JP2013505429A - 甲状腺癌を診断および処置するための方法および組成物 - Google Patents
甲状腺癌を診断および処置するための方法および組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013505429A JP2013505429A JP2012529080A JP2012529080A JP2013505429A JP 2013505429 A JP2013505429 A JP 2013505429A JP 2012529080 A JP2012529080 A JP 2012529080A JP 2012529080 A JP2012529080 A JP 2012529080A JP 2013505429 A JP2013505429 A JP 2013505429A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thyroid cancer
- icd
- sample
- marker
- catenin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Abstract
Description
(a)患者から試料を得る工程;
(b)1つ以上の甲状腺癌マーカーを上記試料中で検出または同定する工程、および
(c)上記検出した量を、標準について検出した量と比較する工程。
(a)被験体由来の試料を、標的である甲状腺癌マーカー(具体的には、Ep−ICD、β−カテニン、ならびに状況に応じてEpExおよびc−mycから選択される少なくとも1つの甲状腺癌マーカー)のレベルを測定することができる試薬と接触させる工程;ならびに
(b)ATCを有していない被験体から、または異なる時間に上記被験体から採取した類似する試料から得た対照レベルを上回る、上記被験体由来の試料中の、Ep−ICDおよびβ−カテニン、および状況に応じてc−mycのうちの少なくとも1つのレベルの増大、ならびに、状況に応じてEpExの低下に基づいて、上記被験体においてATCの診断を提供する工程。
(a)患者から試料を得る工程;
(b)Ep−ICD、β−カテニン、EpEx、およびEpCAMのうちの1つ以上を、上記試料中で検出または同定する工程;ならびに
(c)上記検出した量を標準について検出した量と比較する工程。
(a)核Ep−ICD、核β−カテニン、および細胞質β−カテニンのうちの1つ以上を試料中で検出または同定する工程;ならびに
(b)上記検出した量を、標準について検出した量と比較する工程であって、ここでは、核Ep−ICD、核β−カテニン、および細胞質β−カテニンのうちの1つ以上の増大がATCの指標となる工程。
(a)核Ep−ICD、核β−カテニン、細胞質β−カテニン、およびEpEx(例えば、膜EpEx)のうちの1つ以上を、試料中で検出または同定する工程;ならびに
(b)上記検出した量を標準について検出した量と比較する工程であって、ここでは、核Ep−ICD、核β−カテニン、および細胞質β−カテニンのうちの1つ以上の増大、ならびにEpExの減少もしくはEpExが存在しないことがATCの指標となる、工程。
(a)患者から試料(例えば、腫瘍試料)を得る工程;
(b)甲状腺癌マーカー(好ましくは、Ep−ICDおよび/またはβ−カテニン)を、上記試料中で検出する工程;ならびに
(c)上記検出した量を標準について検出した量またはカットオフ値と比較する工程。
(a)患者由来の甲状腺癌マーカーのレベル;と
(b)甲状腺癌に罹患していない対照患者または低悪性度の甲状腺癌に罹患した対照患者から得た同じタイプの試料中の甲状腺癌マーカーの標準レベル
とを比較する工程が含まれる。ここでは、甲状腺癌マーカーの対応する標準レベルと比較した甲状腺癌マーカーのレベルの変化が、患者が甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌または転移性甲状腺癌、より具体的には、ATC)に罹患していることの指標となる。
(a)上記患者由来の試料(例えば、生検試料)に由来する甲状腺癌マーカーのレベル;と
(b)甲状腺癌を持たない患者または甲状腺癌の異なる病期(例えば、低悪性度の甲状腺癌)にある対照患者から得た同じタイプの対照試料中、あるいは、異なる時間に採取したその患者由来の試料による甲状腺癌マーカーのレベル
とを比較する工程が含まれ、ここでは、対照試料中の対応するレベルと比較した甲状腺癌マーカーのレベルの変化が、その患者が、より浸潤性の甲状腺癌または転移性の甲状腺癌に罹患していることの指標となる。
(a)被験体由来の試料(例えば、腫瘍試料)中の核Ep−ICDの量を決定する工程;
(b)上記試料中の核β−カテニンおよびβ−カテニンの一方または両方の量を決定する工程;
(c)上記試料中のEpExの量を決定する工程;
(d)工程(a)の結果と工程(b)の結果、および状況に応じて工程(c)の結果を数学的に組み合わせて、数学的組み合わせを得る工程;ならびに
(e)甲状腺癌の浸潤性に対して上記数学的組み合わせを比較するかまたは相関させる工程。
(a)最初の時点の患者試料(例えば、生検試料)中の甲状腺癌マーカー(単数または複数)を検出する工程;
(b)次の時点で工程(a)を繰り返し行う工程;および
(c)(a)で検出したレベルと(b)で検出したレベルを比較し、それにより、患者において甲状腺癌の進行をモニタリングする工程。
(a)患者由来の試料中のポリヌクレオチド甲状腺癌マーカー(単数または複数)のレベル;と
(b)甲状腺癌に罹患していない対照患者もしくは低悪性度の甲状腺癌を有している対照患者から得た同じタイプの試料中、または異なる時間に採取したその患者由来の試料からのポリヌクレオチド甲状腺癌マーカー(単数または複数)の対照レベル
とを比較する工程を含む。ここでは、ポリヌクレオチド甲状腺癌マーカー(単数または複数)の対応する対照レベルと比較した、上記ポリヌクレオチド甲状腺癌マーカー(単数または複数)レベルの変化が、甲状腺癌の浸潤性または転移能の指標となる。
(a)患者由来の試料中のポリペプチド甲状腺癌マーカーのレベル;と
(b)非癌試料中または低悪性度の甲状腺癌を持つ患者由来の試料中、あるいは、異なる時間に採取したその患者由来の試料によるポリペプチド甲状腺癌マーカーの対照レベル
とを比較する工程が含まれる。ここでは、対照レベルと比較した、患者由来の試料中での有意に異なるポリペプチド甲状腺癌マーカーのレベル(例えば、患者試料中で高い)が、上記患者が、甲状腺癌、または浸潤性もしくは転移性甲状腺癌(具体的には、ATC)に罹患していることの指標となる。
(a)第1の時点での患者試料中のポリペプチド甲状腺癌マーカー(単数または複数)を検出する工程;および
(b)次の時点で工程(a)を繰り返し行う工程;ならびに
(c)(a)で検出したレベルと(b)で検出したレベルを比較し、それにより、患者において甲状腺癌の進行をモニタリングする工程。
(a)患者に治療の少なくとも一部を提供する前に患者から得た第1の試料中の甲状腺癌マーカーのレベル;と
(b)治療後に患者から得た第2の試料中の甲状腺癌マーカーのレベル
とを比較する工程が含まれる。
(a)試験化合物の存在下および不在下で病的細胞の別々のアリコートを維持する工程;ならびに
(b)各アリコート中の甲状腺癌マーカーのレベルを比較する工程。
(a)被験体由来の試料中の甲状腺癌マーカーの量を決定する工程;
(b)試料中の甲状腺癌と関係がある他のマーカー(具体的には、ガレクチン−3、サイログロブリン、E−カドヘリン、c−Myc、β−アクチン、FHL2、およびLef−1からなる群より選択されるマーカー)の量を決定する工程;
(c)工程(a)の結果と工程(b)の結果を数学的に組み合わせて、数学的組み合わせを得る工程;ならびに
(d)甲状腺癌の存在、または甲状腺癌の浸潤性もしくは転移能に対して、上記数学的組み合わせを比較するかあるいは相関させる工程。
(a)患者に、甲状腺癌マーカー(単数または複数)に結合する薬剤(この薬剤は、甲状腺癌を画像化するための標識を持っている)を注射する工程;
(b)上記薬剤をインビボでインキュベートし、甲状腺癌マーカー(単数または複数)に結合できるようにする工程;および
(c)甲状腺癌に局在化した標識の存在を検出する工程。
本発明は、甲状腺癌マーカーの発現と、甲状腺癌(具体的には、甲状腺癌、より具体的には、ATC、の浸潤性または転移能)との間での新しく発見した相関関係に関する。本明細書中に記載される甲状腺癌マーカーは、甲状腺癌を(具体的には、甲状腺癌(より具体的には、ATC)の浸潤性または転移能を)診断する、検出する、あるいは特性決定するための方法を提供する。試料中の浸潤性または転移性甲状腺癌の存在または不在を診断あるいは検出するための方法、および甲状腺癌の進行をモニタリングするための方法、ならびに患者の甲状腺癌の診断および特性決定と関係がある甲状腺癌の特徴についての情報を提供するための方法を提供する。
