JP2013507939A - 合成フィターゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) A89T / D92A / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / H413Q
(b) A89T / D92N / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / F356L / H413Q
(c) A89T / D92A / H143Y / T156R / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / S314G / H413Qまたは
(d) A89T / D92A / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / H413Q。
S1N; A6V; K12N; S17N; A84V; A89T; D92E; D92P; D92A D92N; Q109K; M137L; D138N; S140P; A142T; H143Y; Q149H; T156R; N202S; N202T; G205R; K207E; K207T; K207I; V208M; A209S; H228Y; K234N; K234I; E243K; D247K; S248L; K251N; K251I; A255V; Q256Y; Q256H; S261E; N270K; A304V; S314G; T320L; Q349R; F356L; S373I; E382G; T399I; K402N; H413L; H413Q;
A89T / D92A / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / H413Q;
A89T / D92N / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / F356L / H413Q;
A89T / D92A / H143Y / T156R / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / S314G / H413Qおよび
A89T / D92A / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / H413Q
の少なくとも1個の保存的アミノ酸置換を有し、
ここで、合成フィターゼは少なくとも1個の個別に記載される変化または該変化群のうちの1個を有することができる。本発明の目的で保存的とは、アミノ酸AによるGの置換; G、SによるAの置換; I、L、A、T、SによるVの置換; V、L、MによるIの置換; I、M、VによるLの置換; L、I、VによるMの置換; A、S、NによるPの置換; Y、W、HによるFの置換; F、W、HによるYの置換; Y、F、HによるWの置換; K、E、DによるRの置換; R、E、DによるKの置換; Q、N、SによるHの置換; N、E、K、R、QによるDの置換; Q、D、K、R、NによるEの置換; T、AによるSの置換; S、V、AによるTの置換; S、T、AによるCの置換; D、Q、H、SによるNの置換; E、N、H、K、RによるQの置換を意味する。この場合、アミノ酸の任意の保存的置換を別のアミノ酸の任意の保存的置換と組み合わせることが可能である。
(a) A89T / D92A / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / H413Qまたは
(b) A89T / D92N / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / F356L / H413Qまたは
(c) A89T / D92A / H143Y / T156R / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / S314G / H413Qまたは
(d) A89T / D92A / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / H413Q
を有するフィターゼ、をコードする単離された核酸配列を含む。
ハフニア属種LU11047由来のフィターゼのクローニング
刊行物Huang et al. (2006) A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochem Biophys Res Commun 350: 884-889, Shi et al. (2008) A novel phytase gene appA from Buttiauxella sp. GC21 isolated from grass carp intestine. Aquaculture 275:70-75およびWO2008116878 (example 1)と同様にして、40℃〜50℃の範囲のアニーリング温度で縮重オリゴHaf1090 5'-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3' (配列番号1)およびHaf1092 5'-GGNGTRTTRTCNGGYTG-3' (配列番号2)を使用して、いくつかの腸内細菌でPCRによってフィターゼを探索した。形成されたPCR産物を同じアニーリング条件下でオリゴHaf1090 5'-GAYCCNYTNTTYCAYCC-3' (配列番号1)およびHaf1091 5'-GCDATRTTNGTRTCRTG-3' (配列番号3)を使用するセミネスティッド(semi-nested) PCRの鋳型として使用する。ハフニア属の菌株(ハフニア属種(Hafnia sp.)LU11047)からフラグメントを単離することができる。単離されたフラグメントを、「TOPO TA クローニング(登録商標)キット」(Invitrogen)を製造元の使用説明書にしたがって使用してサブクローニングし、次いでシークエンシングする。この部分配列から出発し、TAIL-PCR法と称される方法によってフィターゼの完全長配列を増幅する(Yao-Guang Liu and Robert F. Whittier (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25, 674-681)。この目的で以下のオリゴヌクレオチドを使用する。
1. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', 配列番号4)および
Haf1167 (5'-CTTCGAGAGCCACTTTATTACCGTCG-3', 配列番号5)
2. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', 配列番号4)および
Haf1168 (5'-CCAATGTTGTGCTGCTGACAATAGG-3', 配列番号6)
3. Haf1165 (5'-WCAGNTGWTNGTNCTG-3', 配列番号4)および
Haf1169 (5'-CCGAACTCATCAGCGCTAAAGATGC-3', 配列番号7)。
1. Haf1077 (5'- CAWCGWCNGASASGAA-3', 配列番号8)および
Haf1170 (5'- CGCAGTTTGACTTGATGTCGCGCACG-3', 配列番号9)
2. Haf1077 (5'- CAWCGWCNGASASGAA-3', 配列番号8)および
Haf1171 (5'- GTCGCGCACGCCCTATATCGCCAAGC-3', 配列番号10)
3. Haf1077 (5'- CAWCGWCNGASASGAA-3', 配列番号8)および
Haf1172 (5'- CTGCAAACCATCGCACACGCACTGG-3', 配列番号11)。
フィターゼFus5#2のクローニング
ハフニア属種LU11047の染色体DNAから出発し、フィターゼの塩基1〜1074のフラグメントをPCRによって増幅する(配列番号14)。Yersinia mollaretii ATCC43969のフィターゼ候補(すなわち酸性ホスファターゼ)のDNA配列、NCBI sequence ID ZP_00824387から、ヌクレオチド1057〜1323を増幅するためのオリゴヌクレオチドを導き出す。Yersinia mollaretii ATCC 43969の染色体DNA由来の第2のフィターゼフラグメントをそれによって増幅する(配列番号15)。2つのフィターゼフラグメントの増幅で、ハフニアフラグメントの3'末端およびエルシニアフラグメントの5'末端の両末端で、使用されるオリゴの助けにより、それぞれ他方のフィターゼフラグメントとの20 bpのオーバーラップが生じる。このようにして、両フラグメントをPCR融合によって組み合わせて、合成フィターゼFus5#2をコードする配列番号16のフィターゼ配列を得ることができる。それから得られた配列番号17のアミノ酸配列について、ソフトウェアSignalP 2.0によって、アミノ酸1〜33がシグナルペプチドであると予測される。成熟フィターゼFus5#2 (配列番号18)は配列番号19のヌクレオチド配列によってコードされる。
フィターゼ発現カセットを有するプラスミドを保持するE. coli BL21(DE3)株を、アンピシリン(100 mg/l)を含むLB培地で37℃で培養する。0.6のOD (600 nm)で1 mM IPTGを加えることによってフィターゼ発現を誘導する。4時間の誘導後、10% (v/v)の10x BugBuster溶液(Novogen)を加え、混合物を室温で15分インキュベートする。遠心分離後、フィターゼ活性の測定に上清を使用する。
6xHis標識フィターゼ変異体の精製には、誘導された、フィターゼ発現E. coli培養ブロスを300 mM NaCl、EDTAを含まないCompleteTM Protease Inhibitor (製造元Roche Applied Scienceの情報に基づく)と混合し、10% (v/v)の10x BugBuster溶液(Novogen)と混合し、室温で15分インキュベートする。遠心分離後、製造元の使用説明書にしたがって上清をNi-NTAカラム/KIT (Qiagen)に結合させる。冷却溶出バッファー(50 mM酢酸Naバッファー、300 mM NaCl、500 mMイミダゾール、1 mM CaCl2)を使用して、洗浄ステップ後の溶出を実施する。タンパク質含量を測定する前に、透析によってサンプルバッファーを2 mMクエン酸ナトリウムpH 5.5に交換する。
Aspergillus nigerでのフィターゼFus5#2の発現のためには、まず、非コード3' glaA領域に隣接するA. nigerグルコアミラーゼ(glaA)プロモーターの制御下にフィターゼ遺伝子を含む発現構築物を確立する。このようにして、A. nigerの3' glaA領域への組み込みに関して該構築物を判定する。細胞外タンパク質分泌のシグナル配列として、A. ficuumフィターゼのシグナル配列を使用する。発現構築物のベースとして、EP0635574B1に詳細に記載されるプラスミドpGBGLA-53 (WO9846772ではpGBTOPFYT-1とも称される)を使用する。当業者に公知のPCRに基づくクローニング法を使用して、pGBGLA-53中の、アミノ酸配列ASRNQSSで始まる成熟フィターゼタンパク質をコードするA. ficuumフィターゼの遺伝子部分を、成熟Fus5#2フィターゼをコードする配列番号19の遺伝子部分によって置換する。その結果、プラスミドpGLA53-Fus5#2 (配列番号23)が形成される。HindIIIによって、得られたプラスミドから単離された線状発現カセットを、プラスミドpGBLA50 (EP0635574B1)/pGBAAS-1 (WO9846772での同プラスミドの名称)から単離されたamdSマーカーカセットとともにglaA欠失A. niger発現株に同時形質転換し、振とうフラスコ中でフィターゼを発現させることを、2つの引用特許文献に記載されるように進める。細胞を遠心分離によって除去した後、培養上清中のフィターゼ活性を毎日測定する。最大活性は3日目〜6日目の間に達成される。
