JP2013241418A - New antiphlogistic-analgesic agent - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new highly safe nonsteroidal antiphlogistic-analgesic agent capable of being administered over a long period.SOLUTION: A cyclooxygenase-2 (COX-2) selective inhibitor, an antiphlogistic-analgesic agent, an inflammatory disorder (arthritis, articular rheumatism, and the like) therapeutic drug, painful disease (menstrual pain and the like) therapeutic drug, and antiphlogistic-analgesic food and drink using α-lactalbumin as an active ingredient are provided.

Description

本発明は、α-ラクトアルブミンを含有する、消炎鎮痛作用を有する飲食物および医薬組成物に関する。   The present invention relates to foods and drinks having anti-inflammatory analgesic activity and pharmaceutical compositions containing α-lactalbumin.

今日、消炎鎮痛のために日常的に処方される薬剤として、非ステロイド系消炎鎮痛剤と総称されるアスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ジクロフェナクなど、数十種類の合成化合物と、ステロイドと俗称される合成グルココルチコイドホルモン等がある。   Today, dozens of synthetic compounds, such as aspirin, indomethacin, ibuprofen, and diclofenac, which are commonly called nonsteroidal anti-inflammatory analgesics, and synthetic glucos, commonly called steroids, are routinely prescribed for anti-inflammatory analgesia. There are corticoid hormones.

アスピリンは、プロスタグランジン（PG）合成酵素「シクロオキシゲナーゼ（COX）」の活性を抑制する。COXの活性低下によりPGが減少し、疼痛誘発物質（ブラジギニン）の活性が抑えられ、アスピリンの鎮痛作用が発現する。アスピリンと同様にCOXに作用して消炎鎮痛効果を発揮する薬は、作用機序の異なるステロイド剤と区別するために、「非ステロイド系消炎鎮痛剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs: NSAIDs）」と呼ばれている。   Aspirin suppresses the activity of the prostaglandin (PG) synthase “cyclooxygenase (COX)”. Reduced COX activity reduces PG, suppresses the activity of pain-inducing substances (bradiginin), and develops aspirin analgesia. Drugs that exert anti-inflammatory analgesic effects by acting on COX as well as aspirin are classified as “non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)” to distinguish them from steroids with different mechanisms of action. is called.

NSAIDsには消化管潰瘍を起こしやすい欠点がある。その主たる原因は、NSAIDsが血管拡張と粘膜の保護に働くPG（PGE2、PGI2）を減少させてしまうことにある。また、COX活性の抑制により、リポキシゲナーゼの活性が亢進してロイコトリエンが増え、胃液の分泌が減少する。同時に、消化管粘膜を破壊する活性酸素が増え、潰瘍が起こる。 NSAIDs have the disadvantage of causing gastrointestinal ulcers. The main cause is that NSAIDs reduce PG (PGE 2 , PGI 2 ), which acts for vasodilation and mucosal protection. In addition, suppression of COX activity increases lipoxygenase activity, increases leukotrienes, and decreases gastric juice secretion. At the same time, active oxygen that destroys the gastrointestinal mucosa increases and ulcers occur.

このようなNSAIDsの副作用を減らす目的で、ロキソプロフェン等のプロドラッグタイプが開発された。しかし、プロドラッグタイプの作用機序は従来のNSAIDsと同様であり、副作用減少効果には限度がある。   In order to reduce such side effects of NSAIDs, prodrug types such as loxoprofen have been developed. However, the mechanism of action of the prodrug type is the same as that of conventional NSAIDs, and the side effect reduction effect is limited.

NSAIDsによる消化器障害の解消は、消炎鎮痛剤開発における長年の研究課題であった。この難題に光を照らしたのが新しいCOXの発見である。1991年に発見されたCOX-2は外傷や炎症が起こると急激に増加する。一方、体内にもともと存在し、胃粘膜の保護に働くプロスタグランジン類（PGE2、PGI2）を産生するタイプはCOX-1と分類された。そこで、COX-2の活性を選択的に阻害する物質は、副作用の少ない消炎鎮痛剤になりうる。 Resolving gastrointestinal disorders with NSAIDs has been a long-standing research subject in the development of anti-inflammatory analgesics. The discovery of a new COX shed light on this challenge. COX-2, discovered in 1991, increases rapidly when trauma or inflammation occurs. On the other hand, the type that produces prostaglandins (PGE 2 , PGI 2 ) that originally exist in the body and that protect the gastric mucosa was classified as COX-1. Therefore, a substance that selectively inhibits the activity of COX-2 can be an anti-inflammatory analgesic with few side effects.

NSAIDsの副作用には、胃腸障害以外に、腎障害、肝障害、皮膚の発疹などのほか、重大な副作用として喘息発作の誘発がある。従来からある非選択性のNSAIDsのように、主作用であるCOX-2の阻害とともに、COX-1の作用が抑えられると、アラキドン酸の代謝がロイコトリエン産生側に偏るためリポキシゲナーゼの活性が上昇し、気管支を収縮させるロイコトリエンが増え、喘息が誘発される。消炎鎮痛剤による喘息は「アスピリン喘息」と呼ばれるが、アスピリンのみならず、従来型のNSAIDs全般にアスピリン喘息を誘発する危険がある。ところが、COX-2のみを阻害する薬剤はロイコトリエンを増加させないため、喘息誘発の危険が少ないといわれている。この点からも、COX-2選択的阻害剤に対する期待は高い。1994年に発売されたエトドラクはCOX-2への作用が10倍強く、比較的消化器障害の少ない消炎鎮痛剤として使用されている。またメロキシカムが1996年に南アフリカ、フランス、英国などで発売され、その後2001年に日本でも上市された。   In addition to gastrointestinal disorders, NSAIDs have side effects such as kidney damage, liver damage, skin rash, and other serious side effects such as induction of asthma attacks. Like conventional non-selective NSAIDs, when the action of COX-1 is suppressed along with inhibition of COX-2, which is the main action, lipoxygenase activity increases because arachidonic acid metabolism is biased toward leukotriene production. Leukotriene, which causes bronchoconstriction, increases and asthma is induced. Asthma due to anti-inflammatory analgesics is called “aspirin asthma”, but there is a risk of inducing aspirin asthma not only in aspirin but in all conventional NSAIDs. However, drugs that only inhibit COX-2 do not increase leukotrienes, so it is said that there is less risk of inducing asthma. Also from this point, expectation for a COX-2 selective inhibitor is high. Etodolac, launched in 1994, is 10 times stronger on COX-2 and is used as an anti-inflammatory analgesic with relatively little digestive damage. Meloxicam was released in 1996 in South Africa, France, the UK, etc., and later in Japan in 2001.

食品中に含まれるタンパク質のいくつかは、消炎鎮痛作用を有する。例えば、消炎鎮痛作用を有するタンパク質として、ラクトフェリンが知られている。ラクトフェリンは、1939年に発見された分子量約8万の鉄結合性の糖タンパク質である。母乳、特に初乳に多く含まれ、体の外部からの細菌、ウィルスなどの攻撃を防ぐ、感染防御因子として機能する。ラクトフェリンの安全性は高く評価されており、牛乳から抽出したラクトフェリンは、育児用調整粉乳等の乳児用飲食品にまで添加されている。昨今では、様々な病気に関する、ラクトフェリンの研究が注目を浴びている。実験動物モデルにおいて病原微生物及びウィルス感染に対する生体防御能の強化（例えば非特許文献１）、種々の病態モデルにおける抗炎症作用、IgE産生抑制効果（例えば非特許文献２）、化学発癌剤による発ガンの予防効果（例えば非特許文献３）、ガン細胞による血管新生を阻害する効果（例えば非特許文献４）等々、様々な免疫関連の生命現象をコントロールする機能が報告されている。ラクトフェリンが内因性及び外因性オピオイドの鎮痛効果を増強することも明らかになっている（例えば特許文献１）。   Some of the proteins contained in food have anti-inflammatory analgesic action. For example, lactoferrin is known as a protein having anti-inflammatory analgesic action. Lactoferrin is an iron-binding glycoprotein with a molecular weight of about 80,000 discovered in 1939. It is abundant in breast milk, especially colostrum, and functions as an infection defense factor that prevents attacks from bacteria and viruses from outside the body. The safety of lactoferrin is highly evaluated, and lactoferrin extracted from milk has been added to infant foods and drinks such as infant formula. In recent years, research on lactoferrin has attracted attention for various diseases. Strengthening of biological defenses against pathogenic microorganisms and virus infection in experimental animal models (for example, Non-Patent Document 1), anti-inflammatory action in various pathological models, IgE production inhibitory effect (for example, Non-Patent Document 2), carcinogenesis by chemical carcinogens A function of controlling various immune-related life phenomena, such as a prophylactic effect (for example, Non-Patent Document 3) and an effect of inhibiting angiogenesis by cancer cells (for example, Non-Patent Document 4) have been reported. It has also been clarified that lactoferrin enhances the analgesic effect of endogenous and exogenous opioids (for example, Patent Document 1).

また、塩化リゾチームは、18種129個のアミノ酸からなる酵素性を有する塩基性タンパク質で、消炎作用を有する。鎮痛作用については、マウスに50〜300 mg/kgを皮下または経口投与し、鎮痛作用（熱板法）を測定した結果、何ら作用は認められなかったと報告されている（非特許文献５）。   Lysozyme chloride is a basic protein having an enzymatic property composed of 129 amino acids of 18 types and has an anti-inflammatory effect. Regarding analgesic action, 50-300 mg / kg was administered subcutaneously or orally to mice, and the analgesic action (hot plate method) was measured, and as a result, no action was reported (Non-patent Document 5).

また近年、ホエイやホエイの産生画分がCOX-2阻害活性を有することが報告されている（特許文献７）。   In recent years, it has been reported that whey and whey production fractions have COX-2 inhibitory activity (Patent Document 7).

