JP2013224879A

JP2013224879A - Fluorescence detector and fluorescence detection method

Info

Publication number: JP2013224879A
Application number: JP2012097629A
Authority: JP
Inventors: Ryohei Kawamuki; 良平川向
Original assignee: Sharp Corp
Current assignee: Sharp Corp
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2012-04-23
Publication date: 2013-10-31
Anticipated expiration: 2032-04-23
Also published as: JP5899038B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To allow a high-speed scan and obtain high-definition fluorescence image information.SOLUTION: An excitation optical system comprising a light source 18, a prism 20, and an objective lens 17 is supported by a metal frame 21 with high rigidity to prevent lowering of light condensing efficiency and prevent heat generated from the light source 18 from being enclosed inside thereof. A detection optical system comprising a second lens 22, a wavelength filter 23, a third lens 24, a pinhole 25, and a detector 26 that are vertically aligned in series is supported by a resin frame 27 and mounted to the metal frame 21 vertically suspended therefrom. This configuration can prevent deviation of an optical axis from a design position so as to enable a high-speed scan by a scanning module 9. This configuration also enables the fluorescence detector to provide high-definition fluorescence image information.

Description

この発明は、蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。 The present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method.

従来より、生化学分野や分子生物学分野において、蛍光色素を標識物質として利用した蛍光検出システムが広く用いられている。この蛍光検出システムを用いることによって、遺伝子配列,遺伝子の変異・多型解析,タンパク質の分離および同定等の評価を行うことができ、薬等の開発に利用されている。 Conventionally, a fluorescence detection system using a fluorescent dye as a labeling substance has been widely used in the fields of biochemistry and molecular biology. By using this fluorescence detection system, it is possible to evaluate gene sequences, gene mutation / polymorphism analysis, protein separation and identification, and the like, which are used for development of drugs and the like.

上述のような蛍光標識を利用した評価方法としては、電気泳動によってタンパク質等の生物学的化合物をゲル内に分布させ、その生物学的化合物の分布を蛍光検出により取得するという方法がよく用いられている。上記電気泳動では、緩衝液等の溶液中に電極を設置しておき、直流電流を流すことによって上記溶液中に電場勾配を生じさせる。このとき、上記溶液中に電荷を有するタンパク質やＤＮＡ(Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸)やＲＮＡ(ribo nucleic acid：リボ核酸)がある場合に、プラス電荷を有する分子は陰極に、マイナス電荷を有する分子は陽極に引き寄せられ、生体分子の分離を行うことができる。 As an evaluation method using a fluorescent label as described above, a method is often used in which biological compounds such as proteins are distributed in a gel by electrophoresis and the distribution of the biological compounds is obtained by fluorescence detection. ing. In the electrophoresis, an electrode is placed in a solution such as a buffer solution, and an electric field gradient is generated in the solution by flowing a direct current. At this time, when there is a charged protein, DNA (Deoxyribonucleic acid: deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid: ribonucleic acid) in the solution, the positively charged molecule is the cathode, the negatively charged molecule is The biomolecules can be separated by being attracted to the anode.

上記電気泳動を用いた評価方法の一つである二次元電気泳動は、２種類の電気泳動法を組み合わせることによって、ゲル内に生体分子を２次元的に分布させる評価方法であり、プロテオーム解析を行う上で最も有効な方法であると考えられている。 Two-dimensional electrophoresis, which is one of the evaluation methods using electrophoresis, is an evaluation method that distributes biomolecules two-dimensionally in a gel by combining two types of electrophoresis methods. Proteomic analysis It is considered the most effective way to do it.

上記電気泳動の組み合わせとしては、例えば、一次元目としての「個々のタンパク質の等電点の違いを利用する等電点電気泳動」と、二次元目としての「タンパク質の分子量で分離を行うＳＤＳ‐ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動)」との２種類が主に用いられる。こうして分離された上記生体分子としてのタンパク質に対して、蛍光色素は電気泳動前あるいは電気泳動後に付与される。 Examples of the combination of the electrophoresis include, for example, “isoelectric focusing using the difference in isoelectric point of each protein” as the first dimension and “SDS that performs separation based on the molecular weight of the protein” as the second dimension. -PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) "is mainly used. A fluorescent dye is applied to the protein as the biomolecule thus separated before or after electrophoresis.

さらに、上述のようにして作製された上記生体分子(タンパク質)が二次元的に分布されたゲル支持体に励起光を照射し、発生した蛍光強度を取得して、それに基づいて蛍光分布(タンパク質分布)画像を表示させる画像読取装置が、生化学や分子生物学の分野で広く普及している。 Furthermore, the gel support on which the biomolecules (proteins) prepared as described above are two-dimensionally distributed is irradiated with excitation light, and the generated fluorescence intensity is obtained, and the fluorescence distribution (protein Distribution) Image readers that display images are widely used in the fields of biochemistry and molecular biology.

また、上記生体分子の二次元分布を保持する方法としては、上記ゲル内に保持するだけではなく、上記ゲル内にタンパク質を分離させた後に、電気泳動や毛細管現象を利用して上記ゲルからメンブレンに転写させる方法も行われる。その場合には、上記ゲル支持体を用いた画像読取の場合と同様に、上記メンブレンである転写支持体上の蛍光分布を画像読取装置によって画像化することができる。 As a method for maintaining the two-dimensional distribution of the biomolecules, not only the gel is retained in the gel, but also the protein is separated from the gel and then the membrane is separated from the gel using electrophoresis or capillary action. There is also a method of transferring to the surface. In that case, as in the case of image reading using the gel support, the fluorescence distribution on the transfer support, which is the membrane, can be imaged by an image reading device.

上述したような生体分子が二次元的に分布されたゲル支持体や転写支持体から生体分子分布画像を読み取る画像読取装置として、特開平１０‐３１３４号公報(特許文献１)および特開平１０‐３００８９６号公報(特許文献２)に開示された画像読み取り装置がある。 As an image reading apparatus for reading a biomolecule distribution image from a gel support or transfer support in which biomolecules are two-dimensionally distributed as described above, JP-A-10-3134 (Patent Document 1) and JP-A-10-10 There is an image reading apparatus disclosed in Japanese Patent No. 300956 (Patent Document 2).

上記各従来の画像読み取り装置では、中央部に孔が形成されたミラーを主走査方向に移動される光学ヘッドに搭載し、蛍光物質によって標識された変性ＤＮＡの電気泳動が記録された転写支持体に対して、光源からの上記蛍光物質の波長に応じた波長のレーザ光(励起光)を上記ミラーの孔を通過させて照射する。そして、上記転写支持体中の蛍光色素が励起されて発せられた蛍光が上記ミラーの上記孔の周囲で反射され、マルチプライヤによって光電変換されて検出される。こうして、ラインバッファに、１ライン分の画像データが記憶される。以下、上記主走査方向に直交する副走査方向に上記光学ヘッドを移動させながら上記動作を繰り返すことにより、画像処理装置によって二次元の可視画像(蛍光画像)を得るようにしている。 In each of the conventional image reading apparatuses, a transfer support on which electrophoresis of denatured DNA labeled with a fluorescent substance is recorded by mounting a mirror having a hole in the center on an optical head moved in the main scanning direction. In contrast, a laser beam (excitation light) having a wavelength corresponding to the wavelength of the fluorescent material from a light source is irradiated through the hole of the mirror. Then, the fluorescence emitted when the fluorescent dye in the transfer support is excited is reflected around the hole of the mirror, and is detected by being photoelectrically converted by a multiplier. Thus, image data for one line is stored in the line buffer. Hereinafter, by repeating the above operation while moving the optical head in the sub-scanning direction orthogonal to the main scanning direction, a two-dimensional visible image (fluorescent image) is obtained by the image processing apparatus.

上述のように、上記従来の画像読み取り装置においては、ダイクロイックミラーを用いることなく励起光を転写支持体に照射するため、ダイクロイックミラーを通して励起光を照射する方式に比して、強い励起エネルギーを上記転写支持体に付与することができ、光電検出される信号(画像情報)のＳ/Ｎを向上できる。 As described above, in the conventional image reading apparatus, since excitation light is irradiated to the transfer support without using a dichroic mirror, strong excitation energy is higher than that of a method in which excitation light is irradiated through a dichroic mirror. The S / N of a signal (image information) that can be applied to the transfer support and photoelectrically detected can be improved.

