖を高める方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、無血清培地への補足物の追加を含む、無血清培地に適応させた細胞の生産性を高めるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、バイオリアクター中の乳酸塩の蓄積を減少させるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、バイオリアクター中のグルコースおよび他の糖の消費を減少させる方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、培養の開始からバイオリアクター中での採取までの、タンパク質を生成するのに必要な時間を減少させる方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクターへの補足物の追加を含む、バイオリアクター中の細胞の生存率を改善する方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、無血清培地への補足物の追加を含む、無血清条件下で成長させた細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、低密度で平板培養（ｐｌａｔｅｄ）した際の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、単細胞クローンから成長させた細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培地への補足物の追加を含む、培養物中で成長させたプライマリー細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、トランスフェクションの前、間、または、直後の、細胞培地への補足物の追加を含む、トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、凍結保存または解凍の前、間、または、直後の、細胞培地への補足物の追加を含む、凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の収量を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の精製を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のタンパク質分解を減少させるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の生物活性を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の安定性を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のヒトパターンに近い（ａ ｍｏｒｅ ｈｕｍａｎ ｐａｔｔｅｒｎ）グリコシル化を形成するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、組み換えアルブミンを含む補足物の培養への追加を含む、免疫原性の少ない培養中の細胞から生成された組み換え生成物を作るための方法を含む。
組み換え生成方法の１つの態様では、培養中の細胞の生存率が増加する。
これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は組み換えアルブミンを含み、前記組み換えアルブミンは植物で生成され、前記補足物は、約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満（ａｂｏｕｔ １ ＥＵ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ, ／ ｍｇ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ）を有し、前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含む。
これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はプライマリー細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞は幹細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞は組織培養細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞は血球である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はプライマリー単核細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はＣＨＯ細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はハイブリドーマ細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はベロ細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はフローサイトメトリーによって選別される。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞は勾配遠心分離によって分離されたプライマリー細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はＢ細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はＴ細胞である。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はフローサイトメトリーによって単離される。これらの方法のいずれか１つの態様では、細胞はマイクロ流体素子によって単離される。
これらの方法のうちのいずれかの１つの態様では、補足物は、熱ショックタンパク質の少なくとも約０．０１％ｗｔ／ｗｔを含む。この方法の１つの態様では、熱ショックタンパク質はイネの熱ショックタンパク質（ａ ｒｉｃｅ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。この方法の１つの態様では、熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子とイネの胚乳腔の結合タンパク質（ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｌｕｍｅｎａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）とからなる群から選択される。この方法の１つの態様では、熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８、および、ＡＡＢ６３４６９からなる群から選択される。
これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、少なくとも約０．０１％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含む。これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、少なくとも約０．０４％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含む。これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、少なくとも約０．０６％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含む。これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、少なくとも約約０．０８％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含む。これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、少なくとも約０．１％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含む。
これらの方法のいずれかの１つの態様では、補足物は、約１００ｍｇ／Ｌと約２００ｍｇ／Ｌとの間の最終濃度になるまで加えられる組み換えアルブミンを含む。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約２００ｍｇ／Ｌと約４００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約４００ｍｇ／Ｌと約６００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約６００ｍｇ／Ｌと約８００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約８００ｍｇ／Ｌと約１０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約１０００ｍｇ／Ｌと約２０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約２０００ｍｇ／Ｌと約５０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約５０００ｍｇ／Ｌと約１００００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。これらの方法のいずれかの１つの態様では、組み換えアルブミンは、約１００００ｍｇ／Ｌと約２００００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられる。
これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１５％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、２０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、２５％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、３０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、４０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、５０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、６０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、７０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、８０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、９０％以上である。これらの方法のいずれかの１つの態様では、細胞の生存率の改善は、同一の条件下であるが前記補足物を含まずに成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１００％以上である。
本発明の特徴および利点の優れた理解は、本発明の原理が利用される具体例を説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することによって得られる。
アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。血清由来（非組み換えアルブミン）のクロマトグラムを示す。 アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。精製のための「旧プロセス」Ｂ０００を用いて作られたイネの組み換えアルブミン（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）のクロマトグラムを示す。 アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。精製のための「新プロセス」Ｂ００００Ｃを用いて作られたイネの組み換えアルブミン（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）のクロマトグラムを示す。 アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。血清由来アルブミン（１Ａ；点線）と、新プロセス（１Ｃ；実線）を用いて調製されたＣｅｌｌａｓｔｉｍのクロマトグラムの重なりを示す。 アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。旧プロセスＢ０００を用いて調製されたＣｅｌｌａｓｔｉｍ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）（１Ｂ； 点線）と、新プロセスＢ００００Ｃを用いて調製されたＣｅｌｌａｓｔｉｍ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）（１Ｃ；実線）のクロマトグラムの重なりを示す。 アルブミンの他のソースおよび精製方法と比較した、イネから生成される組み換えアルブミンのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。図２Ａは、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１とＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の比較を示す。レーン１は分子量マーカーである。レーン４はＣｅｌｌａｓｔｉｍアルブミン（１０μｇ）であり、レーン７はＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（１０μｇ）である。図２Ｂは、前の工程（Ｂ０００）（レーン２、３および４）と、新しいＣｅｌｌａｓｔｉｍプロセス（Ｂ００００Ｃ）（レーン６、７および８）からの３つのＣｅｌｌａｓｔｉｍロットのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。６つのサンプルは１レーン当たり２０μｇで負荷（ｌｏａｄ）される。 細胞の増殖と生存率に関して、酵母組み換え（Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅ）、ヒト由来（Ｓｅｒａｃａｒｅ）、および、植物組み換えアルブミン（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）の効果の比較を示す（図３Ａ）。図３Ｂは、組み換えアルブミン生成に、旧プロセス（Ｂ０００）と新プロセス（Ｂ００００Ｃ）を用いて生成されたアルブミンのバッチにおけるエンドトキシンレベルの比較を示す。図３Ｃは、組み換えアルブミン生成に、旧プロセス（Ｂ０００）と新プロセス（Ｂ００００Ｃ）を用いて生成されたＣｅｌｌａｓｔｉｍの存在下で成長させた細胞の細胞増殖と生存率の比較を示す。 ＡＴＰ親和性クロマトグラフィー後の組み換えアルブミンから得られた異なる画分の熱ショックタンパク質の含有量を示すために、抗熱ショックタンパク質抗体を用いるウエスタンブロットを示す（例３を参照）。 熱ショックタンパク質を取り除くために、新しいプロセスを用いて生成されたアルブミンを、ＡＴＰアフィニティカラム全体に通した後に、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ組み換えアルブミンの細胞増殖と生存率の効果の比較を示す（詳細に関してはテキストを参照）。 振盪フラスコ内における、補足していない（ｕｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）培地と補足した培地のＣＨＯ−Ｋ１の成長特性を示す。 補足していない培地と補足した培地におけるＣＨＯ−Ｋ１の生細胞のパーセンテージを示す。 振盪フラスコ内における補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な純増加率（ｎｅｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）を示す。 振盪フラスコ内における補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な純死亡率（ｎｅｔ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ ）を示す。 補足していない培地と補足した培地（４日目に栄養のある食事を与えた）での生存細胞密度（viability cell density）を示す。 補足していない培地と補足した培地（４日目に栄養のある食事を与えた）でのＣＨＯ−Ｋ１の生存細胞のパーセンテージを示す。 （４日目に栄養のある食事によりブーストされた）振盪フラスコ内の補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な純増加率を示す。 （４日目に栄養のある食事によりブーストされた）振盪フラスコ内の補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な純死亡率を示す。 振盪フラスコ中の補足物を含む培地で抗体の濃度の増加を示す。 負荷をかける際の有害事象後のバイオリアクター中のＣＨＯ Ｋ１の成長特性を示す。２つのバイオリアクターが２５０ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍ条件について用いられた。 負荷をかける際の有害事象の後のバイオリアクター中のＣＨＯ Ｋ１の生細胞のパーセンテージを示す。２つのバイオリアクターが２５０ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍ条件について用いられた。 （３日目と７日目に栄養物をブーストされた）補足していない培地と補足した培地における、バイオリアクター中のＣＨＯ Ｋ１の成長特性を示す。経時的な生存細胞の密度が示されている。 （３日目と７日目に栄養物をブーストされた）補足していない培地と補足した培地における、バイオリアクター中のＣＨＯ Ｋ１の特異的な増殖率を示す。経時的な生存細胞の密度が示されている。 （３日目と７日目に栄養物をブーストされた）補足していない培地と補足した培地における、有害な事象後のバイオリアクター中のＣＨＯ Ｋ１の生存細胞のパーセンテージを示す。 （３日目と７日目に栄養物をブーストされた）バイオリアクター内の補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な純死亡率を示す。 バイオリアクター中の補足していない培地と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１のｐＨ傾向を示す。 バイオリアクター中の補足していない培地と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１のモル浸透圧濃度の傾向を示す。 （３日目と７日目に栄養のある食事を含む）バイオリアクター内の補足していない培地と補足した培地で成長させた育てられたＣＨＯ Ｋ１のグルコース傾向を示す。 （３日目と７日目に栄養のある食事を含む）バイオリアクター内の補足していない培地と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１の乳酸塩の傾向を示す。 （３日目と７日目に栄養のある食事をブーストされた）バイオリアクター内の補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的なグルコース消費を示す。 （３日目と７日目に栄養のある食事をブーストされた）バイオリアクター内の補足していない培地（対照）と補足した培地で成長させたＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な乳酸塩の生成を示す。 （３日目と７日目の栄養のある食事を含む）バイオリアクター内の補足していない培地と補足した培地でのＣＨＯ Ｋ１によって生成される生成物の濃度を示す。 （３日目と７日目の栄養のある食事を含む）バイオリアクター内の補足していない培地と補足した培地でのＣＨＯ Ｋ１の特異的な生産性を示す。 タンパク質Ａクロマトグラフィーによる抗体の精製で使用される方法の概略図を示す。 平衡、負荷、洗浄、および、を示す吸収クロマトグラム、積み荷、洗浄、および、回避された画分（ｅｌｕｄｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を示す。精製された抗体を表す、回避された画分中のタンパク質の１つの強力なピークがあることに注意する。 抗体の精製と、プロテインＡクロマトグラフィーによる培地補足物の成功した除去とを示す、クーマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 抗体の精製と、プロテインＡクロマトグラフィーによる培地補足物の成功した除去とを示す、銀染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
（定義）
本開示がより容易に理解されるように、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な記載の全体を通じて説明される。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」あるいは「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者に定められるような特定の値の許容可能な誤差の範囲内であることを意味し、それは、部分的に、その値がどのように計測されるか、または、測定されるか、すなわち、測定システムの限定に依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野において、実行ごとに１以上の標準偏差内であることを意味することができる。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、組成に関連して、最大で２０％まで、好ましくは１０％まで、もっと好ましくは５％までの範囲のプラスまたはマイナスを意味することができる。本明細書で使用されるように、用語「増加」または関連語「増加した」は、統計的に有意な増加を指す。誤解を避けるために、それらの用語は、一般的に、所定のパラメーターの少なくとも１０％の増加を指し、少なくとも２０％、５０％、７５％、１００％、１５０％以上を包含することができる。
用語「抗原結合フラグメント」は、抗原結合（すなわち、特異的な結合）のために、抗原と結合するか、または、インタクトな抗体（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド部分のことを指す。結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術によって、または、インタクトな免疫グロブリンの酵素的開裂または化学分解によって生じさせることができる。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単一の鎖、および、単一の鎖の抗体を含む。
用語「アポトーシス」（「標準の」または「プログラム」細胞死）は、望まれない細胞または役立たない細胞が、発達段階および他の正常な生物学的プロセスの間に除去される生理学的プロセスのことを指す。アポトーシスは正常な生理学的条件下で生じる細胞死の形態であり、細胞はみずからの死に積極的に関与するものである（「細胞の自殺」）。それは、通常の細胞交替（ｃｅｌｌ ｔｕｒｎｏｖｅｒ）および組織の恒常性維持、免疫寛容の胚形成、誘導、維持、神経系の発達、および、内分泌腺に依存する組織の萎縮症のあいだに最もよく見られる。アポトーシスも、ストレスに反応した組織培養条件下で成長させた細胞でも誘発されてもよい。アポトーシスを経験した細胞は、容易に測定および定量化可能な、特徴的な形態学に関する特徴、および、生化学的な特徴を示す。これらの特徴は、クロマチン凝集、核および細胞質の凝縮、細胞質および核の、リボソームを含有する膜結合小胞（アポトーシス小体）への分割、形態学的にインタクトなミトコンドリアおよび核物質を含む。インビボで、これらのアポトーシス小体は、マクロファージまたは隣接する上皮細胞のいずれかによって、迅速に認識され、食菌される。
インビボでのアポトーシス細胞の除去のためのこのような効率的な機構により、炎症反応は誘発されない。インビトロで、残存する細胞フラグメントと同様に、アポトーシス小体も最後に膨潤して最終的には溶解する。インビトロの細胞死のこの終末過程は「第２のネクローシス」と呼ばれている。
本明細書で使用されているように、用語「細胞（ｃｅｌｌ、ｃｅｌｌｓ）」、「株化細胞」、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ、ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ）」は、互換的に使用され、植物と動物の細胞を含有し、無脊椎の非哺乳動物と脊椎の哺乳動物の細胞を含む。そのような指定はすべて細胞集団と子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質移入体」という用語は、移入の数に関係なく、それらに由来するプライマリー対象細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔ ｃｅｌｌ）および株化細胞を含んでいる。典型的な非哺乳動物の脊椎動物細胞は、例えば、トリの細胞、爬虫類の細胞、および、両生類の細胞を含んでいる。典型的な無脊椎動物細胞は、限定されないが、例えば、イモムシ（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞、蚊（ネッタイシマカ）細胞、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ）細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞、および、カイコ細胞のような昆虫細胞を含む。例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．, Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５ （１９８８）を参照。細胞は分化しても、部分的に分化しても、または、未分化であってもよく、例えば、幹細胞は、胚性幹細胞と多能性幹細胞を含む。さらに、器官または臓器系に由来する組織サンプルは、本発明にしたがって使用されてもよい。典型的な哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、人類以外の霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ハムスター、ネズミおよびモルモットを含むげっ歯類、ならびに、任意の誘導体およびその子孫に由来する細胞を含んでいる。
用語「細胞培養」または「組織培養」は、懸濁液中で成長させた、または、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅｓ）、細胞培養フラスコ、皿、マルチプルプレートなどの容器内で様々な表面または基質に付着させて成長させた細胞のことを言う。撹拌された発酵槽内でマイクロキャリアに付けられたまま成長する接着細胞を含む、バイオリアクターのような大規模な手法も、用語「細胞培養」に包含される。さらに、接触依存性の細胞を培養するだけでなく、請求される本発明の方法で懸濁培養技術を用いることも可能である。Ｂｕｔｌｅｒ, Ｓｐｉｅｒ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ, Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２８３−３０３（１９８８）で記載されているように、典型的なマイクロキャリアは、例えば、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン、および、セルロース他を含んでいる。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）またはＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）などの多孔質担体は、例えば、ＤＥＡＥデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ １（商標）第四級アミンでコーティングしたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標））などのデキストランベースの担体、または、ゼラチンでコーティングしたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（商標））などのゼラチンベースの担体などと同じように、使用されてもよい。タンパク質の大規模生産と小規模生産の双方のための細胞培養手順は、本発明によって包含される。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、または、撹拌タンクバイオリアクター（ｔａｎｋ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）システムを含むがこれらに限定されない手順は、マイクロキャリアを用いて／用いずに、使用されてもよく、バッチ、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、または、潅流方式で操作されてもよい。
「細胞培地」および「培地」は、細胞と株価細胞を成長させ、貯蔵し、処理し、および、維持するために使用される溶液を指す。そのような溶液は、一般に、細胞の付着、成長、および、細胞環境の維持に必要な様々な因子を含んでいる。例えば、典型的な溶液は、基本培地製剤、細胞の種類に依存する様々な補足物、および、時として抗生物質を含んでもよい。幾つかの実施形態では、溶液は、以下のカテゴリーの１つ以上から少なくとも１つの成分を含んでもよい。１）通常、グルコースのような炭水化物の形をしているエネルギー源；２）すべての必須アミノ酸、および、通常、２０のアミノ酸シスチンとの基礎的なセット；３）低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物；４）遊離脂肪酸；および、５）微量元素。微量元素は通常ミクロモルの範囲で、非常に低い濃度で一般的に必要とされる無機化合物または自然に発生する要素として定義される。溶液は、以下のカテゴリーのいずれかからの１以上の構成要素で随意に補足されてもよい。１）例えば、インシュリン、トランスフェリンおよび表皮成長因子としてのホルモンおよび他の成長因子；２）例えば、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、および、炭酸水素ナトリウムとしての塩類および緩衝液；３）例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチンのようなヌクレオシド、および、塩基；および、４）タンパク質および組織の加水分解産物。一般的に、任意の適切な細胞培地が使用されてもよい。培地は、例えば、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、および、同種のものなどといった血清で構成されてもよい。あるいは、培地は、無血清の、動物質を含まない、または、タンパク質を含まないものであってもよい。
幹細胞培養を指す際の用語「細胞系統」は、最も初期の前駆細胞から完全に成熟した細胞（すなわち、特殊化した細胞）まで、細胞型の成長の段階すべてを指す。
「細胞の生存率」または「生存率」という用語は、任意の所定の時間での細胞集団で示される、生細胞と死細胞の相対量を指す。細胞の生存率は、細胞集団の任意の所定のサンプルにおける生細胞と死細胞の相対数を測定することにより決定されてもよい。細胞の生存率は、細胞増殖と細胞死の速度の全体的なバランスを表す全個体数の細胞増殖の速度を測定することによって評価されてもよい。細胞増殖の速度は、細胞の数を数えることによって、および、細胞増殖の速度を直接記録する任意の数の市販の細胞増殖アッセイを使用することによって、直接的に測定されてもよい。
「馴化培地」は、幹細胞が培養することができ、多能性状態で培養および維持することができるフィーダー細胞の培養物から得られる細胞培地を指す。フィーダー細胞はいくつかの成分の馴化培地を消耗するだけでなく、十中八九は少量の成長因子を含む細胞由来の材料で培地を豊かにする。本明細書で使用されるように、用語「フィーダー細胞因子」とは、フィーダー細胞によって馴化培地へと放出される細胞由来の材料を意味する。細胞培地に放出される細胞因子は、幹細胞の成長を高めるのに役立つか、または、多能性状態の胚性幹細胞の維持に役立つ。フィーダー細胞因子は、当業者に知られている技術を用いて特定および精製可能であり、本明細書に記載されている。
用語「保存アミノ酸置換」または「保存変異」は、共有物を含む別のアミノ酸によって１つのアミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸間の共有物を定義する機能的な手法は、類似する有機体の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化周波数を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ, Ｇ. Ｅ. ａｎｄ Ｒ. Ｈ. Ｓｃｈｉｒｍｅｒ, Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような分析によると、１つの群内のアミノ酸が互いに優先的に交換する場合、アミノ酸の複数の群を定義することができ、それ故、タンパク質構造全体に対する影響という点で互いにもっとも類似している（Ｓｃｈｕｌｚ， Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ）。
このように定義されたアミノ酸基の例は次のものを含んでいる：Ｇｌｕ， Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｇｌｎ， Ｌｙｓ， Ａｒｇおよび Ｈｉｓからなる「荷電群／極性群」、Ｐｒｏ， Ｐｈｅ， Ｔｙｒ、および、Ｔｒｐからなる「芳香族基、または、環状基」、および、Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｖａｌ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｍｅｔ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ および Ｃｙｓからなる「脂肪族基」。
各々の基内で、下位の基は確認することができ、例えば、荷電アミノ酸／極性アミノ酸の基は、Ｌｙｓ， Ａｒｇ および Ｈｉｓ からなる「陽電荷の下位の基」からなる下位の基に、Ｇｌｕ および Ａｓｐからなる陰電荷の下位の基に、ならびに、Ａｓｎ とＧｌｎからなる「極性の下位の基」に再分割されてもよい。芳香族基または環状基は、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、および、Ｔｒｐからなる「窒素環の下位の基」からなる下位の基に、および、ＰｈｅとＴｙｒからなる「フェニル下位の基」とに再分割可能である。脂肪族基は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、および、Ｉｌｅからなる「大脂肪族の非極性の下位の基」からなる下位の機に、Ｍｅｔ，ＳＥＲ，ＴｈｒおよびＣｙｓからなる「脂肪族のわずかに極性を有する下位の基」に、および、ＧｌｙとＡｌａからなる「小さな残留物の下位の基」に再分割されてもよい。
保存的変異の例は、上記の下位の基内部にアミノ酸の置換基を、例えば、陽電荷が維持されることができるようにＡｒｇについてＬｙｓ（その逆も同じ）を、陰電荷が維持されることができるように、ＡｓｐについてＧｌｕ（その逆も同じ）を、遊離−ＯＨが維持されることができるように、ＴｈｒについてＳｅｒ（その逆も同じ）を、および、遊離−ＮＨ２が維持されることができるように、ＡｓｎについてＧｌｎ（その逆も同じ）を含む。
用語「細胞毒性」は、化合物（化学汚染物質またはタンパク質の汚染物質、洗剤、または、トキシンなど）の細胞死滅特性を指す。ネクローシスとアポトーシスとは対照的に、細胞毒性という用語は、必ずしも特定の細胞死機構を示すとは限らない。
本明細書で使用されているように、用語「減少する」または、関連する用語「減少した」「低下する」あるいは「低下した」は、統計的に有意な減少を指す。誤解を避けるために、この用語は、一般的に、所定のパラメーターの少なくとも１０％の減少のことを言い、少なくとも２０％の減少、３０％の減少、４０％の減少、５０％の減少、６０％の減少、７０％の減少、８０％の減少、９０％の減少、９５％の減少、９７％減少、９９％または１００％の減少（すなわち、測定されたパラメーターはゼロである）を包含することができる。
本明細書で使用されているように、幹細胞を記載されたために使用される用語「発達する」「分化する」および「成熟する」は、少なくとも２つの異なる細胞の分化系列へと分化する可能性がある段階から、特定化され、最終的に分化した細胞になるまでの細胞の進行のことを言う。そのような用語は、本出願の目的のために互換的に使用することができる。
本明細書に使用されるように、用語「発現」は、宿主細胞内のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の生成の発現レベルは、細胞中に存在する対応ｍＲＮＡの量か、選択された配列によってエンコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて、決定されてもよい。例えば、選択された配列から転写されるｍＲＮＡの量は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞のＲＮＡへの、または、ＰＣＲによるインサイツハイブリダイゼーションによって定量化可能である。選択された配列によってエンコードされたタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈殿、タンパク質の生物活性のアッセイ、または、ＦＡＣＳ分析をあとに伴うタンパク質の免疫染色を含むが、これらに限定されない様々な方法によって、定量化可能である。
「発現制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などのような、宿主細胞内のコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列である。典型的な発現制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, Ｃａｌｉｆ（１９９０）に記載されている。
用語「フィーダー細胞」は、インビトロで成長し、少なくとも１つの因子を培地に分泌し、さらに、培養中の所望の別の細胞の成長を維持するために使用することができる、細胞の培養のことを言う。本明細書で使用されているように、「フィーダー細胞層」は、用語「フィーダー細胞」と互換的に使用することができる。フィーダー細胞は単層を含むことができ、フィーダー細胞は、単層と完全な層の互いの上に成長する前に完全な層で培養皿の表面を覆い、または、フィーダー細胞は２つの細胞のクラスターを含むことができる。