ところで、α-ラクトアルブミンは、ホエイタンパク質の約25％を占める、分子量14,000の球状タンパク質である。α-ラクトアルブミンはリゾチームとの間に、タンパク質構造類似性および遺伝子配列における高い相同性がある（非特許文献６）。α-ラクトアルブミンの性質としては、カルシウム結合性タンパク質であること、シスチン含量が高いことが知られており、さらに、消化管運動調節作用（例えば特許文献２）、小腸管傷害の予防又は修復促進作用、抗潰瘍作用（例えば非特許文献７、特許文献５、特許文献６）が知られている。   By the way, α-lactalbumin is a globular protein having a molecular weight of 14,000, accounting for about 25% of whey protein. α-Lactalbumin is highly homologous in protein structure and gene sequence with lysozyme (Non-patent Document 6). It is known that α-lactalbumin is a calcium-binding protein and has a high cystine content. Further, it regulates gastrointestinal motility (for example, Patent Document 2), promotes prevention or repair of intestinal injury. An action and an anti-ulcer action (for example, Non-Patent Document 7, Patent Document 5, and Patent Document 6) are known.

また、α-ラクトアルブミンには月経前症候群の症状を抑制することが報告されている（特許文献８）。しかしながら、その作用機序については明らかとなっていない。   In addition, α-lactalbumin has been reported to suppress symptoms of premenstrual syndrome (Patent Document 8). However, its mechanism of action is not clear.

特許第3806427号公報Japanese Patent No. 3806427 特許第3756449号公報Japanese Patent No. 3756449 特開平5-268879号公報Japanese Patent Laid-Open No. 5-28879 特許第2916047号公報Japanese Patent No. 2916047 特許第3756449号公報Japanese Patent No. 3756449 特許第3481931号公報Japanese Patent No. 3348311 特表2007-505078号公報Special Table 2007-505078 特表2007-500755号公報Special Table 2007-500755

Lactoferrin; Structure, Function and Applications. Excerpta Medica Intern. Congress Series 1195 (2000), pp377-381Lactoferrin; Structure, Function and Applications.Excerpta Medica Intern.Congress Series 1195 (2000), pp377-381 Arthritis Rheum. 43 (2000) 2073-2080Arthritis Rheum. 43 (2000) 2073-2080 Drug Metab. Pharmacokin. 19 (2004) 245-263Drug Metab. Pharmacokin. 19 (2004) 245-263 Japan Medical Society 2005年10月号ラクトフェリン実用化研究の新たな展開 第10回がん化学予防効果とラクトフェリン 安藤邦雄Japan Medical Society October 2005 New Development of Lactoferrin Practical Research 10th Cancer Chemopreventive Effect and Lactoferrin Kunio Ando 医薬品インタビューフォーム リフラップ〈塩化リゾチーム製剤〉18頁 エーザイ株式会社Pharmaceutical Interview Form Riflap <Lysozyme Chloride Preparation> 18 Eisai Co., Ltd. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 July 1; 89(13): 5887-5891.Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 July 1; 89 (13): 5887-5891. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (3), 577-583, 2003Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (3), 577-583, 2003

本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであって、副作用が少なくて、安全性が高く、長期間にわたり、医薬品や飲食品として摂取可能な新規消炎鎮痛剤を提供することを目的とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a novel anti-inflammatory analgesic that has few side effects, is highly safe, and can be ingested as a medicine or food and drink for a long period of time. .

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者等は、安全性を考え、食品に含有される天然物質の中から消炎作用を有する物質を丹念に探索した。α-ラクトアルブミンについて消炎鎮痛作用を検討したところ、α-ラクトアルブミンはin vitroにおいて、シクロオキシゲナーゼ（COX）-2阻害活性、ホスホリパーゼA2阻害活性を示した。またカラゲニン足浮腫モデル、アジュバント関節炎モデル、酢酸ライジング法によるin vivoの検証によって急性炎症、実験的慢性炎症、および疼痛に対する治療効果を有することが明らかになった。さらに本発明者等がα-ラクトアルブミンの酵素阻害活性を検討したところ、COX-1よりもCOX-2を選択的に阻害することが明らかになり、α-ラクトアルブミンが消炎鎮痛剤として利用しうることを見出した。α-ラクトアルブミンの安全性の高さは、COX-2選択的阻害作用から予想されるのみならず、長い食経験により担保されているといえる。従来、食物中のタンパク質において、ラクトフェリンの消炎鎮痛効果が知られているが、該効果の作用機序は必ずしも解明されていない。また塩化リゾチームは消炎効果を有するものの、鎮痛効果は有さない。一方、本願発明者は、消炎鎮痛効果を有する食品中のタンパク質としてα-ラクトアルブミンを発見したのみならず、該効果がCOX-2選択的阻害作用によるものであることを明らかにした。COX-2選択的阻害剤は、従来のNSAIDsの副作用問題を解決できると考えられており、本発明者等による上記知見は、α-ラクトアルブミンが新規消炎鎮痛剤として極めて有用な用途を有することを証明する。すなわち、本発明はα-ラクトアルブミンの新規用途に関し、具体的には以下の発明を提供するものである。
（１）α-ラクトアルブミンを有効成分とする、COX-2選択的阻害剤、
（２）α-ラクトアルブミンを有効成分とする、消炎鎮痛剤、
（３）消炎鎮痛剤の製造のための、α-ラクトアルブミンの使用、
（４）炎症性疾患治療薬である、（２）に記載の消炎鎮痛剤、
（５）炎症性疾患が関節炎または関節リウマチである、（４）記載の消炎鎮痛剤、
（６）疼痛性疾患治療薬である、（２）に記載の消炎鎮痛剤、
（７）疼痛性疾患が月経痛である、（６）に記載の消炎鎮痛剤、
（８）α-ラクトアルブミンを有効成分とする、消炎鎮痛用飲食品、
（９）α-ラクトアルブミンの治療的有効量を哺乳動物に投与する、炎症性疾患の治療方法、
（１０）α-ラクトアルブミンの治療的有効量を哺乳動物に投与する、疼痛性疾患の治療方法。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. In consideration of safety, the present inventors have searched carefully for substances having anti-inflammatory effects from natural substances contained in foods. When anti-inflammatory analgesic action was examined for α-lactalbumin, α-lactalbumin exhibited cyclooxygenase (COX) -2 inhibitory activity and phospholipase A2 inhibitory activity in vitro. In vivo verification using a carrageenan paw edema model, an adjuvant arthritis model, and the acetic acid-rising method revealed a therapeutic effect on acute inflammation, experimental chronic inflammation, and pain. Furthermore, when the present inventors examined the enzyme inhibitory activity of α-lactalbumin, it was found that it selectively inhibits COX-2 over COX-1, and α-lactalbumin was used as an anti-inflammatory analgesic. I found out. The high safety of α-lactalbumin is not only expected from the selective inhibitory action of COX-2, but can be said to be ensured by a long dietary experience. Conventionally, anti-inflammatory analgesic effects of lactoferrin have been known for proteins in food, but the mechanism of action of such effects has not necessarily been elucidated. Although lysozyme chloride has an anti-inflammatory effect, it has no analgesic effect. On the other hand, the inventor of the present application not only discovered α-lactalbumin as a protein in foods having anti-inflammatory analgesic effect, but also clarified that the effect is due to COX-2 selective inhibitory action. COX-2 selective inhibitors are thought to solve the side effects of conventional NSAIDs, and the above findings by the present inventors indicate that α-lactalbumin has a very useful use as a novel anti-inflammatory analgesic. Prove that. That is, the present invention relates to a novel use of α-lactalbumin, and specifically provides the following inventions.
(1) a COX-2 selective inhibitor comprising α-lactalbumin as an active ingredient,
(2) an anti-inflammatory analgesic comprising α-lactalbumin as an active ingredient,
(3) Use of α-lactalbumin for the manufacture of anti-inflammatory analgesics,
(4) An anti-inflammatory analgesic according to (2), which is a therapeutic agent for inflammatory diseases,
(5) The anti-inflammatory analgesic according to (4), wherein the inflammatory disease is arthritis or rheumatoid arthritis,
(6) The anti-inflammatory analgesic according to (2), which is a therapeutic agent for painful diseases,
(7) The anti-inflammatory analgesic according to (6), wherein the painful disease is menstrual pain,
(8) Anti-inflammatory analgesic food or drink comprising α-lactalbumin as an active ingredient,
(9) A method for treating an inflammatory disease, comprising administering a therapeutically effective amount of α-lactalbumin to a mammal,
(10) A method for treating painful diseases, wherein a therapeutically effective amount of α-lactalbumin is administered to a mammal.

本発明により新規消炎鎮痛剤が提供された。本発明の新規消炎鎮痛剤は、COX-2を選択的に阻害するため、消化性潰瘍や喘息等の副作用の発生は少なく、長期間にわたって摂取可能と考えられる。α-ラクトアルブミンは、上記のようにほ乳類の乳汁中に含まれており、長い食経験から安全であるとの認識がある。また実際にα-ラクトアルブミンの安全性は科学的に検証されており、例えば、特許文献５は、ラットを用いたα-ラクトアルブミンの急性毒性試験の結果では、最大用量である2,000 mg/kg体重のα-ラクトアルブミン投与によっても、空試験と同様に死亡例は認められなかったと報告している。またそもそも食品中に存在する物質であることから、医薬品としてのみならず、飲食品として加工・流通させることも期待できる。さらに、牛乳などの比較的安価な原料から得ることができるため、大量生産が可能である。   The present invention provides a novel anti-inflammatory analgesic. Since the novel anti-inflammatory analgesic of the present invention selectively inhibits COX-2, side effects such as peptic ulcer and asthma are few, and it can be taken for a long time. As described above, α-lactalbumin is contained in the milk of mammals and has been recognized as safe from a long dietary experience. In fact, the safety of α-lactalbumin has been scientifically verified. For example, Patent Document 5 discloses that the maximum dose of 2,000 mg / kg is the result of an acute toxicity test of α-lactalbumin using rats. As with the blank test, no deaths were reported after administration of body weight α-lactalbumin. In addition, since it is a substance originally present in food, it can be expected to be processed and distributed not only as a pharmaceutical product but also as a food and drink. Furthermore, since it can be obtained from relatively inexpensive raw materials such as milk, mass production is possible.

牛乳中のラクトフェリンは、工業的には牛乳から分離技術により取り出される。ラクトフェリンの含有量は産地、飼料などによって多少の差異はあるが、国内産牛乳では通常200 mg/kgと極微量である。そのため、微量のラクトフェリンを取り出すに十分な乳を国内では調達できず、日本ではまったく生産されておらず、すべて輸入に頼っている現状にある。   Lactoferrin in milk is industrially extracted from milk by separation techniques. The content of lactoferrin varies slightly depending on the production area, feed, etc., but it is usually a trace amount of 200 mg / kg in domestic milk. Therefore, it is not possible to procure enough milk in Japan to extract a small amount of lactoferrin, and it is not produced at all in Japan.