しかしながら、微弱な蛍光を検出するに当たっては、さらなるＳ/Ｎの向上が求められる。そこで、上記従来の画像読み取り装置よりもさらに検出信号のＳ/Ｎを向上させた光学式ヘッド方式の画像読取装置として、特開２０００‐１６２１２６号公報(特許文献３)に開示された画像情報読取装置がある。 However, when detecting weak fluorescence, further improvement in S / N is required. Therefore, as an optical head type image reading apparatus in which the S / N of the detection signal is further improved as compared with the conventional image reading apparatus, the image information reading disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2000-162126 (Patent Document 3). There is a device.

この画像情報読取装置においては、中央部に孔が形成されたミラーを主走査方向に移動される光学ヘッドに搭載し、蛍光色素で標識された生体由来物質が分布する転写支持体に対して、レーザ光源からの上記蛍光色素を励起する波長のレーザ光を、上記ミラーの孔を通過させて上方に照射する。そして、上記転写支持体中の蛍光色素が励起されて下方に発せられた蛍光が上記ミラーに至る。一方、上記転写支持体の上方に出射された蛍光は凹面鏡の内面で反射されて下方に向かい、上記転写支持体を透過して、上記光学ヘッドにおける上記ミラーに至る。こうして、上記ミラーに至った両蛍光は上記ミラーの上記孔の周囲で反射され、マルチプライヤによって光電変換されて検出される。こうして、ラインバッファに、１ライン分の画像データが記憶される。以下、上記主走査方向に直交する副走査方向に上記光学ヘッドを移動させながら上記動作を繰り返すことにより、画像処理装置によって二次元の可視画像(蛍光画像)を得るようにしている。 In this image information reading device, a mirror having a hole formed in the center is mounted on an optical head moved in the main scanning direction, and a transfer support on which a biological substance labeled with a fluorescent dye is distributed, Laser light having a wavelength for exciting the fluorescent dye from the laser light source is irradiated upward through the hole of the mirror. Then, the fluorescent dye in the transfer support is excited and the fluorescence emitted downward reaches the mirror. On the other hand, the fluorescence emitted upward from the transfer support is reflected by the inner surface of the concave mirror, travels downward, passes through the transfer support, and reaches the mirror in the optical head. Thus, the two fluorescent lights that have reached the mirror are reflected around the hole of the mirror and are detected by being photoelectrically converted by the multiplier. Thus, image data for one line is stored in the line buffer. Hereinafter, by repeating the above operation while moving the optical head in the sub-scanning direction orthogonal to the main scanning direction, a two-dimensional visible image (fluorescent image) is obtained by the image processing apparatus.

こうして、上記マルチプライヤによって検出される蛍光の光量を増大して、光電検出される信号(画像情報)のＳ/Ｎを向上することができる。 In this way, the amount of fluorescent light detected by the multiplier can be increased, and the S / N of the photoelectrically detected signal (image information) can be improved.

しかしながら、上記従来の画像情報読取装置には、以下のような問題がある。 However, the conventional image information reading apparatus has the following problems.

すなわち、上記レーザ光を集束させる凸レンズおよび孔が形成されたミラーを搭載した光学ヘッドと、上記ミラーの孔の周囲で反射された蛍光を検出するマルチプライヤとは、別体に構成されており、水平方向に併設されている。したがって、上記光学ヘッドには、上記転写支持体から下方に向かって発せられた蛍光を、横方向にある上記マルチプライヤに向かって略直角に反射させるための上記孔が形成されたミラーを設ける必要がある。 That is, the optical head on which the convex lens for focusing the laser light and the mirror in which the hole is formed is mounted, and the multiplier that detects the fluorescence reflected around the hole of the mirror is configured separately. It is attached horizontally. Therefore, the optical head needs to be provided with a mirror in which the hole is formed to reflect the fluorescence emitted downward from the transfer support toward the multiplier in the lateral direction at a substantially right angle. There is.

蛍光は微弱であり、上記転写支持体の表面上の一点から等方的に発生した蛍光を上記凸レンズで平行光として集め、感度を上げるのが一般的である。そのため、蛍光は光軸上での直径が大きく、上記孔が形成されたミラーによって光路を反射させるためには上記ミラーを大型にする必要である。 Fluorescence is weak, and it is common to increase the sensitivity by collecting fluorescence generated isotropically from one point on the surface of the transfer support as parallel light by the convex lens. Therefore, the fluorescence has a large diameter on the optical axis, and the mirror needs to be large in order to reflect the optical path by the mirror in which the hole is formed.

したがって、上記従来の画像情報読取装置のように、上記マルチプライヤを含む検出系を光学ヘッドの外に出す方式においては、蛍光を略直角に反射させるための大型のミラーを余分に必要になる。そのため、上記光学ヘッド本体の重量が重くなって高速走査ができないという問題がある。また、上記ミラーでの反射によって蛍光の損失が大きくなり、高品位の画像情報を得ることができないという問題がある。 Therefore, in the system in which the detection system including the multiplier is out of the optical head as in the conventional image information reading apparatus, an extra large mirror for reflecting the fluorescence at a substantially right angle is required. Therefore, there is a problem that the optical head main body becomes heavy and high-speed scanning cannot be performed. In addition, there is a problem that high-quality image information cannot be obtained because the loss of fluorescence increases due to reflection by the mirror.

特開平１０‐３１３４号公報Japanese Patent Laid-Open No. 10-3134 特開平１０‐３００８９６号公報JP-A-10-300896 特開２０００‐１６２１２６号公報JP 2000-162126 A

そこで、この発明の課題は、高速走査が可能であり、且つ高品位の蛍光画像情報を得ることができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method capable of high-speed scanning and capable of obtaining high-quality fluorescence image information.

上記課題を解決するため、この発明の蛍光検出装置は、
蛍光を励起する励起光を水平方向に出射する光源と、
上記励起光の進行方向を鉛直上方に変換する光路変換部と、
上記光路変換部からの上記励起光を透過させて検出対象物に照射すると共に、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を鉛直下方に向かって集光する対物レンズ素子と
を含む第１光学系と、
上記対物レンズ素子によって集光された蛍光を、実質的に平行光に変換する変換レンズと、
上記変換レンズからの実質的に平行な蛍光が入射されると共に、上記励起光の波長と同等の波長成分の光を減光する波長フィルタと、
上記波長フィルタからの蛍光を検出する光検出素子と
を含む第２光学系と
を備え、
上記第１光学系の各構成要素は第１支持体によって支持される一方、上記第２光学系の各構成要素は第２支持体によって支持されており、
上記第１支持体の材質は、上記第２支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きく、
上記第２支持体は、上記第１支持体に対して垂下するように取り付けられている
ことを特徴としている。 In order to solve the above problems, the fluorescence detection apparatus of the present invention is:
A light source that horizontally emits excitation light that excites fluorescence;
An optical path conversion unit that converts the traveling direction of the excitation light vertically upward;
An objective lens element that transmits the excitation light from the optical path changing unit and irradiates the detection target, and condenses the fluorescence emitted from the detection target vertically downward based on the irradiation of the excitation light A first optical system including:
A conversion lens that converts the fluorescence collected by the objective lens element into substantially parallel light;
A substantially parallel fluorescent light from the conversion lens is incident, and a wavelength filter for dimming light having a wavelength component equivalent to the wavelength of the excitation light;
A second optical system including a light detection element for detecting fluorescence from the wavelength filter,
Each component of the first optical system is supported by a first support, while each component of the second optical system is supported by a second support,
The material of the first support is higher in rigidity per unit volume and larger in weight per unit volume than the material of the second support,
The second support body is attached so as to hang down with respect to the first support body.

上記構成によれば、光源を第１光学系に組み込んで光利用率の向上を図っているが、上記第１光学系の重量の増加に伴って光学精度の低下および発熱等の問題が発生する。そこで、上記第１光学系を、上記第２支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きい材質である上記第１支持体で支持している。こうして、検出対象物への励起光照射位置の精度を高めるようにしている。 According to the above configuration, the light utilization rate is improved by incorporating the light source into the first optical system, but problems such as a decrease in optical accuracy and heat generation occur with an increase in the weight of the first optical system. . Therefore, the first optical system is supported by the first support that is made of a material that has higher rigidity per unit volume and higher weight per unit volume than the material of the second support. Thus, the accuracy of the excitation light irradiation position on the detection target is increased.