用語「成長段階」は、細胞培養に細胞が一定の割合で***している、指数関数的な細胞増殖（対数期）の期間を指す。この段階中に、細胞は一定期間のあいだ、かつ、細胞増殖が最大化されるのと同じ条件下で、培養されている。宿主細胞用の成長周期の決定は、必要以上の実験を必要とせずに想定された特定の宿主細胞について測定されることができる。「一定時間、かつ、細胞増殖が最大化されるのと同じ条件下で」などは、特定の株化細胞について、細胞の増殖と***に最適なように決定される培養条件のことを指す。成長段階のあいだ、細胞は、最適な成長が特定の株化細胞、例えば、哺乳動物細胞について達成されるように、湿らされた、制御された雰囲気下で、通常約３０−４０°Ｃで、一般的には約３７°Ｃで、必要な添加剤を含有している培養液中で培養されている。
用語「相同性」は、遺伝子またはタンパク質を類似する機能またはモチーフで特定するために使用される、配列類似性の数学的に基づく比較を記載している。例えば、他のファミリーメンバー、関連する配列または相同体を同定するための公のデータベースに対して検索を行なうために、本発明の核酸およびタンパク質配列は、「クエリ−配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ, ｅｔ ａｌ. （１９９０） Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴのプログラムを用いて行なうことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことで、本発明の核酸分子に相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行なうことができる。比較する目的でギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、ギャップアライメントが利用されてもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。
用語「相同の（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、動物の異なる種からの相同タンパク質と同様に、同じ種の動物におけるスーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係性を指す（例えば、ミオシン軽鎖ポリペプチドなど。Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ, ５０：６６７, １９８７を参照）。そのようなタンパク質（および、それらのエンコード核酸）は、百分率同一性の観点から、または、特定の残基またはモチーフの存在、および、保存部位によってであろうとなかろうと、それらの配列類似性によって反映されるように、配列類似性を有する。
成長因子という用語は、アンフィレギュリン、アンギオポエチン、ベタセルリン（骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−２、ヒトＢＭＰ−３、骨形態形成タンパク質−４、ヒトＢＭＰ−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、ヒトＣＤ１３５リガンド／Ｆｌｔ−３リガンド、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１、ヒトＣＴＧＦ（結合組織成長因子）、ヒトＥＧＦ（上皮増殖因子）、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ（内分泌腺由来の血管内皮成長因子）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒトＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子１−２３）、ヒトＧＤＦ−１１、ヒトＧＤＦ−１５、ヒトＧＤＦ−８、ヒト成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ、ＧＲＦ、ＧＨＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン）、ヒトヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒトヘレグリンβ１、ヒトインスリン、ヒトＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ヒトＩＧＦ−２（インスリン様成長因子−２）、ヒトＩＧＦＢＰ−１（インスリン様成長因子結合タンパク質１）、ヒトＩＧＦＢＰ−３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）、腸トレフォイルファクター（ＩＴＦ）、ヒトケラチノサイト成長因子１＆２、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ヒトＭＳＰ、ヒトミオスタチン、ヒトミオスタチン、プロ（プロペプチド）、ヒトＮＲＧ１、ヒトＮＧＦ、ヒトオンコスタチン Ｍ、ヒト骨芽細胞特異因子１（ＯＳＦ−１、プレイオトロフィン）、ヒトＰＤ−ＥＣＧＦ（血小板由来内皮細胞成長因子）、ヒトＰＤＧＦ、ヒトＰＩＧＦ、ヒト胎盤増殖因子１（ＰＬＧＦ１）、ヒト胎盤増殖因子２（ＰＬＧＦ２）、ヒトＳＣＧＦ−ａ（幹細胞成長因子α）、ヒトＳＣＧＦ−ｂ（幹細胞成長因子β）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）／ＣＤ１１７リガンド、ヒトトロンボポイエチン（ＴＰＯ、ＴＨＰＯ）、ヒトトランスフォーミング成長因子、ヒトＴＧＦ−α（トランスフォーミング成長因子α、ＴＧＦａ）、ヒトＴＧＦ−β１（トランスフォーミング成長因子−ｂｅｔａ１、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−β１．２（トランスフォーミング成長因子−ｂｅｔａ１、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−β２（トランスフォーミング成長因子−ｂｅｔａ２、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−β３（トランスフォーミング成長因子−ｂｅｔａ３、ＴＧＦｂ）、ヒトＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ヒトＶＥＧＦ−１２１、および、ヒトＶＥＧＦ−１６５、および、ヒトＶＥＧＦ−Ａのことを言う。
本明細書で使用されているように、「同一性」とは、配列適合を最大限にするために、すなわち、ギャップと挿入を考慮して、配列を整列させる際に、２以上の配列の対応する位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。同一性とは、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３ （１９８８）に記載されるものを含む、既知の方法によって容易に計算可能である。同一性を測定する方法は、試験される配列間の最大の適合を与えるために考案される。さらに、同一性を測定する方法は、好適に入手可能なコンピュータ・プログラム中で成文化されている。２つの配列間の同一性を測定するコンピュータ・プログラム方法は、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ａｎｄ ＦＡＳＴＡ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０） ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を含んでいる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． ， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０ （１９９０））から入手可能である。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を測定するために使用することができる。
（本明細書で互換的に使用される）用語「免疫グロブリン」または「抗体」は、一般的に、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる塩基性の４つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質のことを言い、前記鎖は、例えば、特異的に抗原を結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合によって安定させられる。（本明細書で互換的に使用される）用語「単一鎖免疫グロブリン」または「単一鎖抗体」は、重鎖と軽鎖からなる２−ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質のことをいい、前記鎖は、例えば、特異的に抗原を結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーによって安定させられる。用語「ドメイン」は、例えば、β−プリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって、安定したペプチドループ（例えば、３−４のペプチドループを含む）を含む、重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドの球状の領域を指す。ドメインは、「定常」ドメインの場合の様々なクラスメンバー（ｃｌａｓｓ ｍｅｍｂｅｒｓ）のドメイン内の配列変異の相対的な欠如、または、「可変」領域の場合の様々なクラスメンバーのドメイン内の有意な変化の相対的な欠如に基づいて、「定常」または「可変の」と本明細書では呼ばれる。抗体またはポリペプチドの「ドメイン」は、当該技術分野では、抗体またはポリペプチドの「領域」と互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域、または、「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または、「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域、または、「ＶＬ」ドメインと交換できて呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域、または、「ＶＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルか、または、ポリクローナルであってもよく、単量体かポリマーの形態、例えば、五量体の形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または、単量体か、二量体か、多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体で存在してもよい。用語「フラグメント」は、インタクトまたは完全な抗体よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。フラグメントは、インタクトなまたは完全な抗体あるいは抗体鎖の化学的処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントも組み換え手段によって得ることができる。典型的なフラグメントは、Ｆａｂ， Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、および／または、Ｆｖのフラグメントを含む。
用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、本明細書で開示される細胞培養成分または熱ショックタンパク質を記載するために使用される際、その自然環境の成分から特定および単離された、および／または、回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染物質成分は、タンパク質の研究、診断的使用または治療的使用を一般的に妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および、他のタンパク質または非タンパク質の溶質を含んでもよい。幾つかの実施形態では、タンパク質は、クーマシーブルー、または、好ましくは銀染色を用いて、非還元条件または還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されるように、少なくとも９５％の均一性に浄化される。対象の自然環境のタンパク質の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離されたタンパク質は組み換え細胞内にインサイツでタンパク質を含む。しかしながら、一般的に、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって準備される。
本明細書に使用されるような「マーカー」は、対象細胞の中で異なった形で発現される核酸またはポリペプチド分子である。この文脈では、発現差異は、陽性マーカーについて値の増加を、陰性マーカーについて値の減少を意味する。マーカーの核酸またはポリペプチドの検出可能な値は、対象の細胞が当該技術で既知の様々な方法のいずれかを用いて、特定するとともに他の細胞から識別することが可能となるように、他の細胞と比較して対象細胞内で十分に高いか、または、低い。
「膵臓の内分泌腺の分化系列のマーカー」を発現する細胞は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子の少なくとも１つについて陽性の遺伝子発現を含む細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮＲｘ２．２、ＮＲｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、および、Ｐａｘ６。膵臓の細胞の分化系列に特有のマーカーを発現する細胞は、膵臓のβ細胞を含んでいる。
本明細書で使用されるように、「内胚葉分化系列の特徴的なマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞のことを指す：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、ブラキュリ、混合物のようなホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、または、ＯＴＸ２。最終的な内胚葉分化系列に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞、および、最終的な内胚葉細胞を含んでいる。
本発明の方法に由来する多能性マーカーを発現する細胞は、以下からなる群から選択された以下の多能性マーカーの少なくとも１つを発現する：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａｌ−６０、および、Ｔｒａｌ−８１。
本明細書で使用されるように、「中胚葉分化系列の特徴的なマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６。
本明細書で使用されるように、「外胚葉分化系列の特徴的なマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＢＭＰ−４、ノギン、コーディン、Ｏｔｘ２、Ｆｏｘ Ｊ３、ネスチン、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、β−ＩＩＩチューブリン。
本明細書に互換的に使用されるように、「操作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ、ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合」という用語は、意図した方法で機能することを可能にする手法で２以上のヌクレオチド配列または配列因子を位置決めすることを指す。幾つかの実施形態において、本発明に係る核酸分子は、組み換えタンパク質をコード化するヌクレオチド配列に操作可能に結合されたクロマチンをオープン（ｏｐｅｎ）にするか、および／または、オープン状態にクロマチンを保持することができる１以上のＤＮＡ要素を含む。他の実施形態では、核酸分子は、次のものから選ばれた１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい：（ａ）並進運動を増加させることができるヌクレオチド配列；（ｂ）細胞の外側の組み換えタンパク質の分泌を増加させることができるヌクレオチド配列；および（ｃ）ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列。このようなヌクレオチド配列が組み換えタンパク質をコード化するヌクレオチド配列に操作可能に結合される。一般的に、しかしながら必ずというわけではないが、操作可能に結合するヌクレオチド配列は近接しており、必要に応じて、リーディングフレーム内にある。しかしながら、クロマチンをオープンにするか、および／または、クロマチンをオープン状態に保持することができる操作可能に結合されたＤＮＡ要素は、組み換えタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の上流に位置するのが一般的であるが、該要素は必ずしもそれに隣接していない。様々なヌクレオチド配列の操作可能な結合は、当該技術でよく知られた組み換え方法によって、例えば、ＰＣＲ方法論を用いて、適切な制限酵素部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ ｓｉｔｅｓ）でのライゲーションによって、または、アニーリングによって、遂行される。適切な制限酵素部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、従来の実践と一致して使用することができる。
本明細書で互換的に使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態のことを言う。これらの用語は、一本鎖、二本鎖、または、三本鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または、プリンおよびピリミジンの塩基、または、他の天然の、化学的に修正された、生化学的に修正された、非天然の、または、誘導体化された、ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。ポリヌクレオチドの主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、糖およびリン酸基（ＲＮＡまたはＤＮＡで一般的に見られるような）、または、修正されたか置換された糖またはリン酸基を含むことができる。加えて、二本鎖のポリヌクレオチドは、適切な条件下で 相補鎖を合成して鎖をアニールするか、または、適切なプライマーを含むＤＮＡポリメラーゼを新規に用いることによって、相補鎖を合成することのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から得ることができる。核酸分子は、様々な形態、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメント、１以上のエキソン、１以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクトル、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、および、プライマーの形態をとる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチド、ウラシル、他の糖、および、フルオロリボース（ｆｌｕｏｒｏｒｉｂｏｓｅ）およびチオアートなどの結合基、ならびに、ヌクレオチド分岐のなどを含んでもよい。本明細書で使用されるように、「ＤＮＡ」または「ヌクレオチド配列」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含むのみでなく、任意のそれらのアナログまたはこれらの塩基の修飾された形態（メチル化されたヌクレオチドなど）、ヌクレオチド間の修飾体（無電荷の結合およびチオアート（ｔｈｉｏａｔｅ）など）、糖アナログの使用、および修飾されたおよび／または代替の主鎖構造（ポリアミドなど）も含む。
用語「多能性幹細胞」は、胚、胎児または成体の組織から得られた幹細胞を包含する。１つの好ましい実施形態では、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。別の実施形態では、多能性幹細胞は始原生殖細胞などの胎児の幹細胞である。別の実施形態では、多能性幹細胞は成体幹細胞である。
本明細書で使用されているように、用語「多能性」は、外胚葉の、内胚葉の、および、中胚葉の細胞の１つなくとも進化することができる細胞を指す。本明細書に使用されるように、用語「多能性」は、全能性で、かつ、多能性の細胞を含んでいる。本明細書で使用されているように、用語「全能細胞」は、細胞のすべての分化系列に進化することができる細胞を指す。「多能性」という用語は、最終的に分化しない細胞のことを言う。
「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用されているように、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で結合され、背景を超えて検出可能な値で転写を始めるのに必要な最小の数の塩基または要素を含むために、上流に（５’方向）に伸張する。（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより便利なように定義される）転写開始部位は、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク結合ドメイン（共通配列）と同様に、プロモーター配列内でも見つけられる。真核生物プロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むことができる。原核生物のプロモーターは、−１０および−３５の共通配列に加えて、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含む。
様々な異なるソースからの、構成的プロモーター、誘導プロモーター、および、抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）プロモーターを含む、大多数のプロモーターが当該技術でよく知られている。代表的なソースは、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および、細菌細胞型を含み、これらのソースからの適切なプロモーターは容易に入手可能であるか、または、ネットで、または、例えば、商用のソースか個人的なソースと同様に、ＡＴＣＣなどの保管所から公に入手可能な配列に基づいて、合成的に作ることができる。プロモーターは一方向性（すなわち、一方向で転写を始める）であるか、または、双方向（すなわち、３’または５’のいずれかの方向で転写を始める）であってもいい。プロモーターの非限定的な例は、例えば、Ｔ７細菌発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、イネの胚乳の特異的なグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓウイルスプロモーターを含む。誘導プロモーターは、Tet 系, (米国特許第５，４６４，７５８号および第５，８１４，６１８号)、エクジソン誘導系（ｔｈｅ Ｅｃｄｙｓｏｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９６） ９３ （８）： ３３４６−３３５１；ｔｈｅ Ｔ−Ｒｅｘ（商標）ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（ｒ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，（カリフォルニア州サンディエゴ） 、および、Ｃｒｅ−ＥＲ（商標）Ｔタモキシフェン誘導リコンビナーゼ系（ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （１９９９） ２７ （２２）： ４３２４−４３２７； Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （２０００） ２８ （２３）： ｅ９９； 米国特許第７，１１２，７１５号； および、Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００５） ３０８： １２３−１４４）、または、所望の細胞での発現に適した当該技術で既知のプロモーターを含む。
用語「対象タンパク質」は、研究、診断または治療の目的に役立つ任意のタンパク質を指す。対象タンパク質は、哺乳動物のタンパク質または非哺乳動物のタンパク質を含んでもよく、随意に受容体またはリガンドを含んでもよい。典型的な対象タンパク質は、限定されないが、レニン；ヒト成長ホルモンとウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、および、フォン・ヴィルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子）などの凝固因子；タンパク質Ｃのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤（ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）；ウロキナーゼまたはヒトの尿または組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）のようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β、ＣＤ４０リガンド、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３、ＯＰＧ、ＦａｓリガンドのようなＴＮＦおよびＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ；（血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質）；ヒト・マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュラー管（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ）抑制因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスのゴナドトロピン関連ペプチド（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）；β‐ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；デオキシリボヌクレアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ−４のような細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子のための受容体；プロテインＡまたはＤ；リューマチ因子；骨に由来する向神経性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または、−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、または、ＮＴ−６）、あるいは、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子といった神経栄養因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦとｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、または、ＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−αとＴＧＦβのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび―ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０のようなＣＤタンパク質；エリトロポイエチン；骨誘導因子；抗毒素；骨形成因子（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、および、−ガンマのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、および、Ｇ−ＣＳＦ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；例えば、ＩＬ−１乃至ＩＬ−１０などのインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシド；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の一部のようなウイルス抗原、ｇｐ１２０；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、および、ＶＣＡＭのようなインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、または、ＨＥＲ４受容体のような抗原関連腫瘍；および、先に列挙したポリペプチドのいずれかの変異体および／またはフラグメント；同様に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４などの、様々なタンパク抗原様のＣＤタンパク質に対する抗体；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体のようなＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、および、それらのαまたはβのいずれかのサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）を含むαｖ／β３インテグリンといった細胞接着分子；ＶＥＧＦのような成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；Ａｐｏ−２（ＤＲ５）、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３のようなＡｐｏ−２Ｌ受容体；および、先に特定された抗体などの変異体および／またはフラグメント、のような分子を含む。本発明の１つの実施形態では、対象タンパク質は、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、または、ＴＮＦアルファなどの、インビトロまたはインビボで、哺乳動物または非哺乳動物の細胞中にそれ自体でアポトーシスを誘発することができるたんぱく質を含むであろう。
細胞培養の「生成段階」という用語は、細胞増殖がプラトーに達した期間を指す。生成段階中に、対数の細胞増殖は終了し、タンパク質生成が主要なものである（ｐｒｉｍａｒｙ）である。この期間中に、培地は、一般的に、継続的なタンパク質生成を維持し、かつ、所望のタンパク質生成物を達成するために補足される。
用語、「組み換えタンパク質」または「組み換えポリペプチド」は、ポリペプチドを生成する細胞に対して外因性であること、すなわち、異種または異物のポリペプチドを指す。
アポトーシスまたは細胞培養の文脈における用語「ストレス」は、下記の任意の組み合わせを含む組織培養のための最適でない条件を指す；毒素の存在、栄養素または成長因子の欠乏または撤回、低酸素、熱応力（好ましい範囲と比較して温度が高すぎるかまたは低すぎる）、細胞間接触の損失、ウイルス感染、浸透圧（好ましい範囲と比較して浸透圧が高すぎるかまたは低すぎる）、酸化ストレス、細胞密度（好ましい範囲と比較して細胞密度が高すぎるかまたは低すぎる）、および、ｐＨストレス（好ましい範囲と比較してｐＨが高すぎるかまたは低すぎる）。
用語「形質転換」は、１つ以上の核酸分子の宿主細胞または生物体への転換を指す。宿主細胞へ核酸分子を導入する方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、微量注入、陽イオン性脂質を媒介としたトランスフェクション、エレクトロポレーション、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌａｏｄｉｎｇ）、ウイルスまたは他の病原菌を用いたバリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）または感染を含む。「形質転換された」「形質導入された」および「トランスジェニックな」は、組み換えまたは異種の核酸分子（例えば、１以上のＤＮＡ構築物またはＲＮＡ、または、ｓｉＲＮＡのカウンターパート（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ））が導入された宿主細胞または生物体を指す。核酸分子は安定的に発現される（すなわち、約３か月間以上、細胞の中で機能的な形態を維持する）か、または、３か月未満のあいだ細胞の中で機能的な形態で不安定的に維持される、すなわち、一時的に発現される。例えば、「転換された」「形質転換体」、および、「遺伝子導入の」細胞は、形質転換工程を経て、異質な核酸を含有する。「非形質転換の」という用語は、形質転換工程を経ていない細胞のことを言う。
細胞培養の「移行期間」は、生成段階の培養条件が関連する期間を指す。移行期間のあいだ、ｐＨ、イオン濃度、および、温度のような環境要因は、成長条件から生成条件へと変化してもよい。
用語「配列類似性」は、共通の進化起源を共有する、または、共有しない核酸またはアミノ酸の配列の間の同一性または一致の程度を指す（上記のようにＲｅｅｃｋらを参照）。しかしながら、一般的な使用法と本願において、「高度に」などの副詞で修飾される際、「相同の」という用語は配列類似性を指してもよく、共通の進化起源に関連付けられても関連付けられなくてもよい。
特定の実施形態では、２つの核酸配列は、ヌクレオチドの少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＣＬＵＳＴＡＬなどのように既知の配列比較アルゴリズムによって測定されるように、核酸配列の定義された長さにわたって一致する場合、「ほとんど相同」または「ほとんど同一」である。そのような配列の一例は、本発明の特異遺伝子の対立遺伝子多型または変種である。ほとんど相同の配列は、例えば、その特定の系について定義されたようなストリンジェントな条件下で、例えば、サザンハイブリダイゼーション実験でのハイブリダイゼーションによっても特定されてもよい。
同様に、本発明の特定の実施形態では、アミノ酸残基の８０％以上が同一の場合、または、アミノ酸残基の約９０％以上が類似している（すなわち、機能的に同一である）場合、２つのアミノ酸配列は「ほとんど相同で」または「ほとんど類似している」。好ましくは、類似または相同のポリペプチド配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，ウィスコンシン州マジソン）パイルアッププログラム（ｐｉｌｅｕｐ ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて、または、上に記載されたプログラムとアルゴリズムのいずれかを用いて、配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）することによって特定される。プログラムは、デフォルト値：ＧＡＰクリエーションペナルティ（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝−（１＋１／κ）（κはＧＡＰ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）），平均一致＝１，平均不一致＝−０．３３３）のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｇｏｒｉｔｈｍ）を用いてもよい。
本明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈でマイ核に定められていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、１以上のそのような分子を含んでおり、「試薬」は、１以上のそのような異なる試薬を含んでおり、「抗体」への言及は、１以上のそのような異なる抗体を含んでおり、および、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法に関して修正または代替可能な当業者に周知の同等の工程および方法への言及を含んでいる。
本発明の実施は、別途定めのない限り、当業者の考え得る範囲内で、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を利用し、それらは、当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｏｏｋｓ １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｃｈ． ９， １３， ａｎｄ １６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）；Ｂ． Ｒｏｅ， Ｊ． Ｃｒａｂｔｒｅｅ， ａｎｄ Ａ． Ｋａｈｎ， １９９６， ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ． Ｍ． Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ， １９９０， Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ （Ｅｄｉｔｏｒ）， １９８４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ． Ｍ． Ｊ． Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ． Ｅ． Ｄａｈｌｂｅｒｇ， １９９２， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ （１９９９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ （Ｅｄｉｔｏｒ）， Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （Ｅｄｉｔｏｒ） （１９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３，４−２）， １８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ， Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ （２００１， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；ａｎｄ Ｌａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ， Ｒｅａｇｅｎｔｓ， ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ， Ｅｄｉｔｅｄ Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ， ２００２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照。これらの一般的なテキストの各々は参照によって本明細書で組み入れられる。