また、牛乳中のα-ラクトアルブミンの含有量は産地、飼料などによって多少の差異はあるが、国内産牛乳では通常1.2 g/kgである。ラクトフェリンに比べて豊富に含有されており、工業的分離も容易である。そのため、安定的確保が可能となるうえ、調達コストも安価となる。   The content of α-lactalbumin in milk is slightly different depending on the production area and feed, but is usually 1.2 g / kg for domestic milk. It is abundant in comparison with lactoferrin, and industrial separation is easy. As a result, stable securing is possible and procurement costs are low.

カラゲニン足浮腫抑制試験モデルでの足容積の推移を示す図である。一群６匹の平均値＋標準誤差で示した。controlは対照、WPIはホエイタンパク質分離物、bLGはβ-ラクトグロブリン、aLAはα-ラクトアルブミン、LFはラクトフェリンを表す。＊：vs. control、p<0.05（Dunnetの多重比較検定）It is a figure which shows transition of the foot volume in a carrageenin foot edema suppression test model. The average value of 6 animals per group + standard error is shown. control represents control, WPI represents whey protein isolate, bLG represents β-lactoglobulin, aLA represents α-lactalbumin, and LF represents lactoferrin. *: Vs. control, p <0.05 (Dunnet's multiple comparison test) アジュバント関節炎（治療）モデルでの足容積の推移を示す図である。一群６匹の平均値＋標準誤差で示した。Vehicleは対照、bLGはβ-ラクトグロブリン、aLAはα-ラクトアルブミン、LFはラクトフェリン、Dicroはジクロフェナクを表す。＊、＊＊、＊＊＊：vs. Vehicle、p<0.05、0.01、0.001（Dunnetの多重比較検定）It is a figure which shows transition of the foot volume in an adjuvant arthritis (treatment) model. The average value of 6 animals per group + standard error is shown. Vehicle is a control, bLG is β-lactoglobulin, aLA is α-lactalbumin, LF is lactoferrin, and Dicro is diclofenac. *, **, ***: vs. Vehicle, p <0.05, 0.01, 0.001 (Dunnet's multiple comparison test) アジュバント関節炎（疼痛）モデルでの鳴啼反応の回数を示す図である。一群６匹の平均値＋標準誤差で示した。Vehicleは対照、bLGはβ-ラクトグロブリン、aLAはα-ラクトアルブミン、LFはラクトフェリン、Dicroはジクロフェナクを表す。＊、＊＊：vs. Vehicle、ｐ<0.05、0.01（Dunnetの多重比較検定）It is a figure which shows the frequency | count of a crying reaction in an adjuvant arthritis (pain) model. The average value of 6 animals per group + standard error is shown. Vehicle is a control, bLG is β-lactoglobulin, aLA is α-lactalbumin, LF is lactoferrin, and Dicro is diclofenac. *, **: vs. Vehicle, p <0.05, 0.01 (Dunnet's multiple comparison test) 酢酸ライジング試験モデルでの苦悶動作の回数を示す図である。一群６匹の平均値＋標準誤差で示した。Vehicleは対照、WPIはホエイタンパク質分離物、bLGはβ-ラクトグロブリン、aLAはα-ラクトアルブミン、LFはラクトフェリン、Dicroはジクロフェナクを表す。＊、＊＊：vs. Vehicle、 p<0.05、0.01（Dunnetの多重比較検定）It is a figure which shows the frequency | count of agony operation | movement in an acetic acid rising test model. The average value of 6 animals per group + standard error is shown. Vehicle is a control, WPI is a whey protein isolate, bLG is β-lactoglobulin, aLA is α-lactalbumin, LF is lactoferrin, and Dicro is diclofenac. *, **: vs. Vehicle, p <0.05, 0.01 (Dunnet's multiple comparison test) α-ラクトアルブミンの、月経痛に対する改善効果をランダム化ダブルブラインドクロスオーバー試験における、月経痛の痛みの程度に関する結果を示す図である。It is a figure which shows the result regarding the pain level of the menstrual pain in the double blind crossover test which randomized the improvement effect with respect to the menstrual pain of (alpha) -lactalbumin. α-ラクトアルブミンの、月経痛に対する改善効果をランダム化ダブルブラインドクロスオーバー試験における、月経痛による日常生活への影響程度に関する結果を示す図である。It is a figure which shows the result regarding the influence degree to the daily life by menstrual pain in the double blind crossover test which randomized the improvement effect with respect to menstrual pain of (alpha) -lactalbumin. α-ラクトアルブミンの、月経痛に対する改善効果をランダム化ダブルブラインドクロスオーバー試験における、鎮痛剤の使用程度に関する結果を示す図である。It is a figure which shows the result regarding the use degree of an analgesic in the double blind crossover test which randomized the improvement effect with respect to menstrual pain of (alpha) -lactalbumin.

以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。
本発明は、α-ラクトアルブミンを有効成分とする、COX-2選択的阻害剤に関する。本発明においてCOX-2選択的阻害剤とは、COX-1阻害効果よりもCOX-2阻害効果が強い物質を意味する。本発明のα-ラクトアルブミンは、特に由来は問わないが、好ましくはヒトおよび／または非ヒト哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）由来であり、より好ましくはヒトまたはウシのα-ラクトアルブミンである。これらのα-ラクトアルブミンのアミノ酸配列や塩基配列は既に公知であり、EMBL、DDBJ、NCBI等のデータベースに登録されている。例えばウシα-ラクトアルブミンは、DDBJにACCESSION No.J05147として登録されている。ウシα-ラクトアルブミンの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、第１位から第１９位はシグナルペプチドである。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、第２９位のアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置き換わった変異体の存在が知られている（「ミルク総合辞典」p.35、朝倉書店）。牛乳中に分泌されるα-ラクトアルブミンはシグナルペプチドが切断された成熟ペプチドである。本願実施例で使用したα-ラクトアルブミンは上記ウシ成熟ペプチドである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and can be freely changed within the scope of the present invention.
The present invention relates to a COX-2 selective inhibitor comprising α-lactalbumin as an active ingredient. In the present invention, the COX-2 selective inhibitor means a substance having a COX-2 inhibitory effect stronger than the COX-1 inhibitory effect. The α-lactalbumin of the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from human and / or non-human mammals (bovine, sheep, goat, horse, etc.), more preferably human or bovine α-lactoalcohol. It is albumin. The amino acid sequences and base sequences of these α-lactalbumins are already known and are registered in databases such as EMBL, DDBJ, NCBI. For example, bovine α-lactalbumin is registered with DDBJ as ACCESSION No. J05147. The base sequence of bovine α-lactalbumin is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 1 to 19 are signal peptides. In addition, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it is known that there is a mutant in which arginine (R) at position 29 is replaced with glutamine (Q) (“Milk General Dictionary” p.35, Asakura Shoten) ). Α-Lactalbumin secreted into milk is a mature peptide obtained by cleaving the signal peptide. Α-Lactalbumin used in Examples of the present application is the above-described bovine mature peptide.

α-ラクトアルブミンはヒト、牛、羊、ヤギ等の哺乳類の乳等から、硫酸アンモニウム沈殿法（「最新改稿乳業技術便覧」酪農技術普及学会、122-125ページ、1975）、限外ろ過法（特許文献３）、イオン交換法（特許文献４）等の公知技術により製造することが出来る。牛乳中のα-ラクトアルブミンの含有量は産地、飼料などによって多少の差異はあるが、国内産牛乳では通常1.2 g/kgであり、製造原料として牛乳を用いれば、多量のα-ラクトアルブミンを調製することができる。また、アミノ酸配列および塩基配列を基に、化学的に合成したり、当業者に周知の遺伝子工学的手法によって製造してもよい。より簡便には、市販のα-ラクトアルブミン（例えば、ダビスコ社製など）を使用することができる。   α-Lactalbumin is extracted from the milk of mammals such as humans, cows, sheep, and goats by ammonium sulfate precipitation ("Latest revised dairy technology manual", Dairy Technology Promotion Society, pages 122-125, 1975), ultrafiltration (patented) It can be produced by known techniques such as Document 3) and ion exchange method (Patent Document 4). The content of α-lactalbumin in milk varies slightly depending on the production area, feed, etc., but it is usually 1.2 g / kg for domestic milk, and if milk is used as a raw material for production, a large amount of α-lactalbumin is obtained. Can be prepared. Moreover, based on an amino acid sequence and a base sequence, you may synthesize | combine chemically or may manufacture by the genetic engineering method well-known to those skilled in the art. More simply, commercially available α-lactalbumin (for example, manufactured by Davisco) can be used.