これに対して、上記第２光学系は、上記第１支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が低く、且つ単位体積当たり重量が小さい材質である上記第２支持体で支持している。さらに、上記第２支持体を上記第１支持体に対して垂下するように取り付けている。こうして、上記第２光学系の各部材同士を剛性体で支える必要をなくし、上記第２光学系の垂下方向と上記第２光学系の光軸方向とを同一にして上記光軸のずれ等が発生しにくくしている。 On the other hand, the second optical system is supported by the second support, which has a lower rigidity per unit volume and a lower weight per unit volume than the material of the first support. Further, the second support is attached so as to hang down from the first support. In this way, it is not necessary to support the members of the second optical system with a rigid body, and the hanging direction of the second optical system and the optical axis direction of the second optical system are made the same so that the optical axis is shifted. It is hard to generate.

さらに、上記第２光学系を固定・支持する第２支持体の剛性を低く、且つ重量を小さくして、上記第１支持体に対する負荷を小さくし、走査時における振動等を抑制して検出精度を高めることができる。 Furthermore, the rigidity of the second support that fixes and supports the second optical system is reduced and the weight is reduced, the load on the first support is reduced, and vibration during scanning is suppressed, thereby detecting accuracy. Can be increased.

その結果、上記第１光学系および上記第２光学系による高速走査を可能にし、且つ高品位の蛍光画像情報を得ることを可能にできるのである。 As a result, it is possible to perform high-speed scanning with the first optical system and the second optical system and to obtain high-quality fluorescent image information.

また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記第２光学系は、上記変換レンズと上記波長フィルタと上記光検出素子とが鉛直方向に上記の順で直列に配列して、上記第２支持体によって支持されている。 Moreover, in the fluorescence detection device of one embodiment,
In the second optical system, the conversion lens, the wavelength filter, and the light detection element are arranged in series in the above order in the vertical direction, and are supported by the second support.

この実施の形態によれば、上記第２支持体の垂下方向と上記第２光学系の光軸方向とが同一であるために、上記第２光学系の各部材同士を剛性体で支える必要がない。したがって、上記第２支持体の剛性が低くても、上記第２光学系に光軸のずれ等は発生しにくい。 According to this embodiment, since the hanging direction of the second support and the optical axis direction of the second optical system are the same, it is necessary to support each member of the second optical system with a rigid body. Absent. Therefore, even if the rigidity of the second support is low, the optical axis is unlikely to shift in the second optical system.

また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記第１支持体の材質は金属であり、上記第２支持体の材質は樹脂である。 Moreover, in the fluorescence detection device of one embodiment,
The material of the first support is metal, and the material of the second support is resin.

この実施の形態によれば、上記第１支持体に比して、上記第２支持体の剛性を低く、且つ重量を小さくしている。そのため、上記第１支持体に対する負荷を小さくし、走査時における振動等を抑制して検出精度を高めることができる。さらに、上記第１支持体の材質を金属にすることによって、上記光源からの発熱が上記第１支持体の内部にこもらないようにできる。 According to this embodiment, the rigidity and the weight of the second support are lower than those of the first support. For this reason, it is possible to reduce the load on the first support and to suppress the vibration and the like during scanning to increase the detection accuracy. Furthermore, by using a metal material for the first support, heat generated from the light source can be prevented from being trapped inside the first support.

また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記検出対象物に対して相対的に移動可能な走査装置によって駆動されて、上記検出対象物上を二次元に走査する走査モジュールを備え、
上記第１支持体は、上記走査モジュールに含まれると共に、上記走査装置に接続されている。 Moreover, in the fluorescence detection device of one embodiment,
A scanning module which is driven by a scanning device movable relative to the detection object and scans the detection object in two dimensions;
The first support is included in the scanning module and is connected to the scanning device.

上記走査モジュールによって上記検出対象物上を二次元に走査する場合には、走査時の振動等の影響を考慮する必要がある。この実施の形態によれば、上記走査装置は剛性の高い第１支持体を駆動するため、走査時の振動等による上記第１光学系の光学的な位置ずれは発生しにくくなっている。 In the case where the detection object is scanned two-dimensionally by the scanning module, it is necessary to consider the influence of vibration during scanning. According to this embodiment, since the scanning device drives the first support body having high rigidity, optical displacement of the first optical system due to vibration during scanning is less likely to occur.

また、１実施の形態の蛍光検出装置では、
上記対物レンズ素子は、
屈折によって光を集光する中央部分と、この中央部分の周辺に位置して全反射によって光を集光する周辺部分とを含んで構成されており、
上記中央部分の少なくとも一部は上記励起光を透過させる励起光透過部となっている。 Moreover, in the fluorescence detection device of one embodiment,
The objective lens element is
It is configured to include a central portion that collects light by refraction and a peripheral portion that is located around the central portion and collects light by total reflection.
At least a part of the central portion is an excitation light transmitting portion that transmits the excitation light.

この実施の形態によれば、上記検出対象物からの蛍光を集光する対物レンズ素子は、屈折によって光を集光する通常の凸レンズに相当する中央部分の外周に、全反射によって光を集光する周辺部分を有している。したがって、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができ、集光光率を高めて上記光検出素子による感度アップを図ることができる。そのため、上記従来の画像情報読取装置のように、上記読み取り対象物の上方に出射された蛍光を下方に反射するための凹面鏡を設ける必要がなく、蛍光を検出するための光学系を簡素にすることができる。 According to this embodiment, the objective lens element that condenses the fluorescence from the detection object collects the light by total reflection on the outer periphery of the central portion corresponding to a normal convex lens that condenses the light by refraction. It has a peripheral part. Therefore, it is possible to collect light having a large radiation angle that cannot be collected by a normal convex lens, and it is possible to increase the light collection rate and increase the sensitivity by the light detection element. Therefore, unlike the conventional image information reading device, it is not necessary to provide a concave mirror for reflecting the fluorescence emitted above the reading object downward, and the optical system for detecting the fluorescence is simplified. be able to.

さらに、本蛍光検出装置の対物レンズとして上記対物レンズ素子と同等のＮＡを有する凸レンズを用いる場合に比して、上記対物レンズ素子の直径を小さくすることができる。また、上記対物レンズ素子は、上記検出対象物からの蛍光を集光して上記変換レンズに入射するので、上記変換レンズ,上記波長フィルタおよび上記光検出素子の直径を小さくすることができ、上記第２光学系を軽量に構成できる。 Furthermore, the diameter of the objective lens element can be made smaller than when a convex lens having the same NA as the objective lens element is used as the objective lens of the fluorescence detection apparatus. Further, since the objective lens element condenses the fluorescence from the detection object and enters the conversion lens, the diameters of the conversion lens, the wavelength filter, and the light detection element can be reduced. The second optical system can be configured to be lightweight.

さらに、上記対物レンズ素子における上記中央部分の少なくとも一部は、上記励起光を透過させる励起光透過部となっている。そのために、ダイクロイックミラーを通して励起光を照射する方式に比して、強い励起エネルギーを上記読み取り対象物に付与することができ、上記光検出素子で検出される信号(画像情報)のＳ/Ｎを向上することができる。 Furthermore, at least a part of the central portion of the objective lens element is an excitation light transmitting portion that transmits the excitation light. Therefore, compared with a method of irradiating excitation light through a dichroic mirror, strong excitation energy can be applied to the reading object, and S / N of a signal (image information) detected by the light detection element can be reduced. Can be improved.

また、この発明の蛍光検出方法は、
上記この発明の蛍光検出装置における上記第１光学系により、
上記光源部から、蛍光を励起する励起光を水平方向に出射し、
上記光源部からの励起光の進行方向を、上記光路変換部によって、鉛直上方に変換し、
上記光路変換部からの上記励起光を、上記対物レンズ素子を透過させて、検出対象物に照射し、
上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を、上記対物レンズ素子によって鉛直下方に向かって集光し、
さらに、上記蛍光検出装置における上記第２光学系により、
上記変換レンズによって、上記対物レンズ素子で集光された蛍光を実質的に平行光に変換し、
上記波長フィルタによって、上記変換レンズで変換された実質的に平行な蛍光から上記励起光の波長と同等の波長成分の光を減光し、
上記光検出素子によって、上記波長フィルタからの蛍光を検出する
ことを特徴としている。 Further, the fluorescence detection method of the present invention comprises:
By the first optical system in the fluorescence detection device of the present invention,
From the light source part, the excitation light that excites fluorescence is emitted in the horizontal direction,
The traveling direction of the excitation light from the light source unit is converted vertically upward by the optical path conversion unit,
The excitation light from the optical path changing unit is transmitted through the objective lens element and irradiated to a detection target,
Fluorescence emitted from the detection object based on the irradiation of the excitation light is condensed vertically downward by the objective lens element,
Furthermore, by the second optical system in the fluorescence detection device,
The conversion lens converts the fluorescent light collected by the objective lens element into substantially parallel light,
The wavelength filter attenuates light having a wavelength component equivalent to the wavelength of the excitation light from the substantially parallel fluorescence converted by the conversion lens,
Fluorescence from the wavelength filter is detected by the light detection element.