様々な方法を、甲状腺癌マーカーを含む甲状腺癌の診断および予後の評価、ならびにそのような障害の素因がある被験体の同定に利用することができる。このような方法では、例えば、ポリヌクレオチド甲状腺癌マーカーおよびその断片、ならびに、ポリペプチド甲状腺癌マーカー(ペプチド断片を含む)に特異的な結合剤(例えば、抗体)を利用することができる。具体的には、上記ポリヌクレオチドおよび抗体は、例えば、(1)ポリヌクレオチド突然変異の存在の検出、あるいは、障害ではない状態と比較した、mRNAの過剰発現または低発現のいずれかの検出、あるいは、特定の症状もしくはそのような症状に対する罹患しやすさと相関関係があり得るポリヌクレオチド転写物の選択的にスプライシングされた形態の定性的もしくは定量的検出;および(2)障害ではない状態と比較したポリペプチドの過剰量または過少量のいずれか、あるいは、障害状態もしくは障害状態への進行と相関関係がある修飾された(例えば、全長よりも短い)ポリペプチドの存在の検出に使用することができる。
本明細書中に記載するように、甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌または転移能を持つ甲状腺癌、より具体的には、ATC)を、試料中のポリヌクレオチド甲状腺癌マーカーのレベルに基づいて検出することができる。核酸分子を検出するための技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーションアッセイ)は当該分野で周知である。
結合剤を、様々な診断用途およびアッセイ用途に使用することができる。試料中の標的分子を検出するために結合剤を使用するための様々なアッセイ形式が当業者に公知である(例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY,1988を参照のこと)。一般的には、被験体における浸潤性甲状腺癌または転移能を持つ甲状腺癌(具体的には、ATC)の有無を、(a)被験体由来の試料を結合剤と接触させること;(b)試料中で、結合剤に結合するポリペプチドのレベルを検出すること;および(c)ポリペプチドのレベルを、予め決定した標準値またはカットオフ値と比較することにより決定することができる。本発明の特定の態様においては、結合剤は抗体である。
(a)ポリペプチド甲状腺癌マーカーを含有していると疑われる試料を得る工程;
(b)抗体に結合して複合体を形成させるために有効な条件下で、上記試料を、ポリペプチド甲状腺癌マーカーに特異的に結合する抗体と接触させる工程;
(c)上記複合体の量を定量化することにより、上記試料中に存在するポリペプチド甲状腺癌マーカーの量を測定する工程;および
(d)上記試料中に存在するポリペプチド甲状腺癌マーカーの量を、対照中のポリペプチド甲状腺癌マーカーの量と比較する工程であって、ここでは、対照中の量と比較した試料中のポリペプチド甲状腺癌マーカーの量の変化または有意な差が、浸潤性甲状腺癌または転移能を持つ甲状腺癌(具体的には、ATC)の指標となる、工程。
(a)ポリペプチド甲状腺癌マーカーに結合する抗体を個体由来の試料と、上記抗体と試料中のポリペプチド甲状腺癌マーカーを含有する複合体が形成するように、接触させる工程;
(b)上記試料中の複合体形成の存在もしくは量を決定または検出する工程;
(c)遅い時点で、工程(a)と工程(b)を繰り返し行う工程;および
(d)工程(b)の結果と工程(c)の結果を比較する工程であって、ここでは、複合体の形成量の差が、疾患、病期、進行、上記個体の癌の浸潤性および/または転移能の指標となる、工程。
(a)生物学的試料を、検出可能な物質で直接または間接的に標識されたポリペプチド甲状腺癌マーカーに特異的な第1の抗体および固定化されたポリペプチド甲状腺癌マーカーに特異的な第2の抗体とともにインキュベートする工程;
(b)上記第1の抗体を上記第2の抗体から分離して、第1の抗体相と第2の抗体相を提供する工程;
(c)上記第1の抗体相と上記第2の抗体相中の検出可能な物質を検出し、それにより、上記生物学的試料中のポリペプチド甲状腺癌マーカーを定量化する工程;および
(d)定量化したポリペプチド甲状腺癌マーカーを、予め決定した標準についてのレベルと比較する工程。
本発明ではまた、甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌、より具体的には、ATC)の処置におけるそれらの潜在的有効性について試験薬剤または試験化合物を評価するための方法を検討する。試験薬剤および試験化合物としては、ペプチド(例えば、Igテールの融合タンパク質を含む可溶性ペプチド、ランダムペプチドライブラリーのメンバー、ならびに、D型および/またはL型のアミノ酸から作製されたコンビナトリアルケミストリーにより誘導した分子ライブラリーのメンバー)、ホスホペプチド(ランダムまたは部分縮重の特異的ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む)、抗体[例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、断片(例えば、Fab、F(ab)2、およびFab発現ライブラリー断片、およびそれらのエピトープ結合断片)]、ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス、siRNA)、ならびに、小さい有機分子または無機分子が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬剤または化合物は、内因性の生理学的化合物、または天然の化合物、または合成化合物であり得る。
(a)患者から得た、試験薬剤に曝した第1の試料中の1つ以上の甲状腺癌マーカー、および状況に応じた他のマーカーのレベル;と
(b)患者から得た第2の試料中で、1つ以上の甲状腺癌マーカー、および状況に応じた他のマーカーのレベル(ここでは、上記試料は試験薬剤に曝していない)
とを比較する工程が含まれる。ここでは、第2の試料と比較した第1の試料中の1つ以上の甲状腺癌マーカーおよび状況に応じた他のマーカーの発現レベルの有意な差が、この試験薬剤がその患者の甲状腺癌の処置に有効である可能性があることの指標となる。
(a)患者から試料を得る工程;
(b)複数の試験薬剤の存在下で試料のアリコートを別々に維持する工程、
(c)アリコートのそれぞれの中での1つ以上の甲状腺癌マーカーおよび状況に応じた他のマーカーを比較する工程;ならびに、
(d)他の試験薬剤と比較して、その試験薬剤を含有するアリコートにおいて1つ以上の甲状腺癌マーカーおよび状況に応じた他のマーカーのレベルを変化させる試験薬剤の1つを選択する工程
が含まれる。
本発明は、甲状腺癌を診断するため、および具体的には、甲状腺癌(より具体的には、ATC)の浸潤性または転移能を検出するために本発明の方法を実行するためのキットを検討する。そのようなキットは典型的に、診断アッセイを行うために必要な2つ以上の構成要素が含まれる。構成要素としては、化合物、試薬、容器および/または装置が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。したがって、本明細書中に記載する方法は、本明細書中に記載する少なくとも1つの薬剤(例えば、抗体、プローブ、プライマーなど)を含有する事前に包装された診断キットを利用することにより行うことができる。そのような診断キットは、例えば、臨床状況において、甲状腺癌に罹患している患者を診断するために、また、甲状腺癌を発症する素因を示すそのような個体を診断するために、および具体的には、甲状腺癌(より具体的には、ATC)の浸潤性または転移能を決定するために都合よく使用することができる。
本明細書中で検討する分析方法は、以下に記載する当該分野で公知のコンピューターシステムおよび方法の使用により実行することができる。したがって、本発明は、1つ以上の甲状腺癌マーカーを含むコンピューターで読み取り可能な媒体を提供される。「コンピューターで読み取り可能な媒体」は、コンピューターによる直接の読み取りおよびアクセスが行われ得る任意の媒体をいい、これには、磁気記憶媒体(例えば、フロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ);光学記憶媒体(例えば、CD−ROM);電気的記憶媒体(例えば、RAMおよびROM)、ならびに、これらのカテゴリーのハイブリッド(例えば、磁気/光学記憶媒体)が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、患者および対照について同定されたマーカーがその上に記録されているコンピューターで読み取り可能な媒体を検討する。
本発明は、甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌、より具体的には、ATC)を含む、本明細書中に開示する甲状腺癌マーカーと関係がある治療的適用を検討する。甲状腺癌マーカーは、治療の標的であり得る。例えば、核Ep−ICDが、浸潤性甲状腺癌およびATCの処置の標的であり得る。治療方法としては、抗体療法の使用を含む免疫療法が挙げられる。1つの態様で、本発明は、甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌、より具体的には、ATC)を予防するために使用することができる1つ以上の抗体を提供する。別の態様において、本発明は、甲状腺癌(具体的には、浸潤性甲状腺癌、より具体的には、ATC)を予防する、阻害する、または軽減する方法を提供する。この方法には、甲状腺癌マーカー(例えば、Ep−ICD)に結合する抗体を、上記症状または上記症状の発症を予防する、阻害する、または軽減するために有効な量で患者に投与する工程が含まれる。
(a)患者から腫瘍試料を得る工程;
(b)複数の試験薬剤の存在下で試料のアリコートを別々に維持する工程;