他に特段定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法、組成物、試薬、細胞は、本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法と材料が本明細書に記載される。特許および特許出願を含む、本明細書に記載されるすべての出版物および引用文は、あたかも各々の個々の公報または引用文が十分に説明されるように本明細書で引用によって組み入れられるように具体的にかつ個々に示されているかのように、そっくりそのまま引用することによって本明細書に組み入れられる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願は、出版物と引用文について上に記載された方法でそっくりそのまま本明細書で引用することによって組み込まれられる。
上に議論された出版物は、本願の出願日の前にもっぱらその開示のために提供される。本明細書のいかなることも、本発明が以前の発明のおかげでそのような開示に先行する資格を有していないという承認として解釈されない。
（Ｉ 本発明の補足物を使用するための方法）
請求される補足物が、アポトーシスを予防して組織培養中の細胞の生存率を改善する際に、特に、ストレスに応じて、有意な改善を提供する場合、それは、組織と細胞の培養、および、たんぱく質の生成に関して多種多様な応用例で役立つ。
アポトーシスは、特有の細胞形態学と死につながる一連の生化学的事象を含んでいる。これらの変化は、細胞膜非対称または付着の損失、細胞の小胞形成の細胞収縮、核断片化、クロマチン凝縮、および、染色体ＤＮＡ断片化のような細胞膜に対する変化を含む。
アポトーシスの工程は多様な範囲の細胞シグナルによって制御され、これは、細胞外（外因性のインデューサー）または細胞内（内因性のインデューサー）のいずれかで生じてもよい。細胞外のシグナルは毒素、ホルモン、成長因子、一酸化窒素、サイトカインを含んでもよく、それらは組織培地中で異なる程度存在してもよい。これらのシグナルは、アポトーシスに肯定的（すなわち、誘発する）または否定的（すなわち、抑圧する、阻害する、または、勢いを弱める）な影響を与えることもあり、したがって生存率全体に影響することもある。ＡＴＰ含有量、カルシウム濃度、および、多くのアポトーシス性および抗アポトーシス遺伝子を含む多くの細胞内成分は、アポトーシスを制御するのにも役立つ。細胞はストレスに応じて細胞内のアポトーシスシグナル伝達を始めることもあり、それは細胞自殺を引き起こすことがある。組織培養中に遭遇するストレス誘発剤は、例えば、エンドトキシンなどの組織培養成分に関連する毒素、および、プラスチック製品、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび類似の脂質ベースのトランスフェクション試薬）、ウイルス形質転換、無血清培養に関連する栄養および成長因子の枯渇、または、例えば、洗剤と電気穿孔によって引き起こされる細胞膜への損傷による高密度培養と細胞内カルシウム濃度の増加とに関連する細胞分化プロトコルの低酸素および酸化ストレスを含む。
細胞死の実際のプロセスが生じる前に、アポトーシスシグナルは、アポトーシス経路の活性化を監視するゲートキーパーとして作用する調節タンパク質を克服しなければならない。インビボでは、細胞がもはや死ぬ必要がない場合、この工程のおかげで、プロセスを止めることができる。制御の２つの主要な機構は特定されて、ミトコンドリアの機能に関連した機構と、アダプタータンパク質を介してアポトーシス機構へとシグナルを伝達するのに直接関与する機構を含んでいるが、複数のタンパク質はこの工程に含まれる。
細胞培養条件下で育てられた細胞は、いつもの組織培養手順に関連する細胞ストレスを経験し、上記のように、これは、アポトーシスシグナルを誘発し、アポトーシスに対する細胞の感受性を高める。例えば、無血清培養に関連する栄養の枯渇、バイオリアクター中の高密度成長により関連する酸化ストレス、ＤＮＡトランスフェクション試薬に関連する細胞毒性化合物の使用、および、凍結保存に関連する熱ストレスによって、細胞はアポトーシスに突入しやすくなる。細胞がそのようなシグナルから生き残る能力を高めることによって、細胞死に対する細胞の傾倒を防ぐことによって、これらの手順の間に細胞の生存率を改善することが可能であり、それによって、これらの手法の成果およびユーティリティーを改善する。
最近になって、アポトーシスの発症を抑制するか、または、その効果を弱める、真核細胞中の多くの遺伝子が特定されている。これらの遺伝子のいくつかは、細胞中のカスパーゼ依存性アポトーシス性経路を阻害し、実際に、抗アポトーシス遺伝子を細胞にトランスフェクトことは、生物学的に要求する条件下で育てられたトランスフェクト細胞の寿命および生産性を長くするのに有用である（米国特許第６，５８６，２０６号、米国特許第７，５３１，３２７号、米国特許出願第２００９／０１７０１６５号、米国特許出願第ＵＳ２００９／０１８１４２６号）。
さらに、外因性の熱ショックタンパク質の追加は、場合によっては、様々な条件下で培養中の細胞の生存を改善することが示されている（Ｎｏｖｏｓｅｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ９４ ５９７−６０６ （２００５）； Ｔｉｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ ９ （１） ８８−９０ （２００４）； Ｇｕｚｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ． ３ （１） ６７−７７ （１９９８）； Ｈｏｕｎｅｎｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ １ （３） １６１−１６６ （１９９６）； Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ２９Ａ ８０７−８１２ （１９９３）。
本発明は、植物由来の組み換え細胞培養成分タンパク質が、培養で育てられた哺乳動物細胞に加えられると、細胞の増殖と生存率を驚くほど高めたという実証に一部基づいている。具体的に、そのような補足物は、培養の生存率の改善、細胞の生存の延長、細胞増殖の改善と、組織培養バイオリアクターから生成される組み換えタンパク質の収量の改善を結果としてもたらす。補足物が活性と安定性の予想外の改善を示すため、それらは、標準の組み換えタンパク質または精製されたタンパク質の使用と比較して、有意な改善をもたらす。
本出願で開示される方法は、例えば、細胞の生存率を改善するために、および、培養で成長させた細胞の細胞増殖速度を早める際に、有用である。１つの態様では、本発明の補足物は、細胞培養からの組み換えタンパク質の収量を改善するか高めるのに役立つ。本発明によって提供されるさらなる改善は、以下に詳細に記載される。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞の細胞増殖を高めるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、無血清培地への補足物の追加を含む、無血清培地に適応させた細胞の生産性を高めるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、バイオリアクター中の乳酸塩の蓄積を減少させるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、バイオリアクター中のグルコースおよび他の砂糖の消費を減少させる方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクター中の培養中の細胞への補足物の追加を含む、培養の開始からバイオリアクターでの採取までの、タンパク質を生成するのに必要な時間を減らす方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクターへの補足物の追加を含む、バイオリアクター中の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、無血清培地への補足物の追加を含む、無血清培地条件下で成長させた細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、低密度に平板培養した際の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への補足物の追加を含む、単細胞クローンから成長させた細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培地に対する補足物の追加を含む、培養で成長させたプライマリー細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、トランスフェクションの前、間、後の、細胞培地への補足物の追加を含む、トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、凍結保存の前、間、後の、細胞培地への補足物の追加を含む、凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、細胞培地への本発明の補足物の追加を含む、培養で成長させた幹細胞の細胞増殖または生存率の割合を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、細胞培地への本発明の補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の収量を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の精製を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のタンパク質分解を減少させるための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の生物活性を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物の安定性を改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のアセンブリを改善するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への補足物の追加を含む、培養中の細胞から生成された組み換え生成物のヒトパターンに近いグリコシル化を形成するための方法を含む。
１つの実施形態では、本発明は、培養物の成長段階、移行段階、または、生成段階の１以上の間の、培地への組み換えアルブミンを含む補足物の追加を含む、免疫原性の少ない培養中の細胞から生成された組み換え生成物を形成するための方法を含む。
これらの方法のいずれかにおいて、本発明の補足物は、培養中（および、発酵中の）の宿主細胞の生存率を増加させることによって、機能的な組み換えタンパク質の収量、純度、生物活性、安定性、および、集合を増加させるために、単純でかつコスト効率の良い方法を提供する。さらに、本発明の補足物は、培地中のアポトーシスを減少または阻害することによって、培地中の有害なプロテアーゼの数または存在を減少させて、タンパク質分解に対して発現された対象のタンパク質を保護することができ、それによって、活性タンパク質の量の増加とインタクトなタンパク質の収量の増加とによってからも明らかなように、生成された対象タンパク質の質を高める。さらに、出願人は、本発明の補足物が、洗剤、重金属および培地成分中に存在するエンドトキシン汚染物のような薬剤の潜在的な有害作用から細胞を保護してもよく、または、トランスフェクションまたは凍結保存中に細胞に導入される毒性の試薬から細胞を保護してもよい。
請求される方法のいずれかにおいて、本発明の補足物は、例えば、培地を変えるか、細胞を継代する（ｐａｓｓａｇｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）か、または、低密度で細胞を沈着させる（ｐｌａｔｅ ｏｕｔ）際に、任意の都合のいい時間に培地に直接加えられるか、または、混合されることができる。随意に、補足物は、細胞培養工程の始め（開始時、０日目）に培地に加えられる。１つの態様では、本発明の補足物は、予期されるストレス事象の前に、例えば、凍結保存、トランスフェクション、または、血清の枯渇などの前に加えられてもよい。
別の態様では、補足物は、一般的なアポトーシスの導入が始まる時点よりも前の、細胞の培養の間に、培地に加えられる。例えば、大規模な細胞培養中に、アポトーシスの導入は、培養の３日目または４日目ごろに観察され、したがって、補足物は、３日目または４日目の前に加えられるのが好ましいであろう。随意に、所望の量の補足物が、例えば、全体的な発酵に関して毎日のように、細胞培養にわたって、または、細胞培養のあいだ、加えられる。一例として、５日間の培養について、補足物は、０日目に加えられ、培養が終わるまで、その後２４時間ごとに加えられてもよい。
従って、１つの実施形態では、本発明は、バイオリアクターに本発明の補足物を加えることによって、バイオリアクター内で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。１つの実施形態では、バイオリアクターは細菌細胞を含んでもよい。別の態様では、バイオリアクターは酵母菌を含む。別の態様では、バイオリアクターは植物細胞を含む。別の態様では、バイオリアクターは哺乳動物細胞を含む。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養物に本発明の補足物を加えることによって、細菌細胞中で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。収量を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞培養物に本発明の補足物を加えることによって、酵母菌中で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞培養物に本発明の補足物を加えることによって、植物細胞中で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞培養物に本発明の補足物を加えることによって、昆虫細胞中で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞培養物に本発明の補足物を加えることによって、哺乳動物細胞中で生成された組み換えタンパク質の収量と質を改善する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養系の生成段階の収量を増加させて、それによって、細胞培養系の生成段階の前、または、その最中に、細胞培養系に本発明の補足物を加えることによって、バイオリアクターの生産性を増加させる方法を提供する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約１０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約２０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約３０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約４０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約５０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約６０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約７０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約８０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約９０％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約１００％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約２００％増加する。この方法の１つの態様では、生成段階の収量は約５００％増加する。
別の実施形態では、本発明は、対象タンパク質を発現する細胞への本発明の補足物の追加を含む、タンパク質の生成のための正常な成長条件と比較して高い温度で対象タンパク質を生成する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養発現系への本発明の補足物の追加を含む、対象の凝集しやすいタンパク質による細胞培養発現系で形成された凝集物の量を減らす方法を提供し、それによってタンパク質の凝集状態は低下する。
別の実施形態では、本発明は、細胞への本発明の補足物の追加を含む、組み換えタンパク質の変性と凝集を防ぐことによる、細胞によって発現される対象タンパク質のタンパク質の活性を増加させる方法を提供し、それによって対象タンパク質の特異的な活性が増加する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養発現系への本発明の補足物の追加を含む、凝集しやすい、沈殿を生じさせやすい、またはそれ自体が細胞にとって有毒である細胞培養発現系のタンパク質の発現を改善する方法を提供し、それによって、対象タンパク質の発現は増加する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養発現系への本発明の補足物の追加を含む、グリコシル化されたタンパク質のグリコシル化パターンを改善する方法を提供し、それによって、グリコシル化の程度は増加し、および／または、得られるグリコシル化のパターンは、ヒトのようになる。
これらの方法のいずれかで加えられる補足物の量は、様々な因子、例えば、宿主細胞の型、細胞密度、対象タンパク質の、および、培養条件などに依存するであろう。培地に加えられる補足物の所望の濃度を測定することは、当該技術の範囲内であり、通常の最適化によって、および、余分な実験を行うことなく、実験的に確認することができる。
熟練した技術者は、異なる細胞型が本発明の補足物に対して異なる反応の程度を有するということ、および、これは、補足物中のＨＳＰの量または型によって、ある程度は決定されるということを容易に理解するであろう。さらに、細胞の異なる密度は、細胞の数の増加を説明するために培養物に加えられたＨＳＰの濃度と同様に、補足物の総量の適切な調節を必要とするであろう。さらに、懸濁培養液中で、または、付着培養物を介して成長させた細胞は、（熱ショックタンパク質）ＨＳＰの侵入に利用可能な異なる膜表面領域を有し、異なる反応の速度および程度を示すのが一般的である。それゆえ、アポトーシスの十分な阻害、または、生存率の上昇または細胞の純成長を提供する濃度を選ばなければならない。典型的には、本発明の補足物は、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、または、約５０％Ｗｔ／ｗｔ、または、ｗｔ／体積の最終濃度まで加えられる。
典型的には、超えてしまうと細胞の生存のさらなる増加が起こらない、補足物の濃度の上限があるのが一般的である。以下の実施例に記載されているように、出願人は、本発明の補足物が、約２００ｍｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌまで、または、さらに好ましくは、約２００ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌまで、さらにより好ましくは、約２５０から約５００ｍｇ／Ｌまでの濃度で細胞培養物に加えられると、アポトーシスを阻害することができるということを発見した。
（ＩＩ．補足物）
１つの態様において、本発明の補足物は、１つ以上の植物由来の組み換え細胞培養成分を含む。本発明の１つの実施形態では、１つ以上の組み換え細胞培養成分は、アルブミン、ラクトフェリン、または、その混合物から独立して選択される。
本発明の別の態様では、補足物は、トランスフェリン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、または、成長因子からなる群から選択された１以上の追加の因子を含んでいる。
本発明の別の態様では、成長因子は、インシュリン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１−２３、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子１＆２（ＫＧＦ）、および、白血病抑制因子（ＬＩＦ）から独立して選ばれる。
本発明の補足物の１つの態様では、組み換え細胞培養成分の少なくとも１つは、アルブミンである。別の態様では、アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含む。別の態様では、アルブミンは約１％未満の凝集アルブミンを含む。
本発明の補足物の１つの態様では、組み換え細胞培養成分は、アルブミンとラクトフェリンの混合物を含む。別の態様では、アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含む。別の態様では、アルブミンは約１％未満の凝集アルブミンを含む。
別の態様では、本発明の補足物は、組み換えアルブミンと、イネの熱ショックタンパク質を含む。別の態様では、本発明の補足物は、組み換えアルブミンおよびイネのｈｓｐ７０ホモログを含む。１つの態様では、イネのｈｓｐ７０ホモログは、ＨＳＰ７０、Ｂｉｐ、および、イネのストロマタンパク質（ｓｔｒｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を選んだ。
１つの実施形態では、本発明の補足物は、ｈｓｐの肯定的な影響をさもなければ遮蔽するか阻害する洗剤やエンドトキシンを本質的に含まない、同時精製された組み換えアルブミンおよびイネのｈｓｐｓの調製を含む。１つの態様では、本発明の補足物は、約１ＥＵ未満のエンドトキシンを有しており、前記アルブミンは少なくとも約９５％純度である。
これらの方法のいずれかにおいて、本発明の補足物は、水溶液中で、細胞培養成分を熱ショックタンパク質と同時精製または混合することによって、調製されてもよい。
用語「アルブミン」は、アルブミンのすべての自然発生形態および合成形態を指す。好ましくは、用語「アルブミン」は組み換えアルブミンを指す。１つの態様において、アルブミンは脊椎動物からのものである。１つの態様において、アルブミンは哺乳動物からのものである。さらなる実施形態では、アルブミンは、ヒトのものである。別の態様では、組み換えアルブミンは植物細胞から生成される。１つの特に好ましい実施形態では、組み換えアルブミンは、遺伝子組み換えイネ（オリザ・サティバ）（Ｏｒｙｚａ Ｓａｔｉｖａ）から生成される。代表的な種およびアルブミンの様々な種のための遺伝子バンクの受入番号は、表Ｄ１で以下に列挙される。
異なる種のアルブミンの組み換え型の生成について、問題の宿主生物体用の遺伝子の核酸配列をコドン最適化する必要が典型的にあることが理解される。このようなコドン最適化は、問題の宿主生物用の好ましいコドン利用の標準分析、及び標準のＤＮＡ合成を介する最適化されたヌクレイン酸の合成によって完了することができる。多くの会社は、サービスごとの個別支払方式のサービスなどを提供し、それは例えば、ＤＮＡ２．０及びＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．（ＣＡ，ＵＳＡ）を含む。
アルブミンは、その天然形態で、即ち、自然に現れるように対立遺伝子変異型として存在し得、これは、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。アルブミンの翻訳後修飾及び分解生成物を含む自然発生の化学修飾も、例えば、アルブミンの、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、還元化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。
天然又は合成のアルブミン配列のフラグメントはまた、それらが由来するペプチドの望ましい機能特性を有し得、本発明の任意の方法に使用され得る。したがって、本明細書に使用されるような用語「フラグメント」は、フラグメントが全体の分子の生物学的又は治療上有益な活性を保持する場合の、アルブミンのフラグメントを含む。
例えば、アルブミンは、銅、亜鉛、カドミウム及びニッケルを含む、多くの生理学的に重要な少なくとも２つの高い親和性を有する多金属結合部位を含む。（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５ １５３−２０３ （１９９４）； Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０ （１） ３３−３９ （１９９８）， Ｂｌｉｎｄａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４ （３４） ２３１１６−２４ （２００９）； ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，７８７，６３６）。痕跡量のこれらの金属がアルブミンの組み換え型の生成において典型的に存在するため、かなりの量のこれらの金属イオンは、タンパク質にキレート化され得る。組み換え型のアルブミンに対する、これらのイオンの結合、及び特にカドミウム及びニッケルの結合は、組織培養成分として細胞に加えられた際の、タンパク質の細胞の毒性に関係する。
したがって、１つの態様において、用語アルブミンは、アルブミンの多金属結合部位に関係する１つのアミノ酸又は複数のアミノ酸の欠失を含むアルブミンのフラグメントを包含し得る。１つの態様において、アルブミンのフラグメントは、成熟したタンパク質のＮ末端に１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失によって引き起こされる。別の態様において、アルブミンは、アルブミンのＮ末端金属結合部位に関係する任意のアミノ酸の１つ又はそれ以上の欠失又は変異を含み得る。１つの態様において、欠失又は変異されるアミノ酸は、配列５’ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ ３’（配列番号１）から独立して選択される。
したがって、本明細書に使用されるような用語「誘導体」は、天然の配列と比較した修飾を有する、アルブミン配列又はそのフラグメントを指す。このような修飾は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入及び／又は置換であり得る。これらは、近接してもよいしまたは近接しなくてもよい。代表的な変異体は、表Ｄ１に挙げられる任意の遺伝子と比較して、１〜２０、又はより好ましくは１〜１５、１〜１０、又は１〜５のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。置換されたアミノ酸は、任意のアミノ酸、特に周知の２０の従来のアミノ酸（Ａｌａ （Ａ）； Ｃｙｓ （Ｃ）； Ａｓｐ （Ｄ）； Ｇｌｕ （Ｅ）； Ｐｈｅ （Ｆ）； Ｇｌｙ （Ｇ）； Ｈｉｓ （Ｈ） ；Ｉｌｅ （Ｉ）； Ｌｙｓ （Ｋ）； Ｌｅｕ （Ｌ）； Ｍｅｔ （Ｍ）； Ａｓｎ （Ｎ）； Ｐｒｏ （Ｐ）； Ｇｉｎ （Ｑ）； Ａｒｇ （Ｒ）； Ｓｅｒ （Ｓ）； Ｔｈｒ （Ｔ）； Ｖａｌ （Ｖ）； Ｔｒｐ （Ｗ）；及びＴｙｒ （Ｙ））の１つであり得る。任意のこのようなアルブミンの変異体又は誘導体は、本発明の任意の方法に使用され得る。
従って、本発明のアルブミンは、アルブミンの任意の機能的な結合ドメインにおいてアミノ酸の欠失、挿入又は変異を含み得る。１つの態様において、アルブミンは、アルブミンの結合ドメインの変異を含み得る。１つの態様において、変異した結合ドメインは、米国特許第５，７８０，５９３号に概説されるような、アスピリン、ワルファリン、ジアゼパム、ジギトキシン、クロフィブラート（ｄｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、イブプロフェン又はＡＺＴの結合、又はＢｌｉｎｄａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８４ （３４） ２３１１６−２４ （２００９）において概説されるような多金属結合部位に関係するドメインである。
したがって、本発明の任意の方法に使用され得るアルブミンは、天然アルブミンのアミノ酸配列、例えば、表Ｄ１に挙げられる任意の天然アルブミンの遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、アルブミンは、表Ｄ１に挙げられるアルブミンとの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのアルブミンは、以下に強調して示されるように、成熟した分泌されたヒト血清アルブミン（配列番号２）と少なくとも８０％同一である（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０２７６８）：
他のタンパク質に対するアルブミンの融合タンパク質も含まれ、これらの融合タンパク質は、活性、ターゲッティング、安定性又は効能を高め得る。
アルブミンの活性又は生物学的な半減期を保持又は安定させる天然アルブミン構造の化学修飾はまた、本明細書に記載される任意の方法と共に使用され得る。このような化学修飾の方策は、限定されないが、ペグ化、グリコシル化、及びアシル化を含み（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．： Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３６）： ２１９６９−２１９７７， １９９６； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．： Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５４（４）： ４５９−４７６， （２００２）； Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．： Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｒｅｓ． ４６（３−４）： ２５３−２６４， （１９９５）； Ｇａｒｂｅｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ． ７ （６） ６６６−７４ （２００５）を参照）、Ｃ末端及びＮ末端の保護基及びペプチド模倣のユニットもまた含まれ得る。
天然のＬアミノ酸の異性体、例えば、Ｄ−アミノ酸は、アルブミンの任意の上記の形態に組み入れられ得、本発明の任意の方法に使用される。アルブミンのこのような変異体、誘導体、融合タンパク質、又はフラグメントが全て含まれ、本明細書の方法の請求項のいずれかに使用され得るか、又は開示され得、用語「アルブミン」のもと包含される。
用語「トランスフェリン」は、トランスフェリンのすべての自然発生及び合成の形態を指す。１つの態様において、用語「トランスフェリン」は、組み換え型のトランスフェリンを指す。１つの態様において、トランスフェリンは、脊椎動物からのものである。１つの態様において、トランスフェリンは、哺乳動物からのものである。さらなる実施形態において、トランスフェリンは、ヒトからのものである。別の態様において、組み換え型のトランスフェリンは、植物細胞から生成される。１つの特に好ましい実施形態において、組み換え型のトランスフェリンは、トランスジェニックイネ（イネ属）から生成される。様々な種のトランスフェリンに関する代表的な種及び遺伝子バンク受入番号は、表Ｄ２において以下に挙げられる。
トランスフェリンは、その天然形態で、即ち、自然に現れるように異なるａｐｏ形態、又は対立遺伝子変異型として存在し得、これは、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。トランスフェリンの翻訳後修飾及び分解生成物を含む自然発生の化学修飾も、例えば、トランスフェリンの、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、還元化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。
本発明の任意の方法に使用され得るトランスフェリンは、天然トランスフェリンのアミノ酸配列、例えば、表Ｄ２に挙げられる任意の天然トランスフェリンの遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、トランスフェリンは、表Ｄ２に挙げられるトランスフェリンとの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのトランスフェリンは、成熟したヒトトランスフェリンと少なくとも８０％同一である。
用語「グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ」は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼのすべての自然発生及び合成の形態を指す。１つの態様において、用語「グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ」は、組み換え型のグルタチオンＳト-ランスフェラーゼを指す。１つの態様において、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、脊椎動物からのものである。１つの態様において、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、哺乳動物からのものである。さらなる実施形態において、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、ヒトからのものである。別の態様において、組み換え型のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、植物細胞から生成される。１つの特に好ましい実施形態において、組み換え型のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、トランスジェニックイネ（イネ属）から生成される。様々な種のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼに関する代表的な種及び遺伝子バンク受入番号は、表Ｄ３において以下に挙げられる。
グルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、その天然形態で、即ち、自然に現れるように異なるａｐｏ形態、又は対立遺伝子変異型として存在し得、これは、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。グルタチオンＳ-トランスフェラーゼの翻訳後修飾及び分解生成物を含む自然発生の化学修飾も、例えば、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼの、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、還元化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。本発明の任意の方法に使用され得るグルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、天然のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼのアミノ酸配列、例えば、表Ｄ２に挙げられる任意の天然のグルタチオンＳ-トランスフェラーゼの遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、表Ｄ２に挙げられるグルタチオンＳ-トランスフェラーゼとの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼは、成熟したヒトのグルタチオンＳ-トランスフェラーゼと少なくとも８０％同一である。
用語「超過酸化物不均化酵素」は、超過酸化物不均化酵素のすべての自然発生及び合成の形態を指す。１つの態様において、用語「超過酸化物不均化酵素」は、組み換え型の超過酸化物不均化酵素を指す。１つの態様において、超過酸化物不均化酵素は、脊椎動物からのものである。１つの態様において、超過酸化物不均化酵素は、哺乳動物からのものである。さらなる実施形態において、超過酸化物不均化酵素は、ヒからのものである。別の態様において、組み換え型の超過酸化物不均化酵素は、植物細胞から生成される。１つの特に好ましい実施形態において、組み換え型の超過酸化物不均化酵素は、トランスジェニックイネ（イネ属）から生成される。様々な種の超過酸化物不均化酵素に関する代表的な種及び遺伝子バンク受入番号は、表Ｄ４において以下に挙げられる。
超過酸化物不均化酵素は、その天然形態で、即ち、自然に現れるように異なるａｐｏ形態、又は対立遺伝子変異型として存在し得、これは、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。超過酸化物不均化酵素の翻訳後修飾及び分解生成物を含む自然発生の化学修飾も、例えば、超過酸化物不均化酵素の、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、還元化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。本発明の任意の方法に使用され得る超過酸化物不均化酵素は、天然の超過酸化物不均化酵素のアミノ酸配列、例えば、表Ｄ４に挙げられる任意の天然の超過酸化物不均化酵素の遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、超過酸化物不均化酵素は、表Ｄ４に挙げられる超過酸化物不均化酵素との、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明の任意の方法に使用するための超過酸化物不均化酵素は、成熟したヒトの超過酸化物不均化酵素と少なくとも８０％同一である。
用語「ラクトフェリン」は、ラクトフェリンのすべての自然発生及び合成の形態を指す。１つの態様において、用語「ラクトフェリン」は、組み換え型のラクトフェリンを指す。１つの態様において、ラクトフェリンは、脊椎動物からのものである。１つの態様において、ラクトフェリンは、哺乳動物からのものである。さらなる実施形態において、ラクトフェリンは、ヒトからのものである。別の態様において、組み換え型のラクトフェリンは、植物細胞から生成される。１つの特に好ましい実施形態において、組み換え型のラクトフェリンは、トランスジェニックイネ（イネ属）から生成される。様々な種のラクトフェリンに関する代表的な種及び遺伝子バンク受入番号は、表Ｄ５において以下に挙げられる。