上記構成によれば、上記第１光学系を、上記第２支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きい材質である上記第１支持体で支持して、検出対象物への励起光照射位置の精度を高めるようにできる。 According to the above configuration, the first optical system is supported by the first support, which is a material having a higher rigidity per unit volume and a larger weight per unit volume than the material of the second support, The accuracy of the excitation light irradiation position on the detection target can be increased.

また、上記第２光学系を、上記第１支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が低く、且つ単位体積当たり重量が小さい材質である上記第２支持体で支持している。さらに、上記第２支持体を上記第１支持体に対して垂下するように取付固定している。こうして、上記第２光学系の垂下方向と上記第２光学系の光軸方向とを同一にして光軸のずれ等が発生しにくくすると共に、走査時における振動等を抑制して検出精度を高めることができる。 Further, the second optical system is supported by the second support, which is made of a material having a lower rigidity per unit volume and a lower weight per unit volume than the material of the first support. Further, the second support is attached and fixed so as to hang down with respect to the first support. In this way, the vertical direction of the second optical system and the optical axis direction of the second optical system are made the same so that the optical axis is not easily displaced, and the detection accuracy is improved by suppressing vibration during scanning. be able to.

以上より明らかなように、この発明によれば、光源と光路変換部と対物レンズ素子とを含む第１光学系を支持する第１支持体の材質を、変換レンズと波長フィルタと光検出素子とを含む第２光学系を支持する第２支持体の材質よりも、単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きい材質にしている。したがって、検出対象物への励起光照射位置の精度を高めることができる。 As is clear from the above, according to the present invention, the material of the first support that supports the first optical system including the light source, the optical path conversion unit, and the objective lens element is converted into a conversion lens, a wavelength filter, and a light detection element. The material is higher in rigidity per unit volume and larger in weight per unit volume than the material of the second support that supports the second optical system including Therefore, the accuracy of the excitation light irradiation position on the detection target can be increased.

また、上記第２光学系を、上記第１支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が低く、且つ単位体積当たり重量が小さい材質である上記第２支持体で支持している。さらに、上記第２支持体を上記第１支持体に対して垂下するように取り付けている。したがって、上記第２光学系の垂下方向と上記第２光学系の光軸方向とを同一にして光軸のずれ等が発生しにくくすると共に、走査時における振動等を抑制して検出精度を高めることができる。 Further, the second optical system is supported by the second support, which is made of a material having a lower rigidity per unit volume and a lower weight per unit volume than the material of the first support. Further, the second support is attached so as to hang down from the first support. Accordingly, the hanging direction of the second optical system and the optical axis direction of the second optical system are made the same so that the optical axis is not easily displaced, and the detection accuracy is improved by suppressing vibration during scanning. be able to.

すなわち、上記第１光学系および上記第２光学系による高速走査を可能にし、且つ高品位の蛍光画像情報を得ることを可能にできる。 That is, it is possible to perform high-speed scanning by the first optical system and the second optical system and to obtain high-quality fluorescent image information.

この発明の蛍光検出装置における外観図である。It is an external view in the fluorescence detection apparatus of this invention. 図１におけるサンプル台の下部に設置された走査ステージの外観図である。It is an external view of the scanning stage installed in the lower part of the sample stand in FIG. 図２における第２ステージ上に載置される走査モジュールの断面図である。It is sectional drawing of the scanning module mounted on the 2nd stage in FIG. 走査モジュールの斜視図である。It is a perspective view of a scanning module.

以下、この発明を図示の実施の形態により詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the illustrated embodiments.

図１は、本実施の形態の蛍光検出装置における外観図である。本蛍光検出装置１は、筺体を成す本体２と、本体２の上面を覆う蓋体３とで、大まかに構成されている。本体２の上面には、ガラスでなるサンプル台４が設けられており、サンプル台４上には例えば蛍光物質によって標識された生体由来物質が分布するゲル支持体やメンブレン等の転写支持体(共に図示せず)がサンプル(測定対象物)としてセットされる。 FIG. 1 is an external view of the fluorescence detection apparatus according to the present embodiment. The fluorescence detection apparatus 1 is roughly configured by a main body 2 that forms a casing and a lid 3 that covers an upper surface of the main body 2. A sample table 4 made of glass is provided on the upper surface of the main body 2, and a transfer support such as a gel support or a membrane on which a biological material labeled with a fluorescent material is distributed (both on the sample stand 4). (Not shown) is set as a sample (measuring object).

そして、上記サンプル台４の下側には光学系が配置されており、サンプル台４上にセットされたサンプルに対して、励起光学系によってサンプル台４を通して下方から励起光を照射し、サンプル台４を透過してくる上記サンプルからの蛍光を検出光学系によって検出する。上記検出光学系はＰＣ(Personal computer：パーソナルコンピュータ)５等の外部端末と接続されており、ＰＣ５から測定条件の制御等を行う。さらに、ＰＣ５によって、検出データに基づいてサンプルの蛍光画像を作成し、内蔵する表示画面に上記作成した蛍光画像等を表示する。 An optical system is arranged below the sample table 4, and the sample set on the sample table 4 is irradiated with excitation light from below through the sample table 4 by the excitation optical system. Fluorescence from the sample passing through 4 is detected by a detection optical system. The detection optical system is connected to an external terminal such as a PC (Personal computer) 5 and controls measurement conditions from the PC 5. Further, the PC 5 creates a fluorescence image of the sample based on the detection data, and displays the created fluorescence image or the like on the built-in display screen.

図２は、上記サンプル台４の下部に設置された走査ステージ６の外観図を示す。この走査ステージ６は、基準となる第１ステージ７と第１ステージ７の上に載置された第２ステージ８とで構成されている。そして、第２ステージ８の上に走査モジュール９が載置されている。上記蛍光を検出する上記検出光学系は走査モジュール９の中に格納されている。 FIG. 2 shows an external view of the scanning stage 6 installed at the lower part of the sample table 4. The scanning stage 6 includes a first stage 7 serving as a reference and a second stage 8 placed on the first stage 7. A scanning module 9 is placed on the second stage 8. The detection optical system for detecting the fluorescence is stored in the scanning module 9.

上記走査ステージ６を構成する第１ステージ７には、第１走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドレール１０a,１０bが配設されている。また、第２ステージ８は、第１ステージ７のガイドレール１０aによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第１ガイド部材１１と、ガイドレール１０bによって案内されて上記第１走査方向に往復動する第２ガイド部材１２とを有している。 The first stage 7 constituting the scanning stage 6 is provided with two guide rails 10a and 10b extending in the first scanning direction and facing each other at a constant interval. The second stage 8 is guided by the guide rail 10a of the first stage 7 and reciprocates in the first scanning direction. The second stage 8 is guided by the guide rail 10b and reciprocates in the first scanning direction. And a second guide member 12 that moves.

上記第２ステージ８を構成する第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２との間には、上記第１走査方向に直交する第２走査方向に延在すると共に、一定の間隔で互いに対向する２本のガイドシャフト１３a,１３bが配設されている。また、走査モジュール９には、ガイドシャフト１３a,１３bが挿通される孔が設けられている。そして、走査モジュール９は、ガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に往復動するようになっている。 Between the first guide member 11 and the second guide member 12 constituting the second stage 8, the second stage 8 extends in the second scanning direction orthogonal to the first scanning direction and faces each other at a constant interval. Two guide shafts 13a and 13b are provided. Further, the scanning module 9 is provided with holes through which the guide shafts 13a and 13b are inserted. The scanning module 9 is guided by the guide shafts 13a and 13b and reciprocates in the second scanning direction.