また本発明において、使用可能なα-ラクトアルブミンは、上述のヒトまたは非ヒト哺乳動物の天然型として知られる公知アミノ酸配列からなるものに限られず、COX-2選択的阻害活性を有する限り、上記アミノ酸配列に変異が存在する変異体のポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドの例としては、天然型の変異体、ホモログ、人為的変異体等を挙げることができ、具体的には、天然型のα-ラクトアルブミンアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入した配列を含むポリペプチドや、天然型のα-ラクトアルブミンをコードするポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを挙げることができ、より具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入した配列を含む、COX-2選択的阻害活性を有するポリペプチドを挙げることができ、また別の例として、配列番号：１記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードする、COX-2選択的阻害活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
上記変異体ポリペプチドは、当業者に周知の技術によって製造することができる。例えば、乳腺等のα-ラクトアルブミンを発現する動物細胞からtotal mRNAを調製し、天然型α-ラクトアルブミンの塩基配列を基に設計したプライマーを用いてRT-PCRを行い、得られたDNAを適当なプロモーターとともに宿主-ベクター系に導入し発現させることにより、変異体ポリペプチドを得ることができる。または動物細胞からcDNAライブラリーを作製し、天然型α-ラクトアルブミンの塩基配列をもとに作製したプローブを用い、該cDNAライブラリーの中から該プローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを選択し、該ポリヌクレオチドを適当な宿主に導入して発現させ、変異体ポリペプチドを得ることができる。上記プロモーターや宿主-ベクター系は、当業者であれば、公知のプロモーターや宿主-ベクター系の中から適宜選択可能である。
上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50 mM Hepes pH 7.0、10×デンハルト溶液、20 μg/ml変性サケ***DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1×SSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい高ストリンジェントな条件としては「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい高ストリンジェントな条件としては「0.2×SSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記天然型ポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％の相同性を有する。
または天然型α-ラクトアルブミンの塩基配列に、カセット変異法やPCRによる変異法等によって人為的な変異を部位特異的またはランダムに導入し、該ポリヌクレオチドを適当な宿主-ベクター系を用いて発現させることにより、変異体ポリペプチドを得ることができる。上記のように調製したポリペプチドがCOX-2選択的阻害活性を有するか否かは、公知手法によってCOX-1および2に対する該ポリペプチドの阻害活性を測定することにより確認でき、例えば、後述の本願実施例に記載の方法によって確認することができる。このような、COX-2選択的阻害活性を有する変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、天然型のアミノ酸配列に対し高い相同性を有し、例えば相同性は80％以上または85％以上であり、好ましくは90％以上であり、より好ましくは95％以上である。 Further, in the present invention, α-lactalbumin that can be used is not limited to the above-mentioned known amino acid sequence known as a natural form of a human or non-human mammal, as long as it has COX-2 selective inhibitory activity. It may be a mutant polypeptide having a mutation in the amino acid sequence. Examples of such polypeptides include natural mutants, homologs, artificial mutants, etc. Specifically, one or more amino acids are present in the natural α-lactalbumin amino acid sequence. List polypeptides that contain sequences that have additions, deletions, substitutions, or insertions, or that are encoded by polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the complementary strand of a polynucleotide encoding native α-lactalbumin. More specifically, a polypeptide having a COX-2 selective inhibitory activity comprising a sequence in which one or more amino acids are added, deleted, substituted, or inserted into the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. As another example, it is stringent to the complementary strand of a polynucleotide containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Hybridizing polynucleotide encodes at matter can include a polypeptide having a COX-2 selective inhibitory activity.
The mutant polypeptide can be produced by techniques well known to those skilled in the art. For example, total mRNA is prepared from animal cells that express α-lactalbumin, such as mammary gland, and RT-PCR is performed using primers designed based on the base sequence of natural α-lactalbumin. A mutant polypeptide can be obtained by introducing and expressing it in a host-vector system together with an appropriate promoter. Alternatively, a polynucleotide prepared by preparing a cDNA library from animal cells and using a probe prepared based on the base sequence of natural α-lactalbumin to hybridize to the probe from the cDNA library under stringent conditions And the polynucleotide is introduced into a suitable host and expressed, whereby a mutant polypeptide can be obtained. Those skilled in the art can appropriately select the promoter and host-vector system from known promoters and host-vector systems.
Those skilled in the art can appropriately select the stringent hybridization conditions. For example, in hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4x SSC, 50 mM Hepes pH 7.0, 10x Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA at 42 ° C. After performing overnight prehybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating overnight at 42 ° C. The cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are about “1 × SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more stringent, highly stringent conditions are about “0.5 × SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” As severe stringent conditions, it can be carried out at about “0.2 × SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”. Thus, isolation of a polynucleotide having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing for hybridization become more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
A polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such a hybridization technique usually has a high homology in amino acid sequence with the natural polypeptide. High homology means homology of at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95%.
Alternatively, artificial mutations are introduced site-specifically or randomly into the base sequence of natural α-lactalbumin by cassette mutagenesis or PCR mutagenesis, and the polynucleotide is expressed using an appropriate host-vector system. By doing so, a mutant polypeptide can be obtained. Whether or not the polypeptide prepared as described above has COX-2 selective inhibitory activity can be confirmed by measuring the inhibitory activity of the polypeptide against COX-1 and 2 by a known method. It can confirm by the method as described in an Example of this application. The amino acid sequence of such a mutant polypeptide having COX-2 selective inhibitory activity has high homology to the natural amino acid sequence, for example, the homology is 80% or more or 85% or more, Preferably it is 90% or more, More preferably, it is 95% or more.

本実施形態において、後述する実施例から明らかなとおり、消炎鎮痛作用を享受するためには、剤型、症状、体重などによって異なるが、その有効成分であるα-ラクトアルブミン類は１日に体重１ｋｇ当たりタンパク質換算で約0.002 mg〜約1,000 mg、好ましくは約0.01 mg〜約200 mg、最も好ましくは約0.2 mg〜約40 mgを投与（摂取）することができる。   In this embodiment, as will be apparent from the examples described later, in order to enjoy anti-inflammatory analgesic action, α-lactalbumins, which are active ingredients, vary depending on the dosage form, symptoms, body weight, etc. About 0.002 mg to about 1,000 mg, preferably about 0.01 mg to about 200 mg, and most preferably about 0.2 mg to about 40 mg per kg of protein can be administered (taken).

本発明の消炎鎮痛剤の有効成分であるα-ラクトアルブミンの投与量は、一般的には有効成分として一日あたり約0.1 mg〜約50,000 mg、好ましくは約0.5 mg〜約10,000 mg、最も好ましくは約10 mg〜約2,000 mgを、一度にまたは分割して、本発明の組成物による処置が必要とされている患者に対し、食前、食事後、食間および／または就寝前に投与することができる。投与量は、個別に、投与される患者の年齢、体重、および投与目的に応じて定めることもできる。   The dose of α-lactalbumin, which is an active ingredient of the anti-inflammatory analgesic of the present invention, is generally about 0.1 mg to about 50,000 mg per day as an active ingredient, preferably about 0.5 mg to about 10,000 mg, most preferably About 10 mg to about 2,000 mg can be administered at once or in portions to patients in need of treatment with the composition of the present invention before meals, after meals, between meals and / or before going to bed. it can. The dosage can also be determined individually depending on the age, weight and purpose of administration of the patient being administered.

本発明の消炎鎮痛剤は医薬品又は飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、又は特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種の炎症・痛みの治療及び／又は予防することが期待される。また、液状、ペースト状、固形、粉末等の形態を問わず、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品等）に添加し、これを摂取してもよい。
本発明の消炎鎮痛剤を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を混合して使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α-カゼイン、β-カゼイン、κ-カゼイン、β-ラクトグロブリン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物；バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。本発明の消炎鎮痛剤を含有する飲食品の製造において、これらは合成品であっても天然物由来品のいずれでもよく、および／または多く含む食品を原材料として用いてもよい。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。
本発明の消炎鎮痛剤を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与を挙げることができるが、注射剤や液剤等の製剤に加工して経管、静注、皮内、筋中など他の投与形態であってもよい。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、溶剤、等張化剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、適当量のカルシウムを含んでいてもよい。さらに適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、アミノ酸、ペプチド類などを添加してもよい。 The anti-inflammatory analgesic of the present invention can be used in the form of any medicine or food and drink. For example, it is expected to treat and / or prevent various inflammations and pains by directly administering as a pharmaceutical or by directly ingesting as a special-purpose food such as a food for specified health use or a nutritional functional food. In addition, various foods (milk, soft drinks, fermented milk, yoghurt, cheese, bread, biscuits, crackers, pizza crusts, prepared milk powder, liquid foods, for the sick, regardless of the form of liquid, paste, solid, powder, etc. Foods, nutritional foods, frozen foods, processed foods, and other commercially available foods).
The food containing the anti-inflammatory analgesic of the present invention can be used by mixing water, protein, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, fruit juices, flavors and the like. Examples of proteins include whole milk powder, skim milk powder, partially skimmed milk powder, casein, whey powder, whey protein, whey protein concentrate, whey protein isolate, α-casein, β-casein, κ-casein, β-lactoglobulin , Lactoferrin, soy protein, egg protein, meat protein and other animal and vegetable proteins, and their degradation products; various milk-derived components such as butter, whey minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phospholipids, and lactose Etc. It may contain peptides and amino acids such as casein phosphopeptide, arginine and lysine. Examples of the saccharide include saccharides, processed starch (in addition to dextrin, soluble starch, British starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like. Examples of the lipid include animal oils such as lard, fish oil, etc., fractionated oils, hydrogenated oil, transesterified oil, etc .; palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated oils thereof, Examples include vegetable oils such as hydrogenated oils and transesterified oils. Examples of vitamins include vitamin A, carotene, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline. Examples of minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, and selenium. Examples of the organic acid include malic acid, citric acid, lactic acid, and tartaric acid. In the production of foods and drinks containing the anti-inflammatory analgesic of the present invention, these may be either synthetic products or products derived from natural products, and / or foods containing a large amount may be used as raw materials. These components can be used in combination of two or more. The form of food may be solid or liquid. It may be in the form of a gel.
When the anti-inflammatory analgesic of the present invention is used as a pharmaceutical, it can be administered in various forms. Examples of the form include oral administration using tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., but they can be processed into preparations such as injections and liquids to be administered via tube, intravenous injection, intradermal, muscle Other dosage forms such as medium may be used. These various preparations are pharmaceutical preparations such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents, solvents, isotonic agents, etc. It can be formulated using known adjuvants that can be commonly used in the technical field. Further, it may contain an appropriate amount of calcium. Further, an appropriate amount of vitamins, minerals, organic acids, sugars, amino acids, peptides, etc. may be added.

本発明の消炎鎮痛剤は、炎症性疾患の治療に用いることができる。本発明の消炎鎮痛剤は、例えば、関節炎、関節リウマチ（若年性、慢性）、潰瘍性大腸炎、クローン病に適用可能であるが、これらに限られず、炎症を伴う疾患全般に適用可能である。   The anti-inflammatory analgesic of the present invention can be used for the treatment of inflammatory diseases. The anti-inflammatory analgesic of the present invention can be applied to, for example, arthritis, rheumatoid arthritis (juvenile, chronic), ulcerative colitis, Crohn's disease, but is not limited thereto, and can be applied to all diseases involving inflammation. .

関節炎には、感染性、免疫性、結晶性などの種類が存在する。具体的には、結核、痛風、慢性関節リウマチ、変形性関節症、急性リウマチ熱、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、still病、Reiter症候群、強直性脊椎炎などが知られている（井村裕夫、尾形悦郎、高久史麿、垂井清一郎編、「最新内科学大系 第74巻 関節疾患<骨・関節疾患２>」、中山書店発行、p.19、1995年）。これらの疾患の治療に用いられる剤の１つとしてCOX阻害剤などのNSAIDsが用いられている。   There are various types of arthritis such as infectivity, immunity, and crystallinity. Specific examples include tuberculosis, gout, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, acute rheumatic fever, psoriatic arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, still disease, Reiter syndrome, ankylosing spondylitis, etc. , Goro Ogata, Fumiaki Takahisa, Seiichiro Tarui, “The Latest University of Internal Medicine Vol. 74 Joint Disease <Bone and Joint Disease 2>”, published by Nakayama Shoten, p.19, 1995). NSAIDs such as COX inhibitors are used as one of the agents used for the treatment of these diseases.