ラクトフェリンは、その天然形態で、即ち、自然に現れるように異なるａｐｏ形態、又は対立遺伝子変異型として存在し得、これは、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。ラクトフェリンの翻訳後修飾及び分解生成物を含む自然発生の化学修飾も、例えば、ラクトフェリンの、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、還元化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。本発明の任意の方法に使用され得るラクトフェリンは、天然のラクトフェリンのアミノ酸配列、例えば、表Ｄ５に挙げられる任意の天然のラクトフェリンの遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、ラクトフェリンは、表Ｄ５に挙げられるラクトフェリンとの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのラクトフェリンは、成熟したヒトのラクトフェリンと少なくとも８０％同一である。
１つの態様において、本発明の補足は、分離した細胞培養成分を、水溶液中の１つ又はそれ以上の熱ショックタンパク質の精製した、又は半精製した調製物と混合することによって調製され得る。このような熱ショックタンパク質は、細胞培養成分対ｈｓｐが、約１：１、約１：１０、約１：２０ごろ、約１：５０、約１：１００、約１：２００、約１：５００、約１：１０００、又は約１：１０，０００のモル比で典型的に混合される。１つの態様において、細胞培養成分と１つ又はそれ以上の熱ショックタンパク質の混合物は、数分から一晩の範囲の間、約４℃から２５℃で水性緩衝液中に一緒にインキュベートされ得る。別の態様において、細胞培養成分と１つ又はそれ以上の熱ショックタンパク質の混合物は、数分から一晩の範囲の間、約２０℃から３７℃で水性緩衝液中に一緒にインキュベートされ得る。１つの態様において、細胞培養成分とｈｓｐがＡＴＰがある状態で混合され得ることで、ｈｓｐは、細胞培養成分に結合するＡＴＰ依存性の構造を受けることができる。これらの方法のいずれか１つの態様において、水性緩衝液は、約７．５に対して約６．５のｐＨを有する。これらの方法のいずれかの別の態様において、水性緩衝液は、リン酸塩、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、及び酢酸塩から選択される緩衝液を含む。これらの方法のいずれか１つの態様において、細胞培養成分と熱ショッククタンパク質の複合体は分離される。
請求される方法のいずれか１つの態様において、細胞培養成分はアルブミンである。請求される方法のいずれか１つの態様において、細胞培養成分はラクトフェリンである。請求される方法のいずれか１つの態様において、細胞培養成分はトランスフェリンである。請求される方法のいずれか１つの態様にいて、細胞培養成分はヒト成長因子である。
細胞培養成分に対しておよそ０．０１ｗｔ／ｗｔ％から０．５ｗｔ／ｗｔ％のｈｓｐを含有する比率を得るために、既知濃度の液体も、１つの構成部分Ａ（アルブミン又は別の細胞培養成分）を含んで、構成成分Ｂ（熱ショックタンパク質など）を含む液体に組み合わされ得る。細胞培養成分に対して０．０１〜０．０５％のＨｓｐでＨｓｐの乾重量に基づいた比率を得るために、粉砕されたか、凍結乾燥されたか、又はそうでなければ乾燥された粉末（Ｈｓｐ）は、細胞培養成分を含む水溶液に直接加えられ得る。重量測定に完全に基づく比率を得るために、粉砕されたか、凍結乾燥されたか、又はそうでなければ乾燥されたＨｓｐはまた、重量対重量の方式で細胞培養成分の粉末と混合され得る。結果として生じる粉末は、当該技術分野に共通の適切な緩衝液中に、非常に低い濃度（ピコモル）から非常に高い濃度（ミリモル）までの範囲の濃度で溶解され得、細胞培養成分／ｈｓｐの複合体を再構成する。
１つの態様において、従って、本発明の補足は、アルブミン及び１つ又はそれ以上の熱ショックタンパク質を含む。このような補足は、無菌の液体又は粉末形態として一般に調製される。組成物中のｈｓｐの合計の量は、細胞培養成分の重量の１％〜０．００１％の間で変化し得る。他の態様において、組成物中のｈｓｐの量は、約０．０１％から約０．０２％まで、又は約０．０１％〜約０．０９％、又は約０．０２％〜約０．０４％、又は約０．０２％〜約０．０６％、又は約０．０２％〜約０．０８％の間で変化し得る。別の態様において、組成物中のｈｓｐの量は、細胞培養成分に対して、約０．０２％より多い、又はより好ましくは、約０．０３％より多い、又はより好ましくは、約０．０４ｗｔ／ｗｔ％より多い、又はより好ましくは、約０．０５ｗｔ／ｗｔ％のｈｓｐより多い。
請求される補足のいずれか１つの態様において、補足は、エンドトキシン及び界面活性剤が実質的にない。別の態様において、補足は、約１ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを有する。また別の態様において、補足は、約１０ｐｐｍ未満の界面活性剤を含む。請求される補足のいずれかの別の態様において、細胞培養成分は、９５％より高い純度を有する。
請求される補足のいずれかの別の態様において、補足は、イネの熱ショックタンパク質に結合される組み換え型のアルブミンを含み、その複合体は、約１ＥＵ未満のエンドトキシンを有し、少なくとも９５％の純粋である。１つの態様において、組み換え型のアルブミンは、イネにおいて生成される。
これらの方法のいずれかの別の態様において、補足は、細胞培養成分としてアルブミンを含み、アルブミンは凝集アルブミンが本質的にない。これらの補足のいずれかの別の態様において、アルブミンは、約２％未満の凝集アルブミンを有する。
（ＩＩＩ．典型的な熱ショックタンパク質）
用語「熱ショックタンパク質」、「ＨＳＰ」又は「ｈｓｐ」は、本明細書に使用されるように、抗アポトーシス活性を保持する、熱ショックタンパク質スーパーファミリーのすべての自然発生及び合成の形態を含む。このような熱ショックタンパク質は、小さな熱ショックタンパク質／ＨＳＰＢファミリー、Ｈｓｐ４０／ＤｎａＪファミリー、ＨＳＰ７０／ＨＳＰＡファミリー、ＨＳＰ９０／ＨＳＰＣファミリー、ＨＳＰ１１０／ＨＳＰＨファミリー及びシャペロン（ｃｈａｐｅｒｅｒｏｎｅ）ファミリーの他に、これらに由来する、ペプチドフラグメント及び２つ又はそれ以上の熱ショックタンパク質又はヌクレオチド交換因子のタンパク質複合体（例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ４０の複合体）を含む。
大多数の異なる種からの熱ショック遺伝子が配列決定されており、少なくとも部分的に機能して交換可能であることが当該技術分野に公知である。したがって、イネの熱ショックタンパク質よりも、ファミリー又は種又は遺伝子からの熱ショックタンパク質である変異体を選択することがルーチンのことでなる。熱ショックタンパク質のいくつかのこのような変異体（すなわち代表的な熱ショックタンパク質）は、表Ｄ６〜Ｄ８に示される。
熱ショックタンパク質は、熱及び他のストレスに適応することが必要なストレス応答タンパク質であると元々認識された。その直後、すべてのＨＳＰファミリーはまた、ＨＳＰ７０ファミリーにおけるＨｓｃ７０（ＨＳＰＡ８）のような構成的に発現されたメンバーをコード化することが明らかとなった。最も広範囲に研究されてきた熱ショック遺伝子（及びそれらがコード化するタンパク質ファミリー）は、ＨＳＰ７０ｉ（ＨＳＰＡ１Ａ／Ｂ）、ＨＳＰ４０（ＤＮＡＪＢ１）およびＨＳＰ２７（ＨＳＰＢ１）などのように熱誘導可能な遺伝子である。熱ショックタンパク質は、１つ種類として、すべての種の中で最も高度に発現された細胞タンパク質である。それらの名称が意味するように、熱ショックタンパク質は、高温によってストレスにさらされた時の細胞を保護する。それらは、ストレスにさらされていない細胞中の合計タンパク質の１〜２％を占める。しかしながら、細胞が加熱されるとき、熱ショックタンパク質の割合は、細胞タンパク質の約４〜６％まで増加する。
多様なＨＳＰファミリーに関してコード化する遺伝子の数は、異なる生物体において広く変化する。例えば、ＨＳＰＡ（ＨＳＰ７０）ファミリーでは、メンバーの数は、大腸菌における３からヒトにおける１３まで変化する。進化中の遺伝子複製は、異なる細胞内区画での更なるメンバーの必要性の他に、組織に特異的な発現又は発達上の発現の必要性も恐らく満たした。その上、遺伝子複製は、クライアントの特異性及び／又は処理（ｃｌｉｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ／ｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）に機能的な多様性を与える。
真核生物、原核生物、脊椎動物、無脊椎動物、及び他の植物と同様に他の種からの熱ショックタンパク質のすべてのこのような相同体、オルソログ、及び自然発生のアイソフォームは、検知可能な抗アポトーシスの活性を保持する限り、本発明の任意の方法に含まれる。
ヒトゲノムのアノテーション以来、文献中でＨｓｐファミリーに関して使用される名称は、無秩序になっており、１０までの異なる名称が同じ遺伝子産物に見られ得る。以下の表に使用される呼称は、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＨＧＮＣ）によって与えられ、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ及びＥｎｓｅｍｂｌｅなどのデータベース中の基本識別子として使用される系統的な遺伝子記号に基づく。
（Ｋａｍｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ７ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ １４ １０５−１１１ （２００９））。
ヒトゲノムは、多くの偽遺伝子を除く、ＨＳＰＡファミリーの１３のメンバー（表Ｄ６）をコード化する。最も研究された遺伝子は、ＨＳＰＡ１Ａ及びＨＳＰＡ１Ｂであり、それらの産物は、２つのアミノ酸によって異なるだけであり、十分に交換可能なタンパク質であると考えられる。ＨＳＰＡ６と共に、これらは最も熱誘導可能なファミリーメンバーである。ＨＳＰＡ７は、長く偽遺伝子であると考えられてきたが、最近の分析は、それがＨＳＰＡ６に対して高度に相同性がある本当の遺伝子かもしれないことを示唆する。ＨＳＰＡ８は、同系統のＨＳＰＡであり、Ｈｓｃ７０（又はＨＳＰ７３）として以前に指定された。それは不可欠な「ハウスキーピング」ＨＳＰＡメンバーであり、細胞内膜にわたる共翻訳的フォールディング及びタンパク質移行に関係する。ＨＳＰＡ１Ｌ及びＨＳＰＡ２は、精巣中の高い発現を有する２つの細胞基質のファミリーである。ＨＳＰＡ９は、ミトコンドリアのハウスキーピングＨＳＰＡメンバーである（ＨＳＰＡ９は、モルタリン／ｍｔＨＳＰ７０／ＧＲＰ７５／ＰＢＰ７４としても知られている）。
Ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーは、熱ストレスと有毒化学物質、特にヒ素、カドミウム、銅、水銀などの重金属によって、強力にアップレギュレートされる。Ｈｓｐ７０は、研究員がショウジョウバエ（ミバエ）のインキュベーション温度を偶然に押し上げた１９６０年代に、ＦＭ Ｒｉｔｏｓｓａによって元々発見された。染色体を検査した時、Ｒｉｔｏｓｓａは、１つの、未知のタンパク質の高い遺伝子転写を示す「パフパターン（ｐｕｆｆｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ）」を発見した。これはその後「熱ショック応答」と記載された。
Ｈｓｐ７０タンパク質は、新しいタンパク質のフォールディングを誘導することに重要な役割を果たし、タンパク質の完全性を改善し、部分的に折りたたんだ状態でそれらを安定させることにより、タンパク質の膜透過輸送も助ける。全体的なタンパク質の完全性を改善することに加えて、Ｈｓｐ７０はまた、直接アポトーシスを阻害し、損傷を受けた又は不完全なタンパク質の認識及び処分に関係する。
タンパク質フォールディングを高めるＨｓｐ７０の中心的な役割と共に、Ｈｓｐ７０の発現はまた、低温保存及びバイオ処理などの日常的な組織培養処理の間に熱ストレス又は酸化ストレスから細胞を保護するために作用し得る。これらのストレスは、タンパク質を破損するために通常作用し、部分的なアンフォールディングを引き起こし、凝集を引き起こす可能性もある。ストレスによって曝露した疎水性の残留物に一時的に結合することによって、Ｈｓｐ７０は、これらの部分的に変性したタンパク質が凝集するのを防ぎ、それらがリフォールディングすることを可能にする。熱ショックの特性である低いＡＴＰは、ＨＳＰ７０の持続した結合をさらに強化し、凝集を抑えるＨＳＰの能力を高めるためにさらに作用する。好熱性の嫌気性生物（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）において、Ｈｓｐ７０は、モデルペプチドへの酸化還元感受性の結合を実証し、これは、酸化ストレスに基づいた結合調節の第２様式を示している。
Ｈｓｐ７０はまた、カスパーゼ３の活性化につながるカスパーゼ−９の動員を遮断することによって、アポトーシスを阻害し、ＣＨＩＰ（Ｈｓｐ７０ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎのカルボキシル末端）−Ｅ３ ユビキチンリガーゼとの相互作用によって、損傷を受けた又は不完全なタンパク質の処分に関係することができるようである。
それ故、Ｈｓｐ７０タンパク質は、タンパク質に対する損傷を防ぐだけでなく、ストレスの多い条件下でプログラム細胞死を直接防ぐためにも作用する。ヒトゲノムはまた、Ｎ末端ＡＴＰアーゼドメインとＣ末端ペプチド結合ドメインの間のより長いリンカードメインの存在を除いて、ＨＳＰＡメンバーに対する高い相同性を有するＨＳＰのファミリーをコード化する、４つのＨＳＰ１１０（ＨＳＰＨ；表Ｄ７）遺伝子をコード化する。事実、２つのメンバー、ＨＳＰＡ４（ＨＳＰＨ２）及びＨＳＰＡ４Ｌ（ＨＳＰＨ３）は、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅのデータベースにおいてＨＳＰＡメンバーとして以前に命名された。３つの細胞基質のメンバーに加えて、１つのコンパートメントに特異的なＨＳＰＨメンバー（ＨＹＯＵ１／Ｇｒｐ１７０）が、ＥＲ，（ＨＳＰＨ４）に存在する。最近の証拠から、ＨＳＰＨメンバーがＨＳＰＡファミリーに対するヌクレオチド交換因子であることが示される。
請求項のいずれか１つの実施形態において、本発明の補足は、小さな熱ショックタンパク質ファミリーから選択されたＨｓｐを含む。別の態様において、Ｈｓｐは、ＨＳＰ４０／ＤｎａＪファミリーメンバーから選択される。別の態様において、Ｈｓｐは、ＨＳＰ７０ファミリーメンバーから選択される。別の態様において、Ｈｓｐは、ＨＳＰ９０ファミリーメンバーから選択される。別の態様において、Ｈｓｐは、ＨＳＰ１１０ファミリーメンバーから選択される。別の態様において、Ｈｓｐは、シャペロンファミリーメンバーから選択される。
請求項のいずれか１つの態様において、本発明の補足は、哺乳動物、昆虫、酵母又は植物細胞に由来するＨｓｐスーパーファミリーメンバーを含む。別の態様において、Ｈｓｐスーパーファミリーメンバーは、植物細胞に由来する。また別の実施形態において、ＨＳＰスーパーファミリーメンバーは、イネ（イネ属）に由来する。
これらの請求項のいずれか１つの態様において、本発明の補足は、１つ又はそれ以上の他のタンパク質とのタンパク質複合体において存在するｈｓｐスーパーファミリーメンバーを含む。１つの態様において、ＨＳＰスーパーファミリーメンバーは、ヌクレオチド交換因子の別のＨｓｐスーパーファミリーメンバーと複合される。これらの請求項のいずれかの別の態様において、Ｈｓｐスーパーファミリーメンバーは、アルブミンに結合される。
１つの実施形態において、本発明の補足は、ＨＳＰ７０ファミリーメンバーを含む。１つの態様において、ＨＳＰ７０ファミリーメンバーは、ＨＳＰＡ１Ａ（ＨＳＰ７２）、ＨＳＰＡ８（Ｈｓｃ７２）及びＨＳＰＡ９（Ｇｒｐ７８）から選択される。請求項のいずれか１つの態様において、ＨＳＰスーパーファミリーメンバーは、哺乳動物、昆虫、酵母又は植物細胞に由来する。好ましい態様において、ＨＳＰスーパーファミリーメンバーは、植物細胞に由来する。１つの特に好ましい実施形態において、ＨＳＰスーパーファミリーメンバーは、イネ（イネ属）に由来する。
請求項のいずれか１つの態様において、本発明の補足は、表Ｄ８からの配列から選択されるＨＳＰ７０ファミリーメンバーを含む。
熱ショックタンパク質は、その天然形態で、即ち、機能的に同等な変異体として見られ得る異なる種において自然に現れるように、異なる変異体として存在し得、又はそれらは、その機能的に同等な天然の誘導体であり得、例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方からの）又は他のアミノ酸の欠失、付加、挿入、置換、又は翻訳後修飾によって、それらのアミノ酸配列が変更し得る。Ｈｓｐの翻訳後修飾及び分解生成物を含む、自然発生の化学的誘導体も、例えば、Ｈｓｐの、ピログルタミル、イソアスパルチル、タンパク質分解性、リン酸化、グリコシル化、酸化、異性化、及び脱アミノ化の変異体を含む、本発明の任意の方法に明確に含まれる。
タンパク質又はペプチドの配列を、それらの有用な活性を保持しつつ、合成的に修飾することは当業者に公知であり、これは、当該技術分野において標準であり、文献に広く記載される技術、例えば、核酸のランダムな又は部位特異的な変異誘発、開裂、ライゲーションを使用して、又はアミノ酸またはポリペプチド鎖の化学合成または修飾を介して達成され得る。
したがって、本明細書に使用されるような用語「誘導体」は、天然の配列と比較した修飾を有する、ＨＳＰ配列又はそのフラグメントを指す。このような修飾は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入及び／又は置換であり得る。これらは、近接してもよいしまたは近接しなくてもよい。代表的な変異体は、表Ｄ６からＤ８に挙げられる任意の遺伝子と比較して、１〜１００、又はより好ましくは１〜５０、１〜２５、又は１〜１０のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。置換されたアミノ酸は、任意のアミノ酸、特に周知の２０の従来のアミノ酸（Ａｌａ （Ａ）； Ｃｙｓ （Ｃ）； Ａｓｐ （Ｄ）； Ｇｌｕ （Ｅ）； Ｐｈｅ （Ｆ）； Ｇｌｙ （Ｇ）； Ｈｉｓ （Ｈ） ；Ｉｌｅ （Ｉ）； Ｌｙｓ （Ｋ）； Ｌｅｕ （Ｌ）； Ｍｅｔ （Ｍ）； Ａｓｎ （Ｎ）； Ｐｒｏ （Ｐ）； Ｇｉｎ （Ｑ）； Ａｒｇ （Ｒ）； Ｓｅｒ （Ｓ）； Ｔｈｒ （Ｔ）； Ｖａｌ （Ｖ）； Ｔｒｐ （Ｗ）；及びＴｙｒ （Ｙ））の１つであり得る。任意のこのようなＨＳＰの変異体又は誘導体は、本発明の任意の方法に使用され得る。
したがって、本発明の任意の方法に使用され得るＨｓｐは、天然のＨＳＰアミノ酸配列、例えば、表Ｄ６からＤ８に挙げられる任意の天然のＨＳＰ遺伝子配列に対して、本質的に相同性があるか、又は本質的に類似したアミノ酸配列を有し得る。あるいは、ＨＳＰは、表Ｄ６からＤ８に示される遺伝子のいずれか１つのアミノ酸配列順序との、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。１つの実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのＨＳＰは、表Ｄ６から選択される配列と少なくとも８０％同一である。別の実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのＨＳＰは、表Ｄ６からＤ８から選択される配列と少なくとも８０％同一である。別の実施形態において、本発明の任意の方法に使用するためのＨＳＰは、表Ｄ８から選択されるＨｓｐａ８遺伝子と少なくとも８０％同一である。
他のタンパク質に対するＨＳＰの融合タンパク質も含まれ、これらの融合タンパク質は、ＨＳＰの生物学的活性、ターゲッティング、生物学的生命（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｆｅ）又は安定性を高め得る。
ＨＳＰの活性又は生物学的な半減期を保持又は安定させる天然のＨＳＰ構造の化学修飾はまた、本明細書に記載される任意の方法と共に使用され得る。このような化学修飾の方策は、限定されないが、ペグ化、グリコシル化、及びアシル化を含み（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．： Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３６）： ２１９６９−２１９７７， １９９６； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．： Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ． Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５４（４）： ４５９−４７６， （２００２）； Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．： Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｒｅｓ． ４６（３−４）： ２５３−２６４， （１９９５）； Ｇａｒｂｅｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ． Ｍｅｔａｂ． ７ （６） ６６６−７４ （２００５）を参照）、Ｃ末端及びＮ末端の保護基及びペプチド模倣のユニットもまた含まれ得る。
天然のＬアミノ酸の異性体、例えば、Ｄ−アミノ酸は、ＨＳＰの任意の上記の形態に組み入れられ得、本発明の任意の方法に使用される。さらなる変異体は、単一または複数のアミノ酸の配列間（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｃｅ）挿入のみでなく、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合も含み得る。より長いペプチドは、ＨＳＰペプチド配列の１又はそれ以上の複数コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｉｅｓ）を含み得る。挿入アミノ酸配列の変異体は、１又はそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質の１つの部位で導入された変異体である。
天然又は合成のＨＳＰ配列のフラグメントはまた、それらが由来するペプチドの望ましい機能特性を有し得、本発明の任意の方法に使用され得る。したがって、本明細書に使用されるような用語「フラグメント」は、フラグメントが全体の分子の生物学的又は治療上有益な活性を保持する場合の、ＨＳＰのフラグメントを含む。欠失変異体は、配列から１又はそれ以上のアミノ酸の除去によって特徴づけられる。例えば、変異体はまた、自然に、例えば他の種において現れるように、又は地理的変異に起因した、異なる対立遺伝子の変異体を含み得る。ＨＳＰのそのような変異体、誘導体、融合タンパク質、又はフラグメントはすべて、本明細書に開示される方法の請求項のいずれかに使用され得、用語「熱ショックタンパク質」又は「ｈｓｐ」のもと包含される。
変異体、誘導体、及びフラグメントは、それらが検知可能な抗アポトーシス活性がある点で機能的に同等である。より具体的には、それらは、ＨＳＰ７０、特にイネＨＳＰ７０の活性の、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％を示す。したがって、それらは、アルブミンにより同時投与された時、抗アポトーシス薬剤として機能することができ、即ち、ＨＳＰ７０自体に取って代わることができる。
このような活性は、インビボ又はインビトロのテストシステムに示される生理反応であろうと、又は例えば、酵素アッセイ、細胞増殖アッセイにおいて、又はストレスがある状態での細胞の生存率に対するｈｓｐの効果を検査することによる、天然のＨＳＰによって媒介された任意の生物活性又は反応であろうと、天然のイネＨＳＰによって示されるあらゆる活性を意味する。
したがって、血清を含まない又は低血清を含む培地に、あるいは自然においてアポトーシス性又は毒性である成分を含む培地に調整され得る、培養中で成長した任意の細胞に適用可能な細胞の生存率及びアポトーシスを決定するために、ＨＳＰの活性は、任意の以前に開示された方法を使用して容易に評価され得る。
さらに、成長速度は、細胞の定数を多重プレートに平板培養することによって、低血清又は無血清の状態で成長するように調整された使用して、決定され得る。細胞は、利用される細胞、及び組織培養プレートに依存して、異なる密度で播種され得る。例えば、無血清の状態に調整されたハイブリドーマ細胞は、１ｍＬの培地につき０．５×１０５の細胞の初期密度で播種され得る。典型的に、細胞は最初に３回洗浄され、アルブミン、候補ｈｓｐ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、超過酸化物不均化酵素、又はトランスフェリンなどの、培養中の成長を支持するのに必要な特定の成分が、１０部分（ｐａｒｔｓ）の液体培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏｓ）当たり約１部分までのリン酸塩緩衝食塩水中の所望濃度に加えられる。３７℃及び５％のＣＯ２の成長期の終わりに、細胞は生存率が数えられる。二重標識染色は、生存可能な細胞と生存不可能な細胞の混合物における生存率を測定するための好ましい方法である。細胞の総数に対して生細胞の数を測定する好ましい方法（パーセント生存率）は、当該技術分野に共通の、細胞を数える装置を使用することである。利用され得る他の方法は、二重標識フローサイトメトリー、あるいは顕微鏡を利用し、トリパンブルーで染色された細胞の手集計、及び細胞を数えるデバイスを含む。実験サンプルの生存率及び細胞数は、陰性対照、実験因子を除いた培地成分、及び陽性対照（ウシ胎児血清又は成分を支持する他の既知の細胞培養）と比較される。一般に、計算の統計的有意差は、反復試験サンプルの信号対雑音比の他に、陽性対照及び陰性対照と比較した、観察される違い又は違いの欠如にも基づいて測定されなければならない。当業者にとって、無血清の成長を可能にする安定した細胞プラットフォームが確立されなければならないことを考慮して、対照に対する生存率の２０％の変化は、反復試験サンプルに対する信号対雑音比を提供し、およそ９５％の信頼度で有意差を有すると考えられる。
潜在的な因子のパフォーマンスも、内因性の又は故意に発現されたタンパク質の生成を含む生産性の指標に従って測定され得るか、あるいはアポトーシスの指標に応じて測定され得る。アポトーシスアッセイは、多数あり、ＤＮＡ断片化及び核分解などの細胞の上流の変化に依存する。下流のアッセイは、カスパーゼ３のようなアポトーシス経路成分などの活性の測定に依存する。以前の方法で調整されるような培養細胞もまた、細胞培養に成分を加える効果を測定する市販のアポトーシスアッセイによってアッセイされ得る。
（ＩＶ．組織成分の生成）
本発明の補足に使用されるアルブミン及び他のタンパク質因子は、任意の適切な方法、例えば、自然発生のソースから、発現系を含む遺伝的に操作された宿主細胞からの分離によって（以下を参照）、又は、例えば、自動化したペピチド合成機、又はそのような方法の任意の組み合わせを使用した化学合成によって調整され得る。このようなポリペプチドを調製するための手段は、当該技術分野においてよく理解される。
組み換え型の生成に関して、宿主細胞は、培養成分及び／又は対象のｈｓｐをコード化するヌクレイン酸を組み込むために、遺伝子的に操作され得る。典型的に、ヌクレイン酸は、選択の発現系において高レベルの発現のためにコドン最適化され、発現ベクターへ組み込まれることで、宿主細胞において対象のタンパク質の発現が可能となる。ベクターは、環状の二本鎖のＤＮＡとして存在し得、数キロベース（ｋｂ）から何百ものｋｂのサイズの範囲になり得る。ポリヌクレオチド配列のクローニングおよび組み換え型の操作を促進するために、好ましいクローニングベクターは、自然発生のプラスミドから修飾されてきた。多くのこのようなベクターは、当該技術分野に周知であり、市販で入手可能である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ （Ｉｎ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９））， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｉｎ： Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｖｏｌ． ３， Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ｐｐ． ５６３−６０８（１９８０）を参照。
１つの態様において、発現ベクターは、宿主細胞中の培養成分の発現を増加させるために使用され、一方で、宿主細胞の内因性の熱ショックタンパク質の発現は、宿主細胞遺伝子の発現を活性化することで達成される。別の態様において、発現ベクターは、熱ショックタンパク質の発現を増加させるために使用される。別の態様において、発現ベクターは、熱ショックタンパク質及び細胞培養成分の発現を増加させるために使用される。別の態様において、熱ショックタンパク質及び細胞培養成分をコード化する核酸配列は、同じ発現ベクターに位置する。
発現ベクターは、プラスミド、エピソーム、コスミドレトロウイルス又はファージを含み；発現ベクターは、細胞培養成分又はｈｓｐをコード化するＤＮＡ配列を発現するために使用され得、１つの態様において、発現調節配列のアセンブリを含む。プロモーター及び他の規定上の成分の選択は、意図した宿主細胞に従って変更することができ、多くのこのような成分は、市販で入手可能であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， （ＣＡ， ＵＳＡ）からのＧａｔｅｗａｙシステムなど、分離された成分から容易に集めることができる。ｈｓｐｓ又は組織培養成分のための発現系は、安定した又は一時的な発現系であり得る。
これらの方法のいずれか１つの態様において、ｈｓｐ発現は誘導可能であり得、別の態様において、ｈｓｐ発現は構成的であり得る。ｈｓｐｓのための誘導可能な発現系は、アルブミンのための発現ベクターに含まれ得、又は別々の発現系又は発現ベクターに含まれ得る。
これらの方法のいずれか１つの態様において、細胞培養成分の発現は誘導可能であり得、別の態様において、ｈｓｐ発現は構成的であり得る。組織培養成分のための誘導可能な発現系は、ｈｓｐのための発現ベクターに含まれ得、又は別々の発現系又は発現ベクターに含まれ得る。
植物細胞からタンパク質を生成するための一般的及び具体的な技術は、以下の特許及び出願から得ら得、それらの各々は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる：
米国特許出願公開番号２００３／０１７２４０３（”Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”）；米国特許第６，９９１，８２４号（”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ”）；米国特許出願公開番号２００３／０２２１２２３（”Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ Ｓｅｅｄｓ”）；米国特許出願公開番号２００４−００７８８５１ （”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ Ｓｅｅｄｓ”）；米国特許出願公開番号２００４／００６３６１７（”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”）；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１０８３（”Ｈｉｇｈ− ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｅｅｄｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｅｅｄ− Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ”）。植物細胞からタンパク質を生成するための他の一般的及び具体的な技術は、例えば、以下の文献から得られ得、それらの各々は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる：米国特許第５，６９３，５０７号、米国特許第５，９３２，４７９号、米国特許第６，６４２，０５３号、及び米国特許第６，６８０，４２６号（各々の発明の名称「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ」）；米国特許出願公開番号２００５／００６６３８４（”Ｓｉｔｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”）；米国特許出願公開番号２００５／０２２１３２３（”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｒａｎｓ−Ｓｐｌｉｃｉｎｇ”）；米国特許出願公開番号２００６／００２６７１８（”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”）；米国特許出願公開番号２００６／００７５５２４（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ａ Ｍｕｌｔｉ− Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｏｒｇａｎｉｓｍ”）；
Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｔ．， Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． （２００５） ２３（６）： ７１８−７２３。
代表的な市販で入手可能なウイルス発現ベクターは、限定されないが、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から利用可能なＰｅｒ．Ｃ６システムなどのアデノウイルスベースの系、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＬＰ１などのレンチウイルスベースの系、及びタバコモザイクウイルスなどのレトロウイルスベクターを含む（Ｌｉｎｄｂｏ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００７） ７ ５２−５８）。
エピゾームの発現ベクターは、宿主細胞において複製することができ、適切な選択圧がある状態で、宿主細胞内の染色体外エピソームのとして存続する。（例えば、Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１： １７３５−１７４２ （２００４）を参照）。代表的な市販のエピゾームの発現ベクターは、限定されないが、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＢＮＡ１）及びｔｈｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）の複製開始点（ｏｒｉＰ）を利用するエピゾームのプラスミドを含み、具体的な例は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７を含む。ＥＢＶベースのベクターの宿主領域は、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２（ＥＰＢ２ （Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ． Ｊ． ２０： ２２２−２３０ （２００１））、の同時発現を介して実質的に任意の真核細胞型にまで増加され得、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのベクターｐｃＤＮＡ３．１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１及びｏｒｉＰの代わりにＴ抗原及びＳＶ４０の複製開始点を使用するエピゾームのベクターの限定しない例を表わす。
統合する発現ベクターは、宿主細胞のＤＮＡへ無作為に統合することができるか、又は組み換え部位を含むことができ、それによって、発現ベクターと宿主細胞染色体の間の特異的な組み換えが可能となる。このような統合する発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性の発現調節配列を利用することができ、所望されるタンパク質の発現が達成される。部位に特異的な方法で統合するベクターの例は、例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６Ｃｏｒｅ Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見られるような、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（例えばｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）からのｆｌｐ−ｉｎシステム、又はｃｒｅ−ｌｏｘシステムの成分を含む。無作為な方法で宿主細胞染色体へ統合するベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの（Ｔ抗原がない状態で導入された時の）ｐｃＤＮＡ３．１、ＰｒｏｍｅｇａからのｐＣＩ又はｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（登録商標）を含む。
あるいは、発現ベクターは、熱ショックタンパク質などの対象の内因性遺伝子の発現を調節するように、細胞内の座位へ強力なプロモーター又はエンハンサー配列を導入し統合するために使用され得る（Ｃａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． （２００５）； ６ （６）：５０７−１２； Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （２００５）； ２３ （１）：１０−５）。この手法はまた、熱ショックタンパク質などの対象の内因性遺伝子の誘導可能な発現を提供するように、細胞のゲノムＤＮＡにＴｅｔ−Ｏｎプロモーター−（米国特許第５，４６４，７５８号及び第５，８１４，６１８号）などの誘導可能なプロモーターを挿入するために使用され得る。活性化の構造はまた、標的配列を含み、それによって、対象の遺伝子に特異的である所望の座位への活性化する配列の相同的組み換え又は非相同的組み換えを可能にする（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｔｉｎ ＆ Ｇｕｉｌｌｏｕ， Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． （２００６） １１：１１０８−３６を参照）。あるいは、Ｃｒｅ−ＥＲシステムなどの誘導可能なレコンビナーゼシステムは、４−ヒドロキシタモキシフェンがある状態で、遺伝子組み換えを活性化するために使用され得る（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （１９９９） ２７ （２２）： ４３２４−４３２７； Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （２０００） ２８（２３）： ｅ９９；及び米国特許第７，１１２，７１５号）。