(c)それぞれのアリコートにおける、本明細書中に開示する甲状腺癌マーカーおよび状況に応じた1つ以上の他のマーカーのレベルを比較する工程;
(d)他の試験薬剤と比較して、その試験薬剤を含有しているアリコートの中で甲状腺癌マーカーおよび状況に応じた他のマーカーのレベルを変化させる少なくとも1つの試験薬剤を、患者に投与する工程。
ヒトの原発性甲状腺癌中ならびに浸潤性および非浸潤性甲状腺癌細胞株のパネル中でのEpExタンパク質とEp−ICDタンパク質の発現を、EpCAMのEp−ExドメインとEp−ICDドメインに特異的な抗体を使用する免疫組織化学(IHC)により調べ、その知見をウェスタンブロッティングにより確認した。EpCAMの過剰発現が転写量の増大に寄与しているかどうかを決定するために、定量的リアルタイムPCR(Q−PCR)をこれらの腫瘍中のEpCAM転写物の分析に使用した。さらに、核のEp−ICDとβ−カテニンについての同時染色を、甲状腺癌における発癌性Ep−ICDシグナル伝達の予後的重要性を立証するために行った。
(患者および組織検体)
本研究は、Ontario Ethics Committee and Mount Sinai Hospital,Toronto,Canadaにより承認された。全ての特許の情報を提供し、署名入り同意を得た。30個の甲状腺癌パラフィンブロックを、Department of Pathology,Mount Sinai Hospital,Toronto,Canadaのアーカイブから回収した。15個の甲状腺腫瘍と15個の隣接する正常組織を含む30個の新しい凍結試料もまた、定量的リアルタイムPCR分析のための研究に含めた。これらの組織をRNAlater TissueProtect溶液(Qiagen,Mississauga,ON)中で急速冷凍し、使用するまで−80℃で保存した。それぞれの症例をさらなる実験の前に病理学者により精査した。
抗EpCAMモノクローナル抗体MOC−31(AbD Serotec,Oxford,UK)は、EpCAMのアミノ末端領域中の細胞外成分(EGF1ドメイン−aa27〜59)を認識する[Chaudry Maら、2007]。EpCAMの細胞内ドメイン、α−EpICD抗体1144(Epitomics)は、EpCAMの細胞質ドメインを認識する。β−カテニンのaa571〜781に対して惹起させられたβ−カテニン抗体(カタログ番号610154,B D Sciences,San Jose,CA)およびc−myc抗体(C19,sc−788,アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体,Santa Cruz Biotechnology Inc.)。
M.Ringel,The Ohio State University,OHによる結腸癌細胞株WRO(これまでは甲状腺癌細胞株と考えられていた)とARO結腸癌細胞株(これまではATC細胞株と考えられていた)を、10%のウシ胎児血清(FBS)、2mmol/LのL−グルタミン、1mmol/Lのピルビン酸ナトリウム、および1×の非必須アミノ酸を補充したRPMI 1640の中で増殖させた。TPC−1(高分化型の甲状腺乳頭癌細胞株)を、5%のFBSと2mmol/LのL−グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。甲状腺髄様癌株TT(J.Fagin,University of Cincinnati,Cincinnati,OHによる)を、10%のFBSを補充したF−12K培地(Invitrogen Life Technologies,Grand Island,NY)中で増殖させた。未分化甲状腺癌細胞株CAL62(J.Faginによる)を、10%のFBSを補充したDMEM中で増殖させた。全ての細胞株を、加湿した5%のCO2インキュベーターの中で37℃で培養し、70〜80%のコンフルエント細胞を以下に記載する実験に使用した。
4μmの厚みの連続切片をパラフィンブロックから切り、ガラススライド上にマウントした。これらの切片を脱パラフィンし、キシレンと段階的なアルコール系列により水和した。これらのスライドを0.3%のH2O2で室温で30分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックした。正常なウマまたはヤギ血清で非特異的結合をブロックした後、これらの切片を、抗EpExマウスモノクローナル抗体MOC−31(希釈率1:200)またはα−EpICD抗体1144(希釈率1:200)、またはマウスモノクローナルβ−カテニン抗体(希釈率1:200)とともに30分間、そしてビオチニル化された二次抗体(ウマ抗マウス抗体またはヤギ抗ウサギ抗体)とともに30分間インキュベートした。これらの切片を、最後に、VECTASTAIN Elite ABC Reagent(Vector labs,Burlingame,CA)とともにインキュベートし、ジアミノベンゼジン(diaminobenzedine)を色素原として使用した。
免疫陽性染色(Immunopositive staining)を、記載されているように組織切片の5つの領域において評価した[Ralhanら、2008]。臨床転帰について盲検とした2人の評価者により観察した時に、上皮細胞が、細胞質、原形質膜、および/または核において免疫陽性を示した場合には、切片を陽性としてスコアした。これらの切片は以下のようにスコアした:0、<10%の細胞が免疫反応性を示した;1、10〜30%の細胞が免疫反応性を示した;2、30〜50%の細胞が免疫反応性を示した;3、50〜70%の細胞が免疫反応性を示した;および4、>70%の細胞が免疫反応性を示した。切片をまた、以下のように、強度に基づいて半定量的にスコアした:0、なし;1、弱い;2、中程度;および3、強い。最後に、合計スコア(0〜7の範囲)を、甲状腺癌と正常な甲状腺組織切片のそれぞれについて、陽性率のスコアと強度のスコアを足し算することにより得た。免疫組織化学のデータについて、以前に記載されているように統計分析を行った[Ralhanら、2008]。
免疫組織化学のデータについて、SPSS 10.0ソフトウェア(Chicago)を使用して統計分析を行った。ボックスプロットを使用して、正常な甲状腺組織と甲状腺癌における膜EpEx、核Ep−ICD、および核または細胞質β−カテニンの発現の合計スコアの分布を決定した。≧2のカットオフを、統計試験についての核β−カテニン免疫陽性の陽性基準と定義した。膜β−カテニンについては、6のスコアを発現の喪失と定義した。
RNAの単離は全て、製造業者の説明書にしたがって行った。全RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen,Maryland,MA)を使用して細胞株から抽出した。High Pure RNA Tissue KitとHigh Pure RNA Paraffin Kit(Roche,Mannheim,Germany)を使用して、それぞれ、新しい凍結甲状腺組織検体およびFFPE試料からRNAを単離した。RNAの量を、ND−1000分光光度計(Nanodrop Technologies,Wilmington,DE)を使用して測定した。ファーストストランドcDNAの合成は、Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche,Mannheim,Germany)を使用して行った。5μlの反応産物を、リアルタイムPCRの鋳型として使用した。
定量的リアルタイムRT−PCR(Q−PCR)分析を、SYBR Green I Masterキット(Roche,Mannheim,Germany)とともにLightCycler480(Roche,Mannheim,Germany)を、製造業者の説明書にしたがって使用して行った。リアルタイムPCR反応を、95℃で5分間のインキュベーションにより開始し、続いて、45サイクルの、95℃で10秒間の変性、65℃で15秒間のアニーリング、および72℃で15秒間の伸長を行った。融解曲線分析を、PCRの完了直後に行った。全ての反応を3連で行い、この実験を少なくとも2回繰り返した。データを、LightCycler480ソフトウェア1.5を使用して分析した。
浸潤性および非浸潤性甲状腺癌細胞(WRO、CAL−62、TT、およびTPC−1)と対照細胞(ARO)をカバーガラス上にプレートし(1×103)、一晩増殖させた。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、4%のパラホルムアルデヒドを使用して固定した。免疫組織化学によるEp−Ex、Ep−ICD、およびβ−カテニンの検出のために、固定した細胞を、MOC−31、1144(希釈率1:200)、またはマウスモノクローナルβ−カテニン抗体で、それぞれ30分間染色し、ビオチニル化した二次抗体で30分間染色した。切片を最後に、VECTASTAIN Elite ABC Reagent(Vector labs,Burlingame,CA)とともにインキュベートし、ジアミノベンゼジン(diaminobenzedine)を色素原として使用した。