上記構成を有する走査ステージ６による走査方法は、先ず、上記第２ステージ８の第１ガイド部材１１と第２ガイド部材１２とがガイドレール１０a,１０bによって案内されて上記第１走査方向に移動して、第２ステージ８の第１ステージ７に対する位置決めが行われる。そうした後に、走査モジュール９がガイドシャフト１３a,１３bによって案内されて上記第２走査方向に移動して、走査モジュール９の第２ステージ８に対する位置決めが行われる。以後、上記動作を繰り返すことによって、サンプル１６上を二次元に走査するのである。 In the scanning method using the scanning stage 6 having the above-described configuration, first, the first guide member 11 and the second guide member 12 of the second stage 8 are guided by the guide rails 10a and 10b and moved in the first scanning direction. Thus, the positioning of the second stage 8 with respect to the first stage 7 is performed. After that, the scanning module 9 is guided by the guide shafts 13a and 13b and moved in the second scanning direction, and the scanning module 9 is positioned with respect to the second stage 8. Thereafter, the above operation is repeated to scan the sample 16 two-dimensionally.

また、具体的な説明は省略するが、上記筺体を成す本体２のサンプル台４下部における走査ステージ６よりも更に下側には、第２ステージ８の第１,第２ガイド部材１１,１２を上記第１走査方向に、走査モジュール９を上記第２走査方向に移動させるためのモータ,歯付ベルト,ボールねじ,歯車,制御基板,電源および配線等の走査装置が設置されている。 Although not described in detail, the first and second guide members 11 and 12 of the second stage 8 are provided below the scanning stage 6 below the sample stage 4 of the main body 2 constituting the casing. In the first scanning direction, scanning devices such as a motor, a toothed belt, a ball screw, a gear, a control board, a power source and wiring for moving the scanning module 9 in the second scanning direction are installed.

図３は、上記第２ステージ８の上に載置される走査モジュール９の概略構成を示す縦断面図である。また、図４は、走査モジュール９の外観を示す斜視図である。 FIG. 3 is a longitudinal sectional view showing a schematic configuration of the scanning module 9 placed on the second stage 8. FIG. 4 is a perspective view showing the appearance of the scanning module 9.

図３において、上記走査モジュール９の上部には、サンプル台(ガラス)４の近傍に位置して、サンプル台４上にセットされたサンプル１６からの蛍光を集光する対物レンズ１７を配置している。さらに、対物レンズ１７の光軸と励起光の光源１８の光軸とが直交する位置には、光源１８から出射されて第１レンズ１９で集光されたレーザ光等の励起光を対物レンズ１７に入射するように反射させる上記光路変換部としてのプリズム２０を配置している。 In FIG. 3, an objective lens 17 for concentrating the fluorescence from the sample 16 set on the sample table 4 is disposed on the scanning module 9 in the vicinity of the sample table (glass) 4. Yes. Further, at a position where the optical axis of the objective lens 17 and the optical axis of the light source 18 for excitation light are orthogonal, excitation light such as laser light emitted from the light source 18 and condensed by the first lens 19 is applied to the objective lens 17. The prism 20 serving as the optical path conversion unit that reflects the light so as to enter the light is disposed.

上記光源１８,第１レンズ１９,プリズム２０および対物レンズ１７によって構成される上記第１光学系としての励起光学系は、上記第１支持体としての金属枠２１に固定・支持されている。そのために、光源１８の放熱性が良く、励起光学系は熱変形しにくい構造になっている。したがって、光源１８から出射された励起光を、サンプル１６上の微小な１点に対して、ずれることなく集光させることができる。また、サンプル１６上の１点に対するずれが少ないため、プリズム２０の長手方向(第１レンズ１９の光軸に直交する方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くして、小さくすることが可能である。 The excitation optical system as the first optical system including the light source 18, the first lens 19, the prism 20, and the objective lens 17 is fixed and supported on a metal frame 21 as the first support. Therefore, the heat dissipation of the light source 18 is good, and the excitation optical system has a structure that is not easily thermally deformed. Therefore, the excitation light emitted from the light source 18 can be condensed with respect to one minute point on the sample 16 without shifting. Further, since there is little deviation with respect to one point on the sample 16, the length of the prism 20 in the longitudinal direction (direction perpendicular to the optical axis of the first lens 19) is short, and the width in the direction perpendicular to the longitudinal direction is narrowed. And can be made smaller.

ここで、図３においては、上記金属枠２１内に上記励起光学系を収納して上記励起光学系を支持するようにしている。しかしながら、図４に示すように、上記励起光学系を成す光源１８,第１レンズ１９,プリズム２０および対物レンズ１７を、上記第１支持体としての金属体３３(網掛け領域)上に載置して固定し、支持するようにしてもよい。 Here, in FIG. 3, the excitation optical system is housed in the metal frame 21 to support the excitation optical system. However, as shown in FIG. 4, the light source 18, the first lens 19, the prism 20, and the objective lens 17 constituting the excitation optical system are placed on a metal body 33 (shaded area) as the first support. Then, it may be fixed and supported.

また、図３において、上記対物レンズ１７の光軸上におけるプリズム２０の下方には、プリズム２０側から順に、対物レンズ１７によって集光されたサンプル１６からの蛍光を平行光に変換する上記変換レンズである第２レンズ２２、励起光カット用の波長フィルタ２３、波長フィルタ２３を通過した蛍光を集光する第３レンズ２４、および、第３レンズ２４を通過した蛍光の迷光をカットするピンホール２５が配置されている。さらに、対物レンズ１７の光軸上におけるピンホール２５の下方には、ピンホール２５を通過した蛍光を検出する上記検出素子を含む検出器２６が配置されている。 In FIG. 3, below the prism 20 on the optical axis of the objective lens 17, the conversion lens that converts fluorescence from the sample 16 collected by the objective lens 17 into parallel light in order from the prism 20 side. The second lens 22, the excitation light-cutting wavelength filter 23, the third lens 24 that collects the fluorescence that has passed through the wavelength filter 23, and the pinhole 25 that cuts off the stray light of the fluorescence that has passed through the third lens 24. Is arranged. Further, below the pinhole 25 on the optical axis of the objective lens 17, a detector 26 including the detection element that detects fluorescence that has passed through the pinhole 25 is disposed.

上記第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４,ピンホール２５および検出器２６によって構成される上記第２光学系としての検出光学系は、上記第２支持体としての樹脂枠２７に固定・支持されている。 The detection optical system as the second optical system constituted by the second lens 22, the wavelength filter 23, the third lens 24, the pinhole 25 and the detector 26 is fixed to a resin frame 27 as the second support.・ Supported.

この場合も、図３においては、上記樹脂枠２７内に検出器２６を収納して検出器２６を支持するようにしている。しかしながら、図４に示すように、検出器２６を、樹脂枠２７(ハッチング領域)の底面に固定して、支持するようにしてもよい。 Also in this case, in FIG. 3, the detector 26 is accommodated in the resin frame 27 to support the detector 26. However, as shown in FIG. 4, the detector 26 may be supported by being fixed to the bottom surface of the resin frame 27 (hatched area).

上述したように、図３において、蛍光の直径は大きいため、検出光学系には大口径の第２レンズ２２および第３レンズ２４を使用する。その場合、大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を金属で作成すると検出光学系の重量が増し、走査モジュール９の高速走査が困難となり、走査時間が長くなる。 As described above, in FIG. 3, since the fluorescence diameter is large, the second lens 22 and the third lens 24 having a large aperture are used in the detection optical system. In that case, if the frame for supporting the large-diameter lenses 22 and 24 is made of metal, the weight of the detection optical system increases, making it difficult to scan the scanning module 9 at a high speed and increasing the scanning time.

一方において、上記大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を、軽量化のために何の工夫もなく樹脂枠２７にすると、枠２７が歪むことによって上記検出光学系の光軸が設計位置からずれ、検出光学系の所望の性能を得ることができない。 On the other hand, if the frame supporting the large-diameter lenses 22 and 24 is made the resin frame 27 without any contrivance for weight reduction, the optical axis of the detection optical system is moved from the design position by distorting the frame 27. Therefore, the desired performance of the detection optical system cannot be obtained.

そこで、本実施の形態においては、上記検出光学系の光軸を鉛直方向になるようにし、尚且つ上記検出光学系を支持する樹脂枠２７を金属枠２１の下面に垂下するように取り付けている。こうすることで、大口径のレンズ２２,２４を支持する枠を樹脂枠２７として軽量化図った場合でも、上記検出光学系の変形は光軸方向のみに限定され、自重による光軸のずれを小さくすることができるのである。 Therefore, in the present embodiment, the optical axis of the detection optical system is set in the vertical direction, and the resin frame 27 that supports the detection optical system is attached to the lower surface of the metal frame 21. . In this way, even when the frame supporting the large-diameter lenses 22 and 24 is reduced in weight as the resin frame 27, the deformation of the detection optical system is limited only in the optical axis direction, and the optical axis shift due to its own weight is prevented. It can be made smaller.