関節リウマチは、多発性の関節炎が起こる慢性の炎症性疾患である。その正確な原因は不明だが、体質素因、免疫学的要因、環境因子の３つが重要視されている。免疫学的要因では、サイトカインという物質を分泌して免疫において重要な働きをしているリンパ球が異常な働きをする結果、異常な抗体が出現して自己の関節の組織に結合して関節炎を引き起こすとされている。初期の症状の多くは、起床時に関節がこわばり、関節の痛みと腫脹がおこる。関節の痛みは、自発痛（安静時）、圧痛、運動痛など、多岐にわたる。その他、関節の腫れ、熱、発赤などの症状を呈する。関節炎は、滑膜が炎症を起こした滑膜炎であり、手足の関節に対称的に多くみられる。よくおかされる関節は、手足の指、手、足、肘、膝、肩等で、進行すると変形することもある。一旦、関節リウマチを発症すると完全な治療は困難で、患者は一生この病気とつき合うこととなる。   Rheumatoid arthritis is a chronic inflammatory disease that causes multiple arthritis. The exact cause is unknown, but three predisposing factors, immunological factors, and environmental factors are regarded as important. In immunological factors, lymphocytes that secrete cytokines and play an important role in immunity function abnormally. As a result, abnormal antibodies appear and bind to the tissues of your joints, causing arthritis. It is supposed to cause. Many of the early symptoms are stiff joints when waking up, causing joint pain and swelling. There are many types of joint pain, including spontaneous pain (at rest), tenderness, and movement pain. Other symptoms include joint swelling, fever, and redness. Arthritis is synovitis in which the synovium is inflamed, and is often found symmetrically in the joints of the limbs. Commonly used joints are limbs, hands, feet, elbows, knees, shoulders, etc., and may deform as they progress. Once rheumatoid arthritis develops, complete treatment is difficult and patients will be associated with the disease for life.

今日、慢性関節リウマチ等の関節の炎症性疼痛あるいは骨の接合部位の炎症性疼痛を緩和するために日常的に処方される薬剤は、NSAIDsと称されるアスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ジクロフェナク等、数十種類の合成化合物と、ステロイドと称される合成グルココルチコイド等である。   Today, drugs that are routinely prescribed to relieve inflammatory pain in joints such as rheumatoid arthritis or inflammatory pain at bone joint sites include aspirin called NSAIDs, indomethacin, ibuprofen, and diclofenac. Ten synthetic compounds and synthetic glucocorticoids called steroids.

炎症性疼痛を媒介するのはプロスタグランジンであり、NSAIDsによってCOXを阻害してプロスタグランジン生合成を減少／停止させれば、疼痛は緩和する。しかしながら、既に述べたようにこれらの薬剤は、長期投与すると消化性潰瘍を高い頻度で誘発する。従って、消化性潰瘍を誘発させることなく、高度の安全性をもって関節の炎症性疼痛を改善できる方法が、長年探し求められてきた。最近におけるNSAIDsのトピックは、炎症部位で誘導されるCOX-2を特異的に阻害し、NSAIDsの副作用であった消化性潰瘍を減らすことができるCOX-2阻害剤である（井村裕夫、尾形悦郎、高久史麿、垂井清一郎編、「最新内科学大系 第74巻 関節疾患<骨・関節疾患２>」、中山書店発行、p.19、1995年、および、福島雅典編、「メルクマニュアル医学情報 家庭版」、日経ＢＰ社、p.233-235、1999年）。   Prostaglandins mediate inflammatory pain, and inhibition of COX by NSAIDs to reduce / stop prostaglandin biosynthesis reduces pain. However, as already mentioned, these drugs frequently induce peptic ulcers when administered for a long time. Therefore, a method that can improve inflammatory pain in joints with a high degree of safety without inducing peptic ulcer has been sought for many years. A recent topic of NSAIDs is a COX-2 inhibitor that can specifically inhibit COX-2 induced at the site of inflammation and reduce peptic ulcers that were a side effect of NSAIDs (Hiroo Imura, Goro Ogata) , Shigeru Takahisa, Seiichiro Tarui, “The Latest University of Internal Medicine Vol. 74, Joint Disease <Bone and Joint Disease 2>”, published by Nakayama Shoten, p.19, 1995, and edited by Masanori Fukushima, “Merck Manual Medicine” Information home version ", Nikkei Business Publications, p.233-235, 1999).

また、本発明の消炎鎮痛剤は、炎症を伴わない痛みの緩和にも有効に用いることができる。痛みには急性痛と慢性痛と言った二種類ある。急性痛とは（例えば、足首の捻挫のように）身体に傷や何らかの障害がおきたという警告の信号である。痛みに反応することで、原因を取り除き、悪化を防ごうとする反応である。それに対して慢性痛とは警告の信号が役目を果たさず、どんな治療をしても痛みが消えない場合をいう。慢性痛には、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、あるいはこれらの混合型などがある。   In addition, the anti-inflammatory analgesic of the present invention can be used effectively for alleviating pain without inflammation. There are two types of pain: acute pain and chronic pain. Acute pain is a warning signal that the body has been injured or damaged (such as an ankle sprain). It is a reaction that tries to remove the cause and prevent worsening by reacting to pain. Chronic pain, on the other hand, refers to the case where the warning signal does not play a role and the pain does not go away with any treatment. Chronic pain includes neuropathic pain, nociceptive pain, or a combination thereof.

シクロオキシゲナーゼ（COX）はプロスタグランジン（PG）生合成に係る酵素として知られている。COXには現在少なくともCOX-1、COX-2、COX-3の３種類の存在が報告されている。COX-1は生理的に存在しており、胃や腎などの生理作用を司っている。LPS等の刺激や炎症に関わらずその濃度は変動しない。一方、COX-2は炎症や組織障害などに関係する。正常状態では発現しないが、LPS、IL-1等の刺激や炎症などよって主として遊走細胞から新たに産生し、デキサメタゾンにより産生抑制を受ける。すなわち、COX-2を選択的に阻害した場合、胃や腎などに対する副作用が少なく、炎症や組織障害などを改善する効果を期待することができる。   Cyclooxygenase (COX) is known as an enzyme involved in prostaglandin (PG) biosynthesis. There are currently at least three types of COX reported, COX-1, COX-2, and COX-3. COX-1 exists physiologically and controls physiological actions such as stomach and kidney. The concentration does not change regardless of stimuli such as LPS or inflammation. On the other hand, COX-2 is related to inflammation and tissue damage. Although it is not expressed in a normal state, it is newly produced mainly from migratory cells by stimulation or inflammation of LPS, IL-1, etc., and production is suppressed by dexamethasone. That is, when COX-2 is selectively inhibited, there are few side effects on the stomach, kidneys, and the like, and an effect of improving inflammation and tissue damage can be expected.

COX抑制剤の適応症としては、（１）慢性関節リウマチ、変形性関節症、五十肩、頸肩腕症候群、腰痛、腱鞘炎、痛風などの、リウマチ性疾患や運動器疾患、（２）術後・外傷後痛、癌性疼痛、歯科領域の痛み、症候性神経痛、結石痛、月経痛などの、疼痛性疾患、（３）各種感染症、悪性腫瘍、膠原病などの、発熱を伴う疾患、（４）脳梗塞、一過性虚血発作、虚血性心疾患、川崎病、蛋白尿、癌転移などの、抗血栓や抗血小板作用を利用する適応症、（５）エンドトキシンショック、動脈管開存症、低血圧、Bartter症候群、男子不妊症、免疫抑制、免疫療法の強化などの、主としてPG合成抑制作用による適応症、などが知られている（井村裕夫、尾形悦郎、高久史麿、垂井清一郎編、「最新内科学大系 第74巻 関節疾患<骨・関節疾患２>」、中山書店発行、p.77-78、1995年）。したがって、COX-2阻害活性を有する本発明の消炎鎮痛剤は、炎症を伴う疾患全般に限らず、上記の各種疾患にも適用が可能である。   Indications for COX inhibitors include (1) rheumatoid arthritis, osteoarthritis, fifty shoulders, cervical and shoulder syndrome, low back pain, tendonitis, gout, and other rheumatic diseases and motor organ diseases, and (2) postoperative / traumatic injury. Painful diseases such as after pain, cancer pain, dental pain, symptomatic neuralgia, stone pain, menstrual pain, (3) diseases with fever such as various infectious diseases, malignant tumors, collagen disease, (4 ) Indications using antithrombotic and antiplatelet effects such as cerebral infarction, transient ischemic attack, ischemic heart disease, Kawasaki disease, proteinuria, cancer metastasis, (5) endotoxin shock, patent ductus arteriosus , Low blood pressure, Bartter syndrome, male infertility, immunosuppression, indications mainly due to PG synthesis inhibitory action, such as strengthening of immunotherapy, etc. are known (Hiroo Imura, Goro Ogata, Fumiaki Takahisa, Kiichiro Tarui) , “Latest Internal Medicine Vol. 74, Joint Disease <Bone and Joint Disease 2>”, Medium Shoten, p.77-78, 1995 years). Therefore, the anti-inflammatory analgesic agent of the present invention having COX-2 inhibitory activity is applicable not only to all diseases accompanied by inflammation but also to the above various diseases.

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。   In addition, all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.

以下、本発明について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited by this.

［実施例1］（カラゲニン足浮腫抑制試験、急性炎症に対する作用）
本実施例は、ホエイタンパク質分離物（WPI）およびWPIに含有される各種タンパクの、カラゲニン誘発性足浮腫に対する抑制効果を検証した。なお、WPIとはホエイを精密濾過(MF)、限外濾過(UF)、クロス・フォロー精密濾過(CFM)、イオン交換等で処理してタンパク質を分離し、タンパク質濃度を高めたものである。
（方法）
１週間以上の馴化期間を終えたウィスター系ラット（雄性、6週齢、１群６匹、５群）を用い、各種試験物質の経口投与を行った。試験物質として、生理食塩水に溶解したホエイタンパク質分離物（WPI、ウシ由来、Davisco Foods International, Inc.社製）1g/kg［WPI群］、α-ラクトアルブミン（α-LA、ウシ由来、Davisco Foods International, Inc.社製）250 mg/kg（WPIの25 w/w %）［aLA群］、β-ラクトグロブリン（β-LG、ウシ由来、Davisco Foods International, Inc.社製）500 mg/kg（WPIの50 w/w %）［bLG群］、ラクトフェリン（LF、ウシ由来、Murray Goulburn Ingredients社製）10 mg/kg（WPIの1 w/w %）［LF群］、および生理食塩水［対照群］をそれぞれ表記の用量で、4 ml/kgの容量で投与した。試験物質の経口投与から1時間後、1 w/w %カラゲニン溶液を左肢足蹠に0.1 mL皮内投与した。カラゲニン投与3時間後の時点で足容積を測定し、その抗炎症作用を評価した。なお、以降の実施例では、WPI、α-LA、β-LGおよびLFはここに示すものと同じものを用いた。
（結果）
WPI中には主たる成分として、α-ラクトアルブミン（WPIの25 w/w %）、β-ラクトグロブリン（WPIの50 w/w %）、ラクトフェリン（WPIの1 w/w %）が存在する。今回は、WPI中の活性成分を検討すべく、その含有比率に応じて投与した。その結果、α-ラクトアルブミンのみにカラゲニン足浮腫を抑制する効果がみられた。この結果から、WPIのカラゲニン足浮腫抑制効果は、α-ラクトアルブミンの寄与するものであることが分かった（図１）。 [Example 1] (Carrageenan paw edema suppression test, action on acute inflammation)
In this example, the inhibitory effects of whey protein isolate (WPI) and various proteins contained in WPI on carrageenan-induced foot edema were examined. WPI is a protein in which whey is processed by microfiltration (MF), ultrafiltration (UF), cross-follow microfiltration (CFM), ion exchange, etc., to separate proteins and increase the protein concentration.
(Method)
Various test substances were orally administered using Wistar rats (male, 6 weeks old, 1 group, 6 animals, 5 groups) that had been acclimated for 1 week or longer. As test substances, whey protein isolate dissolved in physiological saline (WPI, derived from bovine, manufactured by Davisco Foods International, Inc.) 1 g / kg [WPI group], α-lactalbumin (α-LA, derived from bovine, Davisco Foods International, Inc.) 250 mg / kg (25 w / w% of WPI) [aLA group], β-lactoglobulin (β-LG, derived from bovine, Davisco Foods International, Inc.) 500 mg / kg (50 w / w% of WPI) [bLG group], lactoferrin (LF, derived from bovine, Murray Goulburn Ingredients) 10 mg / kg (1 w / w% of WPI) [LF group], and physiological saline [Control group] was administered at a dose of 4 ml / kg at the indicated dose. One hour after oral administration of the test substance, 0.1 mL of 1 w / w% carrageenan solution was intradermally administered to the left limb footpad. The foot volume was measured at 3 hours after carrageenin administration, and its anti-inflammatory effect was evaluated. In the following examples, WPI, α-LA, β-LG and LF were the same as those shown here.
(result)
The main components in WPI are α-lactalbumin (25 w / w% of WPI), β-lactoglobulin (50 w / w% of WPI), and lactoferrin (1 w / w% of WPI). This time, in order to examine the active ingredient in WPI, it was administered according to the content ratio. As a result, only α-lactalbumin was effective in suppressing carrageenan paw edema. From this result, it was found that α-lactalbumin contributes to the carrageenan foot edema inhibitory effect of WPI (FIG. 1).

［実施例2］（アジュバント関節炎（治療）モデル、亜急性炎症（実験的慢性炎症）に対する作用）
本実施例では、リウマチ性関節炎の動物モデルであるラットアジュバント関節炎モデルを作成し、WPIに含有される各種タンパクの関節炎に対する治療効果を検証した。
（方法）
１週間以上の馴化期間終了後、ウィスター系ラット（雄性、6週齢）の左肢足蹠に、0.1 mLのフロイント完全アジュバントを皮下注射してアジュバント関節炎を惹起した。使用したフロイント完全アジュバントは10 mL中、流動パラフィン8.5 mL、界面活性剤スパン８０ 1.5 mL および、ヒト型結核死菌H37Rv 7.5 mgを含有する。アジュバント投与から14日後、十分に関節炎が発症したラットを選抜し、左肢足蹠の足容積に基づいて群分けを行った（１群６匹、５群）。
生理食塩水に溶解した試験物質（α-ラクトアルブミン［aLA群］、β-ラクトグロブリン［bLG群］、ラクトフェリン［LF群］）はそれぞれ300 mg/kgの用量で、非ステロイド性消炎鎮痛剤（NSAIDs）であるジクロフェナク（和光純薬工業社製）［陽性対照群］は、50 mg/kgの用量で、4 ml/kgの容量にてアジュバント投与から14〜16日目までの3日間連続経口投与した。また、対照群として、同容量の生理食塩水をアジュバント投与から14〜16日目までの3日間連続経口投与した。
アジュバント投与から14（被検物質投与直後）、15、17日目に左肢足蹠の足容積を測定し、治療効果を調べた。
（結果）
アジュバントを投与した左肢足の浮腫に対して、α-ラクトアルブミンは浮腫の増悪を抑制した。また、ラクトフェリンの投与では足容積は減少し、治療的効果が得られた（図２）。 [Example 2] (Adjuvant arthritis (treatment) model, effect on subacute inflammation (experimental chronic inflammation))
In this example, a rat adjuvant arthritis model, which is an animal model of rheumatoid arthritis, was created, and the therapeutic effects on arthritis of various proteins contained in WPI were verified.
(Method)
After the acclimation period of 1 week or longer, adjuvant arthritis was induced by subcutaneous injection of 0.1 mL of Freund's complete adjuvant into the left footpad of Wistar rats (male, 6 weeks old). The Freund's complete adjuvant used contains 8.5 mL of liquid paraffin, 80 1.5 mL of a surfactant span and 7.5 mg of human tuberculosis killed H37Rv in 10 mL. Fourteen days after administration of the adjuvant, rats with sufficient arthritis were selected and divided into groups based on the foot volume of the left limb footpad (1 group, 6 animals, 5 groups).
Test substances (α-lactalbumin [aLA group], β-lactoglobulin [bLG group], lactoferrin [LF group]) dissolved in physiological saline are each administered at a dose of 300 mg / kg, non-steroidal anti-inflammatory analgesics ( Diclofenac (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [positive control group] is an oral dose of 50 mg / kg for 3 consecutive days from adjuvant administration to the 14th to 16th day after administration of adjuvant in a volume of 4 ml / kg. Administered. As a control group, the same volume of physiological saline was orally administered for 3 consecutive days from the adjuvant administration to the 14th to 16th days.
On the 14th day (immediately after administration of the test substance), 15th and 17th days after administration of the adjuvant, the foot volume of the left footpad was measured to examine the therapeutic effect.
(result)
Α-lactalbumin suppressed the exacerbation of edema in contrast to edema of the left limb that received adjuvant. In addition, administration of lactoferrin decreased the foot volume, and a therapeutic effect was obtained (FIG. 2).

［実施例3］（アジュバント関節炎（疼痛）モデル、慢性疼痛に対する作用）
１週間以上の馴化期間終了後、ウィスター系ラット（雄性、6週齢）の左肢足蹠に、実施例２と同様のフロイント完全アジュバント 0.1 mLを皮下注射してアジュバント関節炎を惹起した。アジュバント投与から16日後、十分関節炎が発症したラットを選抜し、左肢足蹠の足容積に基づいて群分けを行った（１群６匹、５群）。
生理食塩水に溶解した試験物質（α-ラクトアルブミン［aLA群］、β-ラクトグロブリン［bLG群］、ラクトフェリン［LF群］）はそれぞれ300 mg/kgの用量で、消炎鎮痛剤であるジクロフェナク［陽性対照群］は50 mg/kgの用量で4 ml/kgの容量にて経口投与した。試験物質投与1時間後に、左後肢足関節の屈曲伸展刺激疼痛に対する鳴啼反応の有無を測定した。10回屈曲伸展したとき何回鳴啼するかを数値化して、疼痛抑制効果を評価した。
（結果）
α-ラクトアルブミン単回投与、ラクトフェリン単回投与において、関節炎疼痛の抑制効果が得られた（図３）。 [Example 3] (Adjuvant arthritis (pain) model, action on chronic pain)
After the acclimation period of 1 week or longer, adjuvant arthritis was induced by subcutaneously injecting 0.1 mL of Freund's complete adjuvant similar to Example 2 into the left limb footpad of Wistar rats (male, 6 weeks old). Sixteen days after administration of the adjuvant, rats with sufficient arthritis were selected and divided into groups based on the foot volume of the left limb footpad (1 group, 6 animals, 5 groups).
Test substances (α-lactalbumin [aLA group], β-lactoglobulin [bLG group], lactoferrin [LF group]) dissolved in physiological saline are each 300 mg / kg, and the anti-inflammatory analgesic diclofenac [ The positive control group] was orally administered in a volume of 4 ml / kg at a dose of 50 mg / kg. One hour after administration of the test substance, the presence or absence of a crying response to bending extension stimulation pain in the left hind limb ankle was measured. The effect of pain suppression was evaluated by quantifying the number of times of crying when bent and extended 10 times.
(result)
An arthritic pain suppressing effect was obtained by single administration of α-lactalbumin and single administration of lactoferrin (FIG. 3).

［実施例4］（酢酸ライジング試験、疼痛に対する作用）
本実施例では、WPIに含有される各種タンパクの、酢酸誘発性疼痛に対する治療効果を検証した。
１週間以上の馴化期間を終えたマウス（雄性、６週齢、１群６匹、５群）を用い、生理食塩水に溶解したホエイタンパク質分離物（WPI）［WPI群］、α-ラクトアルブミン［aLA群］、β-ラクトグロブリン［bLG群］、ラクトフェリン［LF群］をそれぞれ300 mg/kgの用量で、消炎鎮痛剤であるジクロフェナク［陽性対照（Dicro）群］は、50 mg/kgの用量で、４ ml/kgの容量にて経口投与した。また、対照（Vehicle）群として、同容量の生理食塩水を経口投与した。試験物質の経口投与から1時間後、0.6 v/v%酢酸溶液を腹腔内に0.2 mL投与した。酢酸投与10分後から30分後までの20分間の苦悶動作回数を数値化して、疼痛抑制効果を評価した。
（結果）
結果を図４に示す。α-ラクトアルブミン、ラクトフェリンに有意な鎮痛効果がみられた。 [Example 4] (Acetic acid rising test, effect on pain)
In this example, the therapeutic effects of various proteins contained in WPI on acetic acid-induced pain were verified.
Whey protein isolate (WPI) [WPI group], α-lactalbumin dissolved in physiological saline using mice (male, 6 weeks of age, 1 group, 6 animals, 5 groups) after acclimation period of 1 week or more [ALA group], β-lactoglobulin [bLG group], lactoferrin [LF group] each at a dose of 300 mg / kg, anti-inflammatory analgesic diclofenac [positive control (Dicro) group] is 50 mg / kg The dose was administered orally in a volume of 4 ml / kg. In addition, the same volume of physiological saline was orally administered as a control (Vehicle) group. One hour after oral administration of the test substance, 0.2 mL of a 0.6 v / v% acetic acid solution was intraperitoneally administered. The pain suppression effect was evaluated by quantifying the number of 20-minute agony motions from 10 minutes to 30 minutes after acetic acid administration.
(result)
The results are shown in FIG. α-Lactalbumin and lactoferrin showed significant analgesic effects.

［実施例５］（酵素阻害実験）
本実施例では、試験物質（α-ラクトアルブミン、WPI）の、炎症に係る各種酵素に対する阻害活性を検証した。
（方法）
（１）シクロオキシゲナーゼ-1（COX-1）の酵素標品を用いた活性測定（n=２）
各種濃度の試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）、およびシクロオキシゲナーゼ-1（EC 1.14.99.1、ヒト血小板由来）の酵素標品を、HBSS（Hanks' Balanced Salt Solutions 、15 mM HEPES；pH 7.4）中で37℃15分間プレインキュベーションした後、アラキドン酸を最終濃度100 μMとなるように加えて37℃15分間反応させた。反応後、PGE2の濃度をEIA（enzyme immuno assay）で測定した。また、試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）を添加しないものを対照群として設けた。対照群の測定値の平均値を酵素阻害率100%としてα-ラクトアルブミンおよびWPIの酵素阻害率を算出し、50%阻害濃度をIC50値とした。
（２）シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）の酵素標品を用いた活性測定（n=２）
各種濃度の試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）、およびシクロオキシゲナーゼ-2（EC 1.14.99.1、ヒト組換；Sf21昆虫細胞）の酵素標品を、1 mMグルタチオン、1 μM ヘマチン、500 μM フェノールを含む100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7)中で37℃15分間プレインキュベーションした後、アラキドン酸を最終濃度0.3 μMとなるように加えて37℃5分間反応させた。反応後、PGE2の濃度をEIAで測定した。また、試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）を添加しないものを対照群として設けた。対照群の測定値の平均値を酵素阻害率100%としてα-ラクトアルブミンおよびWPIの酵素阻害率を算出し、50%阻害濃度をIC50値とした。
（３）誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の酵素標品を用いた活性測定（n=２）
各種濃度の試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）、および誘導型一酸化窒素合成酵素（EC 1.14.13.39、マウスマクロファージ由来）の酵素標品を、4 mM NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide還元型）、8 μM (6R)-5,6,7,8-テトラヒドロ-L-ビオプテリン、8 μM FAD、6 mM DTT（Dithiothreitol）を含む100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9)中で37℃15分間プレインキュベーションした後、アルギニンを最終濃度100 μMとなるように加えて37℃2時間反応させた。反応後、NO2-を分光光度法により定量した。また、試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）を添加しないものを対照群として設けた。対照群の定量値の平均値を酵素阻害率100%としてα-ラクトアルブミンおよびWPIの酵素阻害率を算出し、50%阻害濃度をIC50値とした。
（４）ホスホリパーゼA2（PLA2）の酵素標品を用いた活性測定（n=２）
各種濃度の試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）、およびホスホリパーゼA2-I（EC 3.1.1.4、ブタ膵由来）またはホスホリパーゼA2-II（EC 3.1.1.4、ニシダイヤガラガラヘビ由来）の酵素標品を、20 μM EDTAを含む0.1 M Glycine-NaOH buffer (pH 9.0)中で37℃15分間プレインキュベーションした後、1-パルミトイル-2-［1-14C］オレオイル-L-3-ホスファチジルコリンを最終濃度0.03 μCiとなるように加えて37℃5分間反応させた。未反応の1-パルミトイル-2-［1-14C］オレオイル-L-3-ホスファチジルコリンを除去後、オレイン酸塩画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。また、試験物質（α-ラクトアルブミンまたはWPI）を添加しないものを対照群として設けた。対照群の放射活性（Ci）の平均値を酵素阻害率100%としてα-ラクトアルブミンおよびWPIの酵素阻害率を算出し、50%阻害濃度をIC50値とした。 [Example 5] (Enzyme inhibition experiment)
In this example, the inhibitory activity of test substances (α-lactalbumin, WPI) on various enzymes related to inflammation was examined.
(Method)
(1) Activity measurement using an enzyme preparation of cyclooxygenase-1 (COX-1) (n = 2)
Various concentrations of test substance (α-lactalbumin or WPI) and cyclooxygenase-1 (EC 1.14.99.1, derived from human platelets) in HBSS (Hanks' Balanced Salt Solutions, 15 mM HEPES; pH 7.4) After preincubation at 37 ° C. for 15 minutes, arachidonic acid was added to a final concentration of 100 μM and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After the reaction, the concentration of PGE 2 was measured by EIA (enzyme immunoassay). In addition, a test group (α-lactalbumin or WPI) not added was provided as a control group. The enzyme inhibition rate of α-lactalbumin and WPI was calculated with the average value of the measured values of the control group as 100% enzyme inhibition rate, and the 50% inhibition concentration was taken as the IC 50 value.
(2) Activity measurement using an enzyme preparation of cyclooxygenase-2 (COX-2) (n = 2)
Various concentrations of test substance (α-lactalbumin or WPI) and cyclooxygenase-2 (EC 1.14.99.1, human recombination; Sf21 insect cells) enzyme preparation, 1 mM glutathione, 1 μM hematin, 500 μM phenol After preincubating in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.7) for 15 minutes at 37 ° C., arachidonic acid was added to a final concentration of 0.3 μM and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After the reaction, the PGE 2 concentration was measured by EIA. In addition, a test group (α-lactalbumin or WPI) not added was provided as a control group. The enzyme inhibition rate of α-lactalbumin and WPI was calculated with the average value of the measured values of the control group as 100% enzyme inhibition rate, and the 50% inhibition concentration was taken as the IC 50 value.
(3) Activity measurement using enzyme preparation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) (n = 2)
Various concentrations of test substances (α-lactalbumin or WPI) and inducible nitric oxide synthase (EC 1.14.13.39, derived from mouse macrophages) were prepared using 4 mM NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide reduced form), 8 Preincubation for 15 minutes at 37 ° C in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9) containing µM (6R) -5,6,7,8-tetrahydro-L-biopterin, 8 µM FAD, 6 mM DTT (Dithiothreitol) Thereafter, arginine was added to a final concentration of 100 μM and reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, NO 2− was quantified spectrophotometrically. In addition, a test group (α-lactalbumin or WPI) not added was provided as a control group. The enzyme inhibition rate of α-lactalbumin and WPI was calculated with the average value of the quantitative values of the control group as the enzyme inhibition rate of 100%, and the 50% inhibition concentration was taken as the IC 50 value.
(4) Activity measurement using an enzyme preparation of phospholipase A2 (PLA2) (n = 2)
Various concentrations of test substances (α-lactalbumin or WPI) and phospholipase A2-I (EC 3.1.1.4, derived from porcine pancreas) or phospholipase A2-II (EC 3.1.1.4, derived from the rattlesnake) After pre-incubation in 0.1 M Glycine-NaOH buffer (pH 9.0) containing 20 μM EDTA at 37 ° C for 15 minutes, 1-palmitoyl-2- [1- 14 C] oleoyl-L-3-phosphatidylcholine The mixture was added to 0.03 μCi and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After removing unreacted 1-palmitoyl-2- [1- 14 C] oleoyl-L-3-phosphatidylcholine, the radioactivity of the oleate fraction was measured with a liquid scintillation counter. In addition, a test group (α-lactalbumin or WPI) not added was provided as a control group. The enzyme inhibition rate of α-lactalbumin and WPI was calculated with the average value of radioactivity (Ci) of the control group as the enzyme inhibition rate of 100%, and the 50% inhibition concentration was taken as the IC 50 value.

（結果）
結果を表１および表２に示す。α-ラクトアルブミンはシクロオキシゲナーゼ-2、ホスホリパーゼA2-I、ホスホリパーゼA2-IIにおいて高い活性がみられた。とりわけ、シクロオキシゲナーゼ-2に選択的に高い活性を見出すことができた。また、α-ラクトアルブミンは、WPIと比較しても高いシクロオキシゲナーゼ-2活性を有することがわかった。 (result)
The results are shown in Tables 1 and 2. α-Lactalbumin was highly active in cyclooxygenase-2, phospholipase A2-I, and phospholipase A2-II. In particular, cyclooxygenase-2 was found to be selectively highly active. In addition, α-lactalbumin was found to have high cyclooxygenase-2 activity even compared to WPI.

Figure 2013241418
（表１ α-ラクトアルブミンの酵素阻害効果）
Figure 2013241418
 (Table 1 Enzyme inhibitory effect of α-lactalbumin)

Figure 2013241418
（表２ WPIの酵素阻害効果）
Figure 2013241418
 (Table 2 Enzyme inhibitory effect of WPI)

[実施例６]（月経痛（疼痛）に対するヒト試験）
本実施例では、α-ラクトアルブミンの、月経痛に対する改善効果をランダム化ダブルブラインドクロスオーバー試験にて検証した。
（被験者）
協力依頼の掲示に協力を申し出た女性70名を対象に事前調査を行い、月経周期が28日間±3日間で安定し、直近の月経に関する自記式質問紙（表３：月経痛の痛みの程度、月経痛による日常生活への影響程度、鎮痛剤の使用程度）の回答が、月経痛の痛みの程度1以上、月経痛スコア（月経痛による日常生活への影響程度、鎮痛剤の使用程度）の合計が2以上の女性30名（22〜50歳、平均36.4歳）を選抜し、被験者とした。
（被検物）
外見の全く同じ錠菓A, Bを準備した。一方はα-ラクトアルブミン錠菓（1粒中α-ラクトアルブミン150 mg含有）であり、他方はα-ラクトアルブミンを全く含有しないもの（プラセボ錠菓）である。被検者、評価者ともに、評価終了までいずれの錠菓がα-ラクトアルブミン錠菓であるのかを伏せた状態で試験を開始した。
（被検物の摂取方法）
平成19年9〜12月の3月経周期において試験を実施した。最初の月経終了から次回月経終了までの1月経周期を１回目の被検物摂取期として設けた。１回目の被検物摂取期に続く1月経周期（月経終了から次回月経終了まで）は被検物を摂取しない休食期とした。さらに、休食期に続く1月経周期（月経終了から次回月経終了まで）を２回目の被検物摂取期とした。
被験者を２つの群に分け、1群（錠菓A摂取期-休食期-錠菓B摂取期、ｎ＝13）および2群（錠菓B摂取期-休食期-錠菓A摂取期、ｎ＝17）と、それぞれ錠菓A、錠菓Bの摂取順序を違えて設定した。
被検物摂取期は、1回に2粒の被検物（錠菓Aまたは錠菓B）を朝、昼、夕の3回継続して摂取させた。
なお、試験開始前および試験期間中は鎮痛剤の使用は自由とした。
（評価方法）
試験開始前の１回の月経期間中に、被験者に自記式質問紙（表３）を記入させた。さらに、被検物摂取期および休食期の間中、被験者に1日1回、自記式質問紙に継続記録させた。自記式質問紙の内容は月経痛とQOLに関するものである。月経期間中に自記式質問紙に記入された月経痛の程度、日常生活への影響、および鎮痛剤使用の程度は、バーバルレーティングスケールを用いて数値化し、各被験者の期間中における最大値を評価に用いた。なお、評価対象の月経痛は腰痛と下腹部痛に限定した。
さらに、試験開始前の月経および休食期の結果の平均値を求め、これを非摂取期の値とした。
（統計処理）
各測定値について平均値と標準誤差を求め、有意差の検定は統計ソフトを用いてノンパラメトリック法で対応のある群として検定を行った。（Wilcoxsonの符号付き順位和検定）
（結果）
月経痛の痛みの程度を測定したバーバルレーティングスケール値は、は非摂取期と比較するとα-ラクトアルブミン錠菓の摂取で有意（p<0.01）に低下した（図５）。
月経痛による日常生活への影響程度（QOL）を評価するバーバルレーティングスケール値は、非摂取期と比較するとα-ラクトアルブミン錠菓の摂取で減少する傾向（p<0.10）があった（図６）。
鎮痛剤の使用程度については、試験開始前に月経痛のため鎮痛剤を服用した人は21人（70%）であったが、α-ラクトアルブミン錠菓摂取期とプラセボ錠菓摂取期では10人（全体の33%）に減少した。鎮痛剤の使用程度を測定したバーバルレーティングスケール値は、非摂取期と比較するといずれの錠菓摂取期ともに有意な低下が認められた（p<0.01）（図７）。
以上の結果から、α-ラクトアルブミン300 mgを1日3回（朝、昼、夕）摂取することによって、鎮痛剤の使用割合を大幅に減じるとともに、月経痛の緩和、QOLの改善効果が明らかになった。 [Example 6] (Human test for menstrual pain (pain))
In this example, the improvement effect of α-lactalbumin on menstrual pain was verified by a randomized double blind crossover test.
(subject)
A preliminary survey was conducted on 70 women who requested cooperation in posting of cooperation requests, and the menstrual cycle was stable for 28 days ± 3 days. A self-administered questionnaire about the latest menstruation (Table 3: Degree of pain of menstrual pain) , The degree of impact of daily menstrual pain on the daily life, use of analgesics) is the answer of menstrual pain 1 or higher, the menstrual pain score (degree of daily menstrual pain impact on the daily use of painkillers) 30 women (22-50 years old, average 36.4 years old) with a total of 2 or more were selected as subjects.
(Subject)
Tablets A and B with exactly the same appearance were prepared. One is α-lactalbumin tablet confectionery (containing 150 mg of α-lactalbumin in one tablet), and the other is one containing no α-lactalbumin (placebo tablet confectionery). Both the test subject and the evaluator started the test in a state in which which tablet confection was an α-lactalbumin tablet confection until the end of the evaluation.
(Intake method of the test object)
The test was carried out in the menstrual cycle from September to December 2007. The first menstrual cycle from the end of the first menstruation to the end of the next menstruation was established as the first test substance intake period. The menstrual cycle (from the end of menstruation to the end of the next menstruation) following the first subject ingestion period was a rest period in which no subject was ingested. Furthermore, the first menstrual cycle (from the end of menstruation to the end of the next menstruation) following the resting period was set as the second test substance intake period.
The subjects were divided into two groups, 1 group (tablet A intake period-rest period-tablet confection B intake period, n = 13) and 2 groups (tablet B intake period-rest period-tablet confection A intake period) N = 17), and the order of intake of tablet confection A and tablet confection B was set differently.
In the test substance intake period, two test articles (Tablet A or Tablets B) were continuously ingested three times in the morning, noon and evening.
The use of analgesics was allowed before the start of the test and during the test period.
(Evaluation method)
During one menstrual period before the start of the test, the subject was asked to complete a self-administered questionnaire (Table 3). In addition, subjects were continuously recorded on a self-administered questionnaire once a day during the test substance intake and rest periods. The content of the self-administered questionnaire is about menstrual pain and quality of life. The degree of menstrual pain entered in the self-administered questionnaire during the menstrual period, the impact on daily life, and the degree of use of analgesics are quantified using the verbal rating scale, and the maximum value during each period is evaluated. Used for. The menstrual pain to be evaluated was limited to back pain and lower abdominal pain.
Furthermore, the average value of the results of menstruation and the rest period before the start of the test was determined, and this was used as the value in the non-intake period.
(Statistical processing)
The average value and standard error were obtained for each measured value, and the significant difference was tested as a corresponding group by a non-parametric method using statistical software. (Wilcoxson signed rank test)
(result)
The verbal rating scale value, which measured the degree of menstrual pain, significantly decreased (p <0.01) when α-lactalbumin tablet confection was ingested compared to the non-ingestion period (FIG. 5).
The verbal rating scale value for evaluating the degree of influence (QOL) on the daily life due to menstrual pain tended to decrease (p <0.10) when α-lactalbumin tablet confection was consumed compared to the non-intake period (Fig. 6). ).
As for the degree of use of analgesics, 21 people (70%) took analgesics due to menstrual pain before the start of the study, but 10 in the intake period of α-lactalbumin tablets and placebo tablets. It decreased to people (33% of the total). The barval rating scale value, which measured the degree of use of analgesics, was significantly decreased in both tablet candy ingestion periods compared to the non-ingestion period (p <0.01) (FIG. 7).
Based on the above results, taking α-lactalbumin 300 mg three times a day (morning, noon, evening) significantly reduces the proportion of analgesics used, and alleviates menstrual pain and improves QOL Became.

Figure 2013241418
（表３ 自記式質問紙の内容）
Figure 2013241418
 (Table 3 Contents of self-administered questionnaire)

本発明における有効成分であるα-ラクトアルブミン類は、牛乳などの比較的安価な原料から大量生産が可能である。また、副作用が少なくて、安全性が高く、長期間にわたり摂取することが可能であるので、医薬品に混合したり、食品として摂取することにより、消炎鎮痛効果を享受することができる。加えて、日常的に投与又は摂取することによって、充分な栄養管理が可能となるので、低栄養状態の患者に対する機能性食品などの製造などの用途に適用することも可能である。   The α-lactalbumins which are active ingredients in the present invention can be mass-produced from relatively inexpensive raw materials such as milk. Moreover, since there are few side effects, it is safe and can be ingested over a long period of time, the anti-inflammatory analgesic effect can be enjoyed by mixing with a pharmaceutical or ingesting as a food. In addition, since sufficient nutritional management is possible by daily administration or ingestion, it can also be applied to uses such as the production of functional foods for patients with low nutritional status.

Claims (10)

α-ラクトアルブミンを有効成分とする、COX-2選択的阻害剤。 A COX-2 selective inhibitor comprising α-lactalbumin as an active ingredient. α-ラクトアルブミンを有効成分とする、消炎鎮痛剤。 An anti-inflammatory analgesic comprising α-lactalbumin as an active ingredient. 消炎鎮痛剤の製造のための、α-ラクトアルブミンの使用。 Use of α-lactalbumin for the manufacture of anti-inflammatory analgesics. 炎症性疾患治療薬である、請求項２に記載の消炎鎮痛剤。 The anti-inflammatory analgesic according to claim 2, which is a therapeutic agent for inflammatory diseases. 炎症性疾患が関節炎または関節リウマチである、請求項４記載の消炎鎮痛剤。 The anti-inflammatory analgesic according to claim 4, wherein the inflammatory disease is arthritis or rheumatoid arthritis. 疼痛性疾患治療薬である、請求項２に記載の消炎鎮痛剤。 The anti-inflammatory analgesic according to claim 2, which is a therapeutic agent for painful diseases. 疼痛性疾患が月経痛である、請求項６に記載の消炎鎮痛剤。 The anti-inflammatory analgesic according to claim 6, wherein the painful disease is menstrual pain. α-ラクトアルブミンを有効成分とする、消炎鎮痛用飲食品。 An anti-inflammatory analgesic food or drink comprising α-lactalbumin as an active ingredient. α-ラクトアルブミンの治療的有効量を哺乳動物に投与する、炎症性疾患の治療方法。 A method for treating inflammatory diseases, wherein a therapeutically effective amount of α-lactalbumin is administered to a mammal. α-ラクトアルブミンの治療的有効量を哺乳動物に投与する、疼痛性疾患の治療方法。 A method for treating painful diseases, comprising administering a therapeutically effective amount of α-lactalbumin to a mammal.
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