細胞溶解物を、溶解緩衝液(0.15mMのNaCl、5mMのEDTA(pH8.0)、1%のTriton、10mMのTris−Cl(pH7.4))およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)中に調製した。細胞溶解物(30μgのタンパク質)をSDS−PAGEにより分解し、PVDFメンブレン(Millipore,Billerica,MA)に移した。このメンブレンを抗EpCAMマウスモノクローナル抗体B302(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)(希釈率1:500)で、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス抗体で、そして製造業者の説明書(PerkinElmer Life Sciences,Boston,MA)にしたがって化学発光検出システムでプローブした。タンパク質ローディングについての対照として、ブロットを、マウスモノクローナル抗体C−4(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)(希釈率1:1000)を使用してβ−アクチンについてプローブした。定量化は、ImageGaugeソフトウェア(Altura Software Inc.)を使用した濃度測定により行った。
(甲状腺癌中でのEpExおよびEp−ICDの発現の免疫組織化学的分析)
甲状腺癌中でのEp−ExとEp−ICDの臨床的重要性を決定するために、それらの発現を、それぞれ、ドメイン特異的抗体MOC−31および1144を使用して免疫組織化学によりアーカイブした組織において分析した。原形質膜でのEpEx免疫反応性はATCにおいては観察されなかった(図1、パネルIA)。膜EpExの喪失によりその細胞質/核での蓄積を生じたかどうかを決定するために、Ep−ICDの免疫染色を1144抗体を使用して行った。強い核および細胞質Ep−ICD免疫染色がATCにおいて観察された(図1、パネルIIA)。活性化されたEp−ICDは、β−カテニンに結合し、インビトロで癌細胞の細胞増殖を活性化させることが示されている[Maetzelら、2009]。β−カテニンの免疫染色を、細胞質/核Ep−ICDと核/細胞質β−カテニンとの間に何らかの相関関係があるかどうかを決定するために、連続切片において行った。この研究は、ATCにおける細胞質および核β−カテニンの同時免疫染色を示した(図1、パネルIIIA)。
正常な甲状腺組織と甲状腺癌の様々なサブタイプのパラフィンに包埋した切片中で決定したEpEx、Ep−ICD、およびβ−カテニンの合計の免疫染色スコアの分布を、図3に示す。パネルAは、EpEx染色についてのボックスプロットを示す。AIは、正常組織およびPTC中での膜EpEx局在化を示し、ATC中では検出できるほどの発現がないこと、ならびに、FTCおよびSCC中での様々に低下した発現を示す(3のメジアンスコアを持つ、太い横線)。パネルAIIは、正常組織、PTC、PDPTC、PDFTC、およびFTC中での細胞質EpEx局在化を示し、ATC中では検出できるほどの発現がないこと、およびSCC中での様々に低下した発現を示す。パネルAIIIは、正常組織、または甲状腺癌の全てにおいて、検出できるほどの核EpEx染色がないことを示す。
浸潤性甲状腺癌および非浸潤性甲状腺癌におけるEpCAMの示差的発現を、Q−PCRにより転写レベルで決定した。図4は、甲状腺腫瘍および非悪性(組織学的には正常な)甲状腺組織中でのEpCAM転写物のレベルを示す。ATCは、FTCおよびPTCと比較して極めて低いレベルのEpCAM転写物を示した。EpCAM転写物と甲状腺癌の浸潤性との間では相関関係は観察されなかった。
カプラン・マイヤー生存性分析により、核Ep−ICDの発現を示している甲状腺癌患者について全生存率の低下が明らかになった(p<0.0001、図5A)。全生存率のメジアンは、核Ep−ICDを示さなかった患者についての185カ月と比較して、核Ep−ICDを示している患者においては5カ月であった。膜EpExの喪失を示している患者は、膜性発現を示している患者(メジアン=185カ月)よりも短い全生存率(メジアン=5カ月)を有していた(p<0.0001、図5B)。核β−カテニンを示している患者は、核β−カテニンを示さなかった患者(メジアン=185カ月)よりも短い全生存率(メジアン=5カ月)を有していた(p=0.0014、図5C)。Ep−ICDおよびβ−カテニンの両方の核発現を示している甲状腺癌患者は、それらを示さなかった患者(メジアン=185カ月)よりも短い全生存率(メジアン=5カ月)を有していた(p=0.0014、図5D)。
浸潤性のヒト甲状腺癌および非浸潤性のヒト甲状腺癌において観察されたEpExとEp−ICDの示差的な細胞内局在化を、インビトロで増殖させた甲状腺癌細胞株においてシミュレーションし、免疫組織化学により決定した。原形質膜に局在化した強いEpEx免疫染色が、WRO細胞、甲状腺髄様癌TT、および陽性対照である結腸癌細胞ARO(これまではATC細胞と考えられていた)において免疫組織化学により検出されたが、未分化甲状腺癌細胞(CAL−62)と低悪性度の甲状腺乳頭癌細胞(TPC−1)の中では膜EpCAM染色は検出されなかった(図6A、パネルI)。これらの知見を免疫蛍光により確認した(図6A、パネルIII)。
EpCAMの発癌性は、その細胞内ドメインの切り離しにより活性化されるとの説が提案されている。この細胞内ドメインは、Wnt経路の構成要素の活性化により細胞の核にシグナルを伝達することができる。原形質膜からのEpEx発現の喪失、細胞質での蓄積、および核への移動と、Wnt経路の構成要素であるβ−カテニンの細胞内局在化および標的遺伝子(例えば、c−myc)の発現との間に何らかの相関関係があるかどうかを決定するために、これらのタンパク質の発現を甲状腺癌細胞株の上記パネルにおいて分析した。図6Eおよび6Fは、WRO細胞およびARO細胞における、細胞間接触部位での強いEpExの発現と、β−カテニンおよびc−mycの細胞質および核での局在化を示すが、これらはCAL−62、TT、およびTPC−1細胞中では示されない。
本研究の重要な発見は以下である:(i)未分化甲状腺腫瘍は膜EpExの喪失を示したが、腫瘍細胞の細胞質と核においてはEp−ICDの蓄積の増大を示し、これは、同時に起こるβ−カテニンの発現と並行して起こった。このことは、Ep−ICDが、これらの腫瘍において発癌性シグナルトランスデューサーとして作用し得、その結果である、β−カテニンを含むWnt経路の構成要素の活性化が、これらの腫瘍の迅速な増殖とそれらの予後不良の主な原因となり得ることを示唆している;(ii)EpExの膜での過剰発現が、高分化型濾胞性甲状腺癌および甲状腺乳頭癌の両方において観察されたが、分化の度合いが低い濾胞性甲状腺癌および甲状腺乳頭癌のサブセットは核Ep−ICDを示した;(iii)EpExは、培養物中の癌細胞、WRO、およびTTの表面上で過剰発現されていたが、未分化甲状腺癌細胞(CAL62)と浸潤性が低い細胞TPC−1においては膜上では検出されず、一方で、核Ep−ICDがCAL62細胞中で検出された。これらは、臨床的知見を裏付けている。
結論として、浸潤性甲状腺癌(未分化甲状腺癌、およびいくつかの分化の度合いが低い甲状腺乳頭癌)における膜EpExの喪失とEp−ICDの核での蓄積が明らかになった。それに付随する、これらの腫瘍における核β−カテニンの増大は、これらの腫瘍におけるWnt経路のシグナル伝達の活性化を示唆していた。さらに、膜EpExの喪失、またはEp−ICDの核での蓄積は、単独で、あるいはβ−カテニンとの組み合わせにおいて、甲状腺癌患者の低い全生存率と関係があった。Ep−ICDは浸潤性甲状腺癌のマーカーとなり得、新規の治療薬の標的である可能性がある。
(EpCAM − 可能性がある治療標的)
VB4−845/VB6−845で処理した場合のEpCAM陽性甲状腺癌の細胞増殖の阻害
EpCAM特異的免疫毒素であるVB4−845/VB6−845の細胞増殖に対する効果を、甲状腺癌細胞株のパネルにおいて、ならびに、様々なレベルのEpCAMの発現を持つ陽性対照である結腸癌細胞株において試験した。図7に示すように、MTTをベースとする細胞の生存性アッセイは、VB4−845が、WRO細胞およびARO細胞において増殖を阻害し、それぞれ、1pMおよび0.7pMのIC50を有していたことを示した。比較すると、甲状腺髄様癌株TTは、この免疫毒素での処理に対してわずかに反応したが、乳頭状細胞株TPC−1および未分化細胞株CAL−62は、検出できるほどの膜性EpCAM発現がなく、VB4−845に対して非反応性であった。同様の結果が、VB6−845で処理した同じ細胞株においても観察された(未公開データ)。
FACSによる、VB4−845で処理した甲状腺癌細胞の細胞周期分析は、TT細胞およびTPC−1細胞と比較した、WRO細胞および陽性対照であるARO細胞中でのsubG0画分の顕著な増加が反映するアポトーシスの時間依存性誘導を示した。細胞株中でのEpCAMの発現に対するVB4−845の効果もまた、様々な濃度のVB4−845での処理の前後に、ウェスタンブロッティングにより決定した。図8は、免疫毒素で処理したWRO細胞中でのEpCAMの発現の用量依存性の減少を示す。EpCAMの発現は、未処理のTPC−1細胞またはVB4−845で処理したTPC−1細胞中で検出されなかった。
免疫毒素VB4−845は、抗EpCAM単鎖可変断片をPseuodomonas外毒素Aの毒性と組み合わせた組み換え体融合タンパク質である。このタンパク質には、2つのヘキサヒスチジンタグが隣接している。フローサイトメトリーアッセイにより決定すると、VB4−845との2時間のインキュベーション後に、抗His抗体が、EpCAMの発現を示している細胞において検出された。