上記構成を有する走査モジュール９では、光源１８から出射された励起光は、第１レンズ１９で収束され、次いでプリズム２０によって反射されて、対物レンズ１７およびサンプル台４を通過して、サンプル１６における下面上の一点に集光される。その場合、プリズム２０の長手方向(第１レンズ１９の光軸に直交する方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、光源１８からの励起光は対物レンズ１７の光軸付近(励起光透過部)のみを通過するようになっている。 In the scanning module 9 having the above configuration, the excitation light emitted from the light source 18 is converged by the first lens 19, then reflected by the prism 20, passes through the objective lens 17 and the sample stage 4, and passes through the sample 16. It is condensed at one point on the lower surface. In that case, the length of the prism 20 in the longitudinal direction (direction orthogonal to the optical axis of the first lens 19) is short, the width in the direction orthogonal to the longitudinal direction is narrow, and the excitation light from the light source 18 is the objective light. Only the vicinity of the optical axis of the lens 17 (excitation light transmitting portion) passes therethrough.

上記蛍光は、サンプル１６における上記励起光が照射された部分から周囲に等方的に出射される。そして、出射された蛍光のうちのガラスで成るサンプル台４を透過して対物レンズ１７に入射した成分が、対物レンズ１７,第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４およびピンホール２５を通過して、検出器２６によって検出される。そして、検出器２６で検出された信号は、内蔵されるＡＤ変換器等によってＡＤ変換等の処理が施された後に、ＰＣ５へ送出される。こうして、サンプル１６上の各測定点での蛍光強度の分布が内部メモリ等に記録される。 The fluorescence is isotropically emitted from the portion of the sample 16 irradiated with the excitation light to the periphery. The component of the emitted fluorescent light that has passed through the sample stage 4 made of glass and entered the objective lens 17 passes through the objective lens 17, the second lens 22, the wavelength filter 23, the third lens 24, and the pinhole 25. Passed through and detected by detector 26. Then, the signal detected by the detector 26 is subjected to processing such as AD conversion by a built-in AD converter or the like, and then sent to the PC 5. In this way, the fluorescence intensity distribution at each measurement point on the sample 16 is recorded in the internal memory or the like.

ここで、上述したように、上記対物レンズ１７を通過した蛍光は、収束光となって第２レンズ２２の方向に導かれる。そして、第２レンズ２２によって実質的に平行光になるように屈折される。また、第３レンズ２４は蛍光を集光する。また、ピンホール２５は空間的に迷光をカットするために配置される。尚、励起光カット用の波長フィルタ２３は、例えば回転フォルダ２８(図４参照)等に配置されて、励起光の波長に応じて他の波長のフィルタ２３aと交換可能になっている。 Here, as described above, the fluorescence that has passed through the objective lens 17 becomes convergent light and is guided toward the second lens 22. Then, the light is refracted by the second lens 22 so as to be substantially parallel light. The third lens 24 collects the fluorescence. Moreover, the pinhole 25 is arrange | positioned in order to cut a stray light spatially. The wavelength filter 23 for cutting the excitation light is disposed, for example, in the rotary folder 28 (see FIG. 4) and can be replaced with a filter 23a having another wavelength according to the wavelength of the excitation light.

図３に示すように、上記対物レンズ１７における光軸を含む中央部分は、通常の凸レンズの機能(屈折のみで光を偏向)を有する凸レンズ部２９となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうち、放射角度の小さい蛍光は、この凸レンズ部２９の部分を通過して検出器２６に向かって集光される。 As shown in FIG. 3, the central portion including the optical axis in the objective lens 17 is a convex lens portion 29 having a function of a normal convex lens (light is deflected only by refraction). Of the fluorescence emitted from the sample 16, the fluorescence having a small emission angle passes through the convex lens portion 29 and is condensed toward the detector 26.

上記対物レンズ１７における凸レンズ部２９の周囲は、下方に向かって開いた円錐台形の筒状体ミリ波送信装置となっている。そして、サンプル１６から出射された蛍光のうちの、凸レンズ部２９に入りきらないような放射角度の大きい蛍光は、筒状体３０の上端面から筒状体３０内に入射し、筒状体３０の外周面で全反射されて光軸側に偏向され、筒状体３０の下端面から検出器２６に向かって出射される。 The periphery of the convex lens portion 29 in the objective lens 17 is a truncated cone-shaped cylindrical millimeter wave transmitter that opens downward. Then, of the fluorescence emitted from the sample 16, fluorescence having a large radiation angle that does not enter the convex lens portion 29 enters the cylindrical body 30 from the upper end surface of the cylindrical body 30, and the cylindrical body 30. Are totally reflected on the outer peripheral surface of the light source, deflected toward the optical axis, and emitted from the lower end surface of the cylindrical body 30 toward the detector 26.

すなわち、本実施の形態においては、上記凸レンズ部２９で上記中央部分を構成し、筒状体３０で上記周辺部分を構成しているのである。 That is, in the present embodiment, the convex lens portion 29 constitutes the central portion, and the cylindrical body 30 constitutes the peripheral portion.

以上のごとく、上記サンプル１６から出射された蛍光のうち、凸レンズ部２９に入りきらないような放射角度の大きい蛍光を、筒状体３０の外周面で全反射させることにより、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができる。そのため、検出器２６の感度アップを図ることができるのである。 As described above, among the fluorescent light emitted from the sample 16, fluorescent light having a large radiation angle that does not enter the convex lens portion 29 is totally reflected on the outer peripheral surface of the cylindrical body 30, so that the normal convex lens collects the fluorescent light. Light with a large radiation angle that cannot be emitted can be collected. Therefore, the sensitivity of the detector 26 can be increased.

上記金属枠２１には、例えば歯付ベルト等の上記走査装置が接続されている。また、金属枠２１における互いに対向する側面２１a,２１a(図３では、一方の側面２１aのみが現れている)には、ガイドシャフト挿通用の穴が２つ設けられており、この穴に２本のガイドシャフト１３a,１３bが挿通されて水平に配置されている。さらに、上記検出光学系を支持する樹脂枠２７は、上記励起光学系を支持する金属枠２１の下面に、対物レンズ１７の光軸と上記検出光学系の光軸とが一致するように取り付けられて、鉛直方向に垂下されている。こうすることによって、樹脂枠２７は軽く、重心は金属枠２１側にあるため、上記走査装置によって走査する際に走査モジュール９のねじれや振動を抑えることができるのである。 The metal frame 21 is connected to the scanning device such as a toothed belt. Further, two side holes 21a, 21a (only one side surface 21a appears in FIG. 3) facing each other in the metal frame 21 are provided with two guide shaft insertion holes. Two holes are provided in these holes. The guide shafts 13a and 13b are inserted horizontally. Furthermore, the resin frame 27 that supports the detection optical system is attached to the lower surface of the metal frame 21 that supports the excitation optical system so that the optical axis of the objective lens 17 and the optical axis of the detection optical system coincide with each other. And is suspended vertically. By doing so, since the resin frame 27 is light and the center of gravity is on the metal frame 21 side, twisting and vibration of the scanning module 9 can be suppressed when scanning by the scanning device.

以上のごとく、本実施の形態においては、励起光の光源１８を、走査モジュール９の励起光学系に組み込んで、一体化している。このように、光源１８を走査モジュール９に内蔵することによって、外部光源からの励起光を光ファイバーやミラー等を用いて走査モジュール内に導入するよりも光利用率を向上させ、構造的にも簡略化が可能になる。但し、光源１８を走査モジュール９に内蔵することによって、走査モジュール９の重量増加,光学精度の低下および発熱等の問題が発生する。 As described above, in the present embodiment, the excitation light source 18 is integrated into the excitation optical system of the scanning module 9. Thus, by incorporating the light source 18 in the scanning module 9, the light utilization rate is improved and the structure is simplified as compared with the case where the excitation light from the external light source is introduced into the scanning module using an optical fiber or a mirror. Can be realized. However, by incorporating the light source 18 in the scanning module 9, problems such as an increase in weight of the scanning module 9, a decrease in optical accuracy, and heat generation occur.

