JP2013509361A

JP2013509361A - ステロイド化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション

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Publication number: JP2013509361A
Application number: JP2012535617A
Authority: JP
Inventors: 玉玲対; 学軍夏; 瑞芳郭; 鵬霄張; 鋭韓; 招▲ねい▼ 付; 翠萍周; 仁芸汪; 篶嘉金
Original assignee: 中国医学科学院葯物研究所
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2010-10-28
Publication date: 2013-03-14
Also published as: CN102686217A; JP2014133764A; KR20140041952A; WO2011050739A1; EP2494957A4; KR20120091257A; CN102686217B; HK1175707A1; CN104224711A; AU2010312021B2; AU2016210620A1; BR112012010148A2; CA2779166A1; US20120308616A1; AU2010312021A1; EP2494957A1; CN104224711B; KR20160137646A; CA2779166C; CN102048688B

Abstract

【課題】リポソーム材料の含有量が低く、封入率が高く、長期貯蔵における品質安定性に優れるタクソールサブマイクロエマルションを提供する。
【解決手段】本発明はタクソールサブマイクロエマルション剤の一種を公開した。本発明のサブマイクロエマルション剤は、タクソールステロイド化合物、注射用油類、注射用水、乳化剤、補助乳化剤や等張性剤を含む。紹介したタクソールステロイド化合物の中で、タクソールとステロイドのモル比は1:0.2~4で、1:0.25~2を優先選択する。本発明はタクソールサブマイクロエマルション剤の作製方法や用途も公開した。ステロイド化合物を中間担体として、ステロイド化合物を利用した薬物油溶性に改善して、タクソールステロイド化合物を油相に溶け、400nm平均の粒径以下、pH3.5-6の水中で油サブマイクロエマルション剤を作製し、悪性腫瘍の治療に用いた。より高い安全性と有効性を持つ。
【選択図】図１

Description

本発明は、一つステロイド化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤及びその作製やり方にかかわり、本発明も同タクソールサブマイクロエマルション剤の用途にかかわり、医薬製剤の技術分野に属する。

タクソール(paditaxel，Taxol)は、重要な抗腫瘍活性をもつ、臨床では卵巣癌や乳癌・非小細胞肺がんや頭頸部がんなどの治療に広く使われている。そのはほぼ水(0.006μg/ml)に溶解しないので、現在、臨床に用いたタクソールの一般注射剤Taxol（登録商標）がCremopher EL(クレモフォールEL)/エタノール(50:50、v/v)の混合溶液5mlを采用して30mgのタクソールを溶解することで作られている。処方の中で大量のCremopher ELに含まれているために、体内のヒスタミンが釈放しやすく、大変なアレルギー反応となった。このため、臨床使用時には.次のように脱感処理しなければならない：治療の前12時間には10mg経口デキサメタゾン、治療前の6時間にはもう一度経口デキサメタゾン10mg、治療前の30 ~ 60分には筋肉注射がベネドリル20mg、静脈注射がシメチジン300mgまたはラニチジン50mgである。このようにもかかわらず、5~30%臨床の患者たちが依然として異常にのアレルギー反応を見せた。また、Cremopher EL /アルコール可溶化タクソール濃溶液を薄めて、物理的安定性の問題を存在する、たとえば環境温度が低いや滴注長時間、発散薬物ができることがあり、隠れた危険がある。

タクソール注射剤の問題点については、タクソールが市場に出回る後の二十数年で、国内外の薬剤学従事者は幅広く新型の釈薬システムの研究を繰り広げた、技術プログラムに関係しているものはシクロデキストリン包接化合物、リポソーム、高分子ミセル、ナノ粒などが含まれている。

シクロデキストリン包接化合物はタクソール溶解度を増加することができるが、シクロデキストリン用量が大きすぎての厳しい腎臓毒性を誘発しやすい、そして水を薄めて発散薬物がやすいため、現在でも臨床に入ることができない。

リポソームは封入率が低いため、長期貯蔵が漏洩しやすい、そして水を薄めて発散薬物がやすいの上で欠陥があり、産業化の発展が困難で、海外には20年間の研究を経験したが、結局は製品発売されていることを見えない。国内では早期(2004年)の承認されたタクソールリポソーム（Liposome) 凍結乾燥粉末の注射薬は1本あたり30mg薬物を含有し、規格や臨床使用剤量が市販の一般注射液と一致して、効果が特に違いがあるものがない、しかし中間調合の部分を増加した、しかも同様に脱感前処理を采用しなければならず、技術の優位性は明らかではない。

タクソール高分子ミセルについては、国内外の研究が非常に活発になったが、装薬量も低く、放置した後の品質が不安定であるため、保存の場合では凍結乾燥しなければならない、産業化の発展を制限している。近年では、新しいタイプの高分子材料の大量に出現することにつれて、高分子ミセルの研究技術が急速な発展を実現させるが、大量の新しい構造のポリマー材料を生体内に導入したのは、その臨床用薬の安全性はつぶさに観察することに待たなければならない。

2005年、米国のバイオサイエンス公司がFDAによって市場に出回る許可を獲得したの注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒(符丁ABI-007)は、これまで国際で最も影響力のある国際特許の保護タクソール新製剤である。その技術提案は、ヒトのアルブミン血で薬物担体として、タクソールをアルブミン接合型ナノ粒に作られている、無菌濾過と冷凍乾燥した後、1本当たりタクソール100mgとアルブミン900mgの凍結乾燥粉末の注射薬を含有しているものがついていた。一般の注射液に比べ、注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒の優位が2つ側を体現している、1) 処方の中でCremopher ELが含まれない、過敏反応を完全に取り除いた、国際で唯一脱感処理の必要ではないとして直接使用されているタクソール新製剤になる。2) 毒性の削減、耐受性を高めるのために、臨床の患者が使用されている剤量には一般注射液の135~175mg/m² から260mg/m²までが高めた、臨床治療効果がタクソール一般注射液よりもはるかに優れている。しかし担体材料アルブミンの用量が大きいため、値段が高すぎる(1本が6200人民元)、また中間の調合操作が非常に複雑で、要求が厳しいので、アルブミン接合型タクソールナノ粒の臨床応用を制限した。

水中で油サブマイクロエマルションは薬物の親脂肪性によって、薬物を油相に溶解する、天然のリン脂質を乳化剤として、高圧均質の乳化作製を経過して、平均粒径600nm以下の乳液を得る。薬物は内油相に存在することにより、水と空気の接触を免れ、難溶性薬物の溶解度が低いと安定性不良で液体製剤の作ることに不利な欠陥を克服できる。リポソーム技術に比べて、サブマイクロエマルションがさらに産業化の発展優位を持っています。アルブミン接合型ナノ粒に比べ、サブマイクロエマルションの製造コストも低い、端末で滅菌を采用することができ、臨床では直接的な点滴注入することができ、薬物を析出しにくいため、使用の場合では便利安全便利である。それで、サブマイクロエマルションを担体としてタクソール新製剤を発展することは良好な将来性がある。国内外の学者はタクソールサブマイクロエマルションに対して大量の試してみるにもかかわらず、タクソール水溶性が悪いだけでなく、同時に油の中で溶解度も小さい(約0.25mg/ml)、直接的な作製のサブマイクロエマルションの載量が0.02mg/mlより低い、また殺菌や貯蔵過程で薬物は油相からが水相まで転移しやすい、乳剤の破損、層間剥離や凝集を引き起こす。油の中でタクソールの溶解度が低いの制限され、これまで国際には薬の載量が高い、耐熱圧滅菌および長期貯蔵を経て品質安定のタクソールサブマイクロエマルション製剤を開発できない。

油相の中で薬物の溶解度を高めるため、物理化学的性質についてタクソールサブマイクロエマルション剤の研究に対しての制限を突破するため、前期では「タクソールリポソーム化合物」や「リポソーム化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤」に対して研究してきており、また二つの発明特許を申請した:申請番号は200810168213.Xの「タクソールリポソーム化合物」と申請番号は200810168212.5の「リポソーム化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤」である。

200810168213.Xに公開されたタクソールリポソーム化合物は、天然卵黄レシチン、大豆リン脂質とコレステロールのリポソーム材料を優先選択する、タクソールとリポソーム材料の重さの割合は1:1~19、すなわちリポソーム材料の用量がタクソールの1~19倍に達する(その中ではリン脂質をリポソーム材料として場合、タクソールとリポソーム材料のモル比は約1:1~20で、コレステロールをリポソーム材料として場合、タクソールとリポソーム材料のモル比は約1:2.2~42で、コール酸をリポソーム材料として場合、タクソールとリポソーム材料のモル比は約1:2.1~40である)。200810168212.5に公開されたサブマイクロエマルション剤は、200810168213.Xに公開されたタクソールリポソーム化合物を中間担体とする。