以下の材料および方法を本実施例に記載する研究において利用した。
本研究は、Mount Sinai Hospital Research Ethics Board,Toronto,Canadaにより承認された。IHC分析については、正常な甲状腺組織(N=9)、非腫瘍性過形成性/コロイド結節(N=1)、甲状腺乳頭癌(PTC、N=86)、濾胞性甲状腺癌(FTC、N=2)、分化の度合いが低いPTC(N=1)、分化の度合いが低いFTC(N=1)、甲状腺髄様癌(N=3)、島状癌(N=6)、SCC(N=4)、未分化の甲状腺癌(N=11)のアーカイブされた組織ブロックを腫瘍バンクから取り出し、病理学者により精査し、以下に記載するようにEp−ICD抗体およびEpEx抗体(Moc31)での免疫染色のための組織切片の切断に使用した。
図10〜14の散布図は、分析した、正常な甲状腺組織と甲状腺腫瘍の9つのサブタイプにおける、Ep−ICDおよびEpExの膜/細胞質/核の免疫組織化学染色スコアの分布を説明する。ATC群とSCC群は、膜EpEx染色の顕著な減少を示し、4未満の平均スコアを有しており、島状癌は膜EpExの中程度の減少を示した。注目すべきは、ATCがEpExの喪失を示し、1未満の膜IHCスコアを有していたことである(図10)。正常な甲状腺組織の群と同様に、他の浸潤性が低い甲状腺腫瘍のサブタイプは高いEpEx膜染色を示し、6を上回る平均IHCスコアを有していた(図10)。EpExの細胞質染色についての観察においては(図11)、正常な甲状腺の群と同様に、いくつかの浸潤性が低い甲状腺癌のサブタイプ(例えば、PTC、FTC)は、ATC、SCC、および島状癌のサブタイプを含むより浸潤性である甲状腺癌のサブタイプよりも高いEpEx染色を示した。ATC群は、検出できるほどの低いEpEx染色を示さなかったか、またはぼんやりした免疫反応性を示した。
比較した2つの腫瘍である甲状腺癌サブタイプ(甲状腺乳頭癌と未分化甲状腺癌)のうち(表2)、ATC群は、陽性を決定するために≧4のカットオフを選択した場合には11個の組織ブロックのうちの10個において(90.9%)核Ep−ICD陽性を示したが、11個の組織全てが、≦4のカットオフ値でEpExの膜発現の喪失を示した。86個のPTC組織のうちの1個だけ(1.2%)が核Ep−ICD陽性を明らかに示した。PTCにおける4.5の高い核EpICDスコアの病歴との相関関係は、患者がリンパ節転移の証拠がある35歳の男性であったことを明らかにした。3の核Ep−ICDスコアを持つ別のPTC患者は、敗血症を伴う転移性膵臓癌を有していた。Ep−ICD染色スコアとEpEx IHC染色スコアは、PTC群とATC群との間で有意に異なっており、これにより、浸潤性甲状腺癌を非浸潤性甲状腺癌(TC)と識別した。
ROC曲線を、最も浸潤性である甲状腺癌のサブタイプATCを、最も頻繁に観察されたが非浸潤性である甲状腺癌のサブタイプPTCから識別するために、膜EpExと核Ep−ICDについて作製した(図15および16)。ROC分析の結果を表4にまとめる。≧4のカットオフで、核Ep−ICDの蓄積により、90.9%の感度、98.8%の特異性、そして0.9931のAUCで、ATCをPTCから識別した(図15および表4)。これは、高レベルの核EpICDの蓄積が、浸潤性甲状腺癌のサブタイプを他の非浸潤性甲状腺癌のサブタイプから識別するための優れた生体マーカーとなる可能性があることを示唆している。図15および表5に示すように、核EpICDのIHC染色スコアのカットオフを2.5〜4の間で選択すると、この生体マーカー(核EpICD)は、90〜100%の高い感度、および95〜98%の高い特異性で、ATCをPTCから識別することができる。≦4のカットオフでは、膜EpEx発現の喪失によってもまた、100%の高い感度、98.8%の高い特異性、および0.914のAUC値で、ATCの症例全てをPTCから識別することができた(図16および表6)。陽性予想値は91.67%であり、陰性予想値は100%である(図16および表6)。図16および表7に示すように、EpEx膜IHC染色スコアのカットオフを3.5〜5の間で選択すると、この生体マーカー(膜EpEx)により、90〜100%の高い感度および95〜100%の高い特異性で、ATCをPTCから識別することができる。
(フィリピン人の甲状腺癌の研究)
フィリピン人の集団について、甲状腺癌の発症率が高いことを観察し、これらの腫瘍はフィリピン人ではない患者よりも浸潤性が高かった。EpExとEp−ICDの発現を、フィリピン人患者の浸潤性甲状腺癌と非浸潤性甲状腺癌において分析した。結果を以下に示す。
比較した3つの腫瘍群のうち(表3)、浸潤性悪性腫瘍群は、10個の組織のうちの7個において核Ep−ICD陽性を示し、4のIHCスコアカットオフ値で、10個の組織のうちの6個がEpExの膜発現の喪失を示した。分析した9個の良性腫瘍の症例と11個の非浸潤性悪性腫瘍の症例のいずれにおいても、EpExの膜発現の喪失は観察されなかった。非浸潤性甲状腺癌は、核Ep−ICD陽性を示さず、分析した9個の良性腫瘍のうちのわずか1つだけが核Ep−ICD陽性を示した。図17に示す顕微鏡写真は、良性甲状腺腫瘍(A)および非浸潤性悪性腫瘍(C)における膜EpEx発現を示し、EpExの膜発現の喪失が、10個の浸潤性悪性甲状腺腫瘍の症例の全てにおいていくつかの領域で観察された(E、G)。Ep−ICD核発現が、浸潤性悪性甲状腺腫瘍(F、H)において観察されたが、良性腫瘍群および非浸潤性悪性腫瘍群においては観察されなかった(B、D)。
図18および19の散布図、図21Aおよび21B、ならびに図22Aおよび22Bのボックスプロットは、分析したフィリピン人の甲状腺腫瘍の症例の3つの群(全部で30の症例)における膜EpEx染色スコアと核Ep−ICD染色スコアの分布を示した。核Ep−ICD染色の増大(≧4のカットオフを上回る)は、試験した10個の浸潤性悪性腫瘍のうちの7個において見られ(図22B)、4.3の平均染色スコアを示していた。≧4のカットオフに達した核Ep−ICD染色は、9個の良性腫瘍のうちではわずか1つにおいてしか観察されず、11個の非浸潤性悪性腫瘍組織のいずれにおいても観察されなかった。試験した9個の良性甲状腺腫瘍組織の全ておよび11個の非浸潤性悪性腫瘍の全てが、高レベルの膜EpEx染色を示し、およそ7の平均スコアを有している(図21(A))。膜EpEx発現の喪失は、浸潤性悪性腫瘍の症例の3分の2において観察された(図22A)。
ROC曲線を、悪性甲状腺腫瘍を良性腫瘍から識別するために(図20A、B)、また、浸潤性悪性腫瘍を非浸潤性腫瘍と識別するために(図20C、D)、膜EpExと核Ep−ICDについて作製した。結果を含む関連するROC分析を表8にまとめる。
配列番号1
NP_002345
ヒト上皮細胞接着分子(EPCAM)、mRNA
アクセッション NM_002354
β−カテニンSwiss−Prot:P35222.1およびGenbank NP_001091679
β−カテニンmRNA NM_001904.3(ヒト)
NM_001098209 mRNA 直鎖状ヒトカテニン(カドヘリン結合タンパク質)、β1、88kDa
NM_001098210 mRNA 直鎖状ヒトカテニン(カドヘリン結合タンパク質)、β1、
Claims (31)
- 被験体において甲状腺癌と関係がある甲状腺癌マーカーを検出するための方法であって:
(a)患者から試料を得る工程;
(b)1つまたはそれより多い甲状腺癌マーカーを前記試料中で検出または同定する工程;および
(c)検出した量を標準について検出した量と比較する工程
を含むか、あるいは本質的に前記工程からなり、ここでは、前記甲状腺癌マーカーがEp−ICDおよび/またはβ−カテニンである、方法。 - 甲状腺癌を診断するための方法であって:
(a)被験体由来の試料から抽出される甲状腺癌マーカーのレベル;と
(b)対照試料中の甲状腺癌マーカーのレベル
とを比較する工程を含み、ここでは、前記対照中の対応するレベルと比較した、甲状腺癌マーカーのレベルの有意な差が甲状腺癌の指標となり、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICD、β−カテニン、および状況に応じてEpExである、方法。 - 前記被験体が、甲状腺癌のリスクがあるか、またはスクリーニングが必要な被験体である、請求項1または2に記載の方法。
- 甲状腺試料を特性決定または分類するための方法であって、対照と比較して甲状腺癌マーカーの発現の差を検出する工程を含み、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICD、β−カテニン、および状況に応じてEpExである、方法。
- 被験体において甲状腺癌の特定の病期を診断する方法であって、前記被験体から得た試料中の甲状腺癌マーカーの状態を決定する工程を含み、ここでは、前記マーカーの異常な状態が特定の病期の存在を示し、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、方法。
