JP2013178140A - Isolation device of nucleic acid-protein complex - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微量の核酸−タンパク質複合体の単離に好適な、核酸−タンパク質複合体の単離装置に関する。 The present invention relates to a nucleic acid-protein complex isolation apparatus suitable for isolation of a small amount of nucleic acid-protein complex.
近年、医学、工学、薬学、理学、農学等の生命科学分野において、核酸とタンパク質との相互作用を、迅速、定量的及び網羅的に再現性良く分析するための新たな技術が求められている。
核酸とタンパク質との相互作用は、主として二つの機構から説明することができる。一つは、タンパク質を主体、核酸を客体として位置付け、転写因子と呼ばれるタンパク質が特定の塩基配列のプロモーターやエンハンサーを認識し、ここへ結合する転写制御と呼ばれる機構である。ヒトの場合、約１８００の転写因子が知られており、これらは、代謝、免疫、知覚、運動等の様々な生命活動をコントロールする役割を担っている。
In recent years, in the life science fields such as medicine, engineering, pharmacy, science, agriculture, etc., there is a demand for new techniques for analyzing the interaction between nucleic acids and proteins quickly, quantitatively and comprehensively with good reproducibility. .
The interaction between nucleic acid and protein can be explained mainly by two mechanisms. One is a mechanism called transcription control in which a protein called a protein, a nucleic acid as an object, a protein called a transcription factor recognizes and binds to a promoter or enhancer having a specific base sequence. In humans, about 1800 transcription factors are known, and these play a role in controlling various life activities such as metabolism, immunity, perception, and movement.
もう一つは、核酸を主体、タンパク質を客体として位置付け、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、核酸医薬と呼ばれる特定の塩基配列とコンフォメーションを有する核酸が、タンパク質の特定部位を認識し、ここへ結合する機構である。このような機構は、例えば、抗体に代わる分子認識素子であるバイオセンサーや、医薬材料として、各種産業での利用が期待されている。 The other is a mechanism in which nucleic acid is the main body, protein is positioned as an object, and nucleic acid having a specific base sequence and conformation called DNA aptamer, RNA aptamer, or nucleic acid medicine recognizes and binds to a specific site of protein. It is. Such a mechanism is expected to be used in various industries, for example, as a biosensor that is a molecular recognition element instead of an antibody or as a pharmaceutical material.
例えば、ＤＮＡとタンパク質との相互作用、又は結合を定量的に分析する手段としては、目的とするＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ−タンパク質複合体）と、その他の夾雑物とを含有する生体試料等の試料から、ＤＮＡ結合タンパク質等の分離精製操作を行なわずに、短時間でＤＮＡ結合タンパク質の含有量を定量する方法と、定量用キットが開示されている（特許文献１参照）。ＤＮＡの塩基配列及びタンパク質の種類が共に既知であれば、上記のような手段で、目的とするＤＮＡ結合タンパク質のみを光学的に補足でき、定量分析を行うことが可能となる。しかし、ＤＮＡの塩基配列及びタンパク質の種類の少なくとも一方が未知の場合には、上記のような手段で、ＤＮＡ結合タンパク質の定量分析を行うことは困難である。 For example, as a means for quantitatively analyzing the interaction or binding between DNA and protein, a sample such as a biological sample containing the target DNA binding protein (DNA-protein complex) and other contaminants Thus, a method for quantifying the content of a DNA-binding protein in a short time without performing a separation and purification operation of the DNA-binding protein and the quantification kit have been disclosed (see Patent Document 1). If both the DNA base sequence and the protein type are known, only the target DNA-binding protein can be optically captured by the above-described means, and quantitative analysis can be performed. However, when at least one of the DNA base sequence and the protein type is unknown, it is difficult to quantitatively analyze the DNA-binding protein by the above-described means.
これに対して、核酸の塩基配列及びタンパク質の種類が共に未知の場合に、核酸とタンパク質との多様な相互作用を分析できる手段として、ＳＤＳ電気泳動又は二次元電気泳動でタンパク質を他の成分から分離し、転写膜へ転写した後、転写膜上で核酸と複合体（核酸−タンパク質複合体）を形成させる方法が開示されており、例えば、転写因子分析のためのサウスウェスタンブロッティング（非特許文献１及び参照）、ＤＮＡアプタマーのスクリーニングのためのアプタマーブロッティング（非特許文献３参照）が知られている。 On the other hand, as a means for analyzing various interactions between nucleic acids and proteins when both the nucleic acid base sequence and the protein type are unknown, the protein is separated from other components by SDS electrophoresis or two-dimensional electrophoresis. A method of forming a complex with a nucleic acid (nucleic acid-protein complex) on a transfer film after separation and transfer to a transfer film has been disclosed. For example, Southwestern blotting for analysis of transcription factors (non-patent literature) 1 and reference), aptamer blotting (see Non-Patent Document 3) for screening of DNA aptamers is known.