中国特許第200810168213.X号明細書中国特許第200810168212.5号明細書

タクソールリポソーム化合物の作製目的は、油の中でタクソール溶解度を向上させるために、サブマイクロエマルションの作製に良い中間担体を提供する。しかしさらにの研究結果によると、200810168213.Xと200810168212.5特許の中で技術案は次の欠陥を存在するものである:

1、リン脂質をリポソーム材料として化合物を作製するの際、薬物の油溶性に改善効果があるが、ただ最大の2mg/mlに達することができるだけ、さらにリン脂質の使用量を向上させることが油の中で溶解度を引き続き高めるわけではない。油の中で溶解度が低いの制限することによる、リン脂質化合物を中間担体としてサブマイクロエマルション剤を作製するの際、最大の薬物負荷は0.5mg/ml程度に放置して達するだけであり、また封入率が80%よりも低い、6ヵ月放置後、層間剥離がはっきりしてきた、臨床の需要を満たすことができない。薬物負荷は1.0mg/mlに達する時には均一な乳剤を形成できない。

2、コレステロールをリポソーム材料として化合物を作製する際、薬物の油溶性について改善効果が明らかにリン脂質より優れているが、コレステロールがステロイド類リポソーム材料で、その用量がタクソール重量の1~19倍に達し、多くの弊害を存在する、（1）摂取量があまり大きい：健康の大人がコレステロールの摂取量は、おおかた300mg~500mg(1~2個の卵黄のコレステロール量に相当する)で、タクソール臨床の投薬量が約300mgで、 200810168213.X特許ではコレステロール化合物とその製剤にかかわるものによって、コレステロール300mg~5700mgに相当するものを摂取し、最高では19個の卵黄に相当し、明らかに高い、隠れた危険がある。。
（2）作製のサブマイクロエマルションを長期貯蔵は不安定である:コレステロール化合物を中間担体としてサブマイクロエマルションを作製の場合、治療剤の用量や特定のタクソール濃度によって、化合物の中のリポソーム材料の用量が高ければ高いほど、サブマイクロエマルションの内油相の中で包まれた化合物量が多くなる。内油相の中の油滴体積や油水インタフェースの制限によって、包まれた化合物総量は油相と油水インタフェースの内容物を超える場合、一部の薬が外水相へ遊離することになり、そのため封入率が下げ、また作製のサブマイクロエマルション剤が不安定である。200810168212.5特許の説明によってサブマイクロエマルションを視察することを経て、封入率は65~85%で、4℃で貯蔵6ヵ月の質は比較的安定しているが、貯蔵12ヵ月の時まで、明らかに層間剥離現象を出現し、マークアップ含有量が低下し、タクソール不純物が明らかに上昇する。（3）作製コストが高い：リポソーム材料の使用量が大きく、作製過程で溶剤用量は大きく、溶剤を振り回して乾燥することに必要な時間が長く、したがって製造コストが高いことになり、薬物経済学の原則に合わない。

リポソーム材料の含有量が低い、封入率が高い、安定性が良いサブマイクロエマルション剤を提供するために、本申請が大量の実験を経て、リポソーム材料用量が低いステロイド化合物を採用して中間担体として、サブマイクロエマルション剤を作製する。ステロイド化合物の中で、タクソール /ステロイドのモル比は1：0.2~4で、1:0.25~2を優先選択し、さらに1:0.33~1を優先選択する。対応して、タクソールとステロイドの重量の割合は1:0.09~1:1.94で、1:0.11~1:0.97を優先選択し、さらに1:0.15~1:0.49を優先選択する。200810168212.5特許に比べて、本申請の化合物はステロイド用量が大幅に減少した状況の下にも依然としてタクソールを完全に化合させることができ、薬物を油の中で溶解度をもっとも大きな向上させている。さらにステロイド用量を増やす、溶解度が安定に向かう、さらに作用を増加させることではない。ステロイド化合物によって薬物の油溶性を改善し、化合物を油相の中に溶解し、乳化剤、補補助乳化剤の選択して使用を通じて、封入率が高く、長期貯蔵における品質安定、ステロイド含有量が低いのタクソールサブマイクロエマルションを手に入れ，したがって本発明をやり遂げた。

発明内容
本発明の一つ目的は、一種タクソールサブマイクロエマルション剤を提供することである。それはタクソール/ステロイド化合物、注射用油、注射用水、乳化剤、補補助乳化剤と等張性剤を含める。前述のタクソール/ステロイド化合物の中のステロイドは、天然ステロイドやその派生物の中で少なくとも1種もある。前述の天然ステロイドは、コレステロール、7-水素化コレステロール(別名7 -脱水素コレステロール)、ラノステロール、シトステロール、ブラシカステロール、真菌ステロイド、イタボガキ属ステロールやスチグマステロール、マイケルステロールやエルゴステロールから選択する。コレステロール、7-水素化コレステロールとエルゴステロールを優先選択し、さらにコレステロールを優先選択する。前述の天然ステロイド派生物は、コール酸、デオキシコール酸、チェノーデオキシコール酸から選択する。

本発明のサブマイクロエマルション剤の乳液滴径は、400nm平均以下で、300nm以下の乳液を優先選択する。油相の用量の割合は前述のサブマイクロエマルション剤総量の5~35%(ml/ ml)で、10~30%(ml/ml) を優先選択する。タクソールとして計算すれば、装薬量が0.25mg/ml~5mg/mlで、0.5mg/ml ~2mgを優先選択する。

本発明では前述のタクソール/ステロイド化合物には次のようなやり方1または2によって作製できる、
やり方1の次第:
a . タクソールをステロイドと比例によって混ぜて、適当量の有機溶剤を加入して溶解し、任意選択で抗酸化安定剤を加入する。
b . 適当の温度の条件の下で攪はんして、回転蒸発あるいはスプレー乾燥を通じて、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥を得る。

やり方2の次第:
a .一定の割合タクソールとステロイドを取り、それぞれ適当量の多様な有機溶剤を加入して溶解させ、それを混ぜて、任意選択で抗酸化安定剤を加入する。
b．適当の温度の条件の下で攪はんして、回転蒸発あるいはスプレー乾燥を通じて、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥してそれを得る。

上述のタクソール/ステロイド化合物やその作製やり方の中で、タクソールとステロイドのモル比は1:0.2~4、1:0.25~2を優先選択し、さらに1:0.33~1を優先選択する。相応して、タクソールとステロイドの重量比率は1:0.09~1:1.94で、1:0.11~1:0.97を優先選択し、さらに1:0.15~1:0.49を優先選択する。

上述のタクソール/ステロイド化合物の作製やり方の中で、前述の有機溶剤はジクロロメタン、エタノール、メタノール、ベンジルアルコール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、三級ブタノールの一種や多様なものから選択できる。エタノール、アセトン、酢酸エチルとテトラヒドロフランの一種や多様を優先選択できる。「適量の有機溶剤」の中の「適量」と言うのは、本分野の技術者が慣例技術に従って、タクソールとステロイドの混合物を溶解することを確認できるの量は、具体的に、タクソールとステロイド化合物を溶液の中で濃度がタクソールで計算し、0.5~16mg/mlやより高い値を抑制し、1.0~8.0mg/mlを優先選択する。「適当の温度の条件」は、10℃-70℃を抑制するということで、35-55℃を優先選択し、たとえば25℃、35℃、45℃、55℃あるいは70℃である。攪拌の反応時間と真空乾燥の時間も本分野の技術者で通常技術どおり確定することができる、例えば撹拌反応の時間が0.5~3.0時間ができ、例えば0.5時間、1.0時間、1.5時間や2.0時間で、真空乾燥の時間は8時間-48時間ができ、例えば8時間、12時間、16時間や24時間である。前述の抗酸化安定剤が亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ビタミンC、EDTAと塩、トコフェロールとその派生物の中の少なくとも一種から選択でき、抗酸化安定剤の用量は本分野がリポソーム化合物を作製して通常の容量を採用することである。一般的に、化合物総量の1%(重量)を超えない。