- 甲状腺癌についての処置の候補である被験体を同定するための診断方法であって、前記被験体から得た試料中の甲状腺癌マーカーの状態を決定する工程を含み、ここでは、前記試料中の前記甲状腺癌マーカーの異常な状態が、処置が望ましいかまたは必要であることを示し、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICD、β−カテニン、および状況に応じてEpExである、方法。
- 前記異常な状態が、上昇した状態であってよく、低い状態であってよく、また陰性の状態であってもよい、請求項5または6に記載の方法。
- 被験体において甲状腺癌の浸潤性または転移能を診断するための方法であって:
(a)前記被験体から試料を得る工程;
(b)甲状腺癌マーカーを前記試料中で検出する工程;および
(c)検出した量を標準について検出した量と比較する工程
を含み、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDおよび/またはβ−カテニンである、方法。 - 前記標準または対照が、より低い悪性度の甲状腺癌を持つ被験体において検出されたレベルまたは量を含む、請求項1または8に記載の方法。
- 被験体において未分化甲状腺癌(ATC)を診断するための方法であって:
(a)被験体由来の試料を、標的である甲状腺癌マーカーのレベルを測定することができる試薬と接触させる工程であって、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICD、β−カテニン、および状況に応じてEpExである、工程;および
(b)ATCを有していない被験体から、もしくは異なる時間に前記被験体から採取した類似する試料から得た対照レベルを上回る、前記被験体由来の前記試料中での、Ep−ICD、およびβ−カテニンの少なくとも1つのレベルの増大、ならびに、状況に応じて、EpExの減少に基づいて、前記被験体においてATCの診断を提供する工程
を含む、方法。 - 被験体において甲状腺癌の進行をモニタリングするための方法であって:(a)第1の時点での患者由来の試料中で甲状腺癌マーカーを検出する工程;(b)次の時点で工程(a)を繰り返し行う工程;および(c)工程(a)で検出したレベルと工程(b)で検出したレベルを比較し、それにより、前記癌の進行をモニタリングする工程を含み、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、方法。
- 前記甲状腺癌マーカーが以下の工程により検出されるポリペプチドである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法:
(a)前記試料を、前記ポリペプチドまたはその一部に特異的に結合する結合剤と接触させる工程;および
(b)予め決定した標準と比較して、前記結合剤に結合するポリペプチドの量を前記試料中で検出する工程。 - 被験体において浸潤性甲状腺癌または転移能を持つ甲状腺癌の存在を検出あるいは診断するための方法であって:
(a)甲状腺癌マーカーに特異的に結合する結合剤を提供する工程;
(b)前記結合剤と前記甲状腺癌マーカーとを含有する複合体の形成を可能にする条件下で、前記結合剤を前記被験体由来の試料と接触させる工程;
(c)前記複合体の存在または量を決定する工程;および
(d)前記被験体における浸潤性甲状腺癌または転移能を持つ甲状腺癌の存在を決定するために、前記量を標準と比較する工程
を含み、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、方法。 - 前記結合剤が抗体である、請求項12または13に記載の方法。
- 前記甲状腺癌マーカーがポリヌクレオチドである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがmRNAまたはその断片である、請求項15に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが以下の工程により検出される、請求項15に記載の方法:
(a)前記試料を、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程;および
(b)予め決定した標準値またはカットオフ値と比較して、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸のレベルを前記試料中で検出し、それから、前記被験体における甲状腺癌の存在または不在を決定する工程。 - 前記mRNAが増幅反応を使用して検出される、請求項16に記載の方法。
- 前記増幅反応が、前記ポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応である、請求項18に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがRT−PCRを使用して検出される、請求項19に記載の方法。
- 前記mRNAが、前記ポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用するハイブリダイゼーション技術を使用して検出される、請求項16に記載の方法。
- 被験体において甲状腺癌を阻害することについて試験薬剤の潜在的有効性を評価するための方法であって:(a)被験体から得た、前記試験薬剤に曝した第1の試料中の1つまたはそれより多い甲状腺癌マーカーのレベルであって、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDおよび/またはβ−カテニンである、レベルと、(b)前記被験体から得た第2の試料中の前記甲状腺癌マーカーのレベルであって、ここでは、前記試料は前記試験薬剤に曝していない、レベルとを比較する工程を含み、ここでは、前記第2の試料と比較した前記第1の試料中での前記甲状腺癌マーカーの発現レベルの有意な差が、前記試験薬剤が、前記被験体において甲状腺癌を阻害することについて有効である可能性があることの指標となる、方法。
- 被験体において甲状腺癌を阻害するための薬剤を選択する方法であって:(a)前記被験体から癌細胞を含有している試料を得る工程;(b)前記試料のアリコートを複数の試験薬剤の存在下に別々に曝す工程;(c)前記アリコートのそれぞれにおける1つまたはそれより多い甲状腺癌マーカーのレベルを比較する工程;および(d)他の試験薬剤と比較して、前記試験薬剤のうちの1つを含有している前記アリコート中で前記甲状腺癌マーカーのレベルを変化させる前記試験薬剤のうちの1つを選択する工程を含み、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDおよび/またはβ−カテニンである、方法。
- 他の試験薬剤と比較して、前記試験薬剤のうちの少なくとも1つを含有している前記アリコート中で前記甲状腺癌マーカーのレベルを変化させる、前記試験薬剤のうちの少なくとも1つを、前記被験体に対して投与する工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 試験化合物の甲状腺癌細胞の発癌の可能性を評価する方法であって:(a)前記試験化合物の存在下および不在下で、甲状腺癌細胞の別々のアリコートを維持する工程;ならびに、(b)前記アリコートのそれぞれにおける1つまたはそれより多い甲状腺癌マーカーの発現を比較する工程を含み、ここでは、前記試験化合物の不在下で維持した前記アリコートと比較した、前記試験化合物の存在下で維持した前記アリコート中の甲状腺癌マーカーのレベルの有意な差が、前記試験化合物が、甲状腺癌細胞の発癌の可能性を持つことの指標となり、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDおよび/またはβ−カテニンである、方法。
- 前記試料が、組織、抽出物、細胞培養物、細胞溶解物、洗浄液(lavage fluid)、または生理学的流体から得られる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が腫瘍組織から得られる、請求項26に記載の方法。
- 甲状腺癌マーカーに結合する結合剤、または甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするかもしくは甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドを増幅する作用物質を含有している、浸潤性甲状腺癌あるいは転移能を持つ甲状腺癌を検出ならびに/あるいは診断するためのキットであって、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、キット。
- 甲状腺癌マーカーに結合する抗体、または甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするかもしくは甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドを増幅するポリヌクレオチドの、甲状腺癌の浸潤性もしくは転移能を検出および/あるいは診断するための使用であって、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、使用。
- 甲状腺癌の浸潤性もしくは転移能を検出および/または診断することにおける使用のための、甲状腺癌マーカーに結合する抗体または甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするかもしくは甲状腺癌マーカーをコードするポリヌクレオチドを増幅するポリヌクレオチドを含有している組成物であって、ここでは、前記甲状腺癌マーカーが、Ep−ICDまたはβ−カテニンである、組成物。