ここで、「二次元電気泳動」とは、生体組織や細胞から回収した多様なタンパク質を含む試料に対して、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ電気泳動を行い、シート状のゲルに数百以上のタンパク質を展開する方法である。また、「転写」とは、タンパク質を不安定なゲル中から多孔質膜（転写膜）に電気的作用により移動させる方法である。そして、「核酸−タンパク質複合体」とは、鍵と鍵穴の関係と表現される特異的相互作用によって、タンパク質と核酸とから形成されたものである。通常は、前記複合体形成後に、特定のタンパク質又は核酸に蛍光体等の標識物質を結合させて前記複合体を標識し、これを光学的に検出する。さらに、特異的に相互作用する核酸及びタンパク質のみを転写膜から回収し、シーケンサー分析による核酸の塩基配列の決定、又は質量分析によるタンパク質の構成アミノ酸の解析が行われる。 Here, “two-dimensional electrophoresis” means performing isoelectric focusing in the first dimension and SDS electrophoresis in the second dimension on a sample containing various proteins recovered from biological tissues and cells. In this method, several hundred or more proteins are spread on a sheet-like gel. In addition, “transfer” is a method of transferring proteins from an unstable gel to a porous film (transfer film) by an electrical action. The “nucleic acid-protein complex” is formed from a protein and a nucleic acid by a specific interaction expressed as a relationship between a key and a keyhole. Usually, after the complex is formed, a labeling substance such as a fluorescent substance is bound to a specific protein or nucleic acid to label the complex, and this is optically detected. Further, only the nucleic acid and protein that interact specifically with each other are collected from the transfer membrane, and the base sequence of the nucleic acid is determined by sequencer analysis, or the constituent amino acids of the protein are analyzed by mass spectrometry.
上記の方法では、核酸−タンパク質複合体形成後の転写膜上には、通常、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質が混在している。そして、この後、目的とする核酸−タンパク質複合体に対して、正確なシーケンサー分析及び質量分析を行うためには、不要な核酸及びタンパク質を除去して、核酸−タンパク質複合体のみを単離することが必要不可欠となる。ここで従来は、目的とする核酸−タンパク質複合体を、これが保持されている膜ごとカッターで切り取る方法や、ピッカーと呼ばれる円形中空の刃物によって、膜ごとくり抜く（ピッキング）方法が適用されている。 In the above method, the nucleic acid-protein complex, nucleic acid and protein are usually mixed on the transfer film after the nucleic acid-protein complex is formed. Then, in order to perform accurate sequencer analysis and mass spectrometry on the target nucleic acid-protein complex, unnecessary nucleic acids and proteins are removed and only the nucleic acid-protein complex is isolated. It becomes essential. Heretofore, a method of cutting out the target nucleic acid-protein complex with a cutter with the membrane on which the target nucleic acid-protein complex is held, or a method of picking up the membrane with a circular hollow blade called a picker has been applied.
近年は、分析時間の短縮、試料の少量化、分析の自動化等が求められ、上記の方法でも、二次元電気泳動用ゲルの小型化が進められており、例えば、縦横５ｃｍの小型規格等もあり、このような小型規格で二次元電気泳動を行った場合には、核酸−タンパク質複合体が、ゲルにおいて直径１mm以下の微小なスポットとして分離されることがある。このとき、従来の単離方法では、カッターの細かくて正確な操作が困難であり、ピッカーの中空部の直径が最小で２ｍｍ程度であるため、目的とする核酸−タンパク質複合体だけでなく、その周辺に存在する不要成分も誤って取り出してしまう危険性が高く、目的とする核酸−タンパク質複合体のみを単離することが困難であるという問題点があった。また、目的とする核酸−タンパク質複合体が多数存在する場合には、これらを個別に切り取り又はくり抜きにより単離する必要があり、作業時間、労力及び再現性が実用的ではなく、簡便かつ高精度に単離できないという問題点があった。 In recent years, analysis time has been shortened, sample volume has been reduced, analysis has been automated, etc., and miniaturization of gels for two-dimensional electrophoresis has also been promoted by the above methods. Yes, when two-dimensional electrophoresis is performed according to such a small standard, the nucleic acid-protein complex may be separated as a minute spot having a diameter of 1 mm or less on the gel. At this time, in the conventional isolation method, it is difficult to finely and accurately operate the cutter, and the diameter of the hollow portion of the picker is about 2 mm at the minimum. Therefore, not only the target nucleic acid-protein complex, There is a high risk that unnecessary components present in the vicinity will be erroneously taken out, and it is difficult to isolate only the target nucleic acid-protein complex. In addition, when there are a large number of target nucleic acid-protein complexes, it is necessary to isolate them individually by cutting or hollowing out, and the working time, labor and reproducibility are not practical, simple and highly accurate There was a problem that it could not be isolated.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、部材に保持された微量の核酸−タンパク質複合体を、簡便かつ高精度に単離できる、核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a nucleic acid-protein complex isolation device that can easily and accurately isolate a small amount of a nucleic acid-protein complex held on a member. Is an issue.
上記課題を解決するため、
本発明は、核酸−タンパク質複合体を保持可能な第一の保持部材及び第二の保持部材が積層された保持構造体、並びに前記保持構造体に電圧を印加するための電極及び電源を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持された第一の保持部材から、前記核酸−タンパク質複合体を第二の保持部材に転写して保持することにより、前記核酸−タンパク質複合体が単離可能とされたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
To solve the above problem,
The present invention includes a first holding member capable of holding a nucleic acid-protein complex, a holding structure in which a second holding member is laminated, and an electrode and a power source for applying a voltage to the holding structure, By transferring and holding the nucleic acid-protein complex from the first holding member holding the nucleic acid-protein complex and the nucleic acid and / or protein to the second holding member when a voltage is applied, A nucleic acid-protein complex isolation device is provided, wherein the nucleic acid-protein complex can be isolated.
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記第一の保持部材及び第二の保持部材がシート状であることを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記第一の保持部材と前記第二の保持部材との間に、さらに、前記核酸−タンパク質複合体が透過可能なゲル状媒体が積層されたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記ゲル状媒体が、アクリルアミドゲル又はアガロースゲルであることを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、二次元電気泳動により分離したタンパク質を転写して、さらに前記タンパク質から形成させた核酸−タンパク質複合体を保持する転写部材を、前記第一の保持部材としたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
The present invention also provides the nucleic acid-protein complex isolation device, wherein the first holding member and the second holding member are in sheet form. provide.