本発明では前述の注射用油として、長鎖の油と中鎖の油の一種あるいはそれらの混合物から選択することである。前述の長鎖の油は長鎖脂肪酸と長鎖脂肪酸エステルと長鎖脂肪アルコールの中の一種から選択し、具体的には大豆油、ヒマシ油、リノール酸、コーン油、オリーブオイル、ピーナッツ油、綿実油、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、グリセリルモノオレエート、セチルアルコールから選択できる。前述の中鎖の油は中鎖脂肪酸と中鎖脂肪酸エステルの一種から選択する。優先選択した長鎖の油が長鎖脂肪酸エステルで、具体的には注射用大豆油である。優先選択した中鎖の油が中鎖脂肪酸グリセリドである。

本発明では前述の乳化剤は非イオン界面活性剤や天然界面活性剤です。非イオン界面活性剤が脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビンアルコールおよびソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、ビタミンE派生物類やポリウレタンオレフィン共重合体のうち少なくとも一種から選択する。前述の天然界面活性剤として、卵黄レシチンや大豆リン脂質、コレステロールとコール酸、アルギン酸ナトリウムやキトサンのうち少なくとも一種から選択する。優先選択した乳化剤は天然界面活性剤で、最も優先選択した乳化剤は天然の卵黄レシチンや大豆レシチンである。乳化剤は本発明したサブマイクロエマルション剤の中の含有量は、サブマイクロエマルション剤組合物総量の0.5~5%(g/ml)で、1.0%-4.0% (g/ml) を優先選択し、最も1.0%-2.0% (g/ml)を優先選択する。

本発明では前述の補補助乳化剤はポリエチレングリコール（PEG）類とポロキサマー類から選択する。補助乳化剤の含有量は、サブマイクロエマルション剤総量の0%~5%(g/ml)で、0.5%- 3%(g/ml)を優先選択し、最も1.0%-2.0%(g/ml)を優先選択する。

本発明では、タクソールサブマイクロエマルションの浸透圧調節剤(等張性剤)として、グリセロール、キシリトール、ソルビンアルコール (糖)とマンニトールの一種や多様なものから選択し、グリセロールとグルコースを優先選択し、最もグリセロールを優先選択する。
グリセロール含有量は本発明のタクソールサブマイクロエマルション剤総量の1. 0~3.0%(g/ml)で、1.5~2.5%g/ml)を優先選択する。
本発明では前述のタクソールサブマイクロエマルション剤も安定剤を加入することもでき、オレイン酸、オレイン酸ナトリウムやPEG類の一種から選択し、優先選択した安定剤がオレイン酸やPEGで、最もオレイン酸を優先選択する。
オレイン酸の含有量は本発明のタクソールサブマイクロエマルション剤総量の0.05-0.5%（g/ml）で、0.1-0.2%（g/ml）を優先選択する。

本発明のタクソールサブマイクロエマルション剤は酸化防止剤が含まれています。また、ビタミンEやビタミンEエステル派生物を選択でき、ビタミンEを優先選択する。
本発明では前述の「一種又はその混合物」や「少なくとも一種」は選択した物質の中の一種または2種類の混合物とか、もっと多様な混合物である。

本発明のもう一つの目的は紹介したタクソールサブマイクロエマルション剤の一種の作製やり方を提供することで、その手順は次のとおり：
▲注射用水を取り、乳化剤、補補助乳化剤と等張性剤を加入して、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の水相を分散で作られ、40-80℃まで加熱し、温度を保つ。

▲タクソール/ステロイド化合物を別に取り、任意選択で安定剤と一緒に40-80℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている
▲攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、10000-20000回転/ min切り取り5~10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転し、粒径を抑制して400nm以下まで均質乳化して、300nm以下を優先選択し、全部乳液を収集し、塩酸でpH 3.5~6.0まで調節し、4.0~5.0を優先選択し、また適切な水を添加してそれを得ることになる。

本発明もタクソールサブマイクロエマルション剤の別に一つの作製やり方を提供して、
それは以下の次第を含める：
▲注射用水を取り、乳化剤、補補助乳化剤と等張性剤を加入して、攪拌して水相になり、40-80℃まで加熱し、温度を保つ。
▲タクソール/ステロイド化合物、乳化剤/又は安定剤を別に取り、40-80℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている。
▲攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、10000-20000回転/ min切り取り5~10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転して乳化する、粒径を抑制して400nm以下まで、100-300nm以下を優先選択し、全部乳液を収集し、塩酸でpH 3.5~6.0まで調節し、4.0~5.0を優先選択し、また適量の水を添加する(全量まで)、それを得ることになる。

本発明の作製やり方では、高圧均質機の中で乳化することは、別に乳化やり方によって実現できれば、均一に乳化して、前述の粒径に達すれば良いです。温度40~80℃というのは40℃、50℃、60℃、70℃や80℃などが含まれている。

本発明の作製のやり方では、pHを調節することの塩酸濃度は、本分野の通常の調節pHの塩酸濃度を采用でき、たとえば0.1mol/L、または0.01mol/Lをできる。そのうち注射用水、注射用油の用量は、本分野の技術者が本発明で提示した油相の割合によって完全に確認できる。「適量の水を添加する(全量まで)」とは、水相を作製する際に水の用量を采用することを除いては、当分野の技術者が通常技術によって水に加入して、本発明が紹介した装薬量の水の用量に合致するようになった。

本発明も一種の製剤を提供して、それは本発明に紹介したタクソールサブマイクロエマルション剤を含め、この製剤が臨床にいかなる剤型を使うことができ、輸液剤や干乳剤の形式が含まれている。うちの輸液剤が次のようにやり方を通じて作製するものである：本発明に紹介したタクソールサブマイクロエマルション剤をバルキング後、流通スチーム殺菌や熱圧滅菌の無菌工芸処理することによって、それを得る。うちの干乳剤が次のようにやり方を通じて作製することである: 本発明に紹介したタクソールサブマイクロエマルション剤にプロッパントを適量入れる、無菌濾過処理を経てした後、冷凍乾燥工芸を采用して干乳剤を作られている。マンニトールを優先選択してプロッパントとする、例えば5%（w/v)のマンニトールである。

本発明も作製した抗がん剤の中で応用されたタクソールサブマイクロエマルション剤を提供して,前述の癌は固形腫瘍で、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、頭癌や頚癌、食道癌、腎臓癌、肝臓癌や胃癌が含まれている。

本発明では特別な指摘がなかったとしたら、本文に科学と技術の用語や名称を用いたことは、いずれも本発明の分野に所属している一般技術者の通常の理解と似たような意味を持つ。そして特別な指摘がなかったとしたら、このうち、物質とその含有量や比例、装置や機器、作製条件など採用したことは、すべて本分野の技術者がよく知っているあるいはその本発明の説明を根拠して知ることができる。

本発明が提供したタクソールサブマイクロエマルション剤は、特別に以下のような利点を持つ:

1）作製がコストも低い、類コレステロールの摂取量が少ない:本発明のタクソールサブマイクロエマルションは、リポソーム材料の低いステロイド化合物を使った中間担体とする、化合物の中でステロイドの使用量がわずかタクソールの重さの0.09~1.94倍(0.11~0.97倍を優先選択する)であるため、200810168212.5が公開した「リポソーム化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤」の技術に比べて、本特許申請がリポソーム材料の用量を大きく減少し、作製コストを低下した、大量のステロイド物質を摂取して潜在安全上の問題を誘発することが減少する。

2）封入率が高い、安定性がいい：臨床タクソール単回用量は135〜175mg/m²で、すなわち1人当たり1回が約240~300mgである。別に人体毎回のサブマイクロエマルション体積を受け入れることができることによって、タクソールサブマイクロエマルション剤の単回用量の体積は100~500 mlを抑制しなければならない。これによって計算すれば、サブマイクロエマルション剤の中でタクソールの濃度は0.48mg/ml-3.0mg/mlを抑制しなければならない。200810168212.5が公開した「リポソーム化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤」によると、このうちリン脂質化合物を中間担体として作製のサブマイクロエマルション剤の最大の装薬量は0.5mg/mlで、かつ放置した後が安定していない。コレステロールを中間担体として作製のサブマイクロエマルション剤は、装薬量を引き上げることができるが、コレステロールの用量もタクソールの1~19倍に達し、タクソールサブマイクロエマルション剤の中で包んで化合物総量が1.2 mg/ml--60mg/mに達することになる。本特許申請には、ステロイド化合物を中間担体として作製のサブマイクロエマルション剤の中では、ステロイド用量はわずかタクソール重量の0.09 ~1.94倍(0.11~0.97倍を優先選択する)で、乳剤の中で包んで化合物総量はわずか1.14mg/ml~ 3.60mg/ml(1.39mg/ml~1.80mg/mlを優先選択する)である。これによって、本発明の製剤安定性がいっそう良い、人体にいっそう安全である。