あるいは、１つの実施形態において、宿主細胞は、対象のｈｓｐを内因的に発現し得るか、又は限定されないが、熱上昇（ｈｅａｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）などの上に記載される手段によって対象のｈｓｐを発現するために誘発され得る。ポリヌクレオチドは、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６） ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９）によって編集された、Ｉｎ． ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”第２版）， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｉｎ： Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｖｏｌ． ３， Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， ｐｐ． ５６３−６０８（１９８０）などの、多くの標準的実験マニュアルに記載される方法によって、宿主細胞へ導入され得る。宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する典型的な方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介性トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入又は感染（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を含む。
組織培養成分及び熱ショックタンパク質の生成に適切な細胞は、原核細胞、酵母、昆虫細胞、植物発現系及び哺乳動物発現系を含む。これらの一般的なガイドラインの中で、有用な微生物宿主は、限定されないが、バチルス属、エシェリヒア属（大腸菌など）、シュードモナス属、ストレプトマイシーズ属、サルモネラ属、エルウィニア属、バチルスサチリス属、バチルスブレビス属、エシェリヒアコリの様々な菌株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ ＮＯ．３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ ＮＯ．５３３３８））からの細菌を含む。
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株もまた、種類ハンゼヌラ属、クルイベロマイセス属、ピチア属、リノスポリジウム属、サッカロミケス属、及びシゾサッカロミセス属、及び他の菌類からものを含む、アルブミン及びｈｓｐｓの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞は、例えば、サッカロミケスセレビシエ及びピキアパストリスを含む。
さらに、所望される場合、昆虫細胞系は、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４：８１０−８１７ （１９９３）； Ｌｕｃｋｌｏｗ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４：５６４−５７２ （１９９３）； ａｎｄ Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７：４５６６−４５７９ （１９９３）によって記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９及びＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆ．）を含む。
多くの適切な植物発現系は、アルブミン及びｈｓｐｓの発現に使用され得、それらの植物は、例えば、任意の単子葉植物、又は双子葉植物を含む。適切な単子葉植物は、限定されないが、イネ、大麦、小麦、ライ麦、トウモロコシ、雑穀、ライ小麦、又はモロコシを含み、イネが好ましい。他の適切な植物は、アラビドプシス、アルファルファ、タバコ、ピーナッツ及び大豆を含む。
多くの適切な哺乳動物の宿主細胞もまた、当該技術分野に公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖａ． ２０１１０−２２０９から利用可能である。例は、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：４２１６−４２２０ （１９８０））、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ９２）などの、哺乳動物細胞を含む。形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の生成及び精製のための、適切な哺乳動物の宿主細胞及び方法の選択は、当該技術分野に公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、及びＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらに典型的な哺乳動物の宿主細胞は、形質転換細胞株を含む、霊長類細胞株及び齧歯類細胞株を含む。
無細胞の転写及び翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物（又はＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡ）を使用して、このようなタンパク質を生成するために利用され得る。
したがって、別の態様において、本発明は、培養中の細胞又は組織の生存及び／又は成長を高める能力を有する補足物を生成するための方法を含む。方法は、細胞培養成分及び熱ショックタンパク質の両方の発現に十分な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、及びアルブミンと熱ショックタンパク質の複合体を回収する工程を含む。
本発明の組み換えタンパク質の生成は、当該技術分野に周知のプロセスによって、発現系を含む遺伝的に操作された宿主細胞から調製され得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリヌクレオチド、又はアルブミンをコード化するポリヌクレオチドを含む発現系、及びこのような発現系によって遺伝的に操作される宿主細胞、及び組み換え型の技術によるこのようなタンパク質の生成に関係する。１つの実施形態において、宿主細胞は、対象の熱ショックタンパク質を内因的に発現する。
本発明の補足の発現されたタンパク質の精製が必要な場合において、本発明のタンパク質は、細胞を溶解する前、又は細胞溶解後のいずれかの細胞環境から回収され得る。
タンパク質は、硫酸アンモニウム又はエタノールの沈澱、酸抽出、陰イオン又は陽イオンの交換クロマトグラフィー、組み換え型の細胞培養、フォスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、細胞培養から回収され得るかつ精製され得る。高速液体クロマトグラフィーも精製のために利用される。
陰イオン交換クロマトグラフィー及びＡＴＰアガロース親和性クロマトグラフィーを含む、熱ショックタンパク質の精製のための方法は、当該技術分野に周知である。（Ｗｅｌｃｈ ＆ Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７ （２４）１４９４９−１４９５９； （１９８２）； Ｗｅｌｃｈ ＆ Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５ （６） １２２９−１２３７ （１９８５）。タンパク質をリフォールディングするための周知の技術は、ポリペプチドが細胞内の合成、分離及び／又は精製の間に変性されるときに、活性立体配座を再現するために利用され得る。特許、公開された特許出願、及び関連する出版物の調査も、本開示を読む当業者に、アルブミンを調整し精製するための重要な可能な方法を提供する。例えば、米国特許第４，０７５，１９７号；第４，０８６，２２２号；第４，０９３，６１２号；第４，０９７，４７３号；第４，１３６，０９４号；第４，２２８，１５４号；第５，２５０，６６２号；第５，６５６，７２９号；第５，６７７，４２４号；第５，７１０，２５３号；第５，７２８，５５３号；第５，９９４，５０７号；第６，００１，９７４号；第６，６３８，７４０号；第６，６１７，１３３号及び第７，４２３，１２４号は、アルブミンを精製するための様々なプロセスを開示する。１つの態様において、本発明に使用するためのアルブミンは、これらの当業者に認識された上記のプロセスのいずれかを使用して精製され、次に、水溶液中で熱ショックタンパク質と混合される。
１つの好ましい態様において、組み換え型のアルブミンは、組み換え型のアルブミン及び熱ショックタンパク質の両方、又はｈｓｐタンパク質の複合体の直接の同時精製を可能にする手順を使用して精製される。１つの態様において、組み換え型のアルブミンは、イネにおいて生成され、熱ショックタンパク質は、内因性のイネの熱ショックタンパク質である。
アルブミン及びｈｓｐ７０の類似した電気陰性度により、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｈｓｐｓが豊富なアルブミンを調製するための好ましい方法である。例えば、アルブミン及びＨｓｐ７０の両方は、高いｐＨ（７．５及びそれ以上）でのポリペプチド（大きな分子の排除限界及び適切なサイズである（ｏｆ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｉｚｅ））のイオン交換に適しているビーズ上にマウントされた第四級アミン又はジエチルアミノエチルのいずれかから成る樹脂剤によって陰イオン交換カラムに結合する。このような樹脂剤の例は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ （ＧＥ） Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＧＥ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。それらの類似した電気陰性度により、低いｐＨの状態（ｐＨ ６．５より下）を利用することで、陽イオン交換体上の２つの分子の同時精製も可能となる。このような陽イオン交換体の例は、ＧＥ Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅベースの樹脂剤である。アルブミン及びＨｓｐ７０が類似した等電点を有するため、混合モードの樹脂剤も、アルブミン及びＨｓｐ７０の同時精製のために利用され得る。Ｈｓｐ７０とアルブミンの両方が、脂肪酸及び他の疎水性の分子に結合することは周知であるため、オクチルセファロース（ＧＥ）などの、疎水性がベースの樹脂上でアルブミン及びＨｓｐ７０を同時精製することも可能である。Ｈｓｐ７０タンパク質及びアルブミン（６５−７５ｋＤａ）の類似した大きさにより、２つのタンパク質の同時精製、及び６５−７５ｋＤａより高くより低い分子の排除を利用する接線流限外濾過によるＨｓｐ７０の濃縮も、同時精製し、それによってアルブミンをｈｓｐによって濃縮するために利用され得る。
また、それらの類似した分子量により、大きさに基づいてポリペプチドを分離する任意の方法は、モレキュラーシーブ、ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーのように、アルブミン及びｈｓｐ７０を効果的に同時精製するはずである。さらに、疎水性及び電気陰性度又は表面電荷に関するＨｓｐ７０及びアルブミンの類似した性質により、それらは多くの条件下で沈殿によって同時精製され得る。これらの条件のいくつかは、硫酸アンモニウムによる沈殿、尿素などの変性剤による沈殿、又は等電点及び溶解度に基づいた沈殿である。
また、方法は他のソースからｈｓｐｓによりアルブミンを濃縮するのに適用可能である。例えば、天然の血清及びトランスジェニック動物のフィードストック血清に由来するアルブミンに加え、組み換え型の生物体、及び哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞、昆虫などの非脊椎動物細胞を含む、原核細胞及び真核細胞の他に、植物、及び酵母などの菌類に基づいた、組織培養系から生成されたアルブミン。
（Ｖ 典型的な細胞）
理論によって制限されることなく、アポトーシスに弱い任意の細胞は、本発明の方法に使用され得ることが熟慮され、その細胞は、様々な特殊化の程度を有する、一次細胞、永久増殖細胞、分化細胞、未分化細胞、又は幹細胞などの細胞を含む。特定の実施形態において、本発明の方法に使用される細胞は、対象のタンパク質、例えば、治療上のタンパク質又は抗体をコード化するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってトランスフェクトされる。
特定の実施形態において、本発明の方法に使用される細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例は、限定されないが、例えば、ヒトのＢ細胞、及びＴ細胞、及びハイブリドーマなどの、それらの誘導体、及びＢ細胞又はＴ細胞のマーカーを発現する細胞、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎生腎株（２９３個又は浮遊培養での成長のためにサブクローン化された２９３個の細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ，ＮＶ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））；サル腎培養細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ３８３：４４−６８ （１９８２））ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＮＳＯマウス骨髄腫細胞（ＥＣＡＣＣ；ＳＩＧＭＡ）、及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）を含み得る。有用な細胞株のさらなる例は、限定されないが、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ ＢＴＨ ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７）、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋ， Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：５９２７−５９３２ （１９８８）を参照）、ラージ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）、ナマルバ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）、ダウディ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）、ボーズメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＬＬ ７５．１）、及びＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８２）に加えて、ヒト細胞と別の種の細胞の融合によって生成されたヘテロハイブリドーマ細胞も含む。これら及び他の細胞及び細胞株は、例えば、米国培養菌保存施設（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から，市販で入手可能である。多くの他の細胞株は、当該技術分野に公知であり、当業者によく知られており、それ故、このような細胞株は、本発明の方法において等しくうまく使用され得る。特定の実施形態において、本発明の方法に使用される細胞は、ＣＨＯ細胞又はＮＳＯ細胞である。ハイブリドーマ及び抗体産生細胞も、本発明の方法に使用され得る。
別の実施形態において、本発明の任意の方法に使用される細胞は、幹細胞である。幹細胞は、自己再生する前駆細胞、再生しない前駆細胞、及び最終分化細胞を含む、子孫細胞を生成するために、それらの自己再生及び分化する単離細胞レベルでの能力によって定義された、未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能細胞へとインビトロで分化するそれらの能力の他に、移植に続いて複数の胚葉の組織を生じさせる、及びすべてでないにしても、胚盤胞への注入に続いて組織のほとんどに実質的に寄与するそれらの能力によって特徴付けられる。
本発明の任意の方法に使用され得るヒト幹細胞のタイプは、前胚組織（例えば、胚盤胞など）、胚組織、又は妊娠中のいつでも、典型的には、しかし必ずしもではないが、妊娠およそ１０−１２週未満で得られた胎児組織を含む、妊娠後に形成された組織に由来するヒト細胞の確立した株を含む。限定しない例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ）などの、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の確立した株である。また、このような細胞の初期の確立又は安定化の間に本開示の組成物の使用が熟慮され、その場合、ソース細胞は、ソース組織から直接得られた主要な多能性細胞になる。また、血液又は臍帯血から分離された幹細胞が適切である。また、フィーダー細胞がない状態で既に培養された多能性幹細胞の個体群から得られた細胞が適切である。また、例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ， Ａｔｈｅｎｓ， Ｇａ．）などの、突然変異のヒト幹細胞株が適切である。１つの実施形態において、ヒト幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８４３，７８０号； Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５， １９９８； Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ３８：１３３ ｆｆ．， １９９８； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：７８４４， １９９５）によって記載されるように調製される。
さらに、ハイブリドーマ細胞も、本発明の方法に使用され得る。用語「ハイブリドーマ」は、免疫学的起源の不死化細胞株と抗体産生細胞の融合によって生成されたハイブリッド細胞株を指す。該用語は、ヒト細胞と、トリオーマ細胞株として一般に知られる、プラズマ細胞と後に融合されるネズミ骨髄細胞株の融合の結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合の後代を包含する。更に、該用語は、例えば、クアドローマなどの抗体を生成する任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むように意図される。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ５３７：３０５３ （１９８３）を参照。ハイブリッド細胞株は、ヒト、ウサギ及びマウスを含む、あらゆる種のハイブリッド細胞株であり得る。
幾つかの実施形態において、本発明の方法に使用される細胞株は、抗体産生細胞株である。抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を使用して選択され、培養され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）を参照し、その全体が補足を含む引用によって本明細書に組み込まれる。一般に、細胞培養中の組み換えタンパク質発現に適しているあらゆる細胞は、本発明の方法に使用され得る。
幾つかの実施形態において、本発明の方法に使用される細胞は、所望の組み換えタンパク質、例えば、本発明の方法を使用して生成されることが所望される、治療上のタンパク質又は抗体をコード化する異種核酸分子を含み得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、低下したレベルの１つ又はそれ以上の汚染物質がある状態で、所望の組み換えタンパク質、例えば、治療上のタンパク質又は抗体の高い力価を生み出すのに役立つ。
（ＶＩ．細胞培地）
細胞増殖及びタンパク質生成に適している任意の適切な培地又は流加培地は、本発明の方法に使用され得る。適切な培養又は流加培地は、宿主細胞と対象のプロセスとのそれらの適合性に関して選択される。適切な培養又は流加培地は、当該技術分野に周知であり、限定されないが、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０ （ＳＩＧＭＡ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ （ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）、及びダルベッコ変法イーグル培地ＳＩＧＭＡなどの、商用培地を含み、これらは、動物細胞を培養するのに適切である。さらに、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．， ５８：４４； Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ４，７６７，７０４； ４，６５７，８６６； ４，９２７，７６２； ５，１２２，４６９ ｏｒ ４，５６０，６５５； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ ９０／０３４３０；及びＷＯ ８７／００１９５に記載される任意の培地が使用され得る。
任意のこのような培地は、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）など）、痕跡元素（ミクロモルの範囲内の終末濃度で通常存在する無機化合物がとして定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源とともに必要とされるものとして補足され得る。任意の他の必要な補足物も、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択される宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者に明白となる。例えば、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｍａｔｈｅｒ， Ｊ． Ｐ． ｅｄ． ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８４），及びＢａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ， Ｃｅｌｌ， ２２：６４９ （１９８０）に記載されるように、特定の細胞のための必要な成長因子は、経験的に過度の実験なしで、容易に測定される。
組み換え型の脊椎動物細胞培養において対象のタンパク質の合成への適応に適した他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載される。一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大限にするための、原理、プロトコル、及び実践的技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｂｕｔｌｅｒ， ｅｄ． （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）において見出され得る。
（ＶＩＩ．典型的な細胞培養発現産物）
請求される方法のいずれか１つの態様において、本発明の補足は、対象のタンパク質を発現し生成するために使用される細胞の生存率及び成長を改善するために使用される。細胞は、対象のタンパク質を内因的に発現し得るか、又はその細胞に関する背景（ｂａｃｈｇｒｏｕｎｄ）を超えるレベルで対象のタンパク質を発現するために、遺伝的に修飾されてきた操作された細胞株であり得る。
細胞はまた、対象のタンパク質をコード化するヌクレイン酸との形質転換によって、又は内因性遺伝子の発現を促進する活性化する配列の形質転換によって、タンパク質を発現するために遺伝的に修飾され得る。１つの態様において、対象のタンパク質は、発現ベクターから発現され得、そこで対象のタンパク質のためのコード配列は、発現調節配列に操作可能に連結されることで、当該技術分野に公知のように、構成的な又は誘導可能な発現のいずれかが可能となる。
対象のタンパク質は、任意のタンパク質、又はそのフラグメントであり得、それは、限定されないが、サイトカイン、ケモキネス、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様の分子、一本鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、酵素、免疫性共刺激性分子、免疫修飾性分子、標的タンパク質のトランス優性ネガティブ変異体、毒素、条件付きの毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質、血管作動性のタンパク質及びペプチド、抗ウイルスのタンパク質及びリボザイム、及び（関係するレポーター基との）それらの誘導体を含む、治療上又は診断上の価値のあるタンパク質であり得る。対象のタンパク質はまた、プロドラッグ活性化酵素を含み得る。
幾つかの実施形態において、対象のタンパク質は、糖タンパク質、又は１つ又はそれ以上の翻訳後修飾を有する他のタンパク質を含む。例えば、真核生物宿主内の生成に適している任意のタンパク質は、本明細書に記載される方法及び組成物を使用して発現され得る。
本発明の方法は、任意の所望の組み換えタンパク質又はそのフラグメントを生成するために使用され得る。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して生成された組み換えタンパク質は、治療上のタンパク質である。他の実施形態において、組み換えタンパク質は、抗体又はその機能性フラグメントである。本発明の方法を使用して生成され得る抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、ＣＤＲグラフト化抗体を含む。それは、完全長ＩｇＧ１抗体、又は例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃｆｖなどの、その抗原結合性フラグメントを含み得る
本発明の範囲内の抗体は、限定されないが、以下を含む：トラスツズマブを含む抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５−４２８９ （１９９２），米国特許第５，７２５，８５６号）；米国特許第５，７３６，１３７号（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））におけるようなキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」、米国特許第５，７２１，１０８号におけるような２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化の変異体、Ｂ１、又はトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（商標））などの、抗ＣＤ２０抗体；抗−ＩＬ−８；（Ｓｔ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｓｔ， １０３：９３２ （１９９３），及び国際公開番号ＷＯ ９５／２３８６５）;ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）などの、ヒト化及び／又は親和性が成熟した抗ＶＥＧＦ抗体を含む、抗ＶＥＧＦ抗体
（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ７：５３−６４ （１９９２）、１９９８年１０月１５日に公開された、国際公開番号ＷＯ ９６／３００４６、及びＷＯ ９８／４５３３１）；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９）；Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化変異体を含む、抗ＣＤ４０抗体（ＷＯ００／７５３４８）；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ ９８／２３７６１、Ｓｔｅｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ． ４：３−７ （１９９１）、及びＨｏｕｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：３７７−３８０ （１９９４））；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３−２６３２ （１９９３）、及び国際公開番号ＷＯ ９５／１９１８１）；抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日に発行された、米国特許第５，６２２，７００号、又は１９９７年７月３１日に公開された、ＷＯ ９７／２６９１２におけるような）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６及びＥ２７を含む；１９９８年２月３日に発行された、米国特許第５，７１４，３３８号、又は１９９２年２月２５日に発行された、米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に公開された、ＷＯ ９３／０４１７３、又は１９９８年６月３０日に出願された、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０、米国特許第５，７１４，３３８号）；抗−アポ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に公開された、ＷＯ ９８／５１７９３）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５を含む、抗−ＴＮＦ-アルファ、抗体（１９９７年９月３０日に発行された、米国特許第５，６７２，３４７号、Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６（４）：１６４６−１６５３ （１９９６）、及びＤｈａｉｎａｕｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２３（９）：１４６１−１４６９ （１９９５）を参照）；抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日に認可された、欧州特許番号０ ４２０ ９３７ Ｂ１）；抗ヒトアルファ４ベータ７インテグリン（１９９８年２月１９日に公開された、ＷＯ ９８／０６２４８）；抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日に公開された、ＷＯ ９６／４０２１０におけるような、キメラ化又はヒト化の２２５の抗体）；ＯＫＴ３などの、抗ＣＤ３抗体（１９８５年５月７日に発行された、米国特許第４，５１５，８９３号）；ＣＨＩ−６２１などの、抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標））及び（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標））（１９９７年１２月２日に発行された、米国特許第５，６９３，７６２号を参照）；ｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２−５６ （１９９６））などの、抗ＣＤ４抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどの、抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７ （１９８８））；Ｇｒａｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（１０）：４９９６−５００２ （１９９５）におけるような、ＦｃガンマＲＩに向けられたＭ２２抗体などの、抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などの、抗癌胚抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）： ５９３５ｓ−５９４５ｓ （１９９５））；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−ｍｃ ３及びＣＨＬ６を含む、胸上皮細胞に向けられた抗体（Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３）： ５８５２ｓ−５８５６ｓ （１９９５）；及びＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３ Ｓｕｐｐ）： ５９１６ｓ−５９２０ｓ （１９９５））；Ｃ２４２（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）などの、結腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６（１）：１−９ （１９９６））；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ １３／５（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（２）：９２５−９３７ （１９９５））；Ｈｕ Ｍ１９５などの、抗ＣＤ３３抗体（Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ （１９９５）及びＣＭＡ−６７６又はＣＤＰ７７１）；ＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅなどの、抗ＣＤ２２抗体（Ｊｕｗｅｉｄ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ （１９９５））；１７-１Ａなどの、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＰＡＮＯＲＥＸ（商標））；アブシキシマブ又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂなどの抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））などの、ＲＥＯＰＲＯ（商標）の抗ＲＳＶ抗体）；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標）などの、抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などの、抗ＨＩＶ抗体；抗Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（商標）などの、抗肝炎抗体；抗ＣＡ １２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプのＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗．アルファ．ｖ．ベータ．３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）；ｃｈ−Ｇ２５０などの、抗ヒト腎細胞癌抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；
抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに向けられた抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）；及びＳｍａｒｔＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）などの、抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体。
本明細書の抗体のための好ましい標的抗原は、ＨＥＲ２受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、及びＣＤ４０である。
組み換えタンパク質は、受容体（例えば、膜結合受容体又はサイトゾル受容体）などの細胞タンパク質、又は構造タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質）であり得る。組み換えタンパク質は、細胞によって分泌され得るか、又は１つ又はそれ以上のシグナル伝達経路の内部で使用され得る、細胞性因子であり得る。限定しない例は、限定されないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２の受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体のサブユニット、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、破骨細胞分化抑制因子リガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激物Ｃ５補体ＴＡＧ−７２、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン付着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２、及びＣＴＬＡ４（これは、細胞毒性Ｔリンパ球に関係する抗原である）を含む。
組み換えタンパク質はまた、ウイルス、細菌、又は菌類などの伝染因子に由来し得る。例えば、タンパク質は、ウイルスコートに由来し得るか、又はウイルスの酵素又は転写因子であり得る。タンパク質は、細菌膜又は細胞壁に由来し得るか、又は細菌の細胞質ゾルに由来し得る。タンパク質は、酵母酵素、転写因子、又は構造タンパク質であり得る。酵母タンパク質は、膜結合性の、サイトゾルの、又は分泌されたタンパク質であり得る。伝染因子の例は、限定されないが、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、ミュータンス連鎖球菌、及び黄色ブドウ球菌、及びカンジダアルビカンスを含む。その上、細胞培養系の生成物は、これらの上記のいずれかなどの、ウイルスであり得る。これらのウイルスは、生ウイルス、弱毒ウイルス、及びさもなければ、非活化ウイルス又はウイルス粒子又はウイルス様粒子などの、その成分を含む。ウイルスはまた、偽型ウイルスであり得、そのウイルスの成分は、２つ又はそれ以上の異なるウイルスの成分から成る。さらに、細胞培養の生成物は、ワクチンであり得る。ワクチンは、本来、治療上又は予防上のワクチンであり得る。培養中で生成されたワクチンは、しばしば、生ウイルス又は弱毒ウイルス又はサブユニットワクチンによって例証されるようなそれらの成分であり得るか、又は１つを超えるウイルスの成分を含む、組み換えウイルス又はウイルス様粒子であり得る。