そこで、本実施の形態では、上記光源１８,プリズム２０および対物レンズ１７で構成される上記励起光学系を、金属枠２１で支持している。 Therefore, in the present embodiment, the excitation optical system including the light source 18, the prism 20, and the objective lens 17 is supported by the metal frame 21.

上記検出光学系へ向かう蛍光を遮らないようにするためには、プリズム２０を小さくする必要があり、サンプル１６への励起光照射位置にも精度が求められるため、励起光の光路には非常に高い精度が求められる。これは、蛍光は励起光照射位置を中心とした点光源と見なされ、点光源から広角で放射された蛍光を近接させた対物レンズ１７で捕集するため、点光源と対物レンズ１７との位置関係がわずかにずれただけでも集光効率が大幅に低下するからである。これらの理由より、上記励起光学系を剛性の高い金属枠２１で支持する必要がある。また、光源１８からの発熱が内部にこもらないように枠２１を金属製とすることが望ましい。 In order not to block the fluorescence toward the detection optical system, it is necessary to make the prism 20 small and the accuracy of the excitation light irradiation position on the sample 16 is also required. High accuracy is required. This is because the fluorescence is regarded as a point light source with the excitation light irradiation position as the center, and the fluorescence emitted from the point light source at a wide angle is collected by the objective lens 17 in the proximity, so the position of the point light source and the objective lens 17 is This is because even if the relationship is slightly shifted, the light collection efficiency is greatly reduced. For these reasons, it is necessary to support the excitation optical system with a highly rigid metal frame 21. Further, it is desirable that the frame 21 is made of metal so that heat generated from the light source 18 is not trapped inside.

これに対し、上記第２レンズ２２,波長フィルタ２３,第３レンズ２４,ピンホール２５および検出器２６によって構成される検出光学系は、樹脂枠２７で支持している。その場合、大口径の第２レンズ２２および第３レンズ２４を使用しても光軸が設計位置からずれないように、検出光学系を鉛直方向に直列に配列して光軸を対物レンズ１７の光軸に一致させ、樹脂枠２７を上記励起光学系の金属枠２１に対して鉛直方向に垂下して取り付けられている。 On the other hand, a detection optical system including the second lens 22, the wavelength filter 23, the third lens 24, the pinhole 25 and the detector 26 is supported by a resin frame 27. In this case, the detection optical system is arranged in series in the vertical direction so that the optical axis does not deviate from the design position even when the second lens 22 and the third lens 24 having a large aperture are used, and the optical axis is aligned with that of the objective lens 17. The resin frame 27 is attached vertically to the metal frame 21 of the excitation optical system so as to coincide with the optical axis.

上記対物レンズ１７によって鉛直下向きに集光される光は、第２レンズ２２を通過する以前においても平行光に近く、対物レンズ１７以降の検出光学系の各光学素子は位置ずれに対して非常に大きな公差をもっている。さらに、上記検出光学系が上記励起光学系に対して鉛直方向に垂下する構造であれば、枠体の剛性が低くとも上記検出光学系の検出精度の低下は起こりにくい。このように、上記検出光学系は金属枠２１に対して垂下した構成にすることによって、上記検出光学系の各部材同士を剛性体で支える必要がない。そのために、上述したように、上記検出光学系の垂下方向と上記検出光学系の光軸方向とが同一であることが、光軸のずれ等が発生しにくい(垂下方向への伸び縮みは起こる可能性はあるが光軸はずれない)ため望ましい。 The light focused vertically downward by the objective lens 17 is close to parallel light even before passing through the second lens 22, and each optical element of the detection optical system after the objective lens 17 is very sensitive to positional deviation. Has a large tolerance. Furthermore, if the detection optical system has a structure that hangs down in the vertical direction with respect to the excitation optical system, the detection accuracy of the detection optical system is hardly lowered even if the rigidity of the frame is low. As described above, the detection optical system is configured to be suspended from the metal frame 21, so that it is not necessary to support the members of the detection optical system with a rigid body. For this reason, as described above, if the hanging direction of the detection optical system is the same as the optical axis direction of the detection optical system, it is difficult for the optical axis to shift or the like (extension or shrinkage in the hanging direction occurs). This is desirable because there is a possibility, but the optical axis does not deviate.

一方、上記樹脂枠２７は金属枠２１に取り付けられるため、上記検出光学系の重量が増加すると金属枠２１に対する負荷が大きくなり、本蛍光検出装置の走査時における振動等によって上段に位置する上記励起光学系の位置精度が低下しやすくなる。したがって、上記検出光学系を固定・支持する枠体は、剛性を犠牲にしてでも樹脂によって軽量化した方が検出精度を高めやすいのである。また、軽量化によって上記走査装置の構造を簡略化でき、本蛍光検出装置の小型化やコストの削減を図ることが可能になる。 On the other hand, since the resin frame 27 is attached to the metal frame 21, when the weight of the detection optical system increases, the load on the metal frame 21 increases, and the excitation located in the upper stage due to vibrations or the like during scanning of the fluorescence detection apparatus. The positional accuracy of the optical system tends to be lowered. Therefore, the frame for fixing and supporting the detection optical system is easier to improve the detection accuracy if it is made lighter by resin even if the rigidity is sacrificed. In addition, the structure of the scanning device can be simplified by reducing the weight, and the fluorescent detection device can be reduced in size and cost.

また、上記サンプル１６の表面を二次元に走査する場合、上記走査装置の振動等の影響を考慮する必要がある。そこで、本実施の形態においては、上記走査装置を、剛性の高い金属枠２１に接続・固定している。したがって、上記走査装置の振動等による上記励起光学系への光学的な位置ずれが、発生しにくくなっている。 Further, when the surface of the sample 16 is scanned two-dimensionally, it is necessary to consider the influence of the vibration of the scanning device. Therefore, in the present embodiment, the scanning device is connected and fixed to the highly rigid metal frame 21. Therefore, an optical positional shift to the excitation optical system due to vibrations of the scanning device is less likely to occur.

また、上記対物レンズ１７を、中央部分に凸レンズ部２６を有すると共に、凸レンズ部２９の周囲に円錐台形の筒状体３０を有するように構成している。したがって、サンプル１６から出射された蛍光のうち、凸レンズ部２９に入りきらないような放射角度の大きい蛍光を、筒状体３０の外周面で全反射させて集光することができ、通常の凸レンズでは集光できないような大きな放射角度の光をも集めることができる。その結果、上記蛍光の集光率を高めることができ、対物レンズ１７の光軸上に配置されたプリズム２０で遮られて検出器２６によって検出されない蛍光の存在によるＳ/Ｎの低下を防止して、高感度な蛍光情報読み取り装置を実現することができる。 Further, the objective lens 17 is configured to have a convex lens portion 26 at the central portion and a truncated cone-shaped cylindrical body 30 around the convex lens portion 29. Therefore, of the fluorescence emitted from the sample 16, the fluorescence having a large radiation angle that does not enter the convex lens portion 29 can be totally reflected by the outer peripheral surface of the cylindrical body 30 to be condensed. Then, it is possible to collect light with a large radiation angle that cannot be collected. As a result, the concentration ratio of the fluorescence can be increased, and a decrease in S / N due to the presence of fluorescence that is blocked by the prism 20 arranged on the optical axis of the objective lens 17 and is not detected by the detector 26 is prevented. Thus, a highly sensitive fluorescence information reader can be realized.

さらに、上記大きな放射角度の蛍光を高いＮＡの通常の凸レンズで集光する場合よりも対物レンズ１７を小型に構成することができる。また、対物レンズ１７は、サンプル１６からの蛍光を集光して第２レンズ２２に入射するので、蛍光を検出器２６に導く光路上に設置される第２レンズ２２,波長フィルタ２３および第３レンズ２４等の光学素子をも小型にすることが可能になる。したがって走査モジュール９の軽量化を図って高速走査を可能にすることができる。したがって、サンプル１６における異なる複数の位置での二次元の蛍光分布を高速に検出することが可能になる。 Furthermore, the objective lens 17 can be made smaller than the case where the fluorescent light having a large radiation angle is collected by a normal convex lens having a high NA. Further, since the objective lens 17 condenses the fluorescence from the sample 16 and enters the second lens 22, the second lens 22, the wavelength filter 23, and the third installed on the optical path that guides the fluorescence to the detector 26. An optical element such as the lens 24 can also be reduced in size. Therefore, it is possible to reduce the weight of the scanning module 9 and enable high-speed scanning. Therefore, it is possible to detect a two-dimensional fluorescence distribution at a plurality of different positions in the sample 16 at high speed.