水中で油サブマイクロエマルション剤について、脂溶性薬物は分布は、油相と/あるいは油水界面に分布しているが、その内油相の油滴体積や油水界面の容量は有限で、投入した総量が多ければ多いほど、乳剤の封入率が低いほど、外水相に遊離している薬物が多く、サブマイクロエマルション剤の長期貯蔵の安定性も悪くなった。200810168212.5の公開技術に比べて、本特許はリポソーム材料の用量が低いステロイド化合物を使用した中間担体として、油相の中で包んで化合物総量が大幅に減少し、サブマイクロエマルション剤の封入率を上げ、水相の中で遊離している薬物が下げ、製剤安全性を上げることに有利である。

研究の結果を対比して、200810168212.5で公開されたサブマイクロエマルション剤の封入率は65~85%で、冷蔵庫で(4℃、以下に同じ)12ヵ月を貯蔵して、層間剥離、含有量が低下し、不純物は初期の時の1%以下から3.5%~7.6%までことが高くなる。本特許申請のサブマイクロエマルション製剤の封入率が90%以上de1、、冷蔵庫で12ヵ月を貯蔵して層間剥離を見ず、外観が均一の乳白色で、粒径および含有量とも明らかに変化ではない、不純物の総含有量は1.7%より低く、優先選択した載薬量の範囲内では封入率が95%以上になり、不純物総量が1.0%より低く、品質が安定している。

3）安全性が良い、許容量が大きい：市販されている一般の注射液に比べ、本発明で提供したサブマイクロエマルション剤は、エタノールやCremopher ELを含有しない、タクソール製剤の血管刺激性を低下した、Cremopher ELによるアレルギー反応と毒副役割を免れた、安全性を向上させ、許容量が増加し、使用薬剤量を向上させ、治療効果を改善するのために良い基盤となった。ヌードマウスを3日ごとに1回ずつ静脈注射して、合計3回投薬して、市販されている一般注射液の最大の許容量(動物死亡を発生しない)は20mg/kgで、本特許申請のサブマイクロエマルション剤が45mg/kgで、許容量が2.25倍まで増え、文献に報道された注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒子の許容量と似ている(一般注射液の2.23倍まで増えた)。許容量の下で抗腫瘍活性を比較した結果によると、20mg/kgの一般注射液%と45mg/kg注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒子を比較すると、本特許申請サブマイクロエマルション剤45mg/kgの投薬は、乳がん、卵巣癌や肺癌の腫瘍の抑制率が最も高く、腫瘍成長のスピードが一般注射液、注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒子より著しく低い水準にある。

次に付図説明と実施例を参照比較して本発明をさらに詳しく説明しているが、本分野の技術者たちは理解しなければならない、本発明がこれらの実施例と使用の作製やり方に限らず。また分野の技術者が本発明の説明に基づいて本発明に対して同等の代替、組み合わせ、改良や修飾を行うことができるが、これらは本発明の範囲内が含まれる。

実験例2サブマイクロエマルションの安定性HPLC考察図鑑（図Aタクソールの対照；図B空白乳剤；図Cサブマイクロエマルション14の初期；図Dサブマイクロエマルション14が4℃に貯蔵12カ月；図Eサブマイクロエマルション31が4℃に貯蔵12カ月。その中でピーク1がタクソールで、ピーク2~3が不純物である）。実験例6さまざまな製剤がMDA-MB-231腫瘍に対する抑制作用実験例6さまざまな製剤を投薬した後MDA-MB-231モデルマウス媒介性腫瘍の変化実験例6さまざまな製剤がMDA-MB-231腫瘍ヌードマウス体重に影響する

具体的な実施方式

実施例1 タクソールステロイド化合物

実験化合物1~実験化合物6:本発明特許の技術要求のとおりに、コレステロール、7 水素化コレステロールとエルゴステロールを選択して使用したリポソーム材料として、2組タクソール/コレステロール化合物モル比は1:1と1:2)、2組タクソール/7 水素化コレステロール化合物(モル比は1:1と1:4)、2組タクソール/エルゴステロール化合物(モル比は1:1と1:4)を作製する。具体的に作製やり方: タクソールとステロイドをいっしょに三角フラスコの中に置いて、アセトン2000mlをその中に入れて溶解し、40℃温度の条件の下で1時間で攪拌する回転蒸発器の中に移す、回転蒸発法によって溶剤を取り除く、40℃減圧と真空乾燥24時間によって得ることができる。

参照比較化合物1~参照比較化合物4:200810168212.5特許の中の化合物の技術要求によって、リン脂質とコレステロールを選択して使用したリポソーム材料として、2組タクソール/リン脂質化合物(モル比は1:6と1:10)、2組タクソール/コレステロール化合物(モル比は1:10と1：20)を作製する。具体的に作製やり方は実験化合物1 ~実験化合物6と同じである。
6組の実験化合物と4組参照比較化合物の構成および作製結果は下の表を参照比較してください。

実施例2：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
▲ 約130 ~ 140ml注射用水を取り、処方量によって卵黄レシチン、ポロキサマー(188)とグリセロールを加入して、ワーリングブレンダーの中に入れて分散し、均一の水相を作られ、40℃まで加熱し、温度を保つ。

▲処方量によって大豆油を取り、40℃まで予熱し、実施例1の作製したタクソールコレステロール化合物1を量って取り、予熱の大豆油の中に溶かして、ワーリングブレンダーの中に入れて均一の油相を分散で作られる。

▲攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、10000回転/ min切り取り5~10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転して、6回均質を行って、全部乳液を収集し、0.1mol/L塩酸でpH を4.0±0.5まで調節し、また水を200mlまで添加し、均等に振り、分けて入れ、115℃/ 30分で滅菌し、それを得ることになる。

サブマイクロエマルション1-サブマイクロエマルション4、乳化剤(卵黄レシチン)の用量は、それぞれサブマイクロエマルション剤の総量の1.0%(g/ml)と1.2%(g /ml)と1.5%(g/ml)と1.5%(g/ml)である。補助乳化剤ポロキサマー(188)の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の0.5%(g/ml)と1.0%(g/ml)、2.0(g/ml)と3.0%(g/ ml)である。タクソールの装薬量は、それぞれ0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ225nm、，233nm、245nm、230nmである。

実施例3：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
▲約130 ~ 140ml注射用水を取り、処方量によってポロキサマー(188)とグリセロールを加入して、ワーリングブレンダーの中に入れて分散し、均一の水相を作られ、80℃まで加熱し、.温度を保つ。
▲処方量によって大豆油を量っ取り、80℃まで予熱し、処方量によって化合物2、卵黄レシチンやビタミンEを量って取り、予熱の大豆油の中に入れ、ワーリングブレンダーの中に入れて均一透明の油相を分散溶解で作られる。

▲攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、20000回転/ min切り取り10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転して、6回均質を行って、全部乳液を収集し、0.1mol/L塩酸でpH 5.5±0.5まで調節し、また水を200mlまで添加し、均等に振り、分けて入れ、115℃/ 30分で滅菌し、それを得ることになる。

サブマイクロエマルション5-サブマイクロエマルション8、乳化剤(卵黄レシチン)の用量は、それぞれサブマイクロエマルション剤の総量の1.0%(g/ml)と1.2%(g /ml)と1.5%(g/ml)と1.5%(g/ml)である。補助乳化剤ポロキサマー(188)の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の1.2%(g/ml)と2.0%(g/ml)、2.0(g/ml)と3.0%(g/ ml)である。タクソールの装薬量は、それぞれ0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ246nm、262nm、231nm、242nmである。

実施例4：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
実施例3と同じである。そのうちpH値を5.0±0.5に調節する。
サブマイクロエマルション9-サブマイクロエマルション12、乳化剤(大豆リン脂質)の用量は、それぞれサブマイクロエマルション剤の総量の1.2%(g/ml)と1.2%(g /ml)と1.2%(g/ml)と1.5%(g/ml)である。補助乳化剤ポロキサマー(188)の用量は、みなサブマイクロエマルション剤の総量の2.0(g/ml)である。タクソールの装薬量は、それぞれ0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/mlと5.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ165nm、153nm、127nm、138nmである。