Further, the present invention provides the nucleic acid-protein complex isolation device, wherein the nucleic acid-protein complex can be further permeated between the first holding member and the second holding member. An apparatus for isolating a nucleic acid-protein complex, characterized in that a medium is laminated.
The present invention also provides an apparatus for isolating a nucleic acid-protein complex, wherein the gel-like medium is an acrylamide gel or an agarose gel.
Further, the present invention provides a nucleic acid-protein complex isolation device, wherein a transcription member that transcribes a protein separated by two-dimensional electrophoresis and further holds the nucleic acid-protein complex formed from the protein, An isolation device for a nucleic acid-protein complex is provided which is the first holding member.
本発明によれば、部材に保持された微量の核酸−タンパク質複合体を、簡便かつ高精度に単離できる、核酸−タンパク質複合体の単離装置が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the isolation apparatus of a nucleic acid-protein complex which can isolate the trace amount nucleic acid-protein complex hold | maintained at the member simply and with high precision is provided.
本発明に係る核酸−タンパク質複合体の単離装置（以下、「単離装置」と略記することがある）は、核酸−タンパク質複合体を保持可能な第一の保持部材及び第二の保持部材が積層された保持構造体、並びに前記保持構造体に電圧を印加するための電極及び電源を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持された第一の保持部材から、前記核酸−タンパク質複合体を第二の保持部材に転写して保持することにより、前記核酸−タンパク質複合体が単離可能とされたことを特徴とする。
本発明においては、特に断りの無い限り、「転写」とは、前記核酸−タンパク質複合体の第一の保持部材から第二の保持部材への移動を指すものとする。
また、本明細書において、濃度の単位「Ｍ」は、モル／Ｌを意味する。
The nucleic acid-protein complex isolation device according to the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “isolation device”) includes a first holding member and a second holding member capable of holding a nucleic acid-protein complex. Are stacked, and an electrode and a power source for applying a voltage to the holding structure, and the first nucleic acid-protein complex and the nucleic acid and / or protein are held when the voltage is applied. The nucleic acid-protein complex can be isolated by transferring the nucleic acid-protein complex from the holding member to a second holding member.
In the present invention, unless otherwise specified, “transcription” refers to the movement of the nucleic acid-protein complex from the first holding member to the second holding member.
In the present specification, the unit of concentration “M” means mol / L.
本発明において、第一の保持部材に保持された核酸−タンパク質複合体を構成するタンパク質は、分析対象の試料から得られたものである。また、核酸−タンパク質複合体とは異なる、上記の単独のタンパク質（以下、「単独のタンパク質」と略記することがある）には、分析対象の試料から得られたものが少なくとも含まれる。一方、核酸−タンパク質複合体とは異なる上記の単独の核酸（以下、「単独の核酸」と略記することがある）は、必ずしも、分析対象の試料から得られたものではない。 In the present invention, the protein constituting the nucleic acid-protein complex held by the first holding member is obtained from the sample to be analyzed. In addition, the single protein (hereinafter sometimes abbreviated as “single protein”) different from the nucleic acid-protein complex includes at least one obtained from the sample to be analyzed. On the other hand, the above-mentioned single nucleic acid different from the nucleic acid-protein complex (hereinafter sometimes abbreviated as “single nucleic acid”) is not necessarily obtained from the sample to be analyzed.
分析対象の前記試料は、生体から採取した生体由来試料、該生体由来試料を処理して得られた処理試料、人工的に作製した人工試料、これら試料の二種以上を混合して得られた混合試料等が例示できる。 The sample to be analyzed was obtained by mixing a biological sample collected from a living body, a processed sample obtained by processing the biological sample, an artificial sample prepared artificially, and a mixture of two or more of these samples. A mixed sample etc. can be illustrated.
前記複合体中の核酸及びタンパク質は、いずれも、前記単独の核酸及び単独のタンパク質と同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。 The nucleic acid and protein in the complex may be the same type as the single nucleic acid and single protein, or may be different types.
第一の保持部材に保持された、前記複合体中の核酸及びタンパク質、並びに前記単独の核酸及び単独のタンパク質は、いずれも、一種のみでもよいし、二種以上でもよい。 Each of the nucleic acid and protein in the complex and the single nucleic acid and single protein held by the first holding member may be one kind or two or more kinds.
前記複合体中の核酸、及び単独の核酸は、いずれも、天然由来の核酸及び人工合成核酸のいずれでもよく、具体的には、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）だけでなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）等の核酸アナログも例示できる。
そして、前記ＤＮＡ及びＲＮＡとして、具体的には、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、mＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＭｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ＰｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＳｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＳｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等が例示できる。
The nucleic acid in the complex and the single nucleic acid may be any of naturally-occurring nucleic acids and artificially synthesized nucleic acids. Specifically, not only DNA (deoxyribonucleic acid) and RNA (ribonucleic acid) but also peptides Examples also include nucleic acid analogs such as nucleic acid (PNA), glycerol nucleic acid (GNA), and threose nucleic acid (TNA).
As the DNA and RNA, specifically, single-stranded DNA, double-stranded DNA, cDNA, messenger RNA (mRNA), mRNA precursor (pre-mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA) ), Antisense RNA (aRNA), guide RNA (gRNA), MiRNA (miRNA), non-coding RNA (ncRNA), PiRNA (piRNA), ShRNA (shRNA), SiRNA (siRNA) and the like.
前記複合体中のタンパク質、及び単独のタンパク質は、動物由来タンパク質、植物由来タンパク質、微生物由来タンパク質、人工合成タンパク質、これらの二種以上が混成された混成タンパク質、及びこれらタンパク質が糖鎖修飾等の翻訳後修飾を受けた修飾タンパク質のいずれでもよい。 Proteins in the complex and single proteins include animal-derived proteins, plant-derived proteins, microorganism-derived proteins, artificially synthesized proteins, hybrid proteins in which two or more of these are hybridized, and these proteins are sugar chain modified, etc. It may be any modified protein that has undergone post-translational modification.