- 被験体において甲状腺癌を処置する方法であって、甲状腺癌の処置を必要とする被験体に対して、Ep−CAM、Ep−ICD、またはβ−カテニンに特異的な抗体を送達する工程を含む、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24417309P | 2009-09-21 | 2009-09-21 | |
US61/244,173 | 2009-09-21 | ||
PCT/CA2010/001503 WO2011032296A1 (en) | 2009-09-21 | 2010-09-21 | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013505429A true JP2013505429A (ja) | 2013-02-14 |
JP2013505429A5 JP2013505429A5 (ja) | 2013-11-14 |
JP6048660B2 JP6048660B2 (ja) | 2016-12-21 |
Family
ID=43758006
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012529080A Expired - Fee Related JP6048660B2 (ja) | 2009-09-21 | 2010-09-21 | 甲状腺癌を診断および処置するための方法および組成物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120252022A1 (ja) |
EP (1) | EP2480687B1 (ja) |
JP (1) | JP6048660B2 (ja) |
CN (1) | CN102844443B (ja) |
AU (1) | AU2010295172B2 (ja) |
CA (1) | CA2773907A1 (ja) |
WO (1) | WO2011032296A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2012236219B2 (en) | 2011-04-01 | 2017-02-23 | Immunogen, Inc. | Methods for increasing efficacy of FOLR1 cancer therapy |
WO2012153186A2 (en) * | 2011-05-06 | 2012-11-15 | Kalgene Pharmaceuticals Inc. | Monoclonal antibodies to epcam-icd and methods for detecting epithelial cancer cells |
EP2541249A1 (en) * | 2011-06-28 | 2013-01-02 | Oncotyrol Center for Personalized Cancer Medicine GmbH | EpCAM detection |
CN103998932B (zh) | 2011-06-29 | 2017-06-06 | 中央研究院 | 使用表面涂层对生物物质的捕获、纯化和释放 |
RU2485517C2 (ru) * | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Московский Научно-Исследовательский Онкологический Институт Им. П.А. Герцена Министерства Здравоохранения И Социального Развития России" | Способ диагностики степени злокачественного рака щитовидной железы |
JP6163502B2 (ja) * | 2012-03-02 | 2017-07-12 | アカデミア シニカAcademia Sinica | 抗上皮細胞接着分子(EpCAM)抗体及びその使用方法 |
JP6309019B2 (ja) | 2012-11-27 | 2018-04-11 | ポンティフィシア・ウニベルシダッド・カトリカ・デ・チレPontificia Universidad Catolica de Chile | 甲状腺腫瘍を診断するための組成物および方法 |
CN105431161A (zh) * | 2013-02-21 | 2016-03-23 | 范安德尔研究所 | Norrin突变体多肽、其制造方法和用途 |
EP2772758A1 (en) | 2013-02-27 | 2014-09-03 | Oncotyrol Center for Personalized Cancer Medicine GmbH | EpCAM tumour diagnosis |
TW201623605A (zh) | 2014-04-01 | 2016-07-01 | 中央研究院 | 用於癌症診斷及預後之方法及系統 |
EP2998026B1 (en) | 2014-08-26 | 2024-01-17 | Academia Sinica | Collector architecture layout design |
US10107726B2 (en) | 2016-03-16 | 2018-10-23 | Cellmax, Ltd. | Collection of suspended cells using a transferable membrane |
CN109187975A (zh) * | 2018-08-08 | 2019-01-11 | 施康培医疗科技(武汉)有限公司 | 一种甲状腺髓样癌联合检测胶体金免疫层析试纸条 |
US20220196637A1 (en) * | 2019-05-24 | 2022-06-23 | Fujirebio Inc. | Method and reagent for measuring thyroglobulin |
CN110411992B (zh) * | 2019-06-18 | 2022-05-06 | 山东省立医院 | 一种甲状腺组织结构的成像方法 |
CN115436640B (zh) * | 2022-11-07 | 2023-04-18 | 西湖欧米(杭州)生物科技有限公司 | 适于可评估甲状腺结节恶性程度或概率的多肽的替代基质 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008500277A (ja) * | 2004-02-13 | 2008-01-10 | マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト | 抗EpCAM免疫グロブリン |
JP2008517914A (ja) * | 2004-10-22 | 2008-05-29 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | ヒトの抗体の分離方法 |
JP2008538282A (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5208020A (en) | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
US5474796A (en) | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
US5605662A (en) | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
US5312922A (en) | 1992-04-06 | 1994-05-17 | Nordion International Inc. | Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays |
US6015880A (en) | 1994-03-16 | 2000-01-18 | California Institute Of Technology | Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix |
US5807522A (en) | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
DE69934259T2 (de) | 1999-07-23 | 2007-05-31 | Glaxo Group Ltd., Greenford | Kombination von einem Anti-Ep-CAM-Antikörper mit einem chemotherapeutischen Mittel |
JP4309662B2 (ja) | 2001-05-03 | 2009-08-05 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 腫瘍特異的組換え抗体およびその使用 |