実施例5：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
実施例3と同じである。そのうちpH値を4.5±0.5に調節する。
サブマイクロエマルション13-サブマイクロエマルション16、乳化剤(大豆リン脂質)の含有量は、それぞれサブマイクロエマルション剤の総量の1.2%(g/ml)と1.2%(g /ml)と1.2%(g/ml)と2.0%(g/ml)である。補助乳化剤ポロキサマー(188)の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の1.5%(g/ml)、1.5%(g/ml)、2.0%(g/ml) と2.0%(g/ml))である。タクソールの装薬量は、それぞれ1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/mlと5.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ145nm、138nm、133nm、146nmである。

実施例6：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
実施例2と同じである。そのうちpH値を5.5±0.5に調節する。
サブマイクロエマルション17-サブマイクロエマルション20、乳化剤(卵黄レシチン)の含有量は、それぞれサブマイクロエマルション剤の総量の1.5%(g/ml)、1.5%(g/ml)、2.0%(g/ml) と3.0%(g/ml)である。補助乳化剤ポロキサマー(188)の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の2.0%(g/ml)、2.0%(g/ml)、3.0%(g/ml) と3.0%(g/ml)である。タクソールの装薬量は、それぞれ0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/mlと5.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ255nm、263nm、285nm、232nmである。

実施例7：タクソールコレステロール化合物を中間担体としてタクソールサブマイクロエマルション剤

[作製やり方]
実施例3と同じである。
サブマイクロエマルション21とサブマイクロエマルション22の中で、脂肪酸グリセロールエステル乳化剤の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の1.5%(g/ml)と2.0%(g/ml)である。サブマイクロエマルション23と24は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを使用して乳化剤とする、その用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の2.0%(g/ml)と3.0%(g/ml)である。サブマイクロエマルション21-サブマイクロエマルション24の中で、補助乳化剤ポロキサマー(188) の用量は、サブマイクロエマルション剤の総量の1.5%(g/ml)、2.0%(g/ml)、2.0%(g/ml) と3.0%(g/ml)である。タクソールの装薬量は、それぞれ0.5mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/mlと4.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ145nm、133nm、126nm、158nmである。

実施例8： 7 水素化コレステロールあるいはエルゴステロール化合物を中間担体としてサブマイクロエマルション

[作製やり方]
実施例5と同じである。
サブマイクロエマルション25-サブマイクロエマルション28の中で、タクソールの装薬量はみな1.0mg/mlである。レーザー粒度寸法測定器によって測定し、4組の乳剤の平均粒径はそれぞれ143nm、138nm、141nm、132nmである。

実施例9：タクソールコレステロール化合物を中間担体として干乳剤

実施例2 -実施例8の中で作製した28.組のサブマイクロエマルション各50mlを取り、3%(w/v)マンニトールを入れ、攪拌して溶解させ、0.2μm精密濾過膜で濾過し、冷凍乾燥を行う、干乳剤を得る。

テスト例
テスト例1：さまざまなステロイド用量の化合物はサブマイクロエマルション剤の封入率に対して影響を考察している

▲封入率測定やり方
サブマイクロエマルション剤の中で薬物総量の測定：乳剤10mlを精密的に量っ取り、250mlメスフラスコに入れ、無水エタノールを入れて乳剤を破壊した後,目盛りまで希釈して、均等に振り、試験製剤とする。また適量のタクソール対照物質を精密的に量っ取り、無水きエタノールで溶解して、濃度40μg / mLの溶液を希釈して対照液とする。精密的に量っ取って各20μLの試験製剤と対照液をクロマトグラフに注入し、Kromasil-C18(300mm×4.6mm，5μm)をクロマトグラフィーカラムとして、アセトニトリル-水(54:46)を移動相とする、流速が1.0mL/min、検出波長が230nm、カラム温度は部屋の温度で、サンプルサイズが10μLである。クロマトグラム図を記録しピーク面積によると外部標準法どおり乳剤の中でタクソール濃度と乳剤の中で薬物の総量を計算し、W総を記載している。

水相中の薬物測定: 乳剤10 mLを取り、40,000 r/minを16℃の超遠心分離法で4.0hを行って、乳剤が層間剥離になり、順序で上から下へことは油層、乳化剤層と水溶液層である。水溶液層の体積を記録し、細心の除去上層の油層と乳化剤層を慎重に取り除いた後、下層の澄ました水溶液を慎重に吸い込み、0.22μm膜で濾過して、後続の濾液を取ってそのまま直接注入のこと、このようなHPLC法測によって水相の中で薬物濃度を測定しながら、水相体積によって薬物の含有量を計算し、W水相を記載している。
油相と油水面は含まれた薬物総量: W油相+油水油水面= W総-W水相、

▲ サブマイクロエマルション剤1~サブマイクロエマルション剤28の封入率測定結果
実施例2 -実施例7作製した28組サブマイクロエマルション剤を取り、上述のやり方をのとおりに封入率を測定したり計算している、下表2中のとおりである。結果によると、中間担体のステロイド用量はタクソール重量の0.09~1.86(その中ではコレステロールをリポソーム材料とするの場合、用量がタクソールの0.45~090)の時、作製した違う装薬量のサブマイクロエマルション剤の封入率は、いずれも90%以上で、このうち装薬量が2mg/mlより低い場合、封入率は95%以上、水相の中に遊離している薬物が少ないからである。

▲サブマイクロエマルション剤を参照比較した作製及びその封入率の測定結果
実施例1項で作製の参照比較化合物1-参照比較化合物4を取り、下記の処方のとおり作製したサブマイクロエマルション剤29~サブマイクロエマルション剤32によって、装薬量はそれぞれ0.5、1.0、1.0と2.0mg/mlで、、対比研究を使ってきた。
具体的な処方、作製やり方や測定の封入率の結果は以下のとおり。

[作製やり方]
約130~140ml注射用水を取り、処方量によって卵黄レシチン、ポロキサマー(188)とグリセロールを加入して、ワーリングブレンダーの中に入れて分散し、均一の水相を作られ、40-80℃まで加熱し、.温度を保つ。

処方量によって大豆油を取り、40-80℃まで予熱し、実施例1の作製したタクソールコレステロール化合物1を量って取り、予熱の大豆油の中に溶かして、ワーリングブレンダーの中に入れて均一の油相を分散で作られる。

攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、10000-20000回転/ min切り取り5~10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転して、6回均質を行って、全部乳液を収集し、0.1mol/L塩酸でpHを4.0±0.5まで調節し、また水を200mlまで添加し、均等に振り、分けて入れ、115℃/ 25分で滅菌し、それを得ることになる。

[封入率測定]
サブマイクロエマルション剤29~サブマイクロエマルション剤32を取り，前述の封入率測定やり方によって則で測定して，封入率は65.7%~84.5%で、詳しい下の表3のように。

テスト例2：サブマイクロエマルション剤の安定性の検討
実施例2 -実施例8で作製したの28組サブマイクロエマルション剤(下表が乳剤1~28で表記されている)とテスト例1で作製した4組の参照比較サブマイクロエマルション剤(下表が乳剤29~32で表記されている)を取り、それぞれ4℃条件の下に貯蔵12ヵ月間、0、6、12ヵ月でサンプリング調査し、以下のやり方によって外観、粒径、含有量および不純物の変化を考察します。

性質と状態：視覚法は、実物の記述のサブマイクロエマルション剤の色によって表面で油滴や層間剥離現象を持つかどうかことを記録する。

粒径：サブマイクロエマルション剤を取り， MASTER SIZER 2000レーザー粒度寸法測定器（MALVERN）を採用して粒径を測定する。

含有量および関連物質：適量のタクソールサブマイクロエマルション剤を精密的に量っ取り、無水エタノールを入れて乳剤を破壊し、適当濃度の試験製剤を作製する。精密的に量っ取って各20μLの試験製剤をクロマトグラフに注入し、HPLC 法によってKromasil-C18(300mm×4.6mm，5μm)をクロマトグラフィーカラムとして、アセトニトリル-水(54:46)を移動相とする、流速が1.0mL/min、検出波長が230nm、カラム温度は部屋の温度で、法則に従って測定し、クロマトグラム図を記録し、ピーク面積で外部標準法によって乳剤の中で薬物の含有量を計算し、帰一法によって不純物の含有量を計算する。
測定結果：細かいことは下表のとおり。