本発明の方法はまた、前述のタンパク質のすべて又はいずれかの部分を含む組み換え型の融合タンパク質を生成するために使用され得る。例えば、ロイシンジッパー、多段コイル、抗体のＦｃ部分、又は本質的に類似したタンパク質などの、多量体化のドメインを加えた前述のタンパク質の１つを含む、組み換え型の融合タンパク質は、本発明の方法を使用して生成され得る。例えば、国際出願番号９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３； Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １４０１−０５； Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３； Ｈａｎｇ．ｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照。
また、本発明によって包含されるのは、本明細書に記載される方法によって生成された１つ又はそれ以上の組み換えタンパク質を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書に使用されるような用語「薬学的に許容可能な担体」は、被験体への投与に適した、１つ又はそれ以上の適合性のある固体又は液体の充填剤、賦形剤、又はカプセル化する物質を意味する。
（ＶＩＩＩ 幹細胞）
１つの実施形態において、ヒト幹細胞は、フィーダー細胞が本質的にないが、それでも、実質的な分化を受けることなく、ヒト胚性幹細胞の増殖を支持する培養系において培養され、これは本発明の補足物を含む。分化なしでのフィーダーのない培養中のヒト幹細胞の成長は、別の細胞型とともに前もって培養することによって調整された培地を使用して支持され、これはさらに本発明の補足物を含む。あるいは、分化なしでのフィーダーのない培養中のヒト幹細胞の成長は、本発明の補足物を含む合成培地を使用して支持される。幹細胞が、幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子で補足された無条件の血清置換（ＳＲ）の培地において維持される、フィーダーのない、無血清培養系の例は、米国特許出願ＵＳ２００５０１４８０７０、ＵＳ２００５０２４４９６２、ＵＳ２００５０２３３４４６、米国特許第６，８００，４８０号、及びＰＣＴ公開ＷＯ２００５０６５３５４及びＷＯ２００５０８６８４５に開示されるものを含む。
代替の実施形態において、ヒト幹細胞は、ヒト幹細胞を支持するフィーダー細胞の層によって最初に培養され、さらに本発明の補足物を含む。ヒトは、その後、フィーダー細胞が本質的にないが、それでも、実質的な分化を受けることなく、ヒト胚性幹細胞の増殖を支持する培養系に転写され、これはさらに本発明の補足物を含む。これらの手法のいずれかにおいて、本発明の補足物の使用は、細胞増殖の著しく高められた割合及び改善された細胞の生存率という結果をもたらす。
本発明の補足物との使用に適した調整培地の例は、ＵＳ２００２００７２１１７、米国特許第６，６４２，０４８号、ＷＯ２００５０１４７９９、及びＸｕ ｅｔ ａｌ （Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２： ９７２−９８０， ２００４）に開示される。本発明の補足物との使用に適した合成培地の例は、ＵＳ２００７００１００１１において見出され得る。
フィーダー細胞の例は、線維芽細胞、ＭＲＣ−５細胞、胎生腎細胞、間充織細胞、骨肉腫細胞、角化細胞、軟骨細胞、卵管上皮細胞、肝細胞、心細胞、骨髄間質細胞、顆粒膜細胞、骨格筋細胞、筋細胞及び大動脈内皮細胞から成る群から選択されるフィーダー細胞を含む。好ましい実施形態において、ＭＲＣ−５細胞は、ＡＴＣＣカタログ番号５５−Ｘを有し；形質転換され、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−２３０９を有し；ヒト骨肉腫細胞は、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−９６を有し；及び間充織細胞は、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４８６を有するヒト胎児の口蓋間充織細胞である。他の好ましい実施形態において、ヒト線維芽細胞は、皮膚ケロイド線維芽細胞、ＫＥＬ ＦＩＢであり、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１７６２を有するか、又は胎児の皮膚線維芽細胞であり；及び骨髄間質細胞、ＨＳ−５は、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１１８８２を有する。
適切な培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５−０９２などの、下記の成分から作られ得る；ノックアウト・ダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８；Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２／５０％ ＤＭＥＭ基本培地；２００ｍＭのＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ ＃１５０３９−０２７；可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、シグマ ＃ Ｍ７５２２；ヒト組み換え型の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ ＃ １３２５６−０２９。
１つの実施形態において、ヒト幹細胞は、本発明の方法によって処置前に処置される適切な培養基質上に、本発明の補足物を含む組成物によって平板培養される。１つの実施形態において、処置は、例えば基底膜に由来するものなど、又は接着分子受容体リガンドのカップリングの一部を形成し得る、細胞間マトリックス成分である。１つの実施形態において、適切な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬは、再構成された基底膜を形成するために室温でゲル化する、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ川辺の低地Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性の調製物である。
他の細胞間マトリックス成分及び成分の混合物は、代替物として適切であり、本発明の補足物とともに使用され得る。これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などを単独で、又は本発明の補足物との様々な組み合わせで含み得る。
別の実施形態において、本発明は、幹細胞培養を含み、これは、本発明の補足物を含む、ヒト多能性幹細胞、及びフィーダーのない、無血清培養系を含む。１つの実施形態において、本発明は、ヒト多能性幹細胞培養を含み、これは、本発明の補足物を含む、ヒト多能性幹細胞、及びフィーダーのない、無血清培養系を含む。
別の実施形態において、本発明は、幹細胞培養を含み、これは、本発明の補足物を含む、ヒト幹細胞及びヒトフィーダー細胞培養を含む。別の実施形態において、本発明は、ヒト多能性幹細胞培養を含み、これは、本発明の補足物を含む、ヒト多能性幹細胞及びヒトフィーダー細胞培養を含む。
別の実施形態において、本発明は、多分化能マーカーを発現する細胞を含む細胞の個体群を引き出すための方法を提供し、該方法は：
ａ． ヒト幹細胞を培養する工程、
ｂ． 多分化能マーカーを発現する細胞へとヒト幹細胞を分化する工程を含み、ここで、分化は本発明の補足物がある状態で行われる。
別の実施形態において、本発明は、外胚葉、内胚葉又は中胚葉の細胞の特性がある、マーカーを発現する細胞を含む細胞の個体群を引き出すための方法を提供し、該方法は：
ａ． 多分化能幹細胞を培養する工程、
ｂ． 外胚葉、内胚葉又は中胚葉の細胞の特性があるマーカーを発現する細胞へと多分化能幹細胞を分化する工程を含み、ここで、分化は本発明の補足物がある状態で行われる。
これらの方法のいずれかにおいて、幹細胞は、当該技術分野における任意の方法によって、内胚葉、外胚葉又は中胚葉の系統の特性があるマーカーを発現する細胞へと分化され得る。例えば、多分化能マーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３， １５３４−１５４１ （２００５）， ｂｙ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１， １６５１−１６６２ （２００４）， ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５， ２９−３８ （２００７）， Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４， １３９２−１４０１ （２００６）に開示される方法によって、明確な内胚葉系統の特性があるマーカーを発現する細胞に分化され得る。
内胚葉系統の特性があるマーカーを発現する細胞はさらに、当該技術分野における任意の方法によって、膵臓の内分泌腺系統の特性があるマーカーを発現する細胞に分化され得る。例えば、膵臓の内胚葉系統の特性があるマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４， １３９２−１４０１ （２００６）に開示される方法によって、膵臓の内分泌腺系統の特性があるマーカーを発現する細胞に分化され得、ここで、分化は本発明の補足物がある状態で行われる。
分化のこれらの方法のいずれか１つの態様において、ヒト幹細胞は、培養され、細胞間マトリックスでコーティングされた組織培養基質上で分化される。細胞間マトリックスは、マウス肉腫細胞から抽出された、可溶性になった基底膜の調製物であり得る（これは、商標名、ＭＡＴＲＩＧＥＬの下、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売される）。あるいは、細胞間マトリックスは、成長因子が減少したＭＡＴＲＩＧＥＬであり得る。あるいは、細胞間マトリックスは、フィブロネクチンであり得る。代替の実施形態において、ヒト幹細胞は、培養され、ヒト血清によってコーティングされた組織培養基質上で分化される。１つの態様において、組織培養基質は、細胞間マトリックス及び本発明の補足物によってコーティングされる。
細胞間マトリックスは、組織培養基質をコーティングする前に希釈され得る。細胞間マトリックスを希釈し、組織培養基質をコーティングするための適切な方法の例は、Ｋｌｅｉｎｍａｎ， Ｈ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：３１２ （１９８６），及びＨａｄｌｅｙ， Ｍ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：１５１１ （１９８５）において見出され得る。
幹細胞分化の方法の１つの態様において、培地は、特定の因子の十分低い濃度を含むべきであり、それによって、例えば、（ＷＯ２００６０２０９１９に開示されるような）インスリン及びＩＧＦなどの、内胚葉、外胚葉又は中胚葉系統の細胞へのヒト幹細胞の分化が可能となる。これは、血清中濃度を低下させることよって、あるいは、インスリン及びＩＧＦを欠く合成培地を使用することによって達成され得る。合成培地の例は、Ｗｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ （Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １９９９ Ｆｅｂ． ２５； ２４７（１）： ２４１−８．）に開示される。これらの方法のいずれかの、好ましい実施形態において、培地は、本発明の補足物を含む。
培地はまた、ヒト幹細胞から、内胚葉、中胚葉又は外胚葉系統の特性があるマーカーを発現する細胞の形成を強化し得る、少なくとも１つの他のさらなる因子を含み得る。
少なくとも１つのさらなる因子は、例えば、ニコチン酸アミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含む、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）のようなグルカゴン、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｏｂｏｄｙ）、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ベータメルカプトエタノール、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミンなどの銅のキレート化剤、ホルスコリン、Ｎａ酪酸塩、アクチビン、ベタセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起成長因子、結節、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ナトリウム酪酸塩、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ、ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７の補足物（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ、ＣＡ）などの、ステロイドアルカロイド、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、島ネオゲネシスに関係するタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路インヒビター、ソニックヘッジホッグインヒビター、又はそれらの組み合わせであり得る。これらの方法の、好ましい実施形態において、上に挙げられる少なくとも１つのさらなる因子を含む培地は、本発明の補足物をさらに含む。
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えばＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）などの膵臓細胞株、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）などの肝細胞株、及び例えばＦＨｓ ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）などの腸細胞株から得られる、条件培地によって供給されてもよい。これら方法の何れかの好ましい実施形態において、調整培地は本発明の補足物を更に含む。別の実施形態において、本発明は、ヒト又は動物における疾患又は疾病の実験的、治療的及び予防的な処置のため、前述の幹細胞の何れかの細胞又は組織を使用する方法を包含する。好ましくは、疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊椎損傷、卒中、黄斑変性、熱傷、肝不全、心臓病、糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、骨形成不全症、骨関節炎、関節リウマチ、貧血症、白血病、乳癌、固形腫瘍、及びエイズから成る群から選択される。好ましい実施形態において、疾患はパーキンソン病又はアルツハイマー病である。より好ましい実施形態において、疾患はパーキンソン病である。
（ＩＸ．組み換えタンパク質の大規模生成）
１つの実施形態において、本発明の補足物は、補足物の存在下で宿主細胞を成長させることにより、対象のタンパク質を生成するために使用することができる。１つの実施形態において、細胞培養は撹拌タンク式バイオリアクターシステムで行なわれ、流加培養法の手順が使用される。別の実施形態において、波型の使い捨ての（ｗａｖｅ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ）バイオリアクターが使用される。バイオリアクターシステムにおいて、バイオリアクターのサイズは、１，０００リットル又は１２，０００リットルのサイズのように、所望の量の対象のタンパク質を生成するには十分大きいが、より小さい（即ち、２リットル、４００リットル）又はより大きい（即ち、２５，０００リットル、５０，０００リットル）バイオリアクター容器が適切であってもよいため、このようなサイズに限定されない。好ましい流加培養法において、哺乳動物の宿主細胞及び培地は、培養容器に最初に供給され、追加の培養栄養素は、培養の終了の前の周期性の細胞及び／又は生成物収集と共に又はそれら無しで、培養中の培養物に、継続的に又は別々の増加量で、供給される。流加培養法は、例えば、半連続的な流加培養法を含むことができ、ここで、周期的に全体の培養物（細胞と培地を含む）が取り除かれ、新しい培地と交換される。流加培養法は、細胞培養のための全ての成分（細胞及びすべての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの初めに培養容器に供給される単純な回分培養と区別される。流加培養法は、上澄みがプロセス中ではなく培養プロセスの終わりに培養容器から取り除かれる限り、灌流培養と更に区別することができる（灌流培養において、細胞は、例えば濾過、カプセル化、マイクロキャリアへの固定などにより培養において抑制され、培地は、継続的に又は断続的に導入され、培養容器から取り除かれる）。
更に、培養細胞は、特定の宿主細胞及び熟慮される特定の生成計画に適している、任意のスキーム又はルーチンに従って繁殖されてもよい。それ故、本発明は単一の工程又は複数の工程の培養手順を熟慮する。単一の工程の培養において、宿主細胞は培養環境に播種され、本発明の方法の工程は、細胞培養の単一の生成段階中に使用される。代わりに、複数段階の培養が予見される。複数段階の培養において、細胞は多くの工程又は段階で培養されてもよい。例えば、細胞は、最初の工程又は成長段階の培養において成長してもよく、ここで細胞は、恐らく貯蔵から取り除かれ、成長及び高い生存率を促進するのに適切な本発明の補足物を含む培地に播種される。細胞は、宿主細胞培養に新しい培地を追加することによって、適切な期間の間、成長段階のまま維持されてもよい。
本発明の好ましい態様によると、流加回分又は連続的な細胞培養条件は、細胞培養の成長段階において哺乳動物細胞の成長を高めるために考案される。成長段階において、細胞は、前記条件下で、成長のため最大限にされる期間の間成長する。温度、ｐＨ、溶解酸素（ｄＯ２）などのような培養条件は、特定の宿主と共に使用されるものであり、通常の当業者に明らかとなるだろう。一般に、ｐＨは、酸（例えばＣＯ２）又は塩基（例えばＮａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５と７．５の間のレベルに調節される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養に適切な温度範囲は、約３０℃から３８℃の間であり、好ましくは約３７℃であり、適切なｄＯ２は空気飽和の５−９０％の間にある。
特定の段階で、細胞は生成段階又は細胞培養の工程で播種するために使用されてもよい。あるいは、上述のように、生成段階又は工程は、播種又は成長段階或いは工程と連続していてもよい。
本発明によると、細胞培養の生成段階中の細胞培養環境は制御される。現在開示された方法の工程によると、本発明の補足物の追加は調和することができ、その結果、対象のタンパク質の所望の含有量及び品質が、結果として生じる細胞培養液において達成され、維持される。好ましい態様において、細胞培養の生成段階は、本発明の補足物の追加が細胞培養の生成段階を開始する細胞培養の転換段階によって始まる。
上記方法のいずれかにおいて、本発明の補足物と組み合わせた細胞培地中で、ブチラート又はトリコスタチンＡのような所望の量の薬剤を含むのが望ましくなることが熟慮される。ブチラートとその塩の様々な形態は、酪酸及び酪酸ナトリウムなどのように、当該技術分野において知られており、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ等の供給源から公的に利用可能である。ブチラートは、細胞培養の生成性及びタンパク質発現を高めるため、文献で報告されている［Ａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．， ３１０：１７１−１７６ （１９９５）； Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１：７６３１−７６４８ （１９８３）； Ｋｒｕｇｈ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４２：６５−８２ （１９８２）； Ｌａｍｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２９：５５−６４ （１９９９）； Ｃｈｏｔｉｇｅａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５：２１７−２２１ （１９９４）］。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤であり、細胞培養における生成性及びタンパク質発現を高める際、ブチラートにも同様に作用してもよい［Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５７：３６９７−３７０７ （１９９７）］。ブチラートはタンパク質発現に対するいくつかの陽性の効果を有するが、一定の濃度で、ブチラートが培養細胞においてアポトーシスを誘発し、それにより生細胞密度と同様に培養の生存率を減少することができることも、当該技術分野において認識される［Ｈａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ５５：４９８−５０５ （１９９３）； Ｃａｌａｂｒｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９５：３１−３８ （１９９３）； Ｆｉｌｌｉｐｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９８：２５７−２６５ （１９９４）； Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５７：３６９７−３７０７ （１９９７）］。本発明の方法において、所望の量のブチラート又はＴＳＡは、生成段階の始めに細胞培養に加えられてもよく、及びより好ましくは、温度シフトが実施された後、細胞培養に加えられてもよい。ブチラート又はＴＳＡは、当業者により経験に基づいて測定される所望の量に加えることができるが、好ましくは、ブチラートは、約１から約２５ｍＭの濃度で細胞培養に加えられ、及びより好ましくは、約１から約６ｍＭの濃度で加えられる。
対象のタンパク質の発現は、適切に標識化されたプローブを使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、サンプル中で直接測定されてもよい。様々な標識が利用されてもよく、最も一般には放射性同位元素、及び特に３２Ｐが利用されてもよい。しかしながら、他の技術も、ポリヌクレオチドへの導入のためビオチン修飾したヌクレオチドを使用するように利用されてもよい。その後ビオチンは、アビジン又は抗体に結合するための部位として役立ち、それはラジオヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、蛍光体又は酵素などの多種多様の標識により標識化されてもよい。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的な二本鎖を認識することができる抗体が利用されてもよい。抗体は次々に標識化されてもよく、アッセイは二本鎖が表面に結合される場合に実行されてもよく、その結果、表面上での二本鎖の形成に際し、二本鎖に結合する抗体の存在を検出することができる。
遺伝子発現は代わりに、遺伝子産物の発現を直接定量化するため、細胞培養又は体液の細胞又は組織部分及びアッセイの免疫組織化学的な染色など、免疫組織化学的な方法によって測定されてもよい。免疫組織化学的な染色法により、細胞サンプルは典型的に脱水と固定によって調製され、その後、標識が通常、酵素の標識、蛍光の標識、発光標識などのように、視覚的に検知可能な場合、結合される遺伝子産物に特異的な標識抗体を伴う反応が生じる。
サンプル流体の免疫組織化学的な染色及び／又はアッセイに役立つ抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよく、任意の哺乳動物で調製されてもよい。多くが市販で入手可能である。
本明細書で請求される補足物も、形質移入中に形質移入の有効性及び細胞の生存率を増加させるために使用することができる。リポフェクタミンなどの、様々な形質移入技術において使用される条件と試薬は、細胞に対し比較的毒性である一方で、エレクトロポレーションは細胞を激しく強調する（ｓｔｒｅｓｓ）ことができる。より高い濃度の形質移入試薬の使用、及びより広範囲なエレクトロポレーション条件は、より高い形質移入の有効性を達成するのが好ましい。したがって、形質移入の前、それと一緒に、及びその後の本発明の補足物の追加は、より高い形質移入の有効性、及びより高い収量の組み換えタンパク質をもたらすことができる。
本発明の補足物は、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ又はＦａｓリガンドなどのアポトーシスを誘発する、対象のタンパク質を発現するために使用することができる。本発明の補足物の存在は、そのようなアポトーシスの活性を阻止し、対象のタンパク質の改善された発現を可能にしてもよい。
加えて、方法は、冷凍／貯蔵／融解手順を受ける細胞の生存率を増加させるために使用することができる。これらの手順中、一般に、細胞は生存率を失う場合がある。細胞培地に加えられるアポトーシス阻害剤の存在は、細胞の生存率の増加を提供することができ、細胞のアリコート又はバイアルの間の細胞の生存率における変異性を減少させる又は除去するのに役立つ。
〈Ｘ．キット〉
また、細胞の生存率を促進するためのキットが本発明によって包含される。１つの実施形態において、本発明によるキットは次のものを含む：（ａ）形質移入のための１つ以上の試薬又はデバイス、及び（ｂ）本発明の補足物。幾つかの実施形態において、本明細書で特筆されるキットは、形質移入デバイス、形質移入薬剤及び補足物の使用に関する詳細を含む、指示書及び／又は宣伝材料を含む。
別の実施形態において、本発明によるキットは次のものを含む：（ａ）細胞を凍結する又は融解するための１つ以上の試薬又はデバイス、及び（ｂ）本発明の補足物。幾つかの実施形態において、本明細書で特筆されるキットは、細胞株を凍結する又は融解するためのプロトコル及び試薬の使用に関する詳細を含む、指示書及び／又は宣伝材料を含む。
別の実施形態において、本発明によるキットは次のものを含む：（ａ）細胞を培養するための１つ以上の組織培養生成物及び（ｂ）本発明の補足物。幾つかの実施形態において、本明細書で特筆されるキットは、希釈クローニング技術に関するプロトコル及びそのような手法における試薬の使用に関する詳細を含む、指示書及び／又は宣伝材料を含む。
〈実施例〉
〈実施例１：組み換え型のイネ粉の生成〉
方法：様々なデータ基礎からヒト血清アルブミンのタンパク質配列を比較した。受入番号Ｐ０２７６８によって表わされる共通配列を、ＷＯ２００７／００２７６２において以前に記載されているような、イネ粒におけるヒト血清アルブミンの適切な発現に関する遺伝子コドン最適化のためのベースとして使用した。遺伝子合成を、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ（ワシントン州シアトル）によって実行し、合成フラグメントを、ｐＵＣ−ＨＳＡを作るためにｐＵＣベースのベクトル（ｐＵＣ ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）に挿入した。正確なＤＮＡ配列の確認後、ベクトルをＭｌｙｌとＸｈｏ１により消化した。コドンにより最適化されたＨＳＡ遺伝子を含むフラグメントを、ｐＡＰ１４０５に挿入し、それはＮａｅ１とＸｈｏ１によりプリカットされた（ｐｒｅｃｕｔ）。プラスミドＡＰ１４０５は、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナル配列及びｎｏｓターミネーターを含む、ベクトルｐＡＰ１４４１（ＷＯ２００７／００２７６２）の誘導体であった。ｐＡＰ１４０５へのＭｌｙ／Ｘｈｏ１フラグメントの挿入は、下記に述べられるような照射による形質移入に使用された、ベクトルｐＡＰ１５０４をもたらした。
粒子の照射を媒介としたイネの形質転換及び植物再生の基本的な手順を、以前に記載されたように行なった（Ｙｉ Ｃｈｕａｎ Ｘｕｅ Ｂａｏ． ２００１； ２８（１１）：１０１２−８． Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２００１；１７（１）：１２６−３３）。イネの品種ＴＰ３０９種子の殻を取り（ｄｅｈｕｓｋｅｄ）、２５分間５０％（ｖ／ｖ）の市販用漂白液で殺菌し、滅菌水で洗浄した。殺菌された種子を、［Ｎ６塩（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ及び３％のスクロース］を含むイネのカルス誘導培地（ＲＣＩ）プレートに置いた。イネ種子を１０日間インキュベートし、カルス形成を誘発した。主要なカルスを種子から切開し、３週間ＲＣＩに置いた。照射及び継続的な継代培養に使用された、第２及び第３のカルスを生成するために、これを２回以上行った。１−４ｍｍの直径のカルスを、照射前に５−２４時間、０．３Ｍのマンニトールと０．３Ｍのソルビトールを有するＲＣＩ上の４ｃｍの環（ｃｉｒｃｌｅ）に置いた。微粒子銃による照射（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を、微粒子銃の（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＰＤＣ−１０００／Ｈｅシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して行なった。その手順は、２．５μｇのＤＮＡでコーティングされる１．５ｍｇの金の粒子状物質（６０μｇ／ｍｌ）を必要とする。ＤＮＡでコーティングされた金の粒子状物質を、１１００ｐｓｉのＨｅ圧力（Ｈｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）でイネのカルス（ｒｉｃｅ ｃａｌｌｉ）に照射した。
照射の後、４８時間でカルスを回復させ、次に選択用の３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンＢを有するＲＣＩに移動させ、２６℃で４５日間暗やみの中でインキュベートした。形質転換されたカルスを選択し、９−１２日間、５ｍｇ／ｌのＡＢＡ、２ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ及び３０ｍｇ／ｌのヒグロマイシンＢを含むＲＣＩ（マイナス２，４−Ｄ）に移動した。形質転換されたカルスを、ＲＣＩ（マイナス２，４−Ｄ）、３ｍｇ／ｌのＢＡＰ、及びヒグロマイシンＢが無い０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡから成る再生培地に移動し、２−４週間、連続的な照明条件下で培養した。再生成された小植物（高さ１−３ｃｍ）を、濃度が、１％のスクロース及び０．０５ｍｇ／ｌのＮＭを加えたＭＳ培地（Ｓｉｇｍａ）の半分であった発根培地（ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に移動した。２週後、発根培地上で、小植物は根を発育させ、芽は約１０ｃｍまで成長した。植物を、５０％の商用土（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ ＃１）と５０％の水田からの土の混合物を含む、６．５×６．５ｃｍのポットに移動した。植物を、１００％近くの湿度を維持するためにプラスチック容器でカバーし、１週間連続的に光を当てて成長させた。透明プラスチックカバーを１日の期間にわたってゆっくりと移し、徐々に湿気を減少させて、必要なときに水と肥料を加えた。遺伝子組み換えのＲ０植物がおよそ２０ｃｍの高さであった時、それらを成熟に成長する温室へ移した。
個々のＲ０再生成植物からの個々のＲ１種子穀粒を、胚と胚乳に解体した。分離されたイネの胚乳中の組み換え型アルブミン発現レベルを測定した。高い組み換えタンパク質発現を有する個々のＲ１粒からの胚を、２５分間５０％の漂白剤で殺菌し、滅菌蒸留水により洗浄した。殺菌された胚を、１％のスクロース及び０．０５ｍｇ／ｌのＮＡＡを追加した１／２のＭＳの基礎の塩（１／２ ＭＳ ｂａｓａｌ ｓａｌｔ）を含む組織培養管に入れた。胚は発芽し、約７ｃｍの芽と健康な根系を有する小植物を約２週間で得た。成熟したＲ１植物を再生体として得た。
異種のポリペプチドを含む遺伝子組み換えのイネは、乾式製粉又は湿式粉砕プロセスによってイネ抽出物に転換することができる。乾式製粉プロセスにおいて、異種のポリペプチドを含む遺伝子組み換えの種もみを、ｄｅｈｕｓｋｅｒによりその殻を取る。その後、例えば、１つの実験において、Ｋ−ＴＥＣからのモデル９１キッチン製粉機（ｍｏｄｅｌ ９１ Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｍｉｌｌ）の速度３での乾式製粉プロセスにより、殻を取ったイネを挽いて細かい粉にした。
〈実施例２：組み換え型のアルブミン（Ｂ００００Ｃ）の精製〉
方法：Ｖｅｎｔｒｉａ ｇｒｏｗｎ ｒｉｃｅに関して、イネをコンバイン又は手で収穫した。このプロセス中に、成熟種子をコンバインセパレーター又は手作業によって発達植物（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｍａｔｔｅｒ）から分離した。採取されたイネを、鳥、齧歯類、トカゲ、昆虫及び他の害虫から穀物を保護する、清潔な穀物ビン、貯蔵トート、スーパーサック（ｓｕｐｅｒｓａｃｋ）、又は他の容器への貯蔵に適している点でおよそ１２％の湿度にまで乾燥した。イネ粒が粉に必要とされるとき、先ず殻を取る又は皮を取る（ｄｅｈｕｌｌｅｄ）。このプロセスを真空下で行い、その結果、種子の砕片及び外側部分を胚乳及び胚又は糠層から払しょくする。殻を取った穀物をその後、洗浄して乾燥し、又は洗浄して湿式均質化（ｗｅｔ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）などで直接加工し、或いは乾燥して殻を取った状態に更に加工する。乾燥して殻を取った材料を、白イネの生成者に共通の精イネ又は糠取り（ｄｅｂｒａｎｎｉｎｇ）用の機械によって糠をとってもよい（ｄｅｂｒａｎｎｅｄ）。
糠を取り、殻を取ったイネを、この時点で洗浄して湿気ミルにかけるか、又は乾式製粉のために乾燥するか、又は挽いて粉にすることにより直接加工してもよい。最小量のせん断機と熱による製粉は、ローラーミル又はピンミルなどによるものが好ましい。ハンマーミルも適切である。激しい撹拌により、タンパク質を水において５分未満で９０％まで抽出することができるように、粉を挽くべきである。通常、それは、４００μｍ又は４ｍｍ未満である大きさの粒子を必要とする。しかしながら、より長い時間が与えられれば、より大きな粒子状物質を抽出することができる。あるいは、抽出可能な９０％のタンパク質が可溶性になるように、穀物を洗浄し、セットアップされた液体のホモジナイザーにより湿式ミルにかける（ｗｅｔ ｍｉｌｌｅｄ）ことができる。
粉スラリーを、少なくとも３部分の水対１部分の粉の比率、及び２０部分までの水対１部分の粉の比率で典型的に混合する。水は、ｐＨがおよそｐＨ７に維持される、典型的にはトリス／ＨＣｌ、シトラート、ホスファート、ＨＥＰＥＳなどの適切な緩衝液、及び１００ｍＭのＮａＣｌなど少量の塩を含んでいる。スラリーを湿式粉砕の場合に均質化し、又は乾燥粉のために徹底的に混合した後、大量の固形物を固液分離によりスラリーから取り除く。これをデカント、遠心分離、又は濾過により実行する；例えば、パッドを有するプレート及びフレーム、加圧フィルター、ベルトフィルター、真空フラスコ、ハイドロクロン（ｈｙｄｒｏｃｌｏｎｅ）又は真空ベルトフィルター。濾過の後、圧縮したケーキを、ケーキからタンパク質を取り出すために抽出緩衝液により洗浄するべきである。珪藻土（ｄｉａｔｏｍａｔｅｏｕｓ ｅａｒｔｈ）又は他の濾過材の追加は、濾液の透明度を促進するのに役立つが、正確な装置を考慮すると、必要ではない。あるいは、凝集剤を、浄化を支援するために使用してもよい。浄化された濾液を、そのアルブミン含有量に関して検査するべきであり、回収率が種もみ内で測定された発現レベルと一致していることを確認した。
デンプン、沈澱可能なタンパク質、ウイルス、及び他の汚染物質を取り除くために、５Ｍの酢酸を、ｐＨが５．０に達し、溶液が白くなるまで、浄化された濾液に加える。白色の溶液を、不溶性の物質の沈殿を促進するために少なくとも２０分間攪拌する。その後、沈殿された溶液を、キャニスターフィルター、カートリッジフィルター、又は限外濾過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に適し、又は１０ＮＴＵ未満（ネフェロメ濁度単位）である透明度に達する他の濾過装置などのデプスフィルターを通して濾過する。またそれは、フィルタプレス、加圧フィルターにより、又は代わりにクロスフローを利用するセラミックフィルター又は他の材料の使用により浄化することができる。加えて、この物質は拡張した床クロマトグラフィーカラム（ｂｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）への直接の適用に適している。
好ましい方法において、浄化された濾液を、０．２ミクロンのフィルターを通す濾過によって浄化し、１ＭのＮａＯＨによりｐＨ７．０まで中和した。この物質はその後、中空繊維、フラットシート又は螺旋創傷クロスフロー濾過による限外濾過に適している。材料を、ウイルス、不要なより大きな汚染物質、及び凝集物を取り除くため、１００キロダルトン（ｋＤａ）以上の大きさの膜に通すことができる。膜を通る材料は、１０又は３０ｋＤａのクロスフロー膜によって濃縮することができ、その後同じ膜はクロマトグラフィーのための溶液を調製するために使用することができる。濃縮した材料をその後、伝導率とｐＨが等しくなるまで、カラム平衡緩衝液により限外濾過する（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）ことができる。
ＧＥ ＤＥＡＥセファロース又はＧＥ Ｑセファロース上での陰イオン交換クロマトグラフィーのための好ましい緩衝液は、ｐＨ８．０まで均衡のとれた１０又は２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液である。対照的に、例えば陰電荷を有するレジン又は疎水性のリンカーと混合した陰電荷を有するレジン（混合モードのアブソルバン）、又は代わりにブルーセファロース（ＧＥ）のようなブルーシビクロン（ｂｌｕｅ Ｃｉｂｉｃｒｏｎ）の使用を介する、陽イオン交換のための好ましい緩衝液は、ｐＨ４．８〜５．０まで均衡のとれたアセテート又はシトラート緩衝液である。