フィターゼ活性をマイクロタイタープレートで測定する。精製された酵素サンプルを反応バッファー(250 mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01% Tween 20、pH 5.5)で希釈する。10μlの酵素溶液を60℃で20分110μlの基質溶液(反応バッファー中の6 mMフィチン酸Na(Sigma P3168))とインキュベートする。80μlのトリクロロ酢酸溶液(15% w/w)を加えることによって反応を停止させる。20μlの停止された反応溶液を、放出されたリン酸の検出のために、280μlの新たに作製された染色試薬(60 mM L-アスコルビン酸(Sigma A7506)、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H2SO4)と混合し、50℃で25分インキュベートし、次いで820 nmで吸光度を測定する。ブランク値として、基質バッファーのみを37℃でインキュベートし、トリクロロ酢酸で停止した後にのみ10μlの酵素サンプルを加える。染色反応を同様の方法で実施する。既知の濃度のリン酸溶液を使用する染色反応の検量線によって、放出されたリン酸の量を決定する。前記条件下で1分あたり1μmolのリン酸を放出する酵素活性を1 Uと称する。使用されたフィターゼ溶液のタンパク質濃度を280 nmの吸光度から決定する。この目的で、「Vector NTI」ソフトウェア(Invitrogen、バージョン10.3.0)を使用してフィターゼの分子吸光係数を決定する。
フィターゼ活性をマイクロタイタープレートで測定する。酵素サンプルを反応バッファー(250 mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01% Tween 20、pH 5.5)で希釈する。10μlの酵素溶液を37℃で1時間140μlの基質溶液(反応バッファー中の6 mMフィチン酸Na(Sigma P3168))とインキュベートする。150μlのトリクロロ酢酸溶液(15% w/w)を加えることによって反応を停止させる。20μlの停止された反応溶液を、放出されたリン酸の検出のために、280μlの新たに作製された染色試薬(60 mM L-アスコルビン酸(Sigma A7506)、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H2SO4)と混合し、50℃で25分インキュベートし、次いで820 nmで吸光度を測定する。ブランク値として、基質バッファーのみを37℃でインキュベートし、トリクロロ酢酸で停止した後にのみ10μlの酵素サンプルを加える。残りの計測値と同様の方法で染色反応を進める。既知の濃度のリン酸溶液を使用する染色反応の検量線によって、放出されたリン酸の量を決定する。
最適温度の測定のためには、酵素サンプルを反応バッファー(250 mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01% Tween 20、pH 5.5)で希釈する。10μlの予熱された(5分、それぞれの反応温度)酵素溶液を110μlの予熱された基質溶液(反応バッファー中の6 mMフィチン酸Na(Sigma P3168))と30分インキュベートする。温度勾配ヒートブロック(gradient heating block)で種々の温度でインキュベーションを進める。80μlのトリクロロ酢酸溶液(15% w/w)を加えることによって反応を停止させる。20μlの停止された反応溶液を、放出されたリン酸の検出のために、280μlの新たに作製された染色試薬(60 mM L-アスコルビン酸(Sigma A7506)、2.2 mMモリブデン酸アンモニウム四水和物、325 mM H2SO4)と混合し、50℃で25分インキュベートし、次いで820 nmで吸光度を測定する。ブランク値として、基質バッファーのみを指定の温度でインキュベートし、トリクロロ酢酸で停止した後にのみ10μlの酵素サンプルを加える。他の計測値と同様の方法で染色反応を進める。相対活性の決定では、最高の測定活性を100%に設定する。結果を図1に示す。
最適pHの決定のためには、修飾反応バッファー(100 mM酢酸Na、100 mMグリシン、100 mMイミダゾール、1 mM CaCl2、0.01% Tween 20)をフィターゼアッセイに使用する。希塩酸を使用して該修飾反応バッファーをpH 1.5〜7の範囲にpHを調整する。相対活性の決定では、最高の測定活性を100%に設定する。結果を図2に示す。
熱失活曲線の記録のためには、反応バッファー(250 mM酢酸Na、1 mM CaCl2、0.01% Tween 20、pH 5.5)中の希釈酵素サンプルを該当する温度に20分加熱し、次いで4℃に冷却する。非熱処理参照サンプルを20分室温に置き、その後、同様に4℃に冷却する。熱での前処理の後、サンプルの酵素活性をフィターゼアッセイによって測定する。参照サンプルの活性を100%に標準化する。種々のフィターゼ変異体の熱安定性をT50値によって特徴付ける。T50値は、熱失活後に、熱処理されない参照サンプルと比較して、50%の残存活性が依然として存在する温度を提供する。2種のフィターゼ変異体の熱安定性の変化(℃単位で表現される)は、それぞれのT50値の差異のせいで生じる。結果を図3に示す。
配列番号19の遺伝子配列のPCRによる突然変異によってフィターゼの変異体を作製した。標的化突然変異誘発では、「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」(Stratagene)を使用する。配列番号19のコード配列の全体または部分のみのランダム突然変異誘発は「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」(Stratagene)を使用して行う。突然変異誘発率を、使用される鋳型DNAの量により1〜5個の突然変異の所望の程度に設定する。単一の突然変異の標的化された組み合わせによって、または複数の突然変異誘発ラウンドを連続して行うことによって多重突然変異を作製する。
Claims (19)
- 配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するフィターゼ。
- 配列番号18に記載の位置に基づいて1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402および413位からなる群から選択される位置の少なくとも1個でのアミノ酸の変化を有する、請求項1に記載のフィターゼ。
- 少なくとも5個の前記変化を有する、請求項2に記載のフィターゼ。