本発明のステロイド化合物を中間担体として作製したサブマイクロエマルション1~サブマイクロエマルション28は、冷蔵庫(4℃)で貯蔵12ヵ月後、初期に比べて、1) 装薬量5.0mg/mlの乳剤の均一粒径は増加傾向を持っているが、層間剥離を見ない、外観や含有量ともみな著しく変化しない、不純物が増えることはあっても、2.0%を超えない;2) 装薬量4.0mg/ml乳剤は層間剥離を見ない、粒径、外観や含有量ともみな著しく変化しない、不純物が増えることはあっても、1.3%を超えない;3) 装薬量3mg/ml乳剤は層間剥離を見ない、粒径、外観や含有量ともみな著しく変化しない、不純物が1.3%を超えない;4) 装薬量は2mg / mlあるいは以下の場合、外観の性質と状態、粒径と含有量ともみな著しく変化しない、不純物が0.7%より低いレベルになることがある。

参照比較のタクソール/リン脂質化合物を中間担体とする。1) 装薬量は0.5mg/mlの時で均一乳剤 (サブマイクロエマルション剤29) を形成でき、放置した6ヵ月後に外観や粒径ともみな著しく変化しない、不純物が3.0%まで増加したが、放置してから12ヵ月後の粒径が著しく増大し、不純物レベルが7%以上に達した、含有量は著しく低下し、また層間剥離と浮遊する油現象を出現する;2) 装薬量は1.0mg/mlに増加したの時、均一乳剤(サブマイクロエマルション剤30)を形成できない、初期のときに薬物結晶と油滴が存在していることを観察できる。

参照比較のタクソール/コレステロール化合物を中間担体として、装薬量が1.0mg/mlと2.0mg/mlの時で、みな均一乳剤 (サブマイクロエマルション剤31~32) を形成できる。1）放置した6ヵ月後に2つ装薬量の外観や粒径と含有量ともみな著しく変化しない、不純物が高くなるが、1.5%に過ぎなかった。2) 貯蔵した12ヵ月後には、2つ装薬量の乳剤径粒が大きくなり、含有量が減少する傾向を有し、不純物がそれぞれま3.58%と4.64％まで上昇することになり、このうち装薬量2.0mg/mlの乳剤は軽度の層間剥離現象を出現する。

テスト例3：タクソールサブマイクロエマルション剤の感作性試験
テスト薬物：
試作薬物溶液：実施例5で作製したサブマイクロエマルション剤14；
参照比較製剤溶液：市販されているタクソール注射液「紫杉素」(規格が5ml:30mg)は、使用する前に生理塩水でタクソール濃度2mg/mlの溶液を含有しているものを薄めで作られている
陽性対照薬の溶液:1.0%のオボアルブミン;
空白乳剤溶液:実施例5のサブマイクロエマルション剤14処方で構成され、タクソールコレステロール化合物を加入しない、空白乳剤を作製する;

空白溶媒:Cremophor ELと無水エタノールを1:1(v/v)でを混ぜて、 (模擬市販されているタクソール注射液の処方を得り、そのうち、タクソールに加入しない)、使用する前に生理塩水で3倍まで薄めで作られている;

テスト動物：
ケイビー，体重300g±20g，雌と雄は半々である。

テストやり方：
体重300g±20gの健康ケイビー30頭を取り、5組にランダムに分けて、組ごとに6頭で、雌と雄は半々である。実験の開始前に、動物をあらかじめ1週間に飼育して、行事の表現を観察する。各組ケイビーを一日おきに、それぞれ0.3mlの供試薬物溶液(サブマイクロエマルション剤組)、参照比較製剤溶液(参照比較製剤組)、陽性対照溶液(陽性対照組)、空白乳剤(空白乳剤組)と空白溶媒(空白溶媒組)を腹腔内に注射して、計3回の注射をした、その感作をさせることで、このうち供試薬物組のタクソール剤量が2mg/kgである。最後に次々と投薬した第12dには、各組の動物に静脈注射して、それぞれ1.0mlの供試薬物溶液、参照比較製剤溶液、陽性対照溶液、空白乳剤と空白溶媒を静脈注射して激発を行う、このうち供試薬物組のタクソール激発剤量が6mg/kgである。各組ケイビーに静脈注射した後の動物の反応を観察し、結果が下表のとおりである。

結果によると、市販されているタクソール注射液とその空白溶媒組はみな強過敏反応を出現するが、タクソールサブマイクロエマルション剤および空白サブマイクロエマルション剤組とも著しいアレルギー反応症状を持っていない。

テスト例4：タクソールサブマイクロエマルション剤急性毒性評価
テスト薬物：サブマイクロエマルション供試溶液は、実施例5で作製したサブマイクロエマルション剤14を取って、参照比較製剤溶液が市販したCremophor ELのタクソール注射液(規格は5ml:30mg)を含有して、使用する前に、生理塩水で薄めで作られているのが含有されてタクソール濃度は2mg/mlの溶液である。

テスト動物：昆明種のマウス70頭、♀、体重20±2g（中国医学科学院実験動物所）。

テストやり方：マウスは体重によってランダム7組分にけて、1組の10頭で、次のような方案で投薬する：
組1：参照比較製剤溶液25mg/kg剤量を単回投与する；
組2：参照比較製剤溶液29mg/kg剤量を単回投与する；
組3：参照比較製剤溶液29mg/kg剤量を投与した後、間隔4日で1回を繰り返して投与する；
組4：サブマイクロエマルション供試溶液29mg/kg剤量を二日連続して投与する；

組5：サブマイクロエマルション供試溶液29mg/kg剤量を三日連続して投与する；

組6：サブマイクロエマルション供試溶液29mg/kg剤量を投与した後、間隔4日で1回を繰り返して投与する；
組7：サブマイクロエマルション供試溶液は44mg/kg剤量によって単回投与する；

毒性の結果は下表のとおり、体重変化の曲線のダイヤグラムが付図2を参照してください

組1、組2と3の結果によると、参照比較製剤によって投与した後、明らかに毒性を出現して、このうち組1と組2では、それぞれ1頭の動物が死亡し、組3では2頭の動物が死亡した。組4-組7のサブマイクロエマルション剤組ではすべて明らかな即時反応しない、動物死亡もない。

組1と組7はいずれも単回投与するが、組7の剤量が組1の1.765倍で、組7が出現したの毒性は明らかに組1より低い、タクソールでサブマイクロエマルションを作製した後、参照比較製剤(市販されている注射液)に比べ、毒性が下がった、耐受剤量が増加している。

テスト例5：タクソールサブマイクロエマルション剤最大耐受剤量（MTD）の考察
テスト動物：ヌードマウス
テストサンプル：
市販したCremophor ELの一般注射剤を含有するものは、20、30、45mg/kgに合計3つ剤量組を設ける;
実施例5では作製したサブマイクロエマルション剤14は、30、45、67.5、101.25mg/kgに合計4つ剤量組を設ける;

テストやり方：静脈注射し、4日毎に1回で投与し、間隔投与3回である。投与から最後1回までの一周間、動物即時反応および死亡状況に対して観察している。無動物死亡したの剤量を覚え最大の耐受剤量（MTD）として記録し、結果は以下の通り。

一般注射液のMTDは20mg/kgで、サブマイクロエマルション剤は45mg/kgである。相者に比べ、サブマイクロエマルションMTDは2.25倍に向上させ、文献の報道された注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒に似ている。

テスト例6：タクソールサブマイクロエマルション剤は腫瘍成長抑制へ効果
テスト目的：最大の耐受剤量の下で、タクソールサブマイクロエマルション剤によって人間の乳癌MDA-MB-231ヌードマウス異種移植腫瘍の成長抑制の効果に対することを観察比較して、注射用の白相アルブミンのタクソールナノ粒および市販されている一般注射液(紫杉素)と比較している。

テスト薬物：
1）実施例5の作製されていたタクソールサブマイクロエマルション剤14;
2）市販されているタクソール一般注射液(紫杉素、北京協和製薬廠)、許可番号100102、規格30mg / 5ml;
3）注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒（アイコンは注射用タクソール)、米国医薬パートナーズ公司の製品、許可番号205133、規格100mg/1g;

分組方案：
陰性対照組、タクソール一般注射液組、アルブミンナノ粒組、タクソールサブマイクロエマルション組を設ける
タクソール注射液組の剤量は20mg/kg/1回である。
タクソールサブマイクロエマルション剤組の剤量は45mg/kg/1回と67.5mg/kg/1回である。