前記動物由来タンパク質としては、ヒト、実験動物、家畜もしくは培養細胞から得られた組織を構成するタンパク質、又は上記のヒト等から抽出されたタンパク質が例示できる。ここで、前記実験動物としては、キイロショウジョウバエ、線虫、マウス、モルモット、アフリカツメカエル、メダカ、カニクイザル、ニホンザル等が例示できる。
前記植物由来タンパク質としては、農業用植物；トウモロコシ、サトウキビ等のバイオエタノール製造用の植物；薬理効果を有する植物；漢方薬剤の原料植物等が例示できる。
前記微生物由来タンパク質としては、ウイルス、細菌、真菌又は原虫に由来するタンパク質が例示でき、病原性微生物に由来するタンパク質が好ましい。
Examples of the animal-derived protein include proteins constituting tissues obtained from humans, laboratory animals, livestock or cultured cells, or proteins extracted from the above humans and the like. Here, examples of the experimental animal include Drosophila melanogaster, nematodes, mice, guinea pigs, African clover frogs, medaka, cynomolgus monkeys, Japanese monkeys, and the like.
Examples of the plant-derived protein include agricultural plants; plants for producing bioethanol such as corn and sugarcane; plants having a pharmacological effect;
Examples of the microorganism-derived protein include proteins derived from viruses, bacteria, fungi or protozoa, and proteins derived from pathogenic microorganisms are preferred.
（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。ただし、ここでは、単離装置の構成をより判り易く説明するために、一部の構造を分解して示している。
(First embodiment)
FIG. 1 is a schematic view schematically illustrating the isolation device according to the first embodiment of the present invention. However, in order to explain the configuration of the isolation device more easily, a part of the structure is shown in an exploded manner.
ここに示す単離装置１は、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４がこの順に積層され、陰極１３及び陽極１４が、それぞれ電線１８により直流電源装置１５に電気的に接続されて、概略構成されている。第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２が積層されて構成された保持構造体１０をはじめ、陰極１３及び陽極１４の一対の電極間に配置されたものは、直流電源装置１５作動時に、これら電極（陰極１３及び陽極１４）から電圧が印加可能となっている。 In the isolation device 1 shown here, a cathode 13, a first filter paper 16, a first holding member 11, a second holding member 12, a second filter paper 17 and an anode 14 are laminated in this order. 14 are each electrically connected to the DC power supply device 15 by an electric wire 18 and are schematically configured. In addition to the holding structure 10 formed by laminating the first holding member 11 and the second holding member 12, the one arranged between the pair of electrodes of the cathode 13 and the anode 14 is activated when the DC power supply 15 is operated. A voltage can be applied from these electrodes (cathode 13 and anode 14).
陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４は、互いの接触面同士が密着して積層されていればよい。 The cathode 13, the first filter paper 16, the first holding member 11, the second holding member 12, the second filter paper 17, and the anode 14 may be stacked so that their contact surfaces are in close contact with each other.
陰極１３及び陽極１４の材質は公知のものでよく、金、白金、銀、銅等の単体金属；ステンレス等の合金；グラッシーカーボン、グラファイトカーボン等のカーボン（非金属）が例示できる。 The materials of the cathode 13 and the anode 14 may be known materials, and examples thereof include simple metals such as gold, platinum, silver, and copper; alloys such as stainless steel; and carbon (nonmetal) such as glassy carbon and graphite carbon.
陰極１３及び陽極１４は、ここに示すようにプレート状であることが好ましく、その厚さは、それぞれ独立して０．１〜１ｍｍであることが好ましい。 The cathode 13 and the anode 14 are preferably plate-shaped as shown here, and the thickness thereof is preferably independently 0.1 to 1 mm.
陰極１３及び陽極１４は、互いに同一でもよいし、互いに異なっていてもよい。ここで、「陰極及び陽極が互いに異なる」とは、これら電極の構造、材質、厚さ、大きさ及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。 The cathode 13 and the anode 14 may be the same as each other or different from each other. Here, “the cathode and the anode are different from each other” means that at least one of the structure, material, thickness, size, and outer shape of these electrodes is different from each other.
第一の保持部材１１は、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質を保持可能なものであれば、その材質は特に限定されない。ここで、「第一の保持部材１１が、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質を保持可能」とは、陰極１３及び陽極１４へ電圧を印加していない状態で、第一の保持部材１１がこれら分子を有した状態を維持できればよいことを意味し、必ずしもこれら分子が第一の保持部材１１と共有結合を形成している必要はなく、例えば、吸着等の作用により前記分子が維持できることを含む。 The material of the first holding member 11 is not particularly limited as long as it can hold the nucleic acid-protein complex, the nucleic acid, and the protein. Here, “the first holding member 11 can hold the nucleic acid-protein complex, nucleic acid and protein” means that the first holding member 11 is in a state where no voltage is applied to the cathode 13 and the anode 14. This means that it is only necessary to maintain the state having these molecules, and it is not always necessary that these molecules form a covalent bond with the first holding member 11, for example, that the molecules can be maintained by an action such as adsorption. Including.
第一の保持部材１１の材質は、電気泳動で使用されるゲル等の分離媒体から前記分子を転写する転写部材（転写膜）と同様の材質であることが好ましく、疎水性であることがより好ましく、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン等の合成樹脂が例示できる。また、通電性のプレート素材でもよい。 The material of the first holding member 11 is preferably the same material as the transfer member (transfer film) that transfers the molecule from a separation medium such as a gel used in electrophoresis, and is more hydrophobic. Preferable examples include synthetic resins such as polyvinylidene fluoride (PVDF), nitrocellulose, and nylon. Further, a conductive plate material may be used.