- 配列番号18に記載の位置に基づいて1、6、12、17、84、89、92、109、137、138、140、142、143、149、156、202、205、207、208、209、228、234、243、247、248、251、255、256、261、270、304、314、320、349、356、373、382、399、402および413位の少なくとも1個のアミノ酸が、いずれの場合も、以下のアミノ酸:1 N, D, Q, H; 6 V, I, L, T, S; 12 N, D, Q, H, S; 17 N, D, Q, H; 84 V, I, L, T, S; 89 T, S, V; 92 E, Q, K, R, N, P, A, S, G, H; 109 K, R, E, D; 137 L, I, V; 138 N, Q, H, S; 140 P, A, N; 142 T, S, V; 143 Y, F, W; 149 H, N, S; 156 R, K, E, D; 202 S, T, A, V; 205 R, K, E, D; 207 E, Q, D, R, N, T, S, V, A, I, L, M; 208 M, L, I; 209 S, T; 228 Y, F, W; 234 N, D, Q, H, S, I, V, L, M; 243 K, R, D; 247 K, R, E; 248 L, I, M, V; 251 N, D, Q, H, S, I, V, L, M; 255 V, I, L, T, S; 256 Y, F, W, H, N, S; 261 E, Q, D, K, R, N; 270 K, R, E, D; 304 V, I, L, T, S; 314 G, A; 320 L, I, M, V; 349 R, K, E, D; 356 L, I, M, V; 373 I, V, L, M; 382 G, A; 399 I, V, L, M; 402 N, D, Q, H, S; 413 L, I, M, V, Q, E, N, K, Rのうちの1個によって置換されている、請求項1に記載のフィターゼ。
- 配列番号18のアミノ酸配列に対して、S1N; A6V; K12N; S17N; A84V; A89T; D92E; D92P; D92A; D92N; Q109K; M137L; D138N; S140P; A142T; H143Y; Q149H; T156R; N202S; N202T; G205R; K207E; K207T; K207I; V208M; A209S; H228Y; K234N; K234I; E243K; D247K; S248L; K251N; K251I; A255V; Q256Y; Q256H; S261E; N270K; A304V; S314G; T320L; Q349R; F356L; S373I; E382G; T399I; K402N; H413LおよびH413Qからなる群から選択される少なくとも1個の変化を有する、請求項1に記載のフィターゼ。
- 少なくとも5個の前記変化を有する、請求項5に記載のフィターゼ。
- 以下の変化:
[A89T / D92A / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / H413Q]、
[A89T / D92N / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / F356L / H413Q]、
[A89T / D92A / H143Y / T156R / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / K251N / Q256H / S314G / H413Q]および
[A89T / D92A / A142T / H143Y / N202S / K207E / A209S / H228Y / K234I / D247K / K251N / Q256H / H413Q]
からなる群から選択される少なくとも1つの変化を有する、請求項1に記載のフィターゼ。 - 請求項5〜7のいずれか一項に記載のフィターゼの1つに対して、少なくとも1個の位置で少なくとも1個の保存的アミノ酸置換を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載のフィターゼ。
- 単離されたフィターゼである、先行する請求項のいずれか一項に記載のフィターゼ。
- Yersinia mollaretiiおよびハフニア属種由来の2つの野生型フィターゼと比べて増加した熱安定性および/または増加した比活性を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載のフィターゼ。
- 請求項1〜10に記載のフィターゼの1つをコードする、フィターゼをコードする単離された核酸配列。
- フィターゼをコードする単離された核酸配列であって、
(a) 配列番号19の核酸配列と少なくとも70%の同一性を有する、
(b) 高度にストリンジェントな条件下で(a)の配列の1つの相補鎖とハイブリダイズする
単離された核酸配列。 - 請求項11または12に記載の核酸配列を含む組み換え発現ベクター。
- 請求項11もしくは12に記載の核酸配列または請求項13に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
- 請求項11もしくは12に記載の核酸配列または請求項13に記載のベクターを含む組み換え産生生物。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のフィターゼの少なくとも1つおよびさらなる飼料添加物をも含む動物飼料添加物。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のフィターゼの少なくとも1つを含む動物飼料。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のフィターゼまたは請求項16に記載の動物飼料添加物の、動物飼料中での使用。
- 家畜の肥料中のリン酸含量を減少させるための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のフィターゼ、請求項16に記載の動物飼料添加物、または請求項17に記載の動物飼料の、使用。
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