注射用アルブミンナノ粒組の剤量は45mg/kg/1回である。

動物模型：
人の乳癌MDA-MB-231ヌードマウス異種移植性腫瘍の模型、
媒介性腫瘍マウスは北京中米冠科バイオ技術(北京)有限公司から導入する

実験過程と観察方法：
腫瘍成長が良い、全身の状況が相対的によくMDA-MB-231媒介性腫瘍の動物を選択し、頚椎脱臼で殺される。無菌の条件の下で腫瘍を取り出すと、好ましい組織を選択し、外科用メスで腫瘍を直径2~3mmの腫瘍塊に切り分けて、套管針でヌードマウスのわき後の皮下に接種する。接種後では腫瘍が自生している。

媒介性腫瘍マウスの腫瘍の平均体積は生長していた110~120mm³まで、腫瘍体積サイズによって層間剥離や分組を行う、1組ごとに7頭の動物である。陰性対照組マウスの腫瘍が自生することを除く、その他の各組が設計の剤量によって、4日間ごとにで薬剤を尾静脈に1回注射する。(このうちタクソールサブマイクロエマルション67.5mg/kg組は、毎回投与する際には、まず総量の1/2によっては静脈注射して、別の1/2が1-2h後で再び注射する。)各薬品組がみな3回投与する。
分組投与その日をゼロ日（DO）として、実験過程の中で、3日ごとに被試動物腫瘍と体重の変化を1回検査する。

実験第25日間(D25)では、3回投与を経過して、動物腫瘍生長が明らかに抑制されている、それぞれ投与組の腫瘍体積検出値は分組投与の時の大きさ状況に等しい又はより小さいの下で、まず大きな媒介性腫瘍の陰性対照組の動物を殺す
、その他の投与組の各組腫瘍生長状況について観察比較を続ける。
実験第45日間(D45)では、紫杉素注射液20mg/ kg組の動物の平均腫瘍体積が1500mm³に接近し、この組のマウスを殺す。
実験第53日間(D53)では、注射用アルブミン接合型タクソールナノ粒45mg/kg組の動物の平均腫瘍体積が1700mm³大きさに達し、この組のマウスを殺す。
実験第80日間(D80)では、実験を終え、この時タクソールサブマイクロエマルション剤45mg/kg剤量組の動物の平均腫瘍体積がわずか198mm³ほどの大きさで、67.5mg/kg投与組の動物腫瘍がすべてなくなり、再発しなかった。

結論:上述したように、MTD剤量の条件の下で、市販されているタクソール一般注射液20mg/kg、タクソールサブマイクロエマルション剤45mg/kgと注射用アルブミンタクソールナノ粒45mg / kgでは、3組がみな98%以上の抑制腫瘍率であることが分かったが、3組の薬品が腫瘍成長速度に対する抑制効果は著しく差があった。
薬を投与した後の第25日まで、タクソール一般注射液と注射用アルブミンタクソールナノ粒実験組は、動物の相対的に腫瘍体積がそれぞれ1.41と0.92で、タクソールサブマイクロエマルション剤腫瘍体積がほとんどなくなって、相対的に腫瘍体積が0.06で僅かである。
薬を投与した後の第45日までの場合、一般注射液組腫瘍が高速の生長し、相対的に腫瘍体積が14.3に達した(この時、殺す)。注射アルブミンナノ粒腫瘍の成長速度は一般の注射液より著しくゆっくりであるが、相対的に腫瘍の体積も6 . 5に達する。タクソールサブマイクロエマルション剤腫瘍体積がほとんど目立って増加傾向を示しない、相対的に腫瘍体積が0.11で僅かである。

第53日まで、注射用アルブミンナノ粒の相対的に腫瘍体積が12.5に増やしたが((この時、殺す)、タクソールサブマイクロエマルション剤相対的に腫瘍体積が0.26で僅かである。

薬を投与した後の第80日まで、タクソールサブマイクロエマルション剤組の相対的に腫瘍体積は1.83で僅かである。この組の腫瘍成長速度がとても遅いので、観察するのをやめ、この組動物を殺す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
タクソール／ステロイド化合物、注射用油、注射用水、乳化剤、補助乳化剤と等張性剤が含まれており、
前述のタクソール／ステロイド化合物の中でタクソールとステロイドのモル比は、１：０．２〜４であることを特徴とするサブマイクロエマルション剤。
【請求項２】
前述のタクソール／ステロイド化合物の中のステロイドは天然ステロイドやその派生物からなる群より選ばれた少なくとも一種であることを特徴とする請求項１のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項３】
前述の天然ステロイドとして、コレステロール、７水素化コレステロール、ラノステロール、シトステロール、ブラシカステロール、真菌ステロイド、イタボガキ属ステロール、スチグマステロール、マイケルステロールとエルゴステロールの中から少なくとも一種を選択し、
前述の天然ステロイド派生物として、コール酸、デオキシコール酸、チエノーデオキシコール酸の中から少なくとも１種を選択することを特徴とする請求項２に記載のタクソールサブマイクロエマルション剤。
【請求項４】
前述のサブマイクロエマルション剤の乳剤液滴の平均粒径は４００ｎｍ以下で、前述の油相の用量の割合はサブマイクロエマルション剤総量の５〜３５％（ｍｌ／ｍｌ）で、タクソールで装薬量をはかることは０．２５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項５】
前述の注射用油として、長鎖の油と中鎖の油（ＭＣＴ）の一種あるいはそれらの混合物から選択し、
前述の長鎖の油は長鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸エステルと長鎖脂肪アルコールから選択し、
前述の中鎖の油は中鎖脂肪酸と中鎖脂肪酸エステルと中鎖脂肪アルコールから選択することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項６】
前述の注射用油が長鎖脂肪酸で、前述の中鎖の油（ＭＣＴ）が中鎖脂肪酸グリセロールドであることを特徴とする請求項５に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項７】
前述の乳化剤が非イオン界面活性剤や天然界面活性剤であり、
前述の非イオン界面活性剤として、脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンアルコ−ルおよびソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、ビタミンＥ派生物類やポリウレタンオレフイン共重合体の中で少なくとも一種から選択し、
前述の天然界面活性剤として、卵黄レシチン、大豆リン脂、コレステロールとエ−ル酸、アルギン酸ナトリウムやキトサンの中で少なくとも一種から選択することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項８】
前述の乳化剤の含有量がサブマイクロエマルション剤総量の０．５〜５％（ｇ／ｍｌ）であることを特徴とする請求項７に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項９】
前述の補助乳化剤がポリエチレンクリゴール（ＰＥＧ）類とポロキサマー１８８８の中で少なくとも一種から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項１０】
前述の補助乳化剤の含有量がサブマイクロエマルション剤総量の０％〜５％（ｇ／ｍｌ）であることを特徴とする請求項９に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項１１】
前述の等張性剤がグリセロール、キシリトール、ソルビンアルコ−ル（砂糖）とマンニト−ルの中の一種または複数であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項１２】
さらに、オレイン酸、オレイン酸ナトリウムやＰＥＧの中で一種から選択される安定剤を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項１３】
さらに、ビタミンＥやビタミンＥエステル派生物から選択される抗酸化剤を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤。
【請求項１４】
次の工程を含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤の作製方法。
注射用水を取り、乳化剤、補助乳化剤と等張性剤を加入して、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の水相を分散で作られ、４０−８０℃まで加熱し、温度を保つ。
タクソールとステロイド化合物を別に取り、前述の比率によって混合し、適量の有機溶剤を加入して溶解し、適切な温度条件の下で攪拌し、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥で化合物に作られた。タクソール／ステロイド化合物を別に取り、任意選択で安定剤と一緒に４０−８０℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている。
攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、１００００−２００００回転／ｍｉｎ切り取り５〜１０ｍｉｎによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転し、４００ｎｍ以下まで粒径を抑制して、全部乳液を収集し、塩酸でｐＨ３．５〜６．０まで調節し、また適切な水を添加してそれを得ることになる。
【請求項１５】
次の工程を含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤の作製方法。
注射用水を取り、補助乳化剤と等張性剤を加入して、攪拌して水相になり、４０−８０℃まで加熱し、温度を保つ。
タクソールとステロイド化合物を別に取り、前述の比率によって混合し、適量の有機溶剤を加入して溶解し、適切な温度条件の下で攪拌し、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥で化合物に作られた。タクソール／ステロイド化合物を別に取り、４０−８０℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている。
攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、高速的な攪拌して切り取り、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転し、４００ｎｍ以下まで粒径を抑制して、全部乳液を収集し、塩酸でｐＨ３．５〜６．０まで調節し、また適量の水を添加してそれを得ることになる。
【請求項１６】
輸液剤や干乳剤の形式として作成されて提供され、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤をふくむことを特徴とする製剤。
【請求項１７】
製剤の形式が輸液剤であって、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤を、スチーム殺菌や熱圧滅菌で、無菌工芸処理を通じて、バルキングし、請求項１６に記載の製剤を得ることを特徴とする製剤の製造方法。
【請求項１８】
製剤の形式が干乳剤であって、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤を、プロッパントを適量入れ、無菌処理した後、冷凍乾燥し、請求項１６に記載の製剤を得ることを特徴とする製剤の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサブマイクロエマルション剤または、請求項１６に記載の製剤の、卵巣癌と乳癌、非小細胞肺がん、頭頸部がん、肝臓がんと胃がんを治療するための薬剤としての応用。
【請求項２０】
請求項１６に記載の製剤の、卵巣癌と乳癌、非小細胞肺がん、頭頸部がん、肝臓がんと胃がんを治療するための薬剤としての応用。