いずれかのシステムに関して、アルブミン及び他の同様に電荷を有するタンパク質を、マトリックスによって保持し、洗浄を、少なくとも５つのカラム体積の添加液によって緩く結合された材料を取り除くために行い、それはまた、疎水性の不純物を取り除くのに役立つことが必要であると見なされるような洗浄薬を含んでもよい。材料を、陽イオン交換のために２−４単位増加されたｐＨ、又は陰イオン交換のために２−４単位減少したｐＨを有する同じ又は修正された緩衝液でカラムを帯電させることにより溶出することができる。結果として生じるｐＨにおける変化は、イオンの交換を可能にし、タンパク質は鋭い帯（ｓｈａｒｐ ｂａｎｄ）で溶出されるであろう。溶出分画の純度を増加させるために、溶出ピークを精査することができ、その結果、第１部分（１０％）又は最後の部分（１０％）、あるいはその両方の部分を主な溶出ピークから排除することができる。好ましい方法において、１０ｍＭのＮａＣｌを含む、１００ｍＭ及びｐＨ４．０に調節されたｐＨでのホスファートを含む溶液を、ＧＥ Ｑセファロース（速い流量）からタンパク質を溶出するために使用する。この場合において、ｐＨと伝導率を、拘束力がない汚染物質（フロースルー及び洗浄）と、より堅く結合する汚染物質（１００ｍＭのホスファート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び４．０に調節されたｐＨにおけるカラム上で保持されるもの）の間の区別を可能にする材料を溶出するために使用する。
溶出後、溶出された材料のｐＨに６．０未満のｐＨがあると、それはその後１ＭのＮａＯＨにより中和される。その後、結果として生じる溶液を、次のクロマトグラフィー工程のため同じ緩衝液に対して限外濾過し、それは好ましい方法において、１００ｍＭのホスファート、１０ｍＭのＮａＣｌ及びｐＨ７．０を有する結合されていない様式以外においては、同じマトリックス（即ち、Ｑセファロース）のカラムを通って溶出剤（ｅｌｕｔｅｎｔ）を流すことを含む。
結合カラム上で共同溶出された汚染物質が、中性のｐＨでマトリックス上で保持される機会を有するように、第２のカラム工程は、最初ではあるが逆の様式で同じ原則を使用する。第１補足カラム（ｆｉｒｓｔ ｃａｐｔｕｒｅ ｃｏｌｕｍｎ）からのフロースルー材料も、様々な代替型のクロマトグラフィー手法、例えば陽イオン交換、疎水性の混合された様式、ゲル濾過クロマトグラフィーにより処理することができる。
好ましい方法において、Ｑセファロースの結合されていないカラムからのフロースルー材料を、濃度が１５及び２５％の間のアルブミンとなるまで、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａのクロスフロー上で濃縮する。その後、緩衝液を、ダルベッコＰＢＳ又は代わりに２０ｍＭのホスファート、５０ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ７．０などの細胞培養のための適切な緩衝液へのダイアフィルトレーションによって変える。材料をその後、無菌の段階で滅菌容器へ濾過する。無菌濾過された材料を、外膜ウイルスを破壊し、かつ疎水性の毒素及び汚染物質の除去を支援するための洗浄薬で処理してもよい。好ましい方法において、０．５％のｖ／ｖトリトンＸ−１１４又はＸ−１００を、室温（２３℃未満及び１８℃以上）で１５から２５％のアルブミン溶液に加え、溶液を最も少ない時間で攪拌するか、かき混ぜる。その後、材料を、アルブミンの分子量よりはるかに少ない分子量排除限界を伴う、疎水性のレジン上に通す。多くの市販のレジンは、Ｂｉｏｒａｄ ａｎｄ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからものを含めて、利用可能である。
その後、カラムを通過する材料を、生物活性を確認するため洗浄薬に敏感な細胞において試験してもよい。残存する残余の洗浄薬は、アルブミン溶液に関して典型的に０．００５％未満であるべきである。洗浄性の遊離フロースルーをその後、直接の出荷用の容器へ無菌濾過することができ、又は追加された安定剤を有することができ、又は安定剤で低温殺菌にさらすことができ、又は乾燥の前に加えられる或いは直接乾燥される安定剤を有することができる。材料を凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥してもよい。乾燥前に、いくつかの例において、それは、ＧＥ、Ｐａｌｌ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅから利用可能なものなどの、使い捨てであり有効なウイルス除去カプセルを使用して、材料をウイルスの濾過工程にさらすことに役立つかもしれない。前濾過工程が効果的に及び経済的に２０ｎｍのフィルターを介して濃縮した材料を通すために必要であると理解することは、当該技術分野において一般的である。
結果：イネ粉をリン酸緩衝食塩水において１：５の比率で抽出し、２０分間混合した。液体をＮａｌｇｅｎｅの濾過フラスコを使用して浄化した。その後の浄化した抽出物を、方法に記載されているように酸沈殿にさらした。その後、溶液を濾過し、中和して、浄化された濾液を得た。材料と緩衝液が平衡に保たれるまで、この物質を５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ８．０に対して限外濾過した。その後、材料を、５０ｇ／ｌの結合能力を許容するため、あらかじめ平衡に保たれたＧＥ Ｑ−セファロースカラムに充填した（３００−６００ｃｍｈ）。充填された物質を同じ緩衝液で洗浄し、該物質をその後、上述のような１００ｍＭのホスファート、１０ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ４．０で溶出した。材料を急なピークで溶出し、収集された溶出液は約５．８の安定したｐＨを有した。この方法を使用して生成されたアルブミンを、以下でより十分に開示されるようなアルブミンの他の源と比較した：溶出液をプールに集め、ｐＨが６．０以上となるまで、１ＭのＮａＯＨを加えた。その後、材料を１０ｋＤａの再生セルロース膜上でおよそ５倍に濃縮し、およそ５等量のダイアフィルトレーションを、１００ｍＭのホスファート、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で実行した。最終の限外濾過を行った材料を、アルブミンタンパク含有量（出発物質中の発現レベルに関連して、８０％以上であるべきである）及びエンドトキシンレベル（供給材料に依存して１００ＥＵ／ｍｇ未満であるべきである）について確認する。この物質を、Ｑセファロースカラム上に通し（６０−１６０ｃｍｈ）、およそ２−３倍の充填量を許容するのに充分な大きさの１００ｍＭのホスファート、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）により平衡に保った。物質を同じ緩衝液でレジンにより洗浄し、収集した。収集された材料を、１０ｋＤａの再生セルロース膜の上で限外濾過し、およそ１０倍に、又はアルブミン濃度が少なくとも１０％又は多くとも２０％に達するまで濃縮し、５等量のダイアフィルトレーションを２０ｍＭのホスファート、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０により行なった。無菌の等級濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ ｇｒａｄｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（０．２μｍ）の後、溶液を２０＋／−２℃で、０．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００により１時間攪拌した。インキュベーション後、材料を製造業者の指示に従ってＰａｌｌ ＳＤＲレジンを介して通した。フロースルー材料を滅菌容器へと無菌等級で濾過を行い、タンパク質と食塩水（ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に共通するように、冷却又は凍結乾燥した。
〈実施例３：アルブミンの他の源と比較されるＢ００００Ｃプロセスを使用してイネから生成される組み換え型アルブミンと、アルブミンの生成のための以前の方法の比較〉
方法：実施例２に記載される方法を使用して調製されるアルブミンを、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ（バッチＢ２０２からＢ２１７）を調製するために以前に使用された代替のプロセス（Ｂ０００）を使用して調製されたアルブミンと比較した。
〈アルブミン生成（古いプロセス、Ｂ０００）〉
イネ粉及び２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウムを、ＮａＯＨによりｐＨ６．５になるまで均衡をとり、およそ１：１０のＳ／Ｌ比率により、室温で２０分間混合した。濾過促進剤（Ｃｅｌｌｐｕｒｅ ３００）を１０ｇ／Ｌで加え、スラリーをフィルタプレス、吸引濾過、又は遠心分離によって濾過した。浄化された濾液を、１Ｍの酢酸でｐＨ５．０まで酸沈降した（ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）。結果として生じる溶液を、５ｇ／Ｌの濾過促進剤（Ｃｅｌｌｐｕｒｅ ３００）の追加と共に、上述されるように濾過した。材料を、１ＭのＮａＯＨによりｐＨ６．５〜７．０まですぐに中和した。材料を、抽出に使用される同じ緩衝液の５等量（ｅｑｕａｌ ｄｉａｖｏｌｕｍｅｓ）により限外濾過した（すべてのＵＦＤＦ工程のための１０ｋＤａの再生セルロース）。６０ｃｍｈで、レジン１リットル当たりに結合する８ｇのアルブミンを許容するために、材料をあらかじめ平衡に保たれたＱセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
５つのカラム体積の同じ緩衝液によりカラムを洗浄した後、アルブミンを、１工程において塩の濃度を２５０ｍＭのＮａＣｌにまで増加することにより溶出した。結果として生じる材料を、５−７等量で１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して限外濾過した。結果として生じる材料を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０により平衡に保たれたＱセファロースカラム上に通し、フロースルーとして収集した。フロースルー材料をその後濃縮し、５容量で２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して限外濾過した。最終濃縮された材料を無菌濾過し、１０ｇ／Ｌの洗浄性のＣＨＡＰＳ（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸）でインキュベートし、室温で１時間混合した。１時間のインキュベーションの後、材料をＢｉｏｒａｄ ＳＭ−２カラム上に通した。材料を無菌濾過し、凍結乾燥した。
〈サイズ排除クロマトグラフィー分析〉
ＨＰＬＣによる純度分析を、２１４及び２８０ｎｍに設定された検出器を用いて、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で、ＧＦ−２５０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で１００ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０において行なった。標準曲線は、塩と水分に関して０．９２の補正因子を有する乾燥粉によって作られた５つの異なる稀釈液の注入により進行した。２１４ｎｍからの主なピークを、持続時間又は代わりに基線のいずれかによって統合した。未知のサンプルを、標準の注射の範囲内にある濃度で注入した。乾燥粉重量（純度）につきアルブミンの未知の濃度を標準曲線から計算した。典型的な実験において、標準の０、５、８、１０、１５及び２０μｇを注入し、その後およそ５０μＬの注入量における道のサンプルのおよそ１０μｇを注入した。ピークを統合した後の標準曲線に関する相関係数は、典型的には０．９８以上だった。
〈ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び密度計測：（硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法）〉
サンプルを、各々のタンパク質の定義された量を各々の容器に充填できるようにするために、１−２ｍｇ／ｍｌまでタンパク質溶液を希釈することにより調製した。サンプルを、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００４）を含むトリス−グリシンＳＤＳサンプル緩衝液（ＬＣ２６７３ Ｎｏｖｅｘ）と１：１で混合し、７０℃で５分間加熱した。サンプルを、Ｎｏｖｅｘの４−２０％のプレキャストゲルに充填し（１０、２０、又は３０μｇ）、標準のトリスグリシン−ＳＤＳランニングバッファにおいて定電圧（１３０Ｖ）で分離した。追跡用色素がゲルの終わりに達した時、電気泳動が終了した。分子量マーカーは参照として最初のレーンに含まれた。
ゲルをＧ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（７８６−３５Ｇ）で染色し、水で脱染した。デジタル画像をヒューレットパッカードスキャナ（Ｇ４０１０）により得た。その後、画像ファイルをＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴ（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）で開いた。密度計測を、全ての可視帯が個々のセグメントとして含まれていた２５６のグレイスケールにおける陽画像分析により実行した。背景雑音を、各々のセグメントのためソフトウェアで明白にされるような４角の補間（ｆｏｕｒ ｃｏｒｎｅｒ ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）によって修正した。その後、各々のセグメント又は帯に関するシグナルを、ピクセルの＃及び平均ピクセル強度（０−２５５）の生成物から計算した。全レーンのシグナルの合計（すべての可視のセグメント又は帯）を１００％として得て、不純物帯を、アルブミン純度を計算するために控除した。各々の帯における各々の混在タンパク質の割合を、特定の帯において同定されるすべてのペプチドの総数で分割されるペプチドマッピングによって測定されるようなその汚染物質タンパク質のために同定される、ペプチドの数として計算した。標準偏差が１００％のうち０．５％未満となるように、画像分析を３回繰り返した。
〈パイロジェン ｒＦＣ方法によるエンドトキシンの測定〉
エンドトキシン含有量をパイロジェン ｒＦＣ方法によって測定した。凍結乾燥されたエンドトキシン標準を、標準曲線を進行させるために製造業者（Ｌｏｎｚａ）によって明白にされるようなエンドトキシン遊離水と混合した。タンパク質サンプルを、液体の場合は希釈し、又は代わりに、粉末の場合はエンドトキシン遊離水で再構成した。数値が標準曲線の範囲内に現われるように、異なる稀釈液を調製した。サンプルを、不要な分子の相互作用を分離するため、１００℃で１０分間加熱した。典型的な実験において、サンプルと標準を、容器につき０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５及び０．１のエンドトキシン単位で、容器につき１００μｌで加えた。サンプルも１００μｌで加え、余剰のサンプルを含み、その結果、容器につき０．００１−０．０１のエンドトキシン単位を有するスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）を、アッセイ阻害又は干渉に関して試験するために加えた。作用する試薬を、それぞれ１：４：５の比率で、ｒＦＣ酵素、アッセイ緩衝液、及び基質を混合することにより製造業者（Ｌｏｎｚａ）に従って調製する。作用する試薬を、サンプル又は基質と等量で容器に加えた。蛍光プレートリーダ（Ｂｉｏｔｅｋ ＦＬＸ ８００Ｔ）を３８０ｎｍ（帯域幅＝２０ｎｍ）での励起のために設定し、放射波長を４４０ｎｍ（帯域幅＝３０ｎｍ）に設定した。０時間で得られる数値（ｒｅａｄｉｎｇ）を、３７℃で１時間後に得られる数値から控除する。標準に関する相関係数、勾配、及びＹ切片が一式の制限内にある場合、数値を有効であると考え、スパイク実験は、スパイクがされたエンドトキシンが一式の制限内で測定可能及び復元可能であったことを示す。加えて、標準偏差が、明白にされ、恣意的に選択された制限内にあったように、二重のサンプルに関する標準偏差は合理的な合意にあるべきである。サンプルをすべて無菌的に収集し、試験に使用された管／バイアル／容器を、それらが正確で精密なエンドトキシン試験に関するような優良実験室規範に従う、極端に低いエンドトキシンであると確認した。
〈細胞の生存率の測定〉
ハイブリドーマ細胞株ＡＥ１（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭの塩基性の媒体（ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉａ）において維持した。アルブミンを、ウシ胎児血清を補足することなく、血清遊離の条件（ＡＦＭ６， ＫＣ Ｂｉｏ， Ｋａｎｓａｓ）下で試験した。細胞を、複数の継代にわたって５％のＦＢＳから血清遊離媒体まで継代培養した。各々の継代培養では、細胞をアルブミンの示された濃度が存在する状態での全細胞数と生存率に関して分析した（トリプシン処理、及びＮｅｕｂａｕｅｒ ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用して直接数えることによって評価されるように）。細胞は、培養に関する生存率が測定された後およそ７０時間、標準培養条件（５％のＣＯ２及び３７℃）下で成長した。実験を全く同じように行なった。データは、１０５に分けられた生細胞／ｍｌの数を示す。
〈洗浄薬の測定〉
アルブミンに関する洗浄性の濃度を洗浄薬（細胞ベース）アッセイによって測定する。簡潔に、洗浄薬感受性細胞を異なる量の洗浄薬でスパイクし（ｓｐｉｋｅｄ）、結果として生じる細胞生存率の細胞測定を、１６の独立したデータポイントから成る標準曲線を生成するために使用した。洗浄薬の濃度の変化に対する生存率の変化をプロットし、対数関数と一致させた。その後、この方程式を、同じ細胞ベースのアッセイで試験されるサンプルにおける未知の洗浄薬濃度を計算するために使用した。与えられるデータに関する標準曲線のための相関係数は、０．９８１６であった。典型的には、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍの乾重量当たり約１０ｐｐｍ以上の洗浄薬の濃度は、顕著な毒性の活性をもたらす。１０％のアルブミン溶液における比較により、洗浄薬の濃度が約１００ｐｐｍから２００ｐｐｍ以上又は０．０１％から０．０２％（ｖ／ｖ）であるとき、洗浄薬の毒作用が明らかになる。
〈結果及び考察〉
〈Ｉ．血漿由来の血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｂｕｍｉｎ）、及び実施例２のプロセス（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）及び古いプロセス（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）を使用して生成される組み換え型のＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ）のサイズ排除クロマトグラフィーによる分析〉
３つのタイプのアルブミンに関するＨＰＬＣサイズ排除特性（図１Ａ、Ｃ、及びＤ）は、全体的な純度に関し、異なるアルブミン製剤が一般に類似することを示す。具体的には、およそ４．５ｋＤａ及び２４０ｋＤａのピークは内部制御である一方で、全ての３つの生成物は、約１０−１２ｋＤａでごく少量のオフメインピークシグナル（ｏｆｆ ｍａｉｎ ｐｅａｋ ｓｉｇｎａｌ）を含む。
ヒト血清由来のアルブミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｂｕｍｉｎ）（図１Ａ）は約１７ｋＤａで汚染物質を含む一方で、新しいプロセス（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）（図１Ｃ）を使用する組み換え型イネ由来のアルブミンは、古いプロセス（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）（図１Ｂ）を使用するときよりも著しく高いレベルで、新しいプロセスで作られるＣｅｌｌａｓｔｉｍにおいて生じる、およそ４４ＫＤａ及び５５ｋＤａの２つのタンパク質汚染物質を含む。これらのピークは、ＨＰＬＣ分離で完全には分解しないが、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１及びシグマアルブミン（図１Ｄ）、及び図１Ｅで示される古く新しいプロセスを使用して作られたＣｅｌｌａｓｔｉｍの、覆われた特性（ｏｖｅｒｌａｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）においてよりはっきりと見ることができる。
これらのピークに相当するタンパク質は、更に以下に考察されるように、実施例２に記載のプロセスを使用して生成されたＣｅｌｌａｓｔｉｍにおける主なアルブミンピークのペプチドマスフィンガープリンティング分析によって確認された汚染物質タンパク質のすべての約５％を表わす。
試験されるすべてのアルブミン生成物も、おそらくアルブミン二量体を表わす約１３０ｋＤａでのピークを含み、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ二量体ピークが血漿由来のアルブミンよりかなり小さいことは顕著である。凝集アルブミンの創造は、業界全体における安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｗｉｄｅ）の分解又は損失のため１つのマーカーとして使用されるタンパク質分解の指標である。Ｈｓｐ７０及び他のＨｓｐタンパク質の一般に知られている機能であるため、おそらく、Ｈｓｐｓはアルブミンの脱凝集を促進するＣｅｌｌａｓｔｉｍの中に存在し、それ故、二量体の数を減らす。
〈ＩＩ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｃａｔ Ｎｏ．９３０１−０１）により生成されるアルブミンと比較される、ＣｅｌｌａｓｔｉｍバッチＰ０１７１（新しいプロセス）のＳＤＳ ＰＡＧＥによる分析〉
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２Ａ及びＢ）は、全体的な純度に関し、生成物が一般に類似することを示す。図２Ａは、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１及びＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の比較を示す。レーン１は分子量マーカーである。レーン４はＣｅｌｌａｓｔｉｍアルブミン（１０μｇ）であり、レーン７はＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（１０μｇ）である。図２Ｂは、以前のプロセス（Ｂ０００）（レーン２、３及び４）、及び新しいＣｅｌｌａｓｔｉｍプロセス（Ｂ００００Ｃ）（レーン６、７及び８）からの３つのＣｅｌｌａｓｔｉｍロットのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。６つのサンプルをレーン当たり２０μｇで充填する。
ゲルの目視検査は、より正確な仕様書を満たす新しいプロセスが、試験される３つのロットにおいてより一貫していることを示す（図２Ｂ、レーン２、３、４対レーン６、７、８）。横縞模様は、新しいプロセスと比較して、以前のプロセスからの３つのサンプルの中で著しく異なる。重要なことに、新しいプロセスサンプルは、古いプロセスサンプルが有するよりも著しく少ない約２５０ＫＤａでの凝集体を有する。（古いプロセスに関しては平均２％以上、新しいプロセスに関しては平均１％未満）。新しいプロセスを使用して生成されるＣｅｌｌａｓｔｉｍで濃縮される（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）タンパク質汚染物質の同一性を、更に以下で考察する。
〈ＩＩＩ．エンドトキシン、洗浄薬、及びＣｅｌｌａｓｔｉｍの古く新しいバッチの能力を促進する成長の分析〉
アルブミン（表Ｅ１及びＥ２）のいくつかの異なるロットを調製するための、２つの異なるプロセスの実行の比較は、古いプロセスが、実施例２に記載される新しいプロセスと比較して、著しく多くのエンドトキシン及び洗浄薬を含んでいた組み換え型アルブミンを生成し、細胞の生存率を著しく高めた生成物をもたらしたことを実証する。
考察：実施例２に記載の新しいプロセスを作り出すために古いプロセスを再度計画実行することにより、さらに十分に以下に記載されるように、全体的な生成物の純度及び実行の両方において有意な変化をもたらした。
この変化は、洗浄薬においてさらに低く、エンドトキシンにおいてさらに低く、及び純度を増加した生成物を作ることを可能にした。具体的に、新しいプロセスは、約９５％以上の全体的な純度を有する組み換え型のアルブミンを定期的に生成した。比較して、古い方法は、約９０％の最大の純度を有するアルブミンを定期的に生成した。驚くことに、生成物純度の増加にもかかわらず、プロセスにおけるこれらの変化はまた、組み換え型アルブミンで、熱ショックタンパク質の高められた同時精製をもたらした（以下を参照）。任意の特定の動作理論と組み合わせることなく、高いアルブミン純度、エンドトキシン及び／又は洗浄薬の相対的な欠如、及び熱ショックタンパク質の同時精製の組み合わせは、アルブミンを調製するため以前の方法を有意に行なう生成物をもたらすと信じられている。
具体的に、表Ｅ１及びＥ２は、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍを生成する新しいプロセスが、例えば５ｍｇ／ｍｌで、細胞の生存率（５ｍｇ／ｍｌでの）における平均のバッチ間で１００パーセントの改善をもたらす生成物をもたらし、また、古いプロセスより平均１００倍少ないエンドトキシン、及び１００倍少ない洗浄薬を有する生成物をもたらすことを実証する。
〈実施例４：細胞増殖と生存率に対する効果の分析〉
本発明の補足物の能力を促進する細胞増殖を促進する能力を、他の市販のアルブミン生成物と比較するために、アルブミンの異なる源を、細胞増殖と生存率アッセイにおいて並行して比較した。試験される３つの生成物は、（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ，Ｌｏｔ ＃ Ｐ０１５３）Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｃａｔ Ｎｏ．＃９３０１−０１）及び血漿由来のアルブミン（Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｃａｔ Ｎｏ．＃ＨＳ−４００−６０）であった。
方法：特別に調整されたハイブリドーマ細胞ＡＥ１を、残余の培地を取り除くために同じ培地で２度洗浄した後、培地１ｍｌ当たりの０．５×１０５の細胞の密度で、ＤＦ１２／ＩＴＳＥにおいて播種した。その後、培地と細胞を、未処理のままにし（陰性対照）、Ｓｅｒａｃａｒｅアルブミンで処理し、Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミンで処理し、及び図の説明文で示される濃度でＣｅｌｌａｓｔｉｍにより処理した。細胞を、培養に関する生存率が測定された後およそ７０時間、標準培養条件（５％のＣＯ２及び３７℃）下で成長させた。実験を複製して行なった。結果を図３に示す。
結果：Ｎｏｖａｚｙｍｅ’ｓ Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅは、生存率（並行線模様の棒（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈ ｂａｒ））における損失を引き起こした。Ｓｅｒａｃａｒｅアルブミン（白い棒）は、生存率における測定可能な増加を引き起こしたが、イネのｈｓｐｓ（黒い棒）を有する組み換え型アルブミンを含む本発明の補足物と共に見られるのもの程、大きな増加ではない。これらの条件下で、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍは、試験される任意の濃度で、他のアルブミン生成物のいずれかと比較される細胞の生存率を促進する際に、およそ５倍活性であった。陰性対照を、縞模様の棒に表わす。
考察：他の市販のアルブミン生成物が、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍに対する類似した全体的な純度、エンドトキシン、及び洗浄薬レベルを有する可能性を考慮すると、他の市販のアルブミンと比較される本発明の組み換え型アルブミンの劇的に優れたパフォーマンスは、血清由来のアルブミン（実施例２）と比較されるＣｅｌｌａｓｔｉｍで確認される、以前に確認されていないタンパク質汚染物質が、細胞の生存率に陽性の影響を及ぼすかもしれないことを示唆する。これらタンパク質のＣｅｌｌａｓｔｉｍの特性への影響を確認し、その後特徴づけるため、以下に記載のように、組み換え型アルブミンのサンプルをペプチドマスフィンガープリンティングにさらした。
〈実施例５：組み換え型ヒト血清アルブミンのペプチドマスフィンガープリンティング〉
方法：アルブミンのサンプルを、ＮａｎｏＬＣＭＳ／ＭＳペプチド配列決定システム（ＰｒｏｔＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、及びペプチド断片の分子量に基づいてタンパク質を確認する専売のソフトウェアを使用して、著しいタンパク質汚染物質を測定するために分析した。要するに、アルブミンのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、主要なバンドゲルバンド（ｂａｎｄ ｇｅｌ ｂａｎｄ）を脱染し、きれいにし、配列決定段階修正トリプシン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｒａｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｒｙｐｓｉｎ）で、ゲル内で消化した。結果として生じるペプチド混合物を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムによって分析し、それにおいて、７５マイクロメートルの内径逆相Ｃ１８カラムでの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、イオントラップ質量分光計と組み合わされてインラインで使用された。獲得した質量分光計のデータを、ＰｒｏｔＴｅｃｈの専売のソフトウェアスイートで最近の非重複のタンパク質データベースを調査するために使用した。データベース調査からの出力を、報告前に手動で検証した。
結果：組み換え型アルブミンの３つの代表的なロットの試験に際して、３つのＨｓｐ７０タンパク質をペプチドマスフィンガープリンティングによって確認した（表Ｅ３）。３つの特異的な配列を次のように確認した：ＡＢＦ９５２６７、ＡＢＡ９７２１１及びＢＡＤ ０７９３８を、非常に関連性のある相同タンパク質を確認するために非重複性のデータベースと比較した。これらの比較の各々からトップヒット（ｔｏｐ ｈｉｔ）の結果を、表Ｅ４、Ｅ５及びＥ６で示す。
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００８ Ｊａｎ；３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５−３０）における、タンパク質配列の非重複性のデータベースにおけるＡＢＦ９５２６７配列に対する配列比較の結果を、以下表Ｅ４に示す。
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）における、タンパク質配列の非重複性のデータベースにおける配列に対するＡＢＢ６３４６９の配列比較の結果を、以下表Ｅ５に示す。
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）における、タンパク質配列の非重複性のデータベースにおける配列に対する配列ＡＢＡ９７２１１に対する配列比較の結果を、以下表Ｅ６に示す。
考察：ペプチドマスフィンガープリンティングは、アルブミンにより同時精製する３つのイネの熱ショックタンパク質のスーパーファミリーメンバー、２つのイネのＨＳＰ７０遺伝子、（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３、及びイネの内乳組織（内乳の管腔の結合タンパク質）からのＡＡＢ６３４６９−ＢｉＰ同族体を確認した。これら遺伝子によってコード化された完全なアミノ酸配列を、以下に記載する：
遺伝子ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜熱ショックタンパク質７０［イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｊａｐｏｎｉｃａ Ｇｒｏｕｐ）］ＨＳＰ７０を、およそ０．０７％の重量／重量で、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍにおける組み換え型アルブミンで生じることを見出した。その完全なアミノ酸コード配列を以下のように提供する：
イネの内乳組織（内乳の管腔の結合タンパク質［イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）］）ＢｉＰからのＡＡＢ６３４６９ ＢｉＰ同族体を、約０．０９％の重量／重量でＣｅｌｌａｓｔｉｍにおける組み換え型のアルブミンで生じることを見出した。その完全なアミノ酸コード配列を以下のように提供する：
ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８［インディカ種（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｉｎｄｉｃａ Ｇｒｏｕｐ）］ストロマＨＳＰ７０を、約０．０６％の重量／重量で、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍにおける組み換え型アルブミンで生じることを見出した。その完全なアミノ酸コード配列を以下のように提供する：
これらのタンパク質が、単にアルブミンに相対するＣｅｌｌａｓｔｉｍの新しいバッチにおいて低レベルで生じるため、これらの汚染物質がＣｅｌｌａｓｔｉｍの新しいバッチの効果を促進するより優れた成長に実際に関与することを確認するための必須条件は、アルブミンに対するこれらの成分の追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ ｂａｃｋ）が、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍにおける各々の成分に関して実際に確認されるものに匹敵するレベルで、アルブミンの活性を促進する成長を修復するか促進するかどうかを測定することである。
〈実施例６：親和性クロマトグラフィーによる組み換え型アルブミンからの熱ショックタンパク質の分離〉
方法：新しいプロセス［ロットＰ０１５３、Ｐ０１５６、及び／又はＰ０１７１］粉末を使用して生成されるＣｅｌｌａｓｔｉｍを、およそ２０ｇ／Ｌで精製水と混合した。結果として生じる溶液を、少なくとも５等量の緩衝液により、５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．０に対して限外濾過した。結果として生じる溶液をＡＴＰアガロースカラムに通し、結果として生じるフロースルーを画分Ａとして標識化した。カラムを５カラム体積の平衡緩衝液で洗浄し、ＡＴＰアガロースに結合する材料を５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、１ＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出した材料を、画分Ｂとして標識化した。洗浄を画分Ｃとして続けた。画分Ａを１００ｇ／ｌまで直接濃縮し、ｄ−ＰＢＳで限外濾過した。画分Ｂを、更なる分析のため、５０ｍＭのトリス／Ｃｌにおいて２０倍又は１００倍にまで著しく濃縮した。洗浄画分Ｃを更なる参照のために続けた。ウェスタンブロッティング法に関して、１０μｇの各々のタンパク質画分（Ａ２８０による、アルブミンのｅ．ｃ（消衰係数）が０．５３ｃｍ２／ｍｇであり、Ｈｓｐ７０のｅ．ｃが０．４１ｃｍ２／ｍｇである場合）を、２Ｘ ＳＤＳの添加液における４−２０％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに充填した。サンプルを充填前に８０℃でおよそ５分間加熱した。分離を２００Ｖ（定電圧）で行い、およそ９０分間行った。結果として生じるゲルを３０分から２時間の間、水ですすぎ、次に、タンパク質を２時間３０ｍＡ（定電流）で、ニトロセルロース膜に移した。結果として生じるブロットは、転送制御として分子量マーカータンパク質を含み、次に、水中の５％（ｗ／ｖ）の粉乳において遮断された。主要な単クローン抗体（マウス抗ウシＨｓｐ７０（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｈ５１４７））を、５％のミルク溶液対ブロット（１：２５００）に加え、ブロットを４℃で一晩、温和な揺動によりロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上でインキュベートした。その後、ブロットを、ＴＤＮ、及び１：２５００の希釈に加えられた５％の乳溶液中の二次的な抗体（結合したピアス抗マウスＨＲＰ）において各々１０分間、４回洗浄した。４℃で２〜３時間のインキュベーションの後、ブロットを、各々１０分間ＴＤＮで４回洗浄した。その後、結果として生じるブロットを、５分間ピコ（ピアス）化学発光基質によりインキュベートした。コダックの写真用フィルムを暗室でブロットにさらし、後のフィルムを現像し、すすぎ、固定し、すすぎ、乾燥した。フィルム上の分子量マーカー位置の正確な伝送を測定するため、光を発する標識を使用した。
結果：結果を図４に示す。撮影されるウエスタンブロットは、分離計画が、Ａ（フロースルー）及びＢ（ＡＴＰ結束）画分においてタンパク質の２つの個体群を生成することを示す。出発材料（レーン２）、画分Ａフロースルー（レーン３）、画分Ｃ洗浄（レーン４）、及び画分Ｂ（レーン５）を、単クローン抗体に反応する能力に関して試験した。加えて、陽性対照として役立つ市販のＨｓｐ７０タンパク質を、最後のレーン（レーン１０）に充填した。図４のブロットで示されるように、フロースルー画分Ａ（レーン３）は、有意な量のＨｓｐ７０を含んでいない。溶出され、濃縮された画分Ｂ（レーン４）は、ブロットで示されるような抗体に非常に反応的であり、少なくとも２つの別の帯が７５ｋＤａの分子量マーカーに集中することを示す。洗浄画分Ｃ（レーン５）は、７５ｋＤａよりわずか下で流れる（ｒｕｎ）、２つの帯の存在を示す。別々の独立した実験において、フロースルー画分Ａ（レーン７）は再び、抗体に反応的ではなく、洗浄画分Ｃ（レーン８）も抗体に反応的ではないが、レーン９に示されるＡＴＰ結合タンパク質で濃縮された画分（画分Ｂ）は、最初の分離から見られたものと同じ横縞模様を与える。