第一の保持部材１１の構造としては、繊維状の原材料を用いた織布もしくは不織布、又はマイクロポア構造を有するものが好ましい。 The structure of the first holding member 11 is preferably a woven or non-woven fabric using a fibrous raw material, or a structure having a micropore structure.
第一の保持部材１１は、ここに示すようにシート状であることが好ましく、その厚さは、０．０５〜２ｍｍであることが好ましい。 The first holding member 11 is preferably in the form of a sheet as shown here, and the thickness thereof is preferably 0.05 to 2 mm.
第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の積層方向（図中のＺ方向）に対して直交する二方向（図中のＸ方向及びＹ方向）における第一の保持部材１１の大きさは、目的に応じて任意に設定できるが、前記二方向における辺の長さが、それぞれ独立に１０〜３００ｍｍであることが好ましく、５０〜１００ｍｍであることがより好ましい。 Size of the first holding member 11 in two directions (X direction and Y direction in the drawing) orthogonal to the stacking direction (Z direction in the drawing) of the first holding member 11 and the second holding member 12 Can be arbitrarily set according to the purpose, but the lengths of the sides in the two directions are preferably independently 10 to 300 mm, more preferably 50 to 100 mm.
第一の保持部材１１は、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよく、複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、層の構造、材質、厚さ、大きさ（積層面の面積）及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。 The first holding member 11 may be either a single layer or a plurality of layers (a plurality of layers laminated in the Z direction in the figure). , All may be the same, all may be different, or only some may be the same. Here, “the layers are different” means that at least one of the structure, material, thickness, size (area of the laminated surface) and outer shape of the layers are different from each other.
第一の保持部材１１は、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を転写（以下、「前転写」と略記することがある）した後の転写膜が好適である。すなわち、二次元電気泳動により分離したタンパク質を前転写し、このタンパク質から形成させた核酸−タンパク質複合体を保持した転写部材（転写膜）を、第一の保持部材１１として使用することが好ましい。 The first holding member 11 is preferably a transfer film after molecules have been transferred from a separation medium (gel) after two-dimensional electrophoresis (hereinafter sometimes abbreviated as “pre-transfer”). That is, it is preferable to use, as the first holding member 11, a transfer member (transfer film) that pre-transfers a protein separated by two-dimensional electrophoresis and holds a nucleic acid-protein complex formed from the protein.
第二の保持部材１２は、核酸−タンパク質複合体を保持可能なものであれば、特に限定されず、例えば、材質、構造及び厚さを、第一の保持部材１１と同様とすることができる。ここで、「第二の保持部材１２が、核酸−タンパク質複合体を保持可能」とは、第二の保持部材１２が核酸−タンパク質複合体を有した状態を維持できればよいことを意味し、必ずしも核酸−タンパク質複合体が第二の保持部材１２と共有結合を形成している必要はなく、例えば、吸着等の作用により前記分子が維持できることを含む。 The second holding member 12 is not particularly limited as long as it can hold the nucleic acid-protein complex. For example, the material, structure, and thickness can be the same as those of the first holding member 11. . Here, “the second holding member 12 can hold the nucleic acid-protein complex” means that the second holding member 12 only needs to be able to maintain the state having the nucleic acid-protein complex. The nucleic acid-protein complex does not need to form a covalent bond with the second holding member 12, and includes that the molecule can be maintained by an action such as adsorption.
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、それぞれ公知のものでよい。
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、いずれも、緩衝液又は純水が含浸された状態で使用される。
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、それぞれ、厚さが０．２〜２ｍｍであることが好ましい。
Each of the first filter paper 16 and the second filter paper 17 may be a known one.
Both the first filter paper 16 and the second filter paper 17 are used in a state where they are impregnated with a buffer solution or pure water.
Each of the first filter paper 16 and the second filter paper 17 preferably has a thickness of 0.2 to 2 mm.
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、いずれも、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよいが、複数層からなるものが好ましい。第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７が複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、第一の保持部材１１の場合と同じである。
第一のろ紙１６及び／又は第二のろ紙１７として、複数層からなるものを使用することで、緩衝液又は純水の含浸量が向上し、核酸−タンパク質複合体の第二の保持部材１２への転写を、より安定して行うことができる。
Each of the first filter paper 16 and the second filter paper 17 may be either a single layer or a plurality of layers (a plurality of layers laminated in the Z direction in the figure). What consists of multiple layers is preferable. When the first filter paper 16 and the second filter paper 17 are composed of a plurality of layers, all of these layers may be the same, or all may be different, or only a part may be the same. Here, “the layers are different” is the same as in the case of the first holding member 11.
By using a plurality of layers as the first filter paper 16 and / or the second filter paper 17, the amount of buffer solution or pure water impregnated is improved, and the second holding member 12 of the nucleic acid-protein complex. Can be transferred more stably.
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、互いに同一でもよいし、互いに異なっていてもよい。ここで、「第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７が互いに異なる」とは、これらろ紙の構造、材質、厚さ、大きさ及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。 The first filter paper 16 and the second filter paper 17 may be the same as each other or different from each other. Here, “the first filter paper 16 and the second filter paper 17 are different from each other” means that at least one of the structure, material, thickness, size, and outer shape of these filter papers is different from each other.
電線１８及び直流電源装置１５は、通常の直流電源回路で使用されるものでよい。 The electric wire 18 and the DC power supply device 15 may be used in a normal DC power supply circuit.
陰極１３の積層面（陰極１３の、第一の保持部材１１と対向する面）の大きさと、陽極１４の積層面（陽極１４の、第二の保持部材１２と対向する面）の大きさは、いずれも、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、陰極１３と対向する面及び第二の保持部材１２との接触面）、及び第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、陽極１４と対向する面及び第一の保持部材１１との接触面）に対して、それぞれ同等以上の大きさであることが好ましく、第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２のそれぞれの積層面に対して、１〜１．５倍の大きさであることがより好ましい。下限値以上であることで、保持構造体１０に対して電圧をより均一に印加でき、より高精度に核酸−タンパク質複合体を単離できると共に、第二の保持部材１２において、目的物である核酸−タンパク質複合体同士をより高精度に分離できる。また、上限値以下であることで、陰極１３及び第二の保持部材１２の接触、並びに陽極１４及び第一の保持部材１１の接触を抑制する高い効果が得られる。 The size of the laminated surface of the cathode 13 (the surface of the cathode 13 facing the first holding member 11) and the size of the laminated surface of the anode 14 (the surface of the anode 14 facing the second holding member 12) In any case, the laminated surface of the first holding member 11 (the surface of the first holding member 11 facing the cathode 13 and the contact surface with the second holding member 12) and the laminated layer of the second holding member 12. The first holding member 11 is preferably equal to or larger than the surface (the surface of the second holding member 12 facing the anode 14 and the contact surface with the first holding member 11). And it is more preferable that it is 1 to 1.5 times as large as each laminated surface of the second holding member 12. By being equal to or higher than the lower limit value, the voltage can be more uniformly applied to the holding structure 10, the nucleic acid-protein complex can be isolated with higher accuracy, and the second holding member 12 is the target. Nucleic acid-protein complexes can be separated with higher accuracy. Moreover, the high effect which suppresses the contact of the cathode 13 and the 2nd holding member 12, and the contact of the anode 14 and the 1st holding member 11 by being below an upper limit is acquired.
陰極１３、第一のろ紙１６及び第一の保持部材１１の積層構造において、陰極１３の積層面は、第一のろ紙１６を介して、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、陰極１３と対向する面）の全面を被覆していることが好ましい。
また、陽極１４、第二のろ紙１７及び第二の保持部材１２の積層構造において、陽極１４の積層面は、第二のろ紙１７を介して、第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、陽極１４と対向する面）の全面を被覆していることが好ましい。
In the laminated structure of the cathode 13, the first filter paper 16, and the first holding member 11, the laminated surface of the cathode 13 passes through the first filter paper 16 and the laminated surface (first holding member 11). The entire surface of the member 11 (the surface facing the cathode 13) is preferably covered.
Further, in the laminated structure of the anode 14, the second filter paper 17, and the second holding member 12, the laminated surface of the anode 14 is disposed on the laminated surface of the second holding member 12 (second second) via the second filter paper 17. It is preferable to cover the entire surface of the holding member 12 facing the anode 14.
第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の積層構造（保持構造体１０）において、第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、第一の保持部材１１との接触面）の大きさは、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、第二の保持部材１２との接触面）の大きさに対して同等以上であることが好ましく、第一の保持部材１１の積層面に対して、１〜１．５倍の大きさであることがより好ましい。下限値以上であることで、第二の保持部材１２において、目的物である核酸−タンパク質複合体同士をより高精度に分離できる。また、上限値以下であることで、陰極１３及び第二の保持部材１２の接触を抑制する高い効果が得られる。
また、前記積層構造において、第二の保持部材１２の積層面は、第一の保持部材１１の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
In the laminated structure (holding structure 10) of the first holding member 11 and the second holding member 12, the laminated surface of the second holding member 12 (with the first holding member 11 of the second holding member 12). The size of the contact surface) is preferably equal to or greater than the size of the laminated surface of the first holding member 11 (the contact surface of the first holding member 11 with the second holding member 12). The size of the first holding member 11 is more preferably 1 to 1.5 times larger. By being more than a lower limit, in the 2nd holding member 12, the nucleic acid-protein complex which is a target object can be separated more accurately. Moreover, the high effect which suppresses the contact of the cathode 13 and the 2nd holding member 12 is acquired because it is below an upper limit.
In the laminated structure, the laminated surface of the second holding member 12 preferably covers the entire laminated surface of the first holding member 11.
第一のろ紙１６及び第一の保持部材１１の積層構造において、第一のろ紙１６の積層面の大きさは、第一の保持部材１１の積層面の大きさに対して同等以上であることが好ましい。そして、第一のろ紙１６の積層面は、第一の保持部材１１の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
同様に、第二のろ紙１７及び第二の保持部材１２の積層構造において、第二のろ紙１７の積層面の大きさは、第二の保持部材１２の積層面の大きさに対して同等以上であることが好ましい。そして、第二のろ紙１７の積層面は、第二の保持部材１２の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
In the laminated structure of the first filter paper 16 and the first holding member 11, the size of the laminated surface of the first filter paper 16 is equal to or greater than the size of the laminated surface of the first holding member 11. Is preferred. The laminated surface of the first filter paper 16 preferably covers the entire laminated surface of the first holding member 11.
Similarly, in the laminated structure of the second filter paper 17 and the second holding member 12, the size of the laminated surface of the second filter paper 17 is equal to or greater than the size of the laminated surface of the second holding member 12. It is preferable that The laminated surface of the second filter paper 17 preferably covers the entire laminated surface of the second holding member 12.
ここでは、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４として、それぞれ、積層面の形状が四角形状であるものを示しているが、目的に応じてその他の形状としてもよい。 Here, the cathode 13, the first filter paper 16, the first holding member 11, the second holding member 12, the second filter paper 17, and the anode 14 are shown as having a quadrangular shape on the laminated surface. However, other shapes may be used according to the purpose.
単離装置１は、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４をこの順に、互いの接触面同士を密着させて積層し、陰極１３及び陽極１４を、それぞれ電線１８により直流電源装置１５に電気的に接続することで、製造できる。陰極１３から陽極１４までの積層構造は、例えば、ひも状又はクリップ状等の結束具等、二層以上の積層体を固定する公知の固定手段を使用して、固定してもよい。 The isolation device 1 has the contact surfaces of the cathode 13, the first filter paper 16, the first holding member 11, the second holding member 12, the second filter paper 17 and the anode 14 in this order. It can manufacture by laminating | stacking and electrically connecting the cathode 13 and the anode 14 to the DC power supply device 15 with the electric wire 18, respectively. The laminated structure from the cathode 13 to the anode 14 may be fixed using a known fixing means for fixing a laminated body of two or more layers, such as a binding tool such as a string or a clip.
単離装置１においては、第一の保持部材１１として、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持されたものを使用し、これと第二の保持部材１２が積層されてなる保持構造体１０に、直流電源装置１５によって陰極１３及び陽極１４間に電圧を印加することにより、陰極１３から陽極１４へ電流を流す。すると、核酸−タンパク質複合体が第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に移動して転写され、保持される。図１では、核酸−タンパク質複合体９１が、矢印Ａで示すように、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に移動し、保持される様子を例示している。 In the isolation device 1, a first holding member 11 in which a nucleic acid-protein complex and a nucleic acid and / or protein are held is used, and the second holding member 12 is laminated. A current is passed from the cathode 13 to the anode 14 by applying a voltage between the cathode 13 and the anode 14 to the holding structure 10 as described above by the DC power supply device 15. Then, the nucleic acid-protein complex moves from the first holding member 11 to the second holding member 12 and is transferred and held. FIG. 1 illustrates the state in which the nucleic acid-protein complex 91 moves from the first holding member 11 to the second holding member 12 and is held as indicated by an arrow A.
このように、核酸−タンパク質複合体が転写されるのは、核酸−タンパク質複合体が、これを構成する核酸に由来するマイナス電荷（−電荷）を帯びているからであり、通常の電気泳動と同様の作用により電極間を移動する。ここで、「核酸に由来するマイナス電荷」としては、ヌクレオシド同士を連結しているリン酸エステル結合中のマイナス電荷が例示できる。 In this way, the nucleic acid-protein complex is transcribed because the nucleic acid-protein complex has a negative charge (-charge) derived from the nucleic acid constituting the nucleic acid-protein complex. It moves between the electrodes by the same action. Here, examples of the “negative charge derived from nucleic acid” include a negative charge in a phosphate ester bond connecting nucleosides.
これに対して、第一の保持部材１１に保持されているタンパク質は、通常、電荷を帯びていないか、又はマイナス電荷を帯びていたとしても、その量は極めて微量であるので、電圧を印加しても移動し難く、第二の保持部材１２に転写されずに第一の保持部材１１に保持されたままとなる。また、タンパク質は、分子量が大きいほど、さらに転写され難い。図１では、タンパク質９２が、電圧印加時にもすべて第一の保持部材１１から移動せず、第一の保持部材１１に保持されている様子を例示している。 On the other hand, the protein held in the first holding member 11 is usually not charged or has a minus charge, so that the amount is very small, so voltage is applied. Even if it does not move, it is not transferred to the second holding member 12 but remains held on the first holding member 11. Proteins are more difficult to be transcribed as the molecular weight increases. FIG. 1 illustrates the state in which the protein 92 is not moved from the first holding member 11 even when a voltage is applied, and is held by the first holding member 11.
一方、第一の保持部材１１に保持されている核酸は、核酸−タンパク質複合体中の核酸と同様にマイナス電荷を帯びており、さらに核酸−タンパク質複合体よりも分子量が小さいため、核酸−タンパク質複合体よりも電圧を印加したときに移動し易く、したがって、第二の保持部材１２に保持及び固定されること無く、第二のろ紙１７に到達し、ここで保持される。図１では、核酸９３が、すべて第二のろ紙１７に移動して、保持されている様子を例示している。 On the other hand, the nucleic acid held by the first holding member 11 is negatively charged like the nucleic acid in the nucleic acid-protein complex and has a smaller molecular weight than the nucleic acid-protein complex. It moves more easily when a voltage is applied than the composite, and therefore reaches the second filter paper 17 without being held and fixed to the second holding member 12 and is held there. FIG. 1 illustrates a state in which the nucleic acid 93 is all moved to the second filter paper 17 and held.
電圧印加時の電圧は、適宜調節すればよく、特に限定されないが、例えば、１０〜６０Ｖとすることが好ましい。
また、電圧印加の時間は、電圧に応じて適宜調節すればよく、特に限定されないが、５〜３０分間であることが好ましい。
電圧印加時の電圧及び時間等の各条件は、途中で変更することなく一定のままとしてもよいし、途中で変更して適宜調節してもよい。
電圧の印加は、核酸−タンパク質複合体の第二の保持部材１２での保持量が最大となるように、適宜調節することが好ましい。
The voltage at the time of voltage application may be adjusted as appropriate and is not particularly limited, but is preferably set to 10 to 60 V, for example.
Moreover, what is necessary is just to adjust suitably the time of voltage application according to a voltage, Although it does not specifically limit, It is preferable that it is 5 to 30 minutes.
Each condition such as voltage and time at the time of voltage application may remain constant without being changed in the middle, or may be appropriately adjusted by changing in the middle.
The voltage application is preferably adjusted as appropriate so that the amount of the nucleic acid-protein complex held by the second holding member 12 is maximized.