尚、上記説明においては、１つの光源１８からの励起光をサンプル１６に照射するようにしている。しかしながら、図４に示すように、光源を第１光源１８,第２光源３１,第３光源３２のように複数設けて、サンプル１６上の生体由来物質を標識している蛍光物質の波長に応じて、波長の異なる励起光を切り換え照射するようにしても差し支えない。 In the above description, the sample 16 is irradiated with excitation light from one light source 18. However, as shown in FIG. 4, a plurality of light sources such as the first light source 18, the second light source 31, and the third light source 32 are provided, and according to the wavelength of the fluorescent substance that labels the biological substance on the sample 16. Thus, it is possible to switch and irradiate excitation light having different wavelengths.

また、上記実施の形態においては、上記第１支持体を金属枠２１あるいは金属体３３で構成する一方、上記第２支持体を樹脂枠２７で構成している。しかしながら、この発明はこれに限定されるものではなく、上記第１支持体は、上記第２支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きい材質で構成されていればよい。 In the above-described embodiment, the first support is configured by the metal frame 21 or the metal body 33, while the second support is configured by the resin frame 27. However, the present invention is not limited to this, and the first support is made of a material having higher rigidity per unit volume and higher weight per unit volume than the material of the second support. Just do it.

１…蛍光検出装置、
４…サンプル台、
５…ＰＣ、
６…走査ステージ、
７…第１ステージ、
８…第２ステージ、
９…走査モジュール、
１３a,１３b…ガイドシャフト、
１６…サンプル、
１７…対物レンズ、
１８,３１,３２…光源、
１９…第１レンズ、
２０…プリズム、
２１…金属枠、
２２…第２レンズ、
２３,２３a…波長フィルタ、
２４…第３レンズ、
２５…ピンホール、
２６…検出器、
２７…樹脂枠、
２８…回転フォルダ、
２９…凸レンズ部、
３０…筒状体、
３３…金属体。 1 ... fluorescence detection device,
4 ... Sample stand
5 ... PC,
6 ... Scanning stage,
7 ... 1st stage,
8 ... Second stage,
9 ... Scanning module,
13a, 13b ... guide shaft,
16 ... sample,
17 ... Objective lens,
18, 31, 32 ... light source,
19 ... first lens,
20 ... Prism,
21 ... Metal frame,
22 ... second lens,
23, 23a ... wavelength filter,
24 ... Third lens,
25 ... pinhole,
26 ... detector,
27 ... Resin frame,
28 ... Rotating folder,
29 ... convex lens part,
30 ... cylindrical body,
33 ... Metal body.

Claims

蛍光を励起する励起光を水平方向に出射する光源と、
上記励起光の進行方向を鉛直上方に変換する光路変換部と、
上記光路変換部からの上記励起光を透過させて検出対象物に照射すると共に、上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を鉛直下方に向かって集光する対物レンズ素子と
を含む第１光学系と、
上記対物レンズ素子によって集光された蛍光を、実質的に平行光に変換する変換レンズと、
上記変換レンズからの実質的に平行な蛍光が入射されると共に、上記励起光の波長と同等の波長成分の光を減光する波長フィルタと、
上記波長フィルタからの蛍光を検出する光検出素子と
を含む第２光学系と
を備え、
上記第１光学系の各構成要素は第１支持体によって支持される一方、上記第２光学系の各構成要素は第２支持体によって支持されており、
上記第１支持体の材質は、上記第２支持体の材質よりも単位体積当たりの剛性が高く、且つ単位体積当たり重量が大きく、
上記第２支持体は、上記第１支持体に対して垂下するように取り付けられている
ことを特徴とする蛍光検出装置。 A light source that horizontally emits excitation light that excites fluorescence;
An optical path conversion unit that converts the traveling direction of the excitation light vertically upward;
An objective lens element that transmits the excitation light from the optical path changing unit and irradiates the detection target, and condenses the fluorescence emitted from the detection target vertically downward based on the irradiation of the excitation light A first optical system including:
A conversion lens that converts the fluorescence collected by the objective lens element into substantially parallel light;
A substantially parallel fluorescent light from the conversion lens is incident, and a wavelength filter for dimming light having a wavelength component equivalent to the wavelength of the excitation light;
A second optical system including a light detection element for detecting fluorescence from the wavelength filter,
Each component of the first optical system is supported by a first support, while each component of the second optical system is supported by a second support,
The material of the first support is higher in rigidity per unit volume and larger in weight per unit volume than the material of the second support,
The fluorescence detection apparatus, wherein the second support is attached so as to hang down with respect to the first support.

請求項１に記載の蛍光検出装置において、
上記第２光学系は、上記変換レンズと上記波長フィルタと上記光検出素子とが鉛直方向に上記の順で直列に配列して、上記第２支持体によって支持されている
ことを特徴とする蛍光検出装置。 In the fluorescence detection apparatus according to claim 1,
The second optical system is characterized in that the conversion lens, the wavelength filter, and the photodetecting element are arranged in series in the above order in the vertical direction and supported by the second support. Detection device.

請求項１あるいは請求項２に記載の蛍光検出装置において、
上記第１支持体の材質は金属であり、上記第２支持体の材質は樹脂である
ことを特徴とする蛍光検出装置。 In the fluorescence detection device according to claim 1 or 2,
The fluorescence detection apparatus according to claim 1, wherein the material of the first support is metal, and the material of the second support is resin.

請求項１から請求項３までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記検出対象物に対して相対的に移動可能な走査装置によって駆動されて、上記検出対象物上を二次元に走査する走査モジュールを備え、
上記第１支持体は、上記走査モジュールに含まれると共に、上記走査装置に接続されている
ことを特徴とする蛍光検出装置。 In the fluorescence detection device according to any one of claims 1 to 3,
A scanning module which is driven by a scanning device movable relative to the detection object and scans the detection object in two dimensions;
The fluorescence detection device, wherein the first support is included in the scanning module and connected to the scanning device.

請求項１から請求項４までの何れか一つに記載の蛍光検出装置において、
上記対物レンズ素子は、
屈折によって光を集光する中央部分と、この中央部分の周辺に位置して全反射によって光を集光する周辺部分とを含んで構成されており、
上記中央部分の少なくとも一部は、上記励起光を透過させる励起光透過部となっている
ことを特徴とする蛍光検出装置。 In the fluorescence detection device according to any one of claims 1 to 4,
The objective lens element is
It is configured to include a central portion that collects light by refraction and a peripheral portion that is located around the central portion and collects light by total reflection.
At least a part of the central portion is an excitation light transmitting portion that transmits the excitation light.

請求項１から請求項５までの何れか一つに記載の蛍光検出装置における上記第１光学系により、
上記光源部から、蛍光を励起する励起光を水平方向に出射し、
上記光源部からの励起光の進行方向を、上記光路変換部によって、鉛直上方に変換し、
上記光路変換部からの上記励起光を、上記対物レンズ素子を透過させて、検出対象物に照射し、
上記励起光の照射に基づいて上記検出対象物から発せられた蛍光を、上記対物レンズ素子によって鉛直下方に向かって集光し、
さらに、上記蛍光検出装置における上記第２光学系により、
上記変換レンズによって、上記対物レンズ素子で集光された蛍光を実質的に平行光に変換し、
上記波長フィルタによって、上記変換レンズで変換された実質的に平行な蛍光から上記励起光の波長と同等の波長成分の光を減光し、
上記光検出素子によって、上記波長フィルタからの蛍光を検出する
ことを特徴とする蛍光検出方法。 By the first optical system in the fluorescence detection device according to any one of claims 1 to 5,
From the light source part, the excitation light that excites fluorescence is emitted in the horizontal direction,
The traveling direction of the excitation light from the light source unit is converted vertically upward by the optical path conversion unit,
The excitation light from the optical path changing unit is transmitted through the objective lens element and irradiated to a detection target,
Fluorescence emitted from the detection object based on the irradiation of the excitation light is condensed vertically downward by the objective lens element,
Furthermore, by the second optical system in the fluorescence detection device,
The conversion lens converts the fluorescent light collected by the objective lens element into substantially parallel light,
The wavelength filter attenuates light having a wavelength component equivalent to the wavelength of the excitation light from the substantially parallel fluorescence converted by the conversion lens,
A fluorescence detection method, wherein fluorescence from the wavelength filter is detected by the light detection element.