WO2003084472A2 (en) * | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Walter Reed Army Institute Of Research | Recombinant p. falciparum merozoite protein-142 vaccine |
CA2524124C (en) | 2003-04-30 | 2014-03-25 | Uwe Zangemeister-Wittke | Methods for treating cancer using an immunotoxin |
US7557190B2 (en) | 2005-07-08 | 2009-07-07 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target Ep-CAM |
WO2007141029A1 (en) * | 2006-06-08 | 2007-12-13 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Specific protease inhibitors and their use in cancer therapy |
-
2010
- 2010-09-21 JP JP2012529080A patent/JP6048660B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-21 WO PCT/CA2010/001503 patent/WO2011032296A1/en active Application Filing
- 2010-09-21 US US13/497,441 patent/US20120252022A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-21 CA CA2773907A patent/CA2773907A1/en active Pending
- 2010-09-21 AU AU2010295172A patent/AU2010295172B2/en not_active Ceased
- 2010-09-21 CN CN201080053701.1A patent/CN102844443B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-21 EP EP10816542.4A patent/EP2480687B1/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008500277A (ja) * | 2004-02-13 | 2008-01-10 | マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト | 抗EpCAM免疫グロブリン |
JP2008517914A (ja) * | 2004-10-22 | 2008-05-29 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | ヒトの抗体の分離方法 |
JP2008538282A (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN7015002915; Ensinger C, 外4名: 'EpCAM overexpression in thyroid carcinomas: a histopathological study of 121 cases' J Immunother. Vol.29,No.5, 20060901, Page.569-573 * |
JPN7015002916; Maetzel D, 外10名: 'Nuclear signalling by tumour-associated antigen EpCAM.' Nat Cell Biol. Vol.11,No.2, 20090201, Page.162-171 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2480687A1 (en) | 2012-08-01 |
EP2480687A4 (en) | 2013-03-27 |
JP6048660B2 (ja) | 2016-12-21 |
AU2010295172B2 (en) | 2016-08-04 |
EP2480687B1 (en) | 2015-01-28 |
CN102844443A (zh) | 2012-12-26 |
AU2010295172A1 (en) | 2012-04-26 |
CA2773907A1 (en) | 2011-03-24 |
US20120252022A1 (en) | 2012-10-04 |
WO2011032296A1 (en) | 2011-03-24 |
CN102844443B (zh) | 2014-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6048660B2 (ja) | 甲状腺癌を診断および処置するための方法および組成物 | |
US9110065B2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer | |
US11105806B2 (en) | Lung cancer markers and uses thereof | |
US20210292407A1 (en) | Cancer targets and uses thereof | |
AU2011250588C1 (en) | Method for the diagnosis of epithelial cancers by the detection of EpICD polypeptide | |
JP5934093B2 (ja) | 子宮内膜がんのマーカー | |
AU2011250588B2 (en) | Method for the diagnosis of epithelial cancers by the detection of EpICD polypeptide | |
US20090232822A1 (en) | Lung disease targets and uses thereof | |
US20110275065A1 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer | |
AU2011250588A1 (en) | Method for the diagnosis of epithelial cancers by the detection of EpICD polypeptide | |
US20170315125A1 (en) | Methods For The Diagnosis Or Prognosis of Breast Cancer | |
JP2008507976A (ja) | マイクロサテライト不安定性における遺伝子の発現の差次的発現 | |
US20140187438A1 (en) | Methods and Compositions for the Diagnosis and Treatment of Epithelial Cancers |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130924 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130924 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20140210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141118 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150216 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150518 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151023 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160115 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160425 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160916 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161017 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20161101 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161108 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20161101 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6048660 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |