JP2013233111A - Method of culturing laver by adding microbe promoting growth of laver - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ノリを養殖する技術に関わる。より具体的には、本発明は、制御された条件下でノリを培養する方法に関わる。 The present invention relates to a technique for cultivating laver. More specifically, the present invention relates to a method for cultivating laver under controlled conditions.
ノリは最もよく食用にされる海藻類の一つである。ノリのライフサイクルは複雑であり、大きく分けると、受精によって生じ２組の染色体を有する複相世代（２ｎ）と、減数***によって生じ１組の染色体を有する単相世代（１ｎ）とに分けられる。各世代はさらに、形状や大きさが異なる複数のステージを含んでおり、一般に食用に付されるのは単相世代のうち葉状体と呼ばれるステージである。葉状体において、雌雄生殖細胞にそれぞれ相当する造果器細胞および精細胞が形成され、これらが受精して複相世代に入り、接合胞子、糸状体、殻胞子と呼ばれる各ステージを経た後に、殻胞子発芽体と呼ばれるステージにおいて減数***が起こって再び単相世代に入り、単相の細胞から葉状体が生長する。以上で述べた１サイクルが完結するのにおおよそ１年かかる。 Nori is one of the most edible seaweeds. The life cycle of laver is complex and can be broadly divided into a multiphase generation (2n), which is caused by fertilization and having two sets of chromosomes, and a single phase generation (1n), which is caused by meiosis and has one set of chromosomes. . Each generation further includes a plurality of stages having different shapes and sizes, and what is generally edible is a stage called a leaf-like body in the single-phase generation. In the frond, fruit organ cells and sperm cells corresponding to male and female germ cells are formed, fertilized into the multiphase generation, and after passing through stages called zygospores, filaments, and shell spores, Meiosis occurs at a stage called a spore germination, then enters the single-phase generation again, and the fronds grow from the single-phase cells. It takes approximately one year to complete one cycle as described above.
ノリを産業的に養殖することは従来から行われてきたが、糸状体を人為的に植えつけて上記のライフサイクルを養殖場において再現するという域を出るものではなかった。従って、従来のノリ養殖には例えば以下のような制限があった。
・葉状体を得るまでに数か月という長い時間がかかり、次のサイクルを開始できるまで１年ほどかかる。
・有用な品種を得るための掛け合わせは可能であるが、受精およびさらなる減数***を介するため、世代間の遺伝学的均一性（ひいては品質の均一性）を確保できない。
・殻胞子の放出という自然現象に依存するため、生産量に限りがある。
・糸状体から殻胞子を得るまでの作業は相当の時間と技術が必要である。
Traditionally cultivating laver has been done in the past, but it did not leave the area of artificially planting filamentous bodies and reproducing the above life cycle in the farm. Therefore, conventional laver culture has the following limitations, for example.
・ It takes a long time of several months to obtain fronds, and it takes about one year to start the next cycle.
・ Multiplication to obtain useful varieties is possible, but due to fertilization and further meiosis, genetic homogeneity between generations (and hence quality uniformity) cannot be ensured.
・ Production is limited because it depends on the natural phenomenon of shell spore release.
・ It takes considerable time and skill to obtain shell spores from filaments.
ライフサイクルの全てのステージを経由することなく、特に複相世代を経由することなく、葉状体から直接新たな葉状体を産生することができれば、養殖期間を短縮でき、望ましい品種の遺伝学的均一性も保たれる。そこで、本発明者らはプロトプラストに着目した。 If new fronds can be produced directly from the fronds without going through all stages of the life cycle, especially without going through the multiphase generation, the cultivation period can be shortened and the genetic uniformity of the desired variety Sex is also maintained. Therefore, the present inventors paid attention to protoplasts.
プロトプラストとは、一般に、細胞壁を人為的に除去した細胞を意味する。ノリの葉状体組織から調製されたプロトプラストは、葉状体を再生する能力を有する場合もあることが知られている。単一のプロトプラストを成長させて得られる葉状体は、元のプロトプラストと同一の１組の染色体を有している。同様に、単一の葉状体から得られる個々のプロトプラストは、全て同一の１組の染色体を有しており、いわゆるクローンの関係にある遺伝学的に均一な個体を多数産生することができる。この場合、１つの葉状体からいくつの新たな葉状体を産生できるかは、葉状体組織からいくつのプロトプラストを分離して培養するかという人為的作業に依存しており、殻胞子の自然放出に依存する場合のような量的制約がない。また、単相・単細胞の組合せを体現しているプロトプラストは突然変異誘導や有用形質の同定・選別にも適している。その上、異なるプロトプラスト同士を細胞融合して新たな個体を産生することができることも知られている。従って、所望の形質を人為的に作製または選別し維持するという側面において、プロトプラストを介する技術は非常に大きな魅力と可能性を有する。 Protoplast generally means a cell from which a cell wall has been artificially removed. It is known that protoplasts prepared from laver frond tissue may have the ability to regenerate fronds. A frond obtained by growing a single protoplast has a set of chromosomes identical to the original protoplast. Similarly, individual protoplasts obtained from a single frond body all have the same set of chromosomes, and can produce a large number of genetically uniform individuals in a so-called clonal relationship. In this case, the number of new fronds that can be produced from one frond depends on the artificial work of how many protoplasts are separated and cultured from the frond tissue. There are no quantitative restrictions as in the case of dependence. Protoplasts that embody a single-phase / single-cell combination are also suitable for mutation induction and identification / selection of useful traits. In addition, it is also known that new individuals can be produced by cell fusion of different protoplasts. Therefore, in terms of artificially creating or selecting and maintaining a desired trait, the technology through protoplasts has great appeal and potential.
無菌状態でノリを培養すると、細胞***しなかったり、異常な細胞***をしたり、カルスを形成したりして、正常な形態形成や生長が進みにくくなることが知られている。これは、無菌化に使用される抗生物質がノリに直接悪影響を与えているという可能性に加え、海水中に生息する細菌類との共生関係がノリの正常な生育にとって重要である可能性も示唆している。従って、従来のノリの培養は雑多な細菌を含んだ天然の海水の使用に依存する部分が大きかった。しかしながら一言で海水と言っても含有微生物が大きく変動することがあり得る。例えば、無作為に採取した海水サンプルには、ノリの生育に必要な細菌が含まれていなかったり、あるいはノリにとってむしろ有害な細菌が含まれていたりする可能性がある。従って、天然海水の使用はノリの培養系に不確定要素をもたらし、安定した生育条件の理解および確保に支障をきたし得る。 It is known that when a paste is cultured under aseptic conditions, normal morphogenesis and growth are difficult to proceed due to cell division, abnormal cell division, and callus formation. In addition to the possibility that antibiotics used for sterilization have a direct adverse effect on laver, the symbiotic relationship with bacteria inhabiting seawater may be important for the normal growth of laver. Suggests. Therefore, conventional laver cultures depend largely on the use of natural seawater containing various bacteria. However, even if it is seawater in a word, the contained microorganisms may fluctuate greatly. For example, a randomly collected seawater sample may not contain bacteria necessary for laver growth, or may contain bacteria that are rather harmful to laver. Therefore, the use of natural seawater brings uncertainty to the laver culture system and may hinder understanding and ensuring stable growth conditions.
従って、ノリの正常な生育を助ける特定の微生物種を同定し、いったん無菌状態にしたノリにその特定の微生物を添加することによってノリの育成を行うことができれば、安定性や再現性に優れた培養系が得られ、さらなる好適培養条件の理解や開発も促進されるため、非常に望ましい。また、無菌化と特定細菌添加とを組み合わせたそのような培養系をプロトプラストに適用できれば、培養条件的要素と遺伝学的要素の双方がコントロールされることになり、一層望ましい。また、天然海水への依存がなくなれば、衛生面の管理も容易になり、海から離れた工場や農場において産業的にノリを製造できる可能性も生まれる。 Therefore, if a specific microorganism species that helps normal growth of the paste is identified, and the paste is cultivated by adding the specific microorganism to the paste once sterilized, the stability and reproducibility are excellent. This is highly desirable because a culture system can be obtained, and further understanding and development of suitable culture conditions can be facilitated. In addition, if such a culture system combining sterilization and addition of specific bacteria can be applied to protoplasts, both culture condition elements and genetic elements are controlled, which is more desirable. In addition, if the reliance on natural seawater is eliminated, hygiene management becomes easier, and there is a possibility that laver can be manufactured industrially at factories and farms away from the sea.
嵯峨らは、スサビノリの無菌の糸状体（２ｎ）から得られた殻胞子の形態形成と成長を促進する細菌の分離・同定を記述している（非特許文献１、２）。これらの細菌は分類学的にはプロトバクテリア綱アルファ亜綱に属する新種であった（非特許文献３）。いわゆるノリ以外の海藻については、無菌化処理したアオサ目の緑藻の形態形成と成長を助ける、Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroidesグループの細菌を分離・同定した松尾らの研究があり（特許文献１）、当該細菌において前記促進効果を担う特定の化合物を同定したことも報告されている（非特許文献４）。なお、これらの文献では、抗生物質の添加をもって無菌化とみなしているが、一般的に個々の抗生物質は必ずしもすべての細菌を抑制するわけではないことはよく知られており、これらの実験が厳密にどれほどの無菌化を達成しているかは不明である。 Have described the isolation and identification of bacteria that promote morphogenesis and growth of shell spores obtained from sterile filamentous bodies (2n) of Susabiori (Non-patent Documents 1 and 2). These bacteria were taxonomically new species belonging to the protobacterium class Alpha subclass (Non-patent Document 3). As for seaweeds other than so-called Nori, there is a study by Matsuo et al. Who isolated and identified bacteria of the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides group, which helps morphogenesis and growth of sterilized blue-green algae (Patent Document 1). It has also been reported that a specific compound responsible for the promoting effect in bacteria has been identified (Non-patent Document 4). In these documents, addition of antibiotics is regarded as sterilization, but it is well known that individual antibiotics generally do not necessarily suppress all bacteria. Exactly how much sterilization is achieved is unknown.
海藻由来プロトプラストの作製および培養においては、そもそも無菌化を達成することに重点をおいてなされた研究がほとんどなく（非特許文献５）、ましてやプロトプラスト培養にとって有用な細菌があるかどうかは全く知られていない。またプロトプラストを無菌状態で培養したと言う記述があったとしても無菌性が厳密に検証されていないことが多いために培養における細菌の貢献度は不明であった。上述したように、ノリのプロトプラストの培養をよく管理された条件下で行うことは品質管理や生産性の点で非常に有利であると考えられ、プロトプラストの厳密な無菌化を行う方法や、プロトプラストの葉状体への再生を促進する細菌を同定し培養に利用することには大きな産業的価値がある。 In the production and culturing of seaweed-derived protoplasts, there has been almost no research focused on achieving sterilization in the first place (Non-Patent Document 5), and it is quite known whether there are any bacteria useful for protoplast culture. Not. Moreover, even if there was a description that the protoplast was cultured in a sterile state, the sterility was often not strictly verified, so the contribution of bacteria in the culture was unknown. As described above, it is considered that culturing Nori protoplasts under well-controlled conditions is very advantageous in terms of quality control and productivity, and there is a method for strict sterilization of protoplasts and protoplasts. It is of great industrial value to identify and utilize bacteria that promote regeneration into frond bodies.
本発明の目的は、厳密な無菌性を達成したノリのプロトプラストの作製法を確立すること、無菌プロトプラストの発育を促進する特定の細菌を単離・同定すること、前記細菌を用いて無菌プロトプラストからノリ葉状体を育成する方法を提供すること、を含む。 The object of the present invention is to establish a method for producing paste protoplasts that have achieved strict sterility, to isolate and identify specific bacteria that promote the development of sterile protoplasts, Providing a method of growing a laver frond.
発明者らはまず、酸処理と酵素処理の組合せにより無菌のプロトプラストを分離する方法を確立した。発明者らはさらに、ノリ葉状体の表面や培養液中などから採集された多様な細菌を分離し、それぞれの細菌を無菌プロトプラスの培養に添加してスクリーニングを行うことにより、葉状体形成を促進する特定の細菌を同定した。以上の結果により、プロトプラストを管理された条件下で培養して葉状体を得るという、ノリの新たな養殖法が提供される。 The inventors first established a method for separating sterile protoplasts by a combination of acid treatment and enzyme treatment. The inventors further isolated the various bacteria collected from the surface of the laver frond, the culture medium, etc., and added each bacterium to a sterile protoplast culture to perform screening, thereby forming the frond. The specific bacteria that promoted were identified. The above results provide a new cultivation method for laver, in which protoplasts are cultured under controlled conditions to obtain fronds.
従って、本発明は以下の項目を含む。
（１）ノリの葉状体由来プロトプラストを培養して新たな葉状体を産生する培養方法であって、前記プロトプラストに培地を添加し、さらにＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を添加して培養を行うことを特徴とする方法。
（２）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属である、１に記載の方法。
（３）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の細菌が、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、ＬＮＭ１０−１６株からなる群から選択される１種以上である、２に記載の方法。
（４）Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌がＡｌｇｉｍｏｎａｓ属である、１に記載の方法。
（５）Ａｌｇｉｍｏｎａｓ属の細菌が、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、１４Ａ−２−４株からなる群から選択される１種以上である、４に記載の方法。
（６）ノリがスサビノリである、１〜５のいずれかに記載の方法。
（７）培地が無菌培地である、１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）プロトプラストが、無菌プロトプラストである、１〜７のいずれかに記載の方法。
（９）ノリの葉状体由来プロトプラストからの葉状体の発育を促進するＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌である、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、およびＬＮＭ１０−１６株。
（１０）ノリの葉状体由来プロトプラストからの葉状体の発育を促進するＡｌｇｉｍｏｎａｓ属の細菌である、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、および１４Ａ−２−４株。
（１１）以下の工程を含む、ノリ無菌プロトプラストの調製方法：
ａ．ノリの葉状体をクエン酸含有液で洗浄する工程
ｂ．葉状体をプロテアーゼ溶液で処理する工程
ｃ．葉状体をマンニトール含有液で洗浄する工程
ｄ．葉状体を細胞壁溶解酵素溶液で処理する工程
ｅ．細胞壁溶解により生じたプロトプラストを濾過する工程
ｆ．プロトプラストを遠心分離する工程
ｇ．プロトプラストをマンニトール含有液で洗浄する工程
（１２）プロテアーゼがパパインである、１１に記載の方法。
（１３）細胞壁溶解酵素が、アガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼの混合物である、１１または１２に記載の方法。
（１４）ノリがスサビノリである、１１〜１３のいずれかに記載の方法。
（１５）無菌プロトプラストが、前記１１〜１４のいずれかの方法により調製された無菌プロトプラストである、８に記載の方法。
（１６）以下の工程を含む、ノリ葉状体由来無菌プロトプラストから葉状体への発育を促進する細菌をスクリーニングする方法：
ａ．複数の培養容器において、前記プロトプラストと、スクリーニングの対象となる個々の細菌株とを分注して、共培養する工程
ｂ．葉状体形成が生じた培養容器を特定し、その容器に適用した細菌株を特定する工程
（１７）スクリーニングの対象となる細菌株が、ノリ葉状体培養液またはノリ葉状体試料由来のものを含む、１６に記載の方法。
（１８）スクリーニングの対象となる細菌株が、抗生物質処理されたノリ葉状体由来のものを含む、１７に記載の方法。
（１９）ノリがスサビノリである、１６〜１８のいずれかに記載の方法。
（２０）無菌プロトプラストが、１１〜１４のいずれかの方法により調製された無菌プロトプラストである、１６〜１９のいずれかに記載の方法。
Accordingly, the present invention includes the following items.
(1) A culture method for cultivating protoplasts derived from laver's fronds to produce new fronds, characterized in that a medium is added to the protoplasts and further cultured by adding bacteria from the family Hyphomonas. how to.
(2) The method according to 1, wherein the bacterium of the family Hyphomonas belongs to the genus Hyphomonas.
(3) Bacteria belonging to the genus Hyphomonas are SCM-2 strain, SNM-14 strain, LNM-9 strain, LNM-21 strain, LNM-24 strain, SNM10-3 strain, SNM10-6 strain, SNM10-12 strain, SNM10 3. The method according to 2, which is at least one selected from the group consisting of -13 strain, SNM10-16 strain, SNM10-19 strain, LNM10-4 strain, and LNM10-16 strain.
(4) The method according to 1, wherein the bacterium of the family Hyphomonas is Algimonas genus.
(5) The method according to 4, wherein the bacterium belonging to the genus Algimonas is one or more selected from the group consisting of 14A-8 strain, 14A-2-1 strain, and 14A-2-4 strain.
(6) The method according to any one of 1 to 5, wherein the paste is Susabiori.
(7) The method according to any one of 1 to 6, wherein the medium is a sterile medium.
(8) The method according to any one of 1 to 7, wherein the protoplast is a sterile protoplast.
(9) Hyphomonas genus bacteria that promote the development of leafy bodies from protoplasts derived from laver leafy bodies, SCM-2 strain, SNM-14 strain, LNM-9 strain, LNM-21 strain, LNM-24 strain, SNM10 -3, SNM10-6, SNM10-12, SNM10-13, SNM10-16, SNM10-19, LNM10-4, and LNM10-16.
(10) The 14A-8 strain, the 14A-2-1 strain, and the 14A-2-4 strain, which are bacteria of the genus Algimonas that promote the development of the leaf-like body from the protoplast derived from the leafy body of the laver.
(11) A method for preparing a paste aseptic protoplast comprising the following steps:
a. Washing laver leaves with citric acid containing solution b. Treating the frond with a protease solution c. Washing the frond with a mannitol-containing solution d. Treating the frond with a cell wall lytic enzyme solution e. Filtering the protoplasts produced by cell wall lysis f. Centrifuging the protoplasts g. The step of washing protoplasts with a mannitol-containing solution (12) The method according to 11, wherein the protease is papain.
(13) The method according to 11 or 12, wherein the cell wall lytic enzyme is a mixture of agarase, xylanase, and mannanase.
(14) The method according to any one of 11 to 13, wherein the glue is Susavinori.
(15) The method according to 8, wherein the sterile protoplast is a sterile protoplast prepared by any one of the methods 11 to 14.
(16) A method for screening a bacterium that promotes development from a paste-like protoplast-derived sterile protoplast to a frond, comprising the following steps:
a. Dispensing and co-culturing the protoplasts and individual bacterial strains to be screened in a plurality of culture vessels b. A step of identifying a culture vessel in which frond formation has occurred and identifying a bacterial strain applied to the vessel. (17) The bacterial strain to be screened includes one derived from a laver leaf culture medium or a laver leaf sample. 16. The method according to 16.
(18) The method according to 17, wherein the bacterial strain to be screened comprises a strain derived from a laver leaflet treated with an antibiotic.
(19) The method according to any one of 16 to 18, wherein the paste is Susavinori.
(20) The method according to any one of 16 to 19, wherein the sterile protoplast is a sterile protoplast prepared by any one of 11 to 14.
本発明により、管理された安定な条件下で、複相世代を経ることなく遺伝学的な均一性を維持したまま、単相の葉状体から直接新たな葉状体を効率よく迅速に産生することが可能となる。 The present invention enables efficient and rapid production of new fronds directly from single-phase fronds under controlled and stable conditions while maintaining genetic homogeneity without going through multiphase generation. Is possible.
本発明はあらゆるノリの種類に適用し得るが、用いられるノリの種類としてはアマノリ類、特にスサビノリが好ましい。 The present invention can be applied to any kind of laver, but the laver used is preferably Amanori, especially Susavinori.
本発明の一つの態様においては、ノリ葉状体から無菌プロトプラストを調製する方法が提供される（図１）。従来は、無菌ノリは糸状体等から出発して調製されることが普通であったが、それに対して無菌ノリをプロトプラストという形で得ることの利点としては、単相（１ｎ）であること、商品価値のある葉状体を直接の調製源とすること、簡便な操作で大量に得られること、成長促進細菌のスクリーニングが効率よく行えること、等が挙げられる。 In one embodiment of the present invention, a method is provided for preparing sterile protoplasts from laver fronds (FIG. 1). Conventionally, aseptic paste was usually prepared starting from filaments and the like, the advantage of obtaining sterile paste in the form of protoplasts is that it is a single phase (1n), For example, it is possible to use commercially available fronds as a direct preparation source, to obtain a large amount by a simple operation, and to efficiently screen for growth-promoting bacteria.
本発明の無菌プロトプラスト調製法は、酸性液による洗浄と酵素処理を組み合わせたものであり、抗生物質の使用を必要としないが、抗生物質添加の可能性を排除するものではない。具体的には、まずノリ葉状体をクエン酸含有液（ｐＨ２．０〜２．３が好ましい）、例えばクエン酸含有海水で洗浄し、続いて滅菌液、例えば滅菌海水で洗浄する。なお、以下の無菌化操作において使用する全ての液はフィルター滅菌等で滅菌されたものであることが望ましいことは言うまでもない。クエン酸の濃度は当業者が適正な範囲を決定することができるが、例えば０．１〜５％（ｗ／ｖ）、特に０．５％が好ましい。図２はクエン酸処理の効果を示している。クエン酸含有液で洗浄することにより、葉状体の段階から大部分の細菌を除去することができ、プロトプラストの段階における無菌性をより確実にできることがわかる。洗浄した後の葉状体は、後の処理がしやすいように細断することが好ましい。 The aseptic protoplast preparation method of the present invention combines washing with an acidic solution and enzyme treatment, and does not require the use of antibiotics, but does not exclude the possibility of adding antibiotics. Specifically, the laver leaf is first washed with a citric acid-containing liquid (preferably pH 2.0 to 2.3), for example, citric acid-containing seawater, and then washed with a sterilizing liquid, for example, sterile seawater. Needless to say, all liquids used in the following sterilization operations are preferably sterilized by filter sterilization or the like. A person skilled in the art can determine an appropriate range for the concentration of citric acid, but it is preferably 0.1 to 5% (w / v), particularly 0.5%. FIG. 2 shows the effect of citric acid treatment. It can be seen that by washing with a citric acid-containing solution, most of the bacteria can be removed from the frond stage, and sterility at the protoplast stage can be more reliably ensured. It is preferable that the washed leaf-like body is shredded so that it can be easily processed later.
続いて葉状体をプロテアーゼで処理する。プロテアーゼの種類としてはパパインが特に好ましいが、同様の活性を有する他の酵素でも代用し得る。複数のプロテアーゼを組み合わせて使用してもよい。プロテアーゼは通常、溶液として使用され、濃度は例えば０．１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特に２％が好ましい。続いてマンニトール含有液、例えばマンニトール含有海水で少なくとも１度洗浄する。マンニトール（他の糖や浸透圧調製剤で代用し得る）の濃度は例えば０．１〜２Ｍの範囲であり、特に０．７Ｍが好ましい。次に細胞壁溶解酵素で葉状体を処理する。細胞壁を溶解できる酵素は当業者にはよく知られており、例としてはアガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ等が挙げられ、これらを複数組み合わせて使用することが好ましい。酵素の適切な濃度や処理時間は当業者が適宜決定できる。好ましい態様では、酵素処理液８ｍｌあたりアガラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼを各０．１〜１０ユニット（より好ましくは８ｍｌあたり各酵素１ユニット）含ませ、６０〜９０分間葉状体サンプルに含浸させる。細胞壁の溶解に伴って葉状体組織はバラバラになり単細胞のプロトプラストが得られる。次にメッシュ（例えば２０μｍ）等で濾過して組織片その他の混在物を除去する。濾液を遠心分離処理してプロトプラストを沈殿させ、上記と同様のマンニトール含有海水またはその代替液で洗浄するという操作を、少なくとも１度行い、好ましくはこの遠心と洗浄の操作を数回繰り返し、プロトプラスト分離が完了する。遠心分離の条件は例えば５００〜５０００ｒｐｍで１分〜１時間とすることができ、１０００ｒｐｍ、５分が好ましいが、これらの数値は当業者が適宜変更できる。本発明の無菌プロトプラスト調製法の好ましい一態様を図１に示す。以上の作業は１日以内で完了できるものであり、例えば糸状体から殻胞子を得る作業と比べるとはるかに迅速であることは言うまでもない。 Subsequently, the frond is treated with protease. Papain is particularly preferred as the type of protease, but other enzymes having similar activities can be substituted. A plurality of proteases may be used in combination. Protease is usually used as a solution, and its concentration is, for example, 0.1 to 10% (w / v), and 2% is particularly preferable. Subsequently, it is washed at least once with a mannitol-containing liquid, for example, mannitol-containing seawater. The concentration of mannitol (which can be substituted with other sugars or osmotic pressure adjusting agents) is, for example, in the range of 0.1 to 2M, and particularly preferably 0.7M. The frond is then treated with cell wall lytic enzyme. Enzymes capable of lysing cell walls are well known to those skilled in the art, and examples include agarase, xylanase, mannanase and the like, and it is preferable to use a combination of these. Appropriate concentrations and treatment times for the enzyme can be appropriately determined by those skilled in the art. In a preferred embodiment, 0.1 to 10 units of agarase, xylanase, and mannanase are included per 8 ml of the enzyme treatment solution (more preferably, 1 unit of each enzyme per 8 ml), and the leaf sample is impregnated for 60 to 90 minutes. As the cell wall lyses, the frond tissue becomes disjoint and single cell protoplasts are obtained. Next, it filters with a mesh (for example, 20 micrometers) etc., and removes a tissue piece and other contaminants. The filtrate is centrifuged to precipitate protoplasts and washed with mannitol-containing seawater similar to the above or an alternative solution at least once. Preferably, the centrifugation and washing operations are repeated several times to separate the protoplasts. Is completed. Centrifugation conditions can be, for example, 500 to 5000 rpm for 1 minute to 1 hour, and 1000 rpm and 5 minutes are preferable, but those values can be appropriately changed by those skilled in the art. A preferred embodiment of the method for preparing sterile protoplasts of the present invention is shown in FIG. The above operation can be completed within one day, and it is needless to say that it is much quicker than, for example, an operation for obtaining shell spores from a filamentous body.
無菌化操作の各段階において無菌化がどの程度達成されているかを調べるためには、適切な固形培地（例えばＺｏＢｅｌｌ２２１６Ｅ培地）上に懸濁液を塗布してインキュベートし、形成する細菌コロニーの数を計測することが好ましい。当業者に知られる他の方法で細菌を検出あるいは測定してもよい。最終的に達成されるプロトプラストの無菌化の程度は、試料１ｇあたりのＣＦＵ（コロニー形成単位）が１×１０2以下であることが好ましく、１×１０1以下であることがさらに好ましく、計数限界以下であることが最も好ましい。本明細書では、１ｇあたりのＣＦＵが１×１０2以下であるものを無菌プロトプラストと呼ぶ。 To determine how much sterilization is achieved at each stage of the sterilization operation, the suspension is spread on an appropriate solid medium (eg, ZoBell 2216E medium) and incubated to determine the number of bacterial colonies that form. It is preferable to measure. Bacteria may be detected or measured by other methods known to those skilled in the art. The degree of sterilization of the protoplast that is finally achieved is preferably 1 × 10 2 or less, more preferably 1 × 10 1 or less, and more preferably a count limit per 1 g of CFU (colony forming unit). Most preferably: In the present specification, one having a CFU of 1 × 10 2 or less per 1 g is called as sterile protoplast.
本発明の別の態様においては、無菌プロトプラストの葉状体への成長を促進する細菌のスクリーニング方法が提供される。ここで用いられる無菌プロトプラストは、公知または非公知のいかなる調製法を用いて調製したものでもよいが、抗生物質はノリの生育に悪影響を及ぼし得ること、スクリーニング対象である細菌にも作用し得ること、一般に抗生物質の殺菌作用は完全ではなく場合によっては抗生物質の投与が特定の細菌群の繁殖を助長してしまうこと、を考慮すると、抗生物質に依存しない調製法が望ましい。特に、本発明の前記態様にかかる調製法による無菌プロトプラストを用いることが好ましい。 In another aspect of the present invention, a method for screening bacteria that promote growth into sterile protoplast fronds is provided. Sterile protoplasts used here may be prepared using any known or non-known preparation method, but antibiotics can adversely affect the growth of laver and can also affect the bacteria to be screened. In view of the fact that the bactericidal action of antibiotics is generally not complete and in some cases administration of antibiotics promotes the growth of specific bacterial populations, preparation methods that do not depend on antibiotics are desirable. In particular, it is preferable to use aseptic protoplasts by the preparation method according to the above aspect of the present invention.
スクリーニングの対象となる細菌群としては、真の共生菌を同定するという観点からはノリ葉状体由来のものが望ましい。例えば、ノリの培養に使用した培養液（馴化培養液）、葉状体の表面、細胞壁試料、プロトプラスト試料等から細菌を採集することができる。しかしながら、本発明にかかるスクリーニング法は原理的にはいかなる採集源から得た細菌に対しても適用し得る。採集した細菌群から個々の細菌を単離する方法は当業者によく知られており、例えば固形培地プレートに細菌群含有液を播いてコロニーを単離することができる。 From the viewpoint of identifying a true symbiotic bacterium, a group derived from a laver leaf is desirable as a bacterial group to be screened. For example, bacteria can be collected from a culture solution (conditioned culture solution) used for laver culture, the surface of a frond, a cell wall sample, a protoplast sample, or the like. However, the screening method according to the present invention can in principle be applied to bacteria obtained from any collection source. Methods for isolating individual bacteria from collected bacterial groups are well known to those skilled in the art. For example, colonies can be isolated by seeding a solid medium plate with a bacterial group-containing solution.
抗生物質の添加は試料中の菌相（すなわち、どのような細菌の種類がどれほどの割合で存在しているか）を変化させ得るので、スクリーニングのための菌の採集に際してあえて抗生物質を用いることも、より多様な菌コレクションを構築する上で有効である（図３）。その一方で、無菌化を達成するための手段としては抗生物質の添加は十分ではないこともわかる。例えば表１で示す実験例では、抗生物質の添加によって、むしろコントロールよりも細菌数が増えることもあり、プロトプラストにした段階における無菌性の程度もむしろ低下し得ることがわかる。 The addition of antibiotics can change the microflora in the sample (ie what kind of bacteria are present in what proportion), so it is possible to use antibiotics when collecting bacteria for screening. This is effective in constructing a more diverse collection of bacteria (FIG. 3). On the other hand, it can also be seen that the addition of antibiotics is not sufficient as a means to achieve sterilization. For example, in the experimental example shown in Table 1, it can be seen that the addition of antibiotics may increase the number of bacteria rather than the control, and the degree of sterility at the stage of protoplast can be reduced.
スクリーニングは以下の手順で行われる。まず、複数の培養容器の各々に、無菌プロトプラスト、スクリーニングの対象となる細菌、および適切な培地を分注する。一般的に細胞培養に利用されるシャーレやウェルプレートがこの用途に適している。以下、ウェルプレートを使用する場合を例にして説明する。スクリーニングに使用されるプロトプラストの個数（細胞数）は、１ウェルあたり１個が最低限必要であり、上限は特に限定されずウェルの大きさにもよるが、比較を公正にするためにはウェル間で個数のばらつきが少ないようにすることが望ましい。例えば１ウェルあたり１〜１０6のプロトプラストを入れることができる。２４ウェルプレートの場合ならば１ウェルあたり約１０2個のプロトプラストを入れることが特に好ましい。無菌プロトプラストと細菌と培地とを混合してからウェルに入れてもよいし、これらを別々にいずれかの順番でウェルに入れてもよい。なお、本明細書において、「プロトプラストに培地を添加し、さらに細菌を添加する」と言う場合、その意味するところは、プロトプラストと培地と細菌とをいずれか任意の順序で混合した場合およびこれらを同時に混合した場合の両方を含むものとする。つまり、前記表現は添加の順序を限定するものではない。ただし、「細菌をさらに添加する」という表現は、培地およびプロトプラストとは別個に細菌を添加することを意味するものとする。すなわち、もし培地自体（またはプロトプラスト自体）に初めから何らかの細菌が含まれていたとしても、本発明にかかる細菌を外部から「さらに」添加することを意味する。 Screening is performed according to the following procedure. First, aseptic protoplasts, bacteria to be screened, and an appropriate medium are dispensed into each of a plurality of culture containers. Petri dishes and well plates generally used for cell culture are suitable for this application. Hereinafter, a case where a well plate is used will be described as an example. The number of protoplasts (number of cells) used for screening must be at least one per well, and the upper limit is not particularly limited, but it depends on the size of the well. It is desirable to reduce the number variation between them. For example, 1 to 10 6 protoplasts can be added per well. In the case of a 24-well plate, it is particularly preferable to add about 10 2 protoplasts per well. Sterile protoplasts, bacteria, and medium may be mixed and then placed in the wells, or they may be separately placed in the wells in any order. In addition, in this specification, when saying "adding a medium to a protoplast and further adding a bacterium", the meaning is that the protoplast, the medium and the bacterium are mixed in any order and these are added. It shall include both when mixed at the same time. That is, the expression does not limit the order of addition. However, the expression “add more bacteria” shall mean adding bacteria separately from the medium and protoplasts. That is, even if some kind of bacteria is contained in the medium (or protoplast itself) from the beginning, it means that the bacteria according to the present invention are added “from the outside”.
培養液の容量は、例えば２４ウェルプレートならば１ウェルあたり１ｍｌ〜１．５ｍｌが適切である。細菌液の濃度は例えば１０1〜１０9ＣＦＵ／ｍｌの範囲で適宜選択でき、１ウェルあたり約１０5〜１０6ＣＦＵが好ましく、培地１ｍｌにつきこの細菌液を例えば１μｌ〜１ｍｌ加えることができる。比較を公正にするためにはウェル間でＣＦＵのばらつきが少ないようにすることが望ましい。１ウェルにつき１種の細菌を入れるのが通常であるが、スクリーニングの効率を上げる目的や、細菌同士の相乗効果を試験する目的で、１ウェルに複数の細菌種を入れる態様も考えられる。 For example, in the case of a 24-well plate, the volume of the culture solution is suitably 1 ml to 1.5 ml per well. The concentration of the bacterial liquid can be appropriately selected within a range of, for example, 10 1 to 10 9 CFU / ml, and is preferably about 10 5 to 10 6 CFU per well. For example, 1 μl to 1 ml of the bacterial liquid can be added per 1 ml of the medium. In order to make the comparison fair, it is desirable to reduce the variation of CFU between wells. Usually, one type of bacteria is added per well. However, for the purpose of increasing the efficiency of screening and the purpose of testing the synergistic effect between bacteria, a mode in which a plurality of bacterial species are added to one well is also conceivable.
無菌プロトプラストと細菌との混合物を、適切な培地（培養液）の存在下でウェルの中で培養する。培養に際しては明暗サイクルを設けることが好ましく、例えば１２時間明／１２時間暗、あるいは１０時間明／１４時間暗といったサイクルを採用できる。培地（培養液）としては例えばＮＰ培地（滅菌海水にＮａＮＯ3（１００ｍｇ／ｌ）およびＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ（２０ｍｇ／ｌ）を加えたもの）が好ましいが、ノリの培養に使用される他の培地でもよい。他の好ましい培地の例としては滅菌海水をベースとした１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地（ＳＷＭ−ＩＩＩ培地（Ogata, E. (1970) Bull Jpn Soc Phycol 18, 171-173）からsoil extract、liver extract、tris、ビタミンを除き滅菌海水で１０倍希釈したもの）、ｆ／１０培地（ｆ培地（Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. (1962) Can. J. Microbiol., 8, 229-239）を滅菌海水で１０倍希釈したもの。Sigmaから購入したｆ／２培地から調製）、１／５ＮＰ培地等が挙げられる。これらの培地は液体として使用してもよいし寒天等を加えた固形培地として使用してもよい。まず固体培地で培養して途中から液体培地に移植してもよい。培地の組成や温度にもよるであろうが、例えば上記培地中で１７℃で培養した場合は、６週間程度で顕微鏡下で葉状体形成細胞が他の種類の細胞（未分化細胞、不定形***細胞、カルス）から区別できるようになる。ここで、「葉状体形成細胞」は、細胞壁を形成した後、１本の仮根および正常な細胞***が観察される細胞として定義した。「未分化細胞」は、細胞壁は形成するがそれ以上の形態形成は示さない細胞として定義した。「不定形***細胞」は、葉状体への形態形成過程で奇形化した細胞として定義し、「カルス」は未分化の細胞が凝集し細胞塊を形成したものと定義した。葉状体形成が見られたウェルに添加していた細菌が、「無菌プロトプラストの葉状体への発育を促進する細菌」であり、当該スクリーニングが探求していた目的物と言える。 A mixture of sterile protoplasts and bacteria is cultured in the wells in the presence of a suitable medium (culture medium). In culturing, it is preferable to provide a light / dark cycle. For example, a cycle of 12 hours light / 12 hours dark or 10 hours light / 14 hours dark can be employed. As the medium (culture solution), for example, NP medium (sterilized seawater added with NaNO 3 (100 mg / l) and Na 2 HPO 4 · 12H 2 O (20 mg / l)) is preferable, but it is used for cultivation of paste. Other media may be used. Examples of other preferred media include 1/10 SWM-III media based on sterile seawater (SWM-III media (Ogata, E. (1970) Bull Jpn Soc Phycol 18, 171-173) from soil extract, liver extract, Tris and vitamins removed 10-fold diluted with sterile seawater), f / 10 medium (f medium (Guillard, RRL, Ryther, JH (1962) Can. J. Microbiol., 8, 229-239) with sterile seawater 10-fold diluted, prepared from f / 2 medium purchased from Sigma), 1/5 NP medium, and the like. These media may be used as a liquid or a solid media to which agar or the like is added. First, it may be cultured in a solid medium and transplanted to a liquid medium in the middle. Although it depends on the composition and temperature of the medium, for example, when cultured at 17 ° C. in the above medium, the phyllode-forming cells become other types of cells (undifferentiated cells, amorphous cells) under a microscope in about 6 weeks. Can be distinguished from dividing cells, callus). Here, “foliate-forming cells” were defined as cells in which one temporary root and normal cell division were observed after forming a cell wall. “Undifferentiated cells” were defined as cells that formed cell walls but did not show further morphogenesis. “Amorphous dividing cells” were defined as cells that became malformed during the morphogenesis into the frond, and “callus” was defined as those in which undifferentiated cells aggregated to form a cell mass. Bacteria added to the wells in which frond formation was observed are “bacteria that promote the development of sterile protoplasts into fronds”, and can be said to be the objectives that the screening was exploring.
発明者らは、上記の無菌プロトプラスト調製法および細菌スクリーニング法を実施することにより、無菌プロトプラストの葉状体への発育を促進する細菌を同定した。すなわち、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌と共に無菌プロトプラストを培養すると、他の科の細菌と共培養した場合や細菌無添加で培養した場合よりも有意にプロトプラストの生残率および葉状体形成率が高いことを見出した（図４〜７）。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の複数の属および複数の種において発育促進効果が確認され、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科細菌全般がこの発育促進効果を有することが示された。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は公知であり、また実施例で示すように、ノリの葉状体由来の細菌（葉状体馴化培養液、葉状体表面等の採取源から採取されたもの）を無作為に分離すると、少なくとも数％（実施例では７％）の割合で当該分類に属する細菌が得られ、またこの数％のものはＰＣＲ等の手法で容易に識別することができる。そして、無作為に分離されたものでも当該分類に属する菌株ならば全て同様の効果を発揮することが示された（図６）。すなわち、本願発明の方法に有用なＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は公知であり、かつ当業者が容易に入手でき、試行錯誤を経ずとも実施できるものである。 The inventors of the present invention have identified bacteria that promote the development of sterile protoplasts into fronds by carrying out the above-described sterile protoplast preparation method and bacterial screening method. That is, it was found that when sterile protoplasts were cultured together with bacteria of the family Hyphomonas, the survival rate and foliar formation rate of protoplasts were significantly higher than when cultured with bacteria of other families or without addition of bacteria. (FIGS. 4-7). The growth promoting effect was confirmed in several genera and several species of the Hyphomonas family, and it was shown that all Hyphomonas bacteria have this growth promoting effect. Hyphomonas bacteria are known, and as shown in the examples, when bacteria isolated from leafy leaf bodies (collected from leaflet conditioned medium, leaf surface, etc.) are randomly isolated. Bacteria belonging to the classification are obtained at a rate of at least several percent (7% in the examples), and this few percent can be easily identified by a technique such as PCR. And even if it isolate | separated at random, if it was a strain which belongs to the said classification | category, it was shown that all the same effects are exhibited (FIG. 6). That is, Hyphomonas bacteria useful for the method of the present invention are known and can be easily obtained by those skilled in the art and can be implemented without trial and error.
従って、本発明のもう一つの態様においては、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を培地に添加することによりノリ葉状体由来のプロトプラストから直接新たな葉状体を培養する方法が提供される。ここで使用されるプロトプラストは、例えば上記の方法により得られた無菌プロトプラストであることが好ましい。しかしながら、無菌化していないプロトプラストに上記細菌を添加した場合でも、混在菌との相互作用で多少の効果程度の変化は起こり得るが、本質的に同様の葉状体形成促進効果が得られると考えられる。培地に関しても、無菌の培地（滅菌培地）、すなわち人為的に添加する上記の細菌以外の細菌は含まないものを使用することが原則であり、それが好ましい。人為的に細菌を加える前の培地の無菌の程度は、１ｍｌあたりのＣＦＵが１×１０2以下であることが好ましく、１×１０1以下であることがさらに好ましく、計数限界以下であることが最も好ましい。本明細書では、１ｍｌあたりのＣＦＵが１×１０2以下であるものを無菌培地または滅菌培地と呼ぶ。無菌でない培地（例えば天然海水）を用いる場合であっても、混在菌との相互作用で多少の効果程度の変化は起こり得るが、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌を人為的にさらに添加することにより本質的に同様の葉状体形成促進効果が得られると考えられる。 Therefore, in another aspect of the present invention, a method for directly culturing new fronds from protoplasts derived from Nori fronds is provided by adding Hyphomonas family bacteria to the medium. The protoplast used here is preferably a sterile protoplast obtained by, for example, the above method. However, even when the bacterium is added to protoplasts that have not been sterilized, a slight change in the degree of effect may occur due to the interaction with the mixed bacteria, but it is considered that essentially the same foliate formation promoting effect can be obtained. . As for the culture medium, as a rule, it is preferable to use a sterile culture medium (sterile culture medium), that is, a culture medium that does not contain bacteria other than the above-mentioned bacteria to be artificially added. The degree of sterility of the medium before artificially adding bacteria is preferably 1 × 10 2 or less, more preferably 1 × 10 1 or less, and less than the count limit. Most preferred. In the present specification, a medium having a CFU per ml of 1 × 10 2 or less is referred to as a sterile medium or a sterile medium. Even when a non-sterile medium (for example, natural seawater) is used, a slight change in the degree of effect may occur due to the interaction with the mixed bacteria. However, it is essentially possible to artificially add Hyphomonas family bacteria. It is considered that a similar foliate formation promoting effect can be obtained.
本発明に係るプロトプラストの培養法に使用できるＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科細菌としては、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属およびＡｌｇｉｍｏｎａｓ属が好ましい。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の例としては、ＳＣＭ−２株、ＳＮＭ−１４株、ＬＮＭ−９株、ＬＮＭ−２１株、ＬＮＭ−２４株、ＳＮＭ１０−３株、ＳＮＭ１０−６株、ＳＮＭ１０−１２株、ＳＮＭ１０−１３株、ＳＮＭ１０−１６株、ＳＮＭ１０−１９株、ＬＮＭ１０−４株、ＬＮＭ１０−１６株が挙げられる。ＬＮＭ１０−１６株は高い葉状体形成率を提供できるため特に好ましい。Ａｌｇｉｍｏｎａｓ属の例としては、１４Ａ−８株、１４Ａ−２−１株、１４Ａ２−４株が挙げられる。これらの他にも、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の他の任意の株、あるいは上記のスクリーニング法で同定される別の細菌をプロトプラスト培養に使用することもできる。 As the Hyphomonas family bacteria that can be used in the protoplast culture method according to the present invention, the genus Hyphomonas and the genus Algimonas are preferable. Examples of the genus Hyphomonas include SCM-2, SNM-14, LNM-9, LNM-21, LNM-24, SNM10-3, SNM10-6, SNM10-12, SNM10-13. Strain, SNM10-16 strain, SNM10-19 strain, LNM10-4 strain, and LNM10-16 strain. The LNM10-16 strain is particularly preferable because it can provide a high follicle formation rate. Examples of the genus Algimonas include 14A-8 strain, 14A-2-1 strain, and 14A2-4 strain. In addition to these, any other strain of the Hyphomonas family, or another bacterium identified by the screening method described above, can be used for protoplast culture.
培養条件としては、上記スクリーニングにおける培養と本質的に同じものをスケールアップして使用できる。例えば、プロトプラスト懸濁液１ｍｌ（１０4細胞）にＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ ＬＮＭ１０−１６株の懸濁液１ｍｌ（１０8〜１０9ＣＦＵ）を加え、最初の４週間には１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地、ｆ／１０培地、１／５ＮＰ培地のいずれかの寒天培地を使用し、５週目以降から同様のものの液体培地（例えば１０〜１０００ｍｌ）に移植することができる。初めに添加した細菌はノリ組織上で生存するので、液体培地に新たに細菌を加える必要はない。追加の細菌添加を行うことも不可能ではない。当業者にはよく知られているように、振盪培養や通気培養を適宜行ってもよい。培地の組成や温度にもよるが、通常は、プロトプラストの培養を開始してから８週間ほどで少なくとも数センチの大きさのノリ葉状体が得られる（図８）。 As culture conditions, essentially the same culture as in the above screening can be scaled up and used. For example, 1 ml of a suspension of Hyphomonas LNM10-16 (10 8 to 10 9 CFU) is added to 1 ml of protoplast suspension (10 4 cells), and 1/10 SWM-III medium, f / 10 is added for the first 4 weeks. Either an agar medium or a 1/5 NP medium can be used and transplanted to the same liquid medium (for example, 10 to 1000 ml) from the fifth week onward. Since the initially added bacteria survive on the glue tissue, there is no need to add new bacteria to the liquid medium. It is not impossible to add additional bacteria. As is well known to those skilled in the art, shaking culture or aeration culture may be appropriately performed. Although depending on the composition and temperature of the medium, a leafy body having a size of at least several centimeters is usually obtained in about 8 weeks after the start of protoplast culture (FIG. 8).
［方法］
ノリの培養条件
モデルノリとしてスサビノリを使用した。スサビノリＵ−５１株の葉状体を、滅菌した改変１／２ＳＷＭ―ＩＩＩ培地（希釈率が２倍である以外は上記１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培地と同じ）で培養した。培養条件は１７℃、明暗周期：１０時間明／１４時間暗、光強度５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ-2Ｓ-1とし、換水は１週間おきに行った。試料採取１週間前に、培養液に抗生物質を加えない区、アンピシリン添加区（１０ｍｇ／ｌ）、およびネオマイシン添加区（１０ｍｇ／ｌ）の３つの試験区を設けた。
[Method]
Susabinori was used as a culture condition model for paste. The fronds of Susavinori U-51 strain were cultured in a sterilized modified 1/2 SWM-III medium (same as the 1/10 SWM-III medium except that the dilution rate was doubled). The culture conditions were 17 ° C., light / dark cycle: 10 hours light / 14 hours dark, light intensity of 50 μmol photons m −2 S −1, and water exchange was performed every other week. One week before sampling, three test groups were prepared: a group in which no antibiotic was added to the culture, an ampicillin-added group (10 mg / l), and a neomycin-added group (10 mg / l).
ノリプロトプラストの分離
３つの試験区からそれぞれプロトプラストを調製するために、培養５〜６週目の複数の葉状体を用い、湿重量５０〜１００ｍｇに調整した。葉状体からのプロトプラストの分離は、図１に示す方法によって行った。まず、０．５％クエン酸溶液（ｐＨ２．０〜２．３）を用いて葉状体を９０〜１８０秒間浸漬処理し、滅菌９０％海水で洗浄した。それから葉状体をカミソリで細断した。２％パパイン（ｐＨ７．５）を加え、３０分振盪した後、０．７Ｍマンニトール海水で数回洗浄した。次に、細胞壁溶解酵素液（アガラーゼ、キシラーゼ、マンナナーゼ各１ユニット／８ｍｌ）を加え６０〜９０分振盪した。これらの酵素はヤクルト薬品工業から購入した。酵素処理液を２０μｍメッシュで濾過し、メッシュ上に残った画分を「細胞壁試料」とした。濾過画分に対して１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、得られたプロトプラストを０．７Ｍマンニトール海水で数回洗浄した後、最終的に０．７Ｍマンニトール海水を加えてプロトプラスト懸濁液（１０6細胞／ｍｌ）を作製した。
Separation of Noriprotoplasts In order to prepare protoplasts from each of the three test groups, a plurality of leaflets at 5 to 6 weeks in culture were used, and the wet weight was adjusted to 50 to 100 mg. Separation of protoplasts from the frond was performed by the method shown in FIG. First, the frond body was immersed for 90 to 180 seconds using a 0.5% citric acid solution (pH 2.0 to 2.3), and washed with sterilized 90% seawater. The frond was then shredded with a razor. 2% papain (pH 7.5) was added, shaken for 30 minutes, and then washed several times with 0.7 M mannitol seawater. Next, a cell wall lysis enzyme solution (1 unit each of agarase, xylase, and mannanase / 8 ml) was added and shaken for 60 to 90 minutes. These enzymes were purchased from Yakult Pharmaceutical. The enzyme-treated solution was filtered through a 20 μm mesh, and the fraction remaining on the mesh was used as a “cell wall sample”. The filtered fraction was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and the obtained protoplast was washed several times with 0.7 M mannitol seawater, and finally 0.7 M mannitol seawater was added to produce a protoplast suspension (10 6 cells / ml).
ノリ試料由来の細菌の培養
細菌採取のための試料として、葉状体を培養した後の（馴化）培養液、葉状体、細胞壁、およびプロトプラスト懸濁液を用いた。葉状体表面または細胞壁試料に付着した細菌を分離するためには、これらの試料にそれぞれ８ｍｌまたは１６ｍｌの滅菌７５％天然海水を加え、１分間激しく振盪し、懸濁液原液を得た。それぞれの液試料の１０倍希釈液列は、滅菌７５％天然海水で希釈することによって作製した。希釈液列から適当な数段階を選び、１００μｌをＭａｒｉｎｅ ａｇａｒ ２２１６培地（Ｄｉｆｃｏ；Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６に寒天を加えたもの）に平板塗抹し、２０℃で２週間培養を行った。また、細胞壁およびプロトプラスト懸濁液の試料については、フィルタ捕集による培養とＭＰＮ法による増菌培養を行った。
Culture of bacteria derived from laver sample As culture samples for collecting bacteria, (acclimated) culture solution after culturing the frond, frond, cell wall, and protoplast suspension were used. To separate the bacteria attached to the frond surface or cell wall samples, 8 ml or 16 ml of sterile 75% natural seawater was added to these samples, respectively, and shaken vigorously for 1 minute to obtain a suspension suspension. A 10-fold dilution series of each liquid sample was prepared by diluting with sterile 75% natural seawater. Appropriate several steps were selected from the dilution line, 100 μl was plated on Marine agar 2216 medium (Difco; Marine broth 2216 and agar added), and cultured at 20 ° C. for 2 weeks. Moreover, about the sample of a cell wall and protoplast suspension, culture | cultivation by filter collection and enrichment culture by MPN method were performed.
分離細菌株の同定
培養液、葉状体表面、細胞壁、およびプロトプラスト懸濁液由来の細菌を培養した平板から、無作為に細菌集落を釣菌し、３回の純粋分離を行った。それぞれの分離株からゲノムＤＮＡを以下の方法により抽出した。細菌集落を１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えたＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌに懸濁し、１００℃、５分間の加熱を行った。その後、クロロホルムとイソアミルアルコールの混合液（２４：１ ｖ／ｖ）を等量加え、激しく混合した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清をＤＮＡ試料とした。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の前半約７００ｂｐの領域の配列を決定するために、真正細菌のユニバーサルプライマー２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）および１４９２Ｒ（５’−ＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）を用いたＰＣＲ増幅を行った。鋳型としてのゲノムＤＮＡ試料（２μｌ）、２７Ｆプライマー（０．５μＭ）、１４９２Ｒプライマー（０．５μＭ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（１×）、ｄＮＴＰミックス（各０．２ｍＭ）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（０．５ユニット）（Ｔａｋａｒａ）、および滅菌蒸留水が混合された計２０μｌの反応液でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９５℃３分でＤＮＡを熱変性させた後、（熱変性９５℃３０秒→アニーリング５５℃３０秒→伸長反応７２℃１分）というサイクルを３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で７分間追加する、というものであった。本プライマーセットによる増幅産物の有無は、２．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により確認した。この増幅産物を元にして、２７Ｆプライマーを用いたサイクル・シークエンシングにより、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定を行った。各試料につき、２０の細菌の配列のアラインメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｘで作成し、ＭＥＧＡ５で系統解析を行った。距離行列を作成し、＞９８％の相同性を基準にグループ化した。さらに、それぞれの試料における代表株については、１６Ｓ ｓＲＮＡ遺伝子塩基配列のほぼ全長を決定した。
Identification of Isolated Bacterial Strain Bacteria colonies were randomly picked from the culture medium, the leaflet surface, the cell wall, and the plate on which the bacteria derived from the protoplast suspension were cultured, and pure separation was performed three times. Genomic DNA was extracted from each isolate by the following method. The bacterial colonies were suspended in 200 μl of TE buffer (pH 8.0) supplemented with 1% (v / v) Triton X-100 and heated at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, an equal volume of a mixed solution of chloroform and isoamyl alcohol (24: 1 v / v) was added and mixed vigorously, followed by centrifugation (15000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was used as a DNA sample. In order to determine the sequence of the region of about 700 bp in the first half of the 16S rRNA gene, PCR amplification using eubacterial universal primers 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′) and 1492R (5′-TTACCTTTGTACACTACT-3 ′) was performed. It was. Genomic DNA sample (2 μl), 27F primer (0.5 μM), 1492R primer (0.5 μM), 10 × Ex Taq buffer (1 ×), dNTP mix (each 0.2 mM), Takara Ex Taq (0 PCR was carried out with a total of 20 μl of reaction mixture mixed with 5 units) (Takara) and sterile distilled water. PCR reaction conditions were as follows: DNA was heat denatured at 95 ° C. for 3 minutes, and then a cycle of (thermal denaturation 95 ° C. 30 seconds → annealing 55 ° C. 30 seconds → extension reaction 72 ° C. 1 minute) was repeated 30 times, and finally the extension reaction Was added for 7 minutes at 72 ° C. The presence or absence of the amplification product by this primer set was confirmed by electrophoresis using a 2.0% agarose gel. Based on this amplified product, the base sequence of the 16S rRNA gene was determined with DNA sequencer model 3100 (Applied Biosystems) by cycle sequencing using 27F primer. For each sample, an alignment of 20 bacterial sequences was prepared with Clustal X, and systematic analysis was performed with MEGA5. A distance matrix was created and grouped based on> 98% homology. Furthermore, for the representative strain in each sample, the almost full length of the 16S sRNA gene base sequence was determined.
無菌プロトプラストと分離細菌株の混合培養
ノリの培養液、葉状体表面、細胞壁、およびプロトプラストから得られた合計２５９株から選抜した菌株を、プロトプラストへの添加試験に用いた。それぞれの供試菌株は、Ｍａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６で培養し、滅菌７５％天然海水を用いて１０倍希釈した。培地としては、硝酸ナトリウム１００ｍｇ／ｌおよびリン酸水素二ナトリウム１２水和物２０ｍｇ／ｌを添加した滅菌９０％海水を使用した。ウェルプレートに、培地を１ｍｌ、およびプロトプラスト（１０3細胞／ｍｌ）を０．１ｍｌ加え（１０2細胞／ウェル）、その後、約１０7〜１０8ＣＦＵ／ｍｌの菌液を１０μｌずつ加えた（約１０5〜１０6ＣＦＵ／ウェル）。対照の細菌未接種区では、前記菌液の代わりに、滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＭａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈ ２２１６を１０μｌ加えた。培養は、１７℃、１０時間明／１４時間暗という条件で６週間行った。選抜菌株については、上記の細菌接種試験を４回繰り返した。
Strains selected from a total of 259 strains obtained from the culture solution of the mixed culture paste of sterile protoplasts and isolated bacterial strains , frond surface, cell wall, and protoplasts were used for the addition test to protoplasts. Each test strain was cultured in Marine broth 2216 and diluted 10-fold with sterilized 75% natural seawater. As the medium, sterilized 90% seawater supplemented with 100 mg / l sodium nitrate and 20 mg / l disodium hydrogenphosphate 12 hydrate was used. To the well plate, 1 ml of medium and 0.1 ml of protoplast (10 3 cells / ml) were added (10 2 cells / well), and then 10 μl of about 10 7 to 10 8 CFU / ml of bacterial solution was added (10 μl). About 10 5 to 10 6 CFU / well). In the control bacteria non-inoculated group, 10 μl of Marine broth 2216 diluted 10-fold with sterilized 75% natural seawater was added instead of the bacterial solution. The culture was performed for 6 weeks under conditions of 17 ° C., 10 hours light / 14 hours dark. For the selected strain, the above bacterial inoculation test was repeated four times.
プロトプラストの形態観察
ウェルプレート内のプロトプラストの生細胞数を倒立顕微鏡で計測し、形態に基づいて生残細胞を葉状体形成細胞、未分化細胞、不定形***細胞、およびカルスの４つに分類した。生残率（％）は、生残細胞数を接種細胞数で除して算出し、葉状体形成率（％）は、葉状体形成細胞数を接種細胞数で除して算出した。
Morphological observation of protoplasts The number of viable cells of protoplasts in the well plate was measured with an inverted microscope, and the surviving cells were classified into four types: phyllode-forming cells, undifferentiated cells, atypically dividing cells, and calli based on the morphology. . The survival rate (%) was calculated by dividing the number of surviving cells by the number of inoculated cells, and the frond body formation rate (%) was calculated by dividing the number of frond body forming cells by the number of inoculated cells.
接種細菌の再分離
プロトプラストとの６週間の混合培養後、接種細菌が再分離・培養されるかを確認するために、培養系内の細菌の再分離を行った。混合培養試験終了の６週目に、ウェルプレートから培養液をループで採取し、Ｍａｒｉｎｅ ａｇａｒ ２２１６上で２０℃で２週間、細菌を培養した。４回の再現性試験において、それぞれのウェルから得られた細菌集落のうち３個の集落を釣菌し、純粋分離を繰り返し、保存した。
Reseparation of inoculated bacteria After 6 weeks of mixed culture with protoplasts, in order to confirm whether the inoculated bacteria were reisolated and cultured, the bacteria in the culture system were reisolated. Six weeks after the end of the mixed culture test, the culture solution was collected from the well plate in a loop, and the bacteria were cultured at 20 ° C. for 2 weeks on Marine agar 2216. In four reproducibility tests, three colonies among the bacterial colonies obtained from each well were fished, and pure separation was repeated and stored.
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の特異的検出ＰＣＲ法の開発と再分離株への応用
再分離したＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を同定するために、本菌に特異的なＰＣＲ検出法を開発した。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長配列を、ノリから分離された他のグループに属する代表株のものと比較した。Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属に特異的な配列領域を見出し、本領域に対応するプライマーＨｙｐｈｏＦ１（５’−ＴＴＴＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴ−３’）およびＨｙｐｈｏＲ１（５’−ＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣ−３’）を設計した。次に、代表株のゲノムＤＮＡ（３μｌ）を鋳型とし、ＨｙｐｈｏＦ１プライマー（０．５μＭ）、ＨｙｐｈｏＲ１プライマー（０．５μＭ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（１×）、ｄＮＴＰミックス（各０．２ｍＭ）、Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（０．５ユニット）（Ｔａｋａｒａ）、および滅菌蒸留水が混合された計２０μｌの反応液でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９５℃３分でＤＮＡを熱変性させた後、（熱変性９５℃３０秒→アニーリング５５℃３０秒→伸長反応７２℃１分）というサイクルを３０回繰り返し、最後に伸長反応を７２℃で５分間追加する、というものであった。本プライマーセットによる増幅産物（４８９ｂｐ）の有無は、２．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により確認した。ＨｙｐｈｏＦ１−ＨｙｐｈｏＲ１のプライマーセットの特異性が確認された後、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の細菌を接種したウェルから再分離した菌株について、上記の特異的検出ＰＣＲ法による同定を行った。
Development of a specific detection PCR method for the genus Hyphomonas and application to the re-isolated strain In order to identify the re-isolated Hyphomonas genus bacteria, a PCR detection method specific to this bacterium was developed. The full-length sequence of the 16S rRNA gene of the genus Hyphomonas was compared with that of representative strains belonging to other groups isolated from laver. A sequence region specific to the genus Hyphomonas was found, and primers HyphoF1 (5′-TTTCACTACGAGATAGCTCTT-3 ′) and HyphoR1 (5′-CTCCTGTTCTCTAGACTTCC-3 ′) corresponding to this region were designed. Next, using representative genomic DNA (3 μl) as a template, HyphoF1 primer (0.5 μM), HyphoR1 primer (0.5 μM), 10 × Ex Taq buffer (1 ×), dNTP mix (each 0.2 mM), PCR was performed with a total of 20 μl of the reaction mixture in which Takara Ex Taq (0.5 units) (Takara) and sterilized distilled water were mixed. PCR reaction conditions were as follows: DNA was heat denatured at 95 ° C. for 3 minutes, and then a cycle of (thermal denaturation 95 ° C. 30 seconds → annealing 55 ° C. 30 seconds → extension reaction 72 ° C. 1 minute) was repeated 30 times, and finally the extension reaction For 5 minutes at 72 ° C. The presence or absence of the amplification product (489 bp) by this primer set was confirmed by electrophoresis using a 2.0% agarose gel. After the specificity of the HyphoF1-HyphoR1 primer set was confirmed, the strains re-isolated from the wells inoculated with the bacteria of the genus Hyphomonas were identified by the above specific detection PCR method.
プロトプラストから葉状体への成長試験
寒天包埋法において、ＮＰ寒天培地、ｆ／２寒天培地、および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ寒天培地の３種類の培地を用いた。９０％天然海水および１％低融点アガロース（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を基礎培地とし、ＮＰ、ｆ／２（Ｇｕｉｌｌａｒｄ’ｓ（ｆ／２）海水栄養液、Ｓｉｇｍａ）、１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩの各成分を加えた後、滅菌し、４５℃で保温した。プロトプラスト懸濁液１ｍｌ（１０4細胞）を用い、細菌添加区では滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株の菌液１ｍｌ（３．８×１０8ＣＦＵ）を、細菌無添加区では滅菌７５％天然海水で１０倍希釈したＭａｒｉｎｅ ｂｒｏｔｈを１ｍｌ添加した。シャーレ上に加えた後、寒天培地で包埋し、１７℃、１０時間明／１４時間暗の条件で４週間培養した。培養後、シャーレの１／４区画をセルスクレイパーで切り取り、希釈した１／５ＮＰ培養液、ｆ／１０培養液、および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液７５ｍｌで２週間、振盪培養した。その後、１０個の葉状体細胞を選抜し、ＮＰ培養液、ｆ／２培養液、および１／２ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液で、２週間、通気培養し（１週間に１度、全換水）、葉状体の葉長および葉幅を測定した。
Protoplast to frond growth test In the agar embedding method, NP agar medium, f / 2 agar medium, and 1/10 SWM-III agar medium were used. 90% natural seawater and 1% low melting point agarose (Nacalai tesque) are used as basal media, and NP, f / 2 (Guillard's (f / 2) seawater nutrient solution, Sigma), 1/10 SWM-III are added. And then sterilized and kept at 45 ° C. Using 1 ml of protoplast suspension (10 4 cells), Hyphomonas sp. Diluted 10-fold with sterile 75% natural seawater in the bacteria-added section. 1 ml of bacterial solution of LNM10-16 strain (3.8 × 10 8 CFU) was added in 1 ml of Marine broth diluted 10-fold with sterilized 75% natural seawater in the bacteria-free group. After adding on a petri dish, it was embedded in an agar medium and cultured under conditions of 17 ° C., 10 hours light / 14 hours dark for 4 weeks. After the culture, a quarter section of the petri dish was cut out with a cell scraper and cultured with shaking in 75 ml of diluted 1/5 NP culture solution, f / 10 culture solution, and 1/10 SWM-III culture solution for 2 weeks. After that, 10 frond somatic cells were selected and cultured in aeration with NP culture solution, f / 2 culture solution, and 1/2 SWM-III culture solution for 2 weeks (once a week, total water change). The body leaf length and leaf width were measured.
［結果］
ノリ由来分離細菌株の同定
ノリ葉状体由来の各試料から採取して分離し、プロトプラストへの添加試験に用いた２５９の細菌株を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列によりグループ化したところ、１７のグループに分けられた。さらに、代表株のほぼ全長の配列を決定し、データベース上の既知の標準株と比較した。その結果、Ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの１２グループ（グループ１〜１２）、Ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの３グループ（グループ１３〜１５）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの２グループ（グループ１６〜１７）に分けられた。Ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのグループ１および２はＭａｒｉｔａｌｅａ属（Hyphomicrobium科）、グループ３はＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属（Hyphomonas科）、グループ４および５はＡｌｇｉｍｏｎａｓ属（Hyphomonas科）、グループ６はＡｈｒｅｎｓｉａ属（Rhodobacter科）、グループ７はＡｎｔａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ８はＴｒｏｐｉｃｉｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ９はＲｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ属（Rhodobacter科）、グループ１０および１１はＳｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒ属（Rhodobacter科）、グループ１２はＳｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ属（Sphingomonas科）に近縁であった。Ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのグループ１３はＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属（Alteromonas科）、グループ１４および１５はＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属（Alteromonas科）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのグループ１６はＫｏｒｄｉａ属（Flavobacteria科）、グループ１７はＰｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ属（Flavobacteria科）に近縁であった。
[result]
Identification of Nori-derived isolated bacterial strains 259 bacterial strains collected and isolated from each sample derived from Nori foliate and grouped according to the partial base sequence of 16S rRNA gene were grouped into 17 groups. It was divided into. Furthermore, the sequence of almost the full length of the representative strain was determined and compared with a known standard strain on the database. As a result, it was divided into 12 groups of Alpha-proteobacteria (groups 1 to 12), 3 groups of Gamma-proteobacteria (groups 13 to 15), and 2 groups of Bacteroides (groups 16 to 17). Alpha-proteobacteria groups 1 and 2 are from the genus Maritalea (family Hyphomicrobium), group 3 is from the genus Hyphomonas (family Hyphomonas), groups 4 and 5 are from the genus Algimonas (family Hyphomonas), group 6 is from the genus Ahrensia (family Rhodobacter) Is the genus Antactobacter (Rhodobacter family), group 8 is the genus Tropicibacter (family Rhodobacter), group 9 is the genus Roseovarus (family Rhodobacter), groups 10 and 11 are the genus Sulfitobacter (family Rhodobacter), and group 12 is the genus Sphingopy family It was closely related. Gamma-proteobacteria group 13 is in the genus Alteromonas (family Alteromonas), groups 14 and 15 are in the genus Martinobacter (family Alteromonas), Bacteroidetes group 16 is in the genus Kordia (Flavobacteria family), and group 17 is in the genus Polaribacter family (Flavobacteria family) Met.
分離菌株の各グループによるプロトプラストの葉状体形成率の比較
２５９株の分離株をプロトプラストに接種し、系統グループごとの平均葉状体形成率を算出した（図４）。細菌を接種しなかったプロトプラストでは、未分化の細胞およびカルスが観察され、葉状体形成率は０％であった。これまでに分離した計２５９の菌株をプロトプラストにそれぞれ接種したとろ、系統グループにより葉状体形成率が異なることがわかった。グループ２のＭａｒｉｔａｌｅａ属、グループ１３のＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属、またはグループ１４のＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属を接種した場合、葉状体形成細胞は観察されなかった。これらの細菌は、ノリのプロトプラストの成長を促進しない細菌、あるいは成長促進をむしろ阻害する細菌であると考えられる。それに対して、グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を接種したとき、葉状体形成率は３．７％であり最も高かった。同じＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科に分類されるグループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属でも比較的高い葉状体形成率１．９％が示された（図４）。
Comparison of protoplast follicle formation rate by each group of isolate strains 259 isolates were inoculated into protoplasts and the average follicle formation rate for each lineage group was calculated (FIG. 4). In protoplasts not inoculated with bacteria, undifferentiated cells and callus were observed, and the rate of formation of foliate was 0%. When inoculating protoplasts with a total of 259 strains separated so far, it was found that the rate of formation of foliate differs depending on the lineage group. When inoculated with the genus Maritalea of group 2, the genus Alteromonas of group 13, or the genus of Maribacter of group 14, no foliate-forming cells were observed. These bacteria are considered to be bacteria that do not promote the growth of Nori protoplasts or that rather inhibit growth promotion. On the other hand, when the group 3 Hyphomonas spp. Was inoculated, the formation rate of the frond was 3.7%, which was the highest. The group 5 Algimonas belonging to the same Hyphomonas family also showed a relatively high frond formation rate of 1.9% (FIG. 4).
選択菌株を用いたプロトプラストの生残細胞率および葉状体形成率の比較
全２５９菌株のうち葉状体形成率が高かった株を選択し、計４回の再現性試験を行った（図５、図６）。細菌未接種区のプロトプラストの生残率および葉状体形成率はそれぞれ、３．６％および０．０６％であり、最も低かった。それに対して、グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属、グループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属の生残率はそれぞれ１４．４〜２４．３％、および１７．４〜２１．４％であり、葉状体形成率を含めた全般的な細胞***促進作用が高かった。グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の葉状体形成率は２．９〜７．３％で、グループ５のＡｌｇｉｍｏｎａｓ属細菌の葉状体形成率は２．９〜３．３％で、他の菌群と比較して高い傾向が観察された。これらＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ科の細菌は、葉状体形成率だけでなくプロトプラストの生残率全般を高めるという作用を有することも、例えばプロトプラスト由来細胞の保持や貯蔵や利用という観点から有用となり得る（図６）。
Comparison of Protoplast Survival Cell Rate and Foliate Formation Rate Using Selected Strains A strain with a high foliage formation rate was selected from all 259 strains, and a total of 4 reproducibility tests were performed (FIGS. 5 and 5). 6). The survival rate and foliate formation rate of protoplasts in the non-bacterial inoculated area were 3.6% and 0.06%, respectively, which were the lowest. On the other hand, the survival rates of the group 3 Hyphomonas genus and the group 5 Algimonas genus are 14.4 to 24.3% and 17.4 to 21.4%, respectively. Mitogenic effect was high. Foliage formation rate of Group 3 Hyphomonas genus bacteria is 2.9 to 7.3%, and that of Group 5 Algimonas genus bacteria is 2.9 to 3.3%, compared with other fungal groups A high tendency was observed. These Hyphomonas bacteria also have the effect of increasing not only the rate of foliate formation but also the overall survival rate of protoplasts, for example, from the viewpoint of retention, storage and use of protoplast-derived cells (FIG. 6).
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の特異的検出ＰＣＲ法の開発と同定
グループ３のＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を、スサビノリからこれまでに分離された他の１６グループの菌株から区別するために、本菌の特異的検出用プライマーセットＨｙｐｈｏＦ１−ＨｙｐｈｏＲ１を設計した。次に本プライマーセットの特異性を調べたところ、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌の１３株のみを特異的に増幅することができた。また、本検出法を用いて、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属の１３株との混合培養後に再分離された計１５６菌株を解析したところ、これらの再分離株のほぼ全てがＨｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌であることが確認された。
Development and identification of a specific detection PCR method for Hyphomonas bacteria In order to distinguish Hyphomonas bacteria belonging to Group 3 from the other 16 groups of strains previously isolated from Susabiori, a primer set for specific detection of this bacteria HyphoF1-HyphoR1 was designed. Next, when the specificity of this primer set was examined, only 13 strains of the genus Hyphomonas were able to be specifically amplified. Moreover, using this detection method, a total of 156 strains re-isolated after mixed culture with 13 strains of the genus Hyphomonas were analyzed, and it was confirmed that almost all of these re-isolated strains were bacteria belonging to the genus Hyphomonas. .
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属細菌を用いたプロトプラストから葉状体への成長試験
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加することによって、プロトプラストから葉状体まで成長させることを、３種類の寒天培地を用いて試験した。その結果、寒天培地で４週間の静置培養後の細菌無添加区では生残細胞が観察されなかったのに対して、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加した３つのいずれの培地においても葉状体形成細胞が観察された。その後、２週間の振盪培養後においても、細菌無添加区では生残細胞が観察されなかった（図７）。一方で、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＬＮＭ１０−１６株を添加したｆ／１０培養液、１／５ＮＰ培養液および１／１０ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液では、多くの正常***細胞の塊や多くの葉状体様細胞が観察され、培養液の種類に関わらず細菌添加の効果が認められた（図７）。さらに無作為に１０の細胞を選抜し、２週間の通気培養を行ったところ、ｆ／２培養液および１／２ＳＷＭ−ＩＩＩ培養液では、それぞれ、平均葉長１２．９ｃｍおよび平均葉幅１．２ｃｍ（ｎ＝１０）、並びに平均葉長１５．０ｃｍおよび平均葉幅０．８ｃｍ（ｎ＝１０）に成長した（図８）。すなわち、葉状体からのプロトプラスト調製からわずか８週間で新たな成熟葉状体を産生することができた。
Protoplast to frond growth test using Hyphomonas sp. Hyphomonas sp. Growth from protoplasts to fronds by adding LNM10-16 strain was tested using three types of agar medium. As a result, no surviving cells were observed in the bacteria-free group after 4 weeks of static culture on an agar medium, whereas Hyphomonas sp. Foliage-forming cells were observed in any of the three media supplemented with the LNM10-16 strain. Thereafter, no viable cells were observed in the bacteria-free group even after 2 weeks of shaking culture (FIG. 7). On the other hand, Hyphomonas sp. In f / 10 culture solution, 1/5 NP culture solution, and 1/10 SWM-III culture solution to which LNM10-16 strain was added, many masses of normal dividing cells and many foliate-like cells were observed. Regardless, the effect of adding bacteria was observed (FIG. 7). Further, 10 cells were randomly selected and subjected to aeration culture for 2 weeks. In the f / 2 culture solution and the 1/2 SWM-III culture solution, the average leaf length was 12.9 cm and the average leaf width was 1. It grew to 2 cm (n = 10) and an average leaf length of 15.0 cm and an average leaf width of 0.8 cm (n = 10) (FIG. 8). That is, a new mature frond was able to be produced in only 8 weeks after the protoplast preparation from the frond.
［寄託生物材料への言及］
Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ属ＬＮＭ−９株およびＳＮＭ１０−１３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに寄託されている（それぞれ、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１３２１およびＮＩＴＥ Ｐ−１３２２）。
［当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所］
独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） 特許微生物寄託センター
郵便番号292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
［上記寄託機関に生物材料を寄託した日付］
平成２４年４月１８日
［上記寄託機関が寄託について付した受託番号］
ＮＩＴＥ Ｐ−１３２１ （ＬＮＭ−９株について）
ＮＩＴＥ Ｐ−１３２２ （ＳＮＭ１０−１３株について）
[Reference to deposited biological materials]
Hyphomonas genus LNM-9 and SNM10-13 have been deposited at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganism Depositary (Accession Numbers NITE P-1321 and NITE P-1322, respectively).
[Name and address of the depository that deposited the biological material]
National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganism Deposit Center Postal Code 292-0818 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan
[Date of deposit of biological material at the above depository]
April 18, 2012 [Accession number given by the above depository for deposit]
NITE P-1321 (About LNM-9 strain)
NITE P-1322 (About SNM10-13)
Claims (9)
１．ノリの葉状体をクエン酸含有液で洗浄する工程
２．葉状体をプロテアーゼ溶液で処理する工程
３．葉状体をマンニトール含有液で洗浄する工程
４．葉状体を細胞壁溶解酵素溶液で処理する工程
５．細胞壁溶解により生じたプロトプラストを濾過する工程
６．プロトプラストを遠心分離する工程
７．プロトプラストをマンニトール含有液で洗浄する工程 7. The method of claim 6, wherein the sterile protoplast is prepared by a preparation method comprising the following steps:
1. 1. Washing laver leaves with citric acid-containing solution 2. Treating the frond with a protease solution 3. Washing the frond with a mannitol-containing solution 4. Process of treating the frond with cell wall lytic enzyme solution 5. Filtration of protoplasts generated by cell wall lysis 6. Centrifugation of protoplasts Washing protoplasts with mannitol-containing liquid
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-
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Also Published As
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