考察：分離プロトコルを、ＡＴＰアガロース親和性レジンに結合する能力に基づきＨＳＰ７０タンパク質を分離するために進行し、その有効性に関して試験した。その手順は、単にＡＴＰアガロース、及び緩衝液変化を濃縮及び実行するための限外濾過、及びｈｓｐｓの存在を検出する抗ｈｓｐ７０抗体を使用する、単なる最小のサンプル操作を含んだ。手順（図４）の結果は、１０μｇの出発原料、１０μｇのフロースルー、又は１０μｇの洗浄画分において、ａｎｔ−Ｈｓｐ抗体によって検出される不十分なｈｓｐ７０があることを明確に実証する。対照的に、ＡＴＰアガロースカラムから溶出された画分において、抗Ｈｓｐ７０抗体によって明らかに認識される少なくとも２つのタンパク質を含んでいる。それ故、結果は、分離計画が２つの独立したクロマトグラフィー実行（ｒｕｎ）及びダイアフィルトレーションに成功し予測可能だったことを示す。更に、データは、ペプチドマスフィンガープリンティングによって作られた熱ショックタンパク質の識別を実証し、これらのタンパク質が機能的であり、単純なＡＴＰアガロースクロマトグラフィー、その後ダイアフィルトレーションによって容易に分離され、濃縮されたことを実証する。熱ショックタンパク質が組み換え型アルブミンにより同時精製することが結論付けられる。そのような同時精製は、熱ショックタンパク質がアルブミンに結合され、アルブミンが安定立体配座において熱ショックタンパク質を安定させるために作用するという仮説と一致している。驚くことに、組み換え型アルブミン／熱ショックタンパク質複合体は、機能熱ショックタンパク質（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の存在と一致する著しいＡＴＰアーゼ活性（示されないデータ）を保持する。この増加した活性を、下記に述べられるような効果を促進する成長を提供するものと更に確認した。
〈実施例７：細胞の生存率上のＣｅｌｌａｓｔｉｍからのＨｓｐｓの除去の影響〉
方法：実施例６に記載の分離計画も、細胞培養検査（図５）に適している画分Ａを生成するために使用した。ＡＴＰアガロースカラムを通って流され、その後ダイアフィルトレーションによって濃縮され、細胞培養に適しているＰＢＳにより緩衝されるため、方法は画分Ａの最小の操作を含む。方法の意図は、実験に新しい変数を導入しないことであり、その結果、生存率の喪失が見られるが、幾つかの他の理由により、あるいはＡＴＰ結合タンパク質の除去を越えて引き起こす。画分Ａを、ハイブリドーマ細胞培養生存率を促進する能力に関して、純粋な対照（出発材料）に対して試験した。試験の結果を図５に示す。
結果：図５に示されるように、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ出発材料（平行線模様の棒）、また部分Ａ（固体の棒（ｓｏｌｉｄ ｂａｒｓ））を、同じ濃度で試験し、陰性対照（縞模様の棒）と比較した。統計的に有意な減少は、試験される４つの濃度すべてに顕著である。結果は、ＡＴＰアガロース処理の後にＣｅｌｌａｓｔｉｍのパフォーマンスにおいて著しい損失があったことを示す。処理は、ＡＴＰ結合タンパク質の除去の前に、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍと比較して、２８．０、２１．７、２６．７、及び７９．５％の損失をもたらした。この実験において、注意（ｃａｒｅ）は、サンプル処理によりパフォーマンスの任意の不注意な損失を保証するためのサンプルの設計及び処理において払われ、あるいは新しい汚染物質の偶発性の導入が最小限にされた。
考察：細胞培養結果（図５）は、単にＡＴＰ結合カラムに通すことにより、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍのパフォーマンスを減少させることが可能であることを実証する。このデータは、実施例５において示される結果と組み合わせた時、ＡＴＰアガロースカラムによるアルブミンからのｈｓｐｓの枯渇が、アルブミンの特性を促進する細胞増殖を直接減少させることを実証する。それ故、この結果は、アルブミンのより優れた特性が、少なくとも一部で、アルブミンにおける汚染熱ショックタンパク質から生じることを実証する。
〈実施例８：振とう培養における細胞増殖及び生存率に対する効果の分析〉
細胞が、フラスコ及びバイオリアクターを振り混ぜることにより高密度で成長するときに、細胞増殖と生存率への本発明の補足物の効果を測定するため、一連の研究を直接比較した。
方法：ヒト化単クローン抗体を発現するＣＨＯ Ｋ１細胞を、研究前に、１０ｍｇ／Ｌのインスリンを含む無血清の塩基培地（ＳＦＭ４ＣＨＯ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｃｌｏｎｅ）に６週間に適応させた。適応された細胞を、バンキング（ｂａｎｋｉｎｇ）のため振とうフラスコで成長させた。細胞をバンクし（ｂａｎｋｅｄ）、ＤＭＳＯ ８％のｖ／ｖを有する成長培地で構成された低温保存培地中の液体窒素に保管した。
振とうフラスコ実験において、細胞を、塩基培地、又は３．０ｘ１０５生細胞／ｍｌの濃度で、１２５ｍｌ／振とうフラスコＣｏｒｎｉｎｇ ＃４３１４０５中の３０ｍｌの培地において補足物を含む培地に播種した。細胞を、実行の長さに関して１１０ＲＰＭで、加湿されたＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃に維持した。流加回分バイオリアクター実験を、塩基培地、又は補足物を備えた塩基培地において、１Ｌ又は２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＥ）で行なった。細胞を、３．０×１０５生細胞／ｍｌで０日目に播種した。バイオリアクター温度、ｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）を監視し、自動化されたコントローラーによって制御した。リアクター温度を、加熱したブランケットによって３７℃に維持した。培養ｐＨを、ＣＯ２又は６％のＮａ２ＣＯ３の追加によって７．１に維持した。通気を、１０ｍｌ／分で円筒状の焼結したスパージャによって行なった。溶解酸素を、培地へＯ２を断続的に散布することにより、５０％の空気飽和で制御した。撹拌翼の撹拌率を１８０ＲＰＭに維持した。
培養中に、バイオリアクターサンプルを、オフライン分析のために周期的に得た。生細胞密度（ＶＣＤ）及び細胞の生存率を、０．４％のトリパンブルーの膜排除、及びＢｅｃｋｍａｎ ＶｉＣｅｌｌ細胞カウンタにより細胞を数えることによって測定した。幾つかの場合において、生細胞密度及び細胞の生存率を、細胞の生存率死（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｉｅ）の排除、Ｖｉａｃｏｕｎｔ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、その後製造業者によって指示されるようなＧｕａｖａ ＰＣＡ細胞カウンタ上での分析によって測定した。グルコース、及びラクタートの濃度を、Ｎｏｖａ ４００ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｚｅｒを使用する標準臨床分析を使用して測定した。特異的な純成長率及び特異的な純死亡率を、Ｇａｕｄｙ ｅｔ ａｌ． （Ｇｕａｄｙ， ＡＦ， Ａ． Ｏｂａｙｓａｈｉ， ａｎｄ Ｅ．Ｔ． Ｇａｕｄｙ． １９７１． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２２（６）： ｐ． １０４１−１０４７）によって測定した。抗体の濃度を、製造業者の指示（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従って抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって測定した。培地の補足物は、組み換え型ヒトアルブミン（実施例２に記載されるようなＣｅｌｌａｓｔｉｍ）、又は組み換え型ヒトラクトフェリン（ｒＬＦ、Ｌａｃｒｏｍｉｎ（Ｌ））、或いは両方のタンパク質の組み合わせを含んだ。補足物を、他に示されない限り、０日目に播種する細胞に加える。複数の実験を、特に明記されない限り（ｅｘｃｅｐｔ ｗｈｅｒｅ ｎｏｔｅｄ）、上記の同じパラメーター下で、振とうフラスコ及びバイオリアクターシステムの両方において行なった。
結果：図６Ａは、振とうフラスコにおける補足された又は補足されていない（対照）塩基培地で成長する細胞の生細胞密度ＶＣＤを示す。この実験において、細胞を、塩基培地又は３．０ｘ１０５の生細胞／ｍｌの濃度で、１２５ｍｌ／振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４３１４０５）中の３０ｍｌの培地において、補足物を含む培地で播種した。細胞を、実行の長さに関して１１０ＲＰＭで、加湿したＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃に維持し、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ、又は０日目からのＣｅｌｌａｓｔｉｍとラクトフェリンの１：１の混合物のいずれかの示された濃度の存在又は欠如下で成長した。図は、細胞がより高密度にまで成長し、補足されていない培地と比較して、本発明の補足物を備えた培地においてより高密度で残ったことを示す。驚くことに、この実験において、生存率を、５００ｍｇ／ｍｌのＣｅｌｌａｓｔｉｍと同様に、２５０ｍｇ／ｍｌのＣｅｌｌａｓｔｉｍの濃度に維持した。図６Ｂは、振とうフラスコに存在する生細胞の割合（％生存率）を示す。データは、補足物が培地に存在する場合に、細胞がより高い生存率を維持したことを示す。したがって、本発明の補足物は、補足物の欠如下で成長する対照細胞が比較される実験の期間を通じて、完全な生細胞密度及び細胞のパーセンテージ生存率の両方を増加させた。図７Ａは、補足された及び補足されない対照培地において、振とうフラスコ中の成長曲線の異なる相における細胞の比増殖速度を示す。補足された細胞が０−８日を通じて陽性の成長率を維持した一方で、特異的な純成長率は、補足されていない培養において５−８日目でかなり減少することに注意する。図７Ｂは、成長曲線の３つの相の間に細胞の特異的な純死亡率を示す。補足されていない培地で成長する細胞が、５−８日の間に最大ピーク死亡率に達したことに注意する。補足物を備えた培地で成長する細胞は、補足されていない対照インキュベーションと比較して、９−１０日目で、その後最大の死亡率に達した。
〈実施例９：細胞の生存率及び密度並びに生成物の生成に与える補足物の効果〉
方法：細胞を、塩基培地、又は３．０ｘ１０５の生細胞／ｍｌの濃度での１２５ｍｌ／振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３１４０５）における３０ｍｌの培地において、補足物を含む培地に播種した。細胞を、実行の長さに関する１１０ＲＰＭで、加湿したＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃に維持し、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ、又はＣｅｌｌａｓｔｉｍとラクトフェリンの１：１の混合物のいずれかの示された濃度の存在下又は欠如下で成長した。この実験において、補足物を０日目に加え、栄養の追加免疫（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔ）（飼料）を、製造業者（効果的な飼料Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って４日目に加えた。
結果：４日目に栄養素飼料により追加免疫された時、振とうフラスコ中の補足されない及び補足された培地におけるＣＨＯ−Ｋ１の成長特性を、図８Ａに示す。グラフは、補足されていない対照と比較して、１６日目で補足物を伴う培地において成長する時、細胞がより高い細胞密度を獲得したことを示す。図８Ｂは、補足されていない対照と比較して、４日目で栄養素飼料により追加免疫された時、振とうフラスコに存在する生細胞の割合（％生存率）を示す。データは、本発明の補足物が４日目に栄養素飼料に加えて使用される培地に存在した時、細胞がより高い生存率を維持したことを示す。図９Ａは、補足されていない対照フラスコと比較して、４日目に栄養素飼料により追加免疫される補足物において、振とうフラスコ研究における成長曲線の異なる相における細胞の比増殖速度を示す。補足された細胞が、０−８日を通じて陽性の成長率を維持したことに注意する。図９Ｂは、成長曲線（４日目に栄養素飼料により追加免疫される）の４つの異なる相の間の、細胞の特異的な純死亡率を示す。補足された培地で成長する細胞が、１２−１６日目により低い細胞死を示したことに注意する。図９Ｃは、振とうフラスコ中の補足された及び補足されていない対照培地において成長するＣＨＯ Ｋ１によって生成された、抗体生成物の濃度を示す。培地における単クローン抗体（ＭＡｂ）濃度は、補足された培地においてより高かった。細胞によって生成され、培地へ分泌される抗体の濃度を、それらの手順（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従った抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって測定した。
〈実施例１０：有害事象からの保護〉
方法：細胞を、塩基培地、又は３．０ｘ１０５の生細胞／ｍｌの濃度での１２５ｍｌ／振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３１４０５）における３０ｍｌの培地において、補足物を含む培地に播種した。細胞を、実行の長さに関する１０ＲＰＭで、加湿したＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃に維持し、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ、又はＣｅｌｌａｓｔｉｍとラクトフェリンの１：１の混合物のいずれかの示された濃度の存在下又は欠如下で成長した。この実験において、説明されない事象は、細胞を伴うバイオリアクターの充填中に細胞死を引き起こした。
結果：図１０Ａと１０Ｂは、補足物がバイオリアクター操作中に有害事象から細胞を保護することを示す。補足された培地で成長するＣＨＯ Ｋ１細胞は、有害事象を乗り越え（ｓｕｒｖｉｅｄ）、高密度にまで成長し（図１０Ａ）、高い生存能力（ｖｉａｂｌｉｌｉｔｙ）に達した（図１０Ｂ）。補足されていない対照培地で成長する細胞は、成長しなかった。
〈実施例１１：バイオリアクターにおいて２重の栄養素飼料を有する補足物の活性〉
２５０ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍで補足された培地と比較して、補足されていない対照培地で細胞が成長するとき、細胞増殖とバイオリアクターパフォーマンスを比較するために、一連の実験（Ｅｘｐ４）も、バイオリアクター中で行なった。
方法：流加回分バイオリアクター実験は、上述のように、塩基培地、又は補足物を備えた塩基培地において、１Ｌ又は２ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＮＥ）にて行なった。培養を、製造業者によって指示されるような栄養素飼料（効果的な飼料Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、３日目と７日目に追加免疫した。したがって、これらのデータは、２重の追加免疫の飼料ストラテジー（ｄｕａｌ−ｂｏｏｓｔ ｆｅｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ）と組み合わせた補足物の効果を示す。加えて、ｐＨを第１栄養素飼料により７．２から６．８まで低くした。
結果：補足された培地で成長する細胞は、補足されていない培地で成長する細胞よりも高い最大の細胞密度にまで成長した（図１１Ａ）。細胞は、対照培地における８００万の生細胞／ｍｌと比較して、補足物により１１００万の生細胞／ｍｌの密度に達した。比増殖速度を、成長特性の異なる相のために計算した。図１１Ｂで示されるように、補足物は、前飼料期間の０−３日目において最も成長率を増加させた。図１２Ａと１２Ｂは、生細胞の割合、及び３日目と７日目に２重の栄養素の追加免疫を使用する、補足された及び補足されていない培地を伴うバイオリアクターで成長するＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的な死亡率を示す。細胞のより高い密度にもかかわらず、補足されて成長する細胞は、１３日目を通じて大多数の高い生存率を維持した。また、特異的な死亡率は、細胞のより高い密度にもかかわらず、１３日目を通じて類似していた。図１３Ａと１３Ｂは、補足された及び補足されていない培地を使用するバイオリアクターで成長するＣＨＯ Ｋ１に関するｐＨとモル浸透圧濃度傾向（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ ｔｒｅｎｄｓ）を示した。細胞を、３日目（ｐＨが７．１０から６．８まで低くなった時点）に供給した。ｐＨを、７日目に第２飼料によって６．８に維持した。図１３Ａは、補足物がバイオリアクター内のｐＨの調節に悪影響を及ぼさず、ｐＨ制御が維持されたことを示す。図１３Ｂは、補足された及び補足されていない培地において成長する細胞のモル浸透圧濃度傾向を示す。補足された培地のモル浸透圧濃度は、補足されていない培地よりも低く、３００の標準のモル浸透圧濃度により近かった。このデータは、補足物がより低いモル浸透圧濃度を都合好くもたらしたことを示す。図１４ＡとＢは、バイオリアクター（３日目及び７日目に栄養素飼料を伴う）中の補足された及び補足されていない培地において成長するＣＨＯ Ｋ１に関するグルコース及びラクタート傾向（ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ ｔｒｅｎｄｓ）を示す。グルコースレベルは、補足された及び補足されない培地において類似した。しかしながら、ラクタートのレベルは、補足物を備えた培地において都合好くより低かった。図１５ＡとＢは、３日目及び７日目に栄養素飼料を伴うバイオリアクター中の補足された及び補足されていない培地において成長する、ＣＨＯ Ｋ１細胞の特異的なグルコース消耗及び特異的なラクタート消耗を示す。データは、補足された培地において細胞がより少ないグルコースを都合好く消耗したことを示す。データはまた、補足された培地において細胞がより少ないラクタートを都合好く生成したことを示す。図１６ＡとＢは、３日目及び７日目に栄養素飼料を伴うバイオリアクター中の補足された及び補足されていない培地において成長するＣＨＯ Ｋ１細胞の、生成される抗体の濃度及び抗体の比生成性を示す。補足された培地において細胞が成長する時、生成された抗体の濃度はかなり高かった。補足された及び補足されていない培地において細胞が成長する時、抗体の特異的な生成は類似した。
〈実施例１２：接種材料での、又は栄養素飼料を伴う補足物の比較（ＥＸＰ４振とうフラスコ研究）〉
方法：ＣＨＯ Ｋ１細胞を、１２５ｍｌの振とうフラスコ中の３０ｍｌの培地における３．０×１０５の生細胞／ｍｌにて、上述のような培地へ播種した。これらの実験において、細胞に、３日目及び７日目に栄養素飼料を与えた（製造業者によって指示されるように、効果的な飼料Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。補足物を、０日目に細胞の接種材料（ｉｎｎｏｃｕｌｕｍ）に加え、又は３日目に第１栄養素飼料に加えた。
結果：データ（図示せず）は、補足物が０日目対３日目に加えられてもそうでなくても、グルコースレベル、モル浸透圧濃度、ｐＨ、ラクタートレベル又は生成、グルコースレベル又はグルコース消耗における違いがほとんどないことを示した。しかしながら、補足物が接種材料に加えられた時、後期（１１日目）の始めに、生成性に適度の改善があった。表Ｅ７は、補足物が０日目に加えられ、又は３日目に供給された時、ＣＨＯ Ｋ１によって生成されるパーセント改善生成物を示す。補足物が無いものと比較して、より多くの生成物が補足物により生成され、及び細胞の接種材料を有する補足物を加えることにより、飼料を有する補足物を加えることと比較して、より多くの生成物が生成された。
表Ｅ８は、振とうフラスコ及びバイオリアクター培養システムにおける様々な実験において、補足された培地で見られたパーセント改善を示す。
〈実施例１３：下流の抗体精製へのＣｅｌｌａｓｔｉｍ及びＬａｃｒｏｍｉｎの影響〉
以下のデータは、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ及び組み換え型ヒトラクトフェリン（Ｌａｃｒｏｍｉｎ）が、培地の補足物として使用された時、細胞の上清から回復した抗体の収量及び全体的な純度に陽性の影響を及ぼすことを示す。
方法：インターロイキン８（ａ−ＩＬ＊）に対し抗体を生成するＣＨＯ Ｋ１細胞は、補足物を備えた、又は上述のような補足物のない成長培地だった。対照培養は、補足されていない培地を使用した。細胞は、３つの補足物のいずれかを備えた培地で成長した：１）２５０ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍ、２）５００ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍ、又は３）１２５ｍｇ／ＬのＣｅｌｌａｓｔｉｍ及び１２５ｍｇ／Ｌのラクトフェリン（Ｌａｃｒｏｍｉｎ）。
図１７Ａで概略的に示されるように、細胞の生存率が８０−５０％に達した時、培地をバッチの末端で細胞から採取した。微粒子の細胞破壊片を、遠心分離と０．２のマイクロフィルターを通す精密濾過によって、採取された細胞培養ブロスから最初に取り除いた。濾液（上清）を、タンパク質Ａカラムの２つの大きさのどちらかにわたって処理した：前／後のＡＫＴＡパイロットサンプル検査のためのＧＥ−ＡＥＫＴＡｐｒｉｍｅ（１ｍｌのタンパク質Ａクロマトグラフィーカラムを有する小規模親和性クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ（商標） ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標） ＳｕＲｅ））、又はＧＥ−ＡＥＫＴＡｐｉｌｏｔ（１００ｍｌのタンパク質Ａクロマトグラフィーカラムを伴う親和性クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＸＫ５０ ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標） ＳｕＲｅ））。溶出プロファイルの結果を図１７Ｂに示す。
タンパク質Ａクロマトグラフィーの後、溶出された抗体を、製造業者によって記載されるような１０ｋＤ ＧＥ ＫＶＩＣＫ（商標）スタートポリエーテルスルフォン膜を備えたＡＥＫＴＡクロスフロー装置を使用して、限外濾過（Ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濃縮した。精製後、抗体を、クーマシーブルー及びシルバー染色を利用して、不純物及び標的タンパク質の存在を検出するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
結果：図１８は、抗体の精製を示すクーマシーブルー染色での様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、及びタンパク質Ａクロマトグラフィーによる培地の補足物の成功的な除去を示す。図１９は、抗体の精製を示すシルバー染色での様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、及びタンパク質Ａクロマトグラフィーによる培地の補足物の成功的な除去を示す。補足物のすべての場合において、抗体の精製を高める。これらゲルは、本発明の補足物の使用が、ｉ）生成物のより高い収量、ｉｉ）正確に折り重ねられた形態；具体的には正確に組まれた多重結合の抗体の重鎖及び軽鎖において濃縮される生成物、ｉｉｉ）高純度の生成物、ｉｖ）他の内因性の細胞タンパク質によってあまり汚染されない生成物、及びｉｖ）本発明の補足物なしで作られた生成物のバッチと比較して、細胞のプロテアーゼによってあまり分解されない生成物、を確立する。更に、以下の表Ｅ９で示されるように、採取された培地からの抗体の回復も、培地における補足物により改善する。
これらのデータは、補足物を異なる濃度で、及び異なる培地の組成物と組み合わせて使用することができ、及びタンパク質Ａクロマトグラフィーの後に、生成物回復の純度に対し負に影響を与えることが無い回復の陽性の効果を有することができることを示す。重要なことに、この実施例は、本発明の補足物が、精製工程中の生成物回収の改善、及び精製の各々の工程中にあまり汚染されていない細胞タンパク質を含む生成物による、生成物精製の改善のより優れた方法を提供することを実証する。このような生成物は、改善された生物活性、安定性を示すと予想され、及び本発明の補足物なしで作られる生成物と比較して、あまり免疫原性及び異質遺伝子型でないことが予想される。

Claims (72)

  1. 培養中の細胞の細胞増殖を高める方法であって、
    前記方法は、
    細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  2. 無血清培地に適応させた細胞の生産性を高めるための方法であって、
    前記方法は、
    無血清培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  3. バイオリアクター中の乳酸塩の蓄積を減少させるための方法であって、
    前記方法は、
    バイオリアクター中の培養中の細胞に、補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  4. バイオリアクター中のグルコースおよび他の糖の消費を減少させる方法であって、
    前記方法は、
    バイオリアクター中の培養中の細胞に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  5. 培養の開始からバイオリアクター中での採取までの、タンパク質を生成するのに必要な時間を減少させる方法であって、
    前記方法は、
    バイオリアクター中の培養中の細胞に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  6. バイオリアクター中の細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    バイオリアクターに、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  7. 無血清条件下で成長させた細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    無血清培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  8. 低密度で平板培養した際の細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  9. 単細胞クローンから成長させた細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  10. 培養物中で成長させたプライマリー細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  11. トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    トランスフェクションの前、間、または、直後の細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  12. 凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    凍結保存または解凍の前、間、または、直後の細胞培地に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  13. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物の収量を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  14. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物の精製を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  15. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物のタンパク質分解を減少させるための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  16. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物の生物活性を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  17. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物の安定性を改善するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  18. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物のアセンブリを改善するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  19. 培養中の細胞から生成された組み換え生成物のヒトパターンに近いグリコシル化を形成するための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  20. 免疫原性の少ない培養中の細胞から生成された組み換え生成物を作るための方法であって、
    前記方法は、
    培養物に、組み換えアルブミンを含む補足物を追加する工程を含み、
    前記組み換えアルブミンは植物中で生成され、
    前記補足物は約１ＥＵエンドトキシン／１ｍｇアルブミン未満を有し、および、
    前記アルブミンは約２％未満の凝集アルブミンを含むことを特徴とする方法。
  21. 培養中の細胞の生存率が増加することを特徴とする請求項１３乃至２０のいずれかに記載の方法。
  22. 細胞は組織培養細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  23. 細胞はＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  24. 細胞はハイブリドーマ細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  25. 細胞はベロ細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  26. 細胞はフローサイトメトリーによって選別されることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  27. 細胞はプライマリー細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  28. プライマリー細胞は幹細胞であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  29. プライマリー細胞はＢ細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  30. プライマリー細胞はＴ細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  31. 細胞はＢ細胞であるか、または、Ｂ細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  32. 細胞はＴ細胞であるか、または、Ｔ細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  33. 細胞はフローサイトメトリーによって単離されることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  34. 細胞はマイクロ流体素子によって単離されることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  35. 細胞は単細胞のサブクローニングによって単離されることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
  36. 生成物は、タンパク質、ワクチン、細胞に関連する細菌またはウイルスであることを特徴とする請求項１３乃至２１のいずれかに記載の方法。
  37. タンパク質は抗体であることを特徴とする請求項４、１３乃至２１のいずれかに記載の方法。
  38. タンパク質は組み換えタンパク質であることを特徴とする請求項１３乃至２１のいずれかに記載の方法。
  39. タンパク質は単量体であることを特徴とする乃至２１のいずれかに記載の方法。
  40. タンパク質は多量体タンパク質であることを特徴とする請求項１３乃至２１のいずれかに記載の方法。
  41. 抗体は完全長であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  42. 抗体は一本鎖抗体であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  43. 前記補足物は熱ショックタンパク質の少なくとも約０．０１％ｗｔ／ｗｔを含むことを特徴とする請求項１乃至４２のいずれかに記載の方法。
  44. 前記熱ショックタンパク質はイネの熱ショックタンパク質であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  45. 前記熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子とイネの胚乳腔の結合タンパク質とからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  46. 熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８、および、ＡＡＢ６３４６９からなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  47. 前記補足物は少なくとも約０．０１％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  48. 前記補足物は少なくとも約０．０４％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  49. 前記補足物は少なくとも約０．０６％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  50. 前記補足物は少なくとも約０．０８％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  51. 前記補足物は少なくとも約０．１％ｗｔ／ｗｔＨＳＰ７０を含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  52. 前記組み換えアルブミンは、約１００ｍｇ／Ｌと約２００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  53. 前記組み換えアルブミンは、約２００ｍｇ／Ｌと約４００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  54. 前記組み換えアルブミンは、約４００ｍｇ／Ｌと約６００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  55. 前記組み換えアルブミンは、約６００ｍｇ／Ｌと約８００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  56. 前記組み換えアルブミンは、約８００ｍｇ／Ｌと約１０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  57. 前記組み換えアルブミンは、約１０００ｍｇ／Ｌと約２０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  58. 前記組み換えアルブミンは、約２０００ｍｇ／Ｌと約５０００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  59. 前記組み換えアルブミンは、約５０００ｍｇ／Ｌと約１００００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  60. 前記組み換えアルブミンは、約１００００ｍｇ／Ｌと約２００００ｍｇ／Ｌの間の最終濃度になるまで加えられることを特徴とする請求項１乃至５１のいずれかに記載の方法。
  61. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  62. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１５％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  63. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、２０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  64. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、２５％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  65. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、３０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  66. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、４０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  67. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、５０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  68. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、６０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  69. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、７０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  70. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、８０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  71. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、９０％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
  72. 細胞の生存率の改善は、理想的な条件下であるが、前記補足物を含まない条件下で成長させた細胞の細胞生存率と比較して、１００％以上であることを特徴とする請求項６乃至１２、および、２１のいずれかに記載の方法。
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