Claims

一種のタクソールサブマイクロエマルション剤、その特徴は、タクソール/ステロイド化合物、注射用油、注射用水、乳化剤、補助乳化剤と等張性剤が含まれている。前述のタクソール/ステロイド化合物の中でタクソールとステロイドのモル比は、1:0.2~4で、1:0.2~2を優先選択し、もっと1:0.33~1を優先選択する。
権利要求によって1-3の中である項のタクソールサブマイクロエマルション剤、その特徴は、前述のタクソール/ステロイド化合物の中のステロイドは天然ステロイドやその派生物の中で少なくとも一種である。
権利要求4によってのタクソールサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の天然ステロイドとして、コレステーロ、7水素化コレステロール、ラノステロール、シトステロール、ブラシカステロール、真菌ステロイド、イタボガキ属ステロール、スチグマステロール、マイケルステロールとエルゴステロールの中で少なくとも一種から選択し、前述の天然ステロイド派生物はコール酸、デオキシコール酸、チエノーデオキシコール酸から選択する。
権利要求によって1-3の中である項のサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述のサブマイクロエマルション剤の乳剤液滴の平均粒径は400nm以下で、前述の油相の用量の割合はサブマイクロエマルション剤総量の5~35%(ml/ml)で、タクソールで装薬量をはかることは0.25mg/ml~5mg/mlである。サブマイクロエマルション剤の乳剤液滴径が300nm以下で前述の油相の用量の割合が10~30%(ml/ml)で、タクソールで装薬量をはかることが0.5mg/ml~2mgのものを優先選択する。
権利要求によって1~4のサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の注射用油として、長鎖の油と中鎖の油(MCT)の一種あるいはそれらの混合物から選択することである。前述の長鎖の油は長鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸エステルと長鎖脂肪アルコールから選択する。前述の中鎖の油は中鎖脂肪酸と中鎖脂肪酸エステルと中鎖脂肪アルコールから選択する。
権利要求によって5のサブマイクロエマルション剤、その特徴は、前述の注射用油が長鎖脂肪酸で、前述の中鎖の油(MCT)が中鎖脂肪酸グリセロールドである。
権利要求によって1~4のサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の乳化剤が非イオン界面活性剤や天然界面活性剤である。前述の非イオン界面活性剤として、脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレン脂肪アルコ-ルエ-テル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンアルコ-ルおよびソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、ビタミンE派生物類やポリウレタンオレフイン共重合体の中で少なくとも一種から選択する。前述の天然界面活性剤として、卵黄レシチン、大豆リン脂、コレステロールとエ-ル酸、アルギン酸ナトリウムやキトサンの中で少なくとも一種から選択し、卵黄レシチンや大豆リン脂を優先選択する。
権利要求によって7に紹介したサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の乳化剤の含有量がサブマイクロエマルション剤総量の0.5~5%(g / ml)で、1.0%-4.0%（g/ml）を優先選択し、さらに1.0%-2.0%（g/ml）を優先選択する。
権利要求によって1~4のサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の補助乳化剤がポリエチレンクリゴール（PEG）類とポロキサマー1888の中で少なくとも一種から選択し、ポロキサマー188を優先選択する。
権利要求によって9に紹介したサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の補助乳化剤の含有量がサブマイクロエマルション剤総量の0%~5%(g/ml)で、0.5%-3%（g/ml）を優先選択し、さらに1.0%-2.0%（g/ml）を優先選択する。
権利要求によって1~4のサブマイクロエマルション剤その特徴は、前述の等張性剤がグリセロール、キシリトール、ソルビンアルコ-ル(砂糖)とマンニト-ルの一種であるや多種の中で、グリセロールを優先選択する。
権利要求によって1~11の中である項のサブマイクロエマルション剤その特徴は、そのも安定剤を包含することができ、オレイン酸、オレイン酸ナトリウムやPEGの中で一種から選択し、オレイン酸を優先選択する。
権利要求によって1~12の中である項のサブマイクロエマルション剤その特徴は、抗酸化剤も含まれている、ビタミンEやビタミンEエステル派生物から選択し、ビタミンEを優先選択する。
権利要求によって1~13の中である項のサブマイクロエマルション剤の作製方法その特徴は、次のように順序が含まれている。

注射用水を取り、乳化剤、補補助乳化剤と等張性剤を加入して、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の水相を分散で作られ、40-80℃まで加熱し、温度を保つ。

タクソールとステロイド化合物を別に取り、前述の比率によって混合し、適量の有機溶剤を加入して溶解し、適切な温度条件の下で攪拌し、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥で化合物に作られた。タクソール/ステロイド化合物を別に取り、任意選択で安定剤と一緒に40-80℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている。
攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、10000-20000回転/ min切り取り5~10minによって、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転し、粒径を抑制して400nm以下まで、300nm以下を優先選択し、全部乳液を収集し、塩酸でpH 3.5~6.0まで調節し、4.0~5.0pH値を優先選択し、また適切な水を添加してそれを得ることになる。
権利要求によって1~13の中である項のサブマイクロエマルション剤の作製方法その特徴は、次のように順序を採取することができる。
注射用水を取り、補補助乳化剤と等張性剤を加入して、攪拌して水相になり、40-80℃まで加熱し、温度を保つ。

タクソールとステロイド化合物を別に取り、前述の比率によって混合し、適量の有機溶剤を加入して溶解し、適切な温度条件の下で攪拌し、有機溶剤を取り除いて、真空乾燥で化合物に作られた。タクソール/ステロイド化合物を別に取り、40-80℃まで予熱した注射の油の中に溶かして、ワーリングブレンダーやカット機の中に入れ、均一の油相を分散で作られている。
攪拌する条件の下で、水相を油相の中にゆっくりと加入し、高速的な攪拌して切り取り、均一の初乳になり、高圧均質機の中へ迅速に移転し、粒径を抑制して400nm以下まで、100-300nm以下を優先選択し、全部乳液を収集し、塩酸でpH 3.5~6.0まで調節し、4.0~5.0pH値を優先選択し、また適量の水を添加してそれを得ることになる。
一種の製剤は、それは権利要求1~13の中である項のタクソールサブマイクロエマルション剤を包含して、同製剤が輸液剤や干乳剤の形式である。
権利要求によって16の紹介した製剤の作製方法その特徴は、その中で輸液剤が次のように方法によって作製した：権利要求1~13の中である項のタクソールサブマイクロエマルション剤をスチーム殺菌や熱圧滅菌で無菌工芸処理を通じて、バルキングした後、それを得ることになる;その中の干乳剤は次のように方法によって作製した：権利要求1~13の中である項のタクソールサブマイクロエマルション剤にプロッパントを適量入れ、無菌処理した後、冷凍乾燥で干乳剤に作られている。
権利要求によって16の紹介したタクソールサブマイクロエマルション剤や権利要求16の製剤は、用いた卵巣癌と乳癌、非小細胞肺がん、頭頸部がん、肝臓がんと胃がんの治療及び作製したこれ薬物において応用です。
権利要求によって16の製剤は、用の作製卵巣癌の治療と乳癌、非小細胞肺がん、頭頸部ガン、肝臓ガンと胃癌の薬物の応用です。用いた卵巣癌、乳癌、非小細胞肺がん、頭頸部がん、肝臓がんと胃がんの治療及び作製したこれ薬物において応用です。