第二の保持部材１２に転写及び保持された核酸−タンパク質複合体は、例えば、これを構成するタンパク質又は核酸を、蛍光標識法、化学発光法又は染色法等の公知の方法で、これらの方法に特有のシグナルを検出することで、検出できる。検出されたシグナルの強度は、タンパク質又は核酸の量に比例するので、検量線を作成してこれを利用することで、第二の保持部材１２に保持された核酸−タンパク質複合体を定量できる。さらに、保持された核酸−タンパク質複合体は、適宜公知の方法で取り出すことができ、シーケンサー分析による核酸の塩基配列の決定、及び質量分析によるタンパク質の構成アミノ酸の解析を行うことができる。このとき、核酸−タンパク質複合体は、不要成分が混入することなく、簡便な方法で取り出せるので、塩基配列の決定や構成アミノ酸の解析を、簡便かつ高精度に行うことができる。 The nucleic acid-protein complex transferred and held on the second holding member 12 can be obtained by, for example, using a known method such as a fluorescent labeling method, a chemiluminescence method, or a staining method for these proteins or nucleic acids. It can be detected by detecting a signal peculiar to. Since the intensity of the detected signal is proportional to the amount of protein or nucleic acid, the nucleic acid-protein complex held in the second holding member 12 can be quantified by creating a calibration curve and using it. Furthermore, the retained nucleic acid-protein complex can be appropriately taken out by a known method, and the base sequence of the nucleic acid can be determined by sequencer analysis and the constituent amino acids of the protein can be analyzed by mass spectrometry. At this time, since the nucleic acid-protein complex can be taken out by a simple method without mixing unnecessary components, the determination of the base sequence and the analysis of the constituent amino acids can be performed easily and with high accuracy.
第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用する場合、このような第一の保持部材１１は、適宜公知の方法で得られる。以下、その方法の例について説明する。 When the transfer film after the molecules are pre-transferred from the separation medium (gel) after the two-dimensional electrophoresis is used as the first holding member 11, the first holding member 11 is appropriately formed by a known method. can get. Hereinafter, an example of the method will be described.
まず、二次元電気泳動に供する試料（上記の分析対象の試料）について、二次元電気泳動をより確実に行うために、タンパク質以外の高分子の除去、一次元目の等電点電気泳動におけるタンパク質の分離を阻害する塩類の除去、二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）におけるタンパク質の分離を阻害するタンパク質の３次構造及び４次構造等の高次構造を解除するための生化学的処理、をそれぞれ行うことで、前処理を行う。この前処理は、通常は、試料に対して、超音波破砕処理、フィルター処理、透析処理、熱処理、脱塩処理等の処理を行うことで達成される。 First, with respect to a sample to be subjected to two-dimensional electrophoresis (the sample to be analyzed), in order to perform two-dimensional electrophoresis more reliably, removal of macromolecules other than protein and protein in first-dimension isoelectric focusing Removal of salts that inhibit the separation of proteins, higher order structures such as tertiary and quaternary structures of proteins that inhibit protein separation in the second-dimensional SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) The pretreatment is performed by performing the biochemical treatment for each. This pretreatment is usually achieved by subjecting the sample to treatment such as ultrasonic crushing treatment, filter treatment, dialysis treatment, heat treatment, and desalting treatment.
次いで、得られた試料を二次元電気泳動に供する。具体的には、溶液状とした試料を等電点電気泳動用ゲルへ浸透させ、等電点電気泳動を行い、平衡化させた後、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行えばよい。二次元電気泳動により、タンパク質等の分子がゲル中で分離される。
例えば、全自動二次元電気泳動システム「Ａｕｔｏ２Ｄ」（販売元：シャープ株式会社）を使用すれば、1〜１０μｇの試料に対して、ｐＨ４〜８の範囲での等電点電気泳動、及び分子量１０〜１５０ｋＤａの範囲でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを順次行い、等電点電気泳動の方向（横方向）が５０mm、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの方向（縦方向）が５０mmという微小のゲルにおいても、簡便にかつ短時間で精度よく試料を展開できる。
The obtained sample is then subjected to two-dimensional electrophoresis. Specifically, after a solution-like sample is permeated into an isoelectric focusing gel, isoelectric focusing is performed and equilibrated, SDS-PAGE may be further performed. By two-dimensional electrophoresis, molecules such as proteins are separated in the gel.
For example, if a fully automatic two-dimensional electrophoresis system “Auto2D” (distributor: Sharp Corporation) is used, isoelectric focusing in a pH range of 4 to 8 and a molecular weight of 10 for a sample of 1 to 10 μg. Even SDS-PAGE in the range of ~ 150 kDa is performed sequentially, even in a small gel with the isoelectric focusing direction (horizontal direction) being 50 mm and the SDS-PAGE direction (vertical direction) being 50 mm. The sample can be developed with high accuracy.
次いで、二次元電気泳動後のゲルから、タンパク質を転写膜へ移動させることで、前転写する。例えば、マイナス電荷を帯びているタンパク質は、セミドライ方式の電気泳動の手法により、前転写することが可能である。転写膜は、後の工程で第一の保持部材として機能するものであり、タンパク質を吸着等により保持できるものが例示でき、上記の第一の保持部材１１と同様の材質、構造及び厚さのものが使用できる。 Next, pre-transfer is performed by moving the protein from the gel after two-dimensional electrophoresis to a transfer film. For example, a negatively charged protein can be pre-transferred by a semi-dry electrophoresis technique. The transfer film functions as a first holding member in a later step, and can be exemplified by a material that can hold protein by adsorption or the like, and has the same material, structure, and thickness as the first holding member 11 described above. Things can be used.
前転写後の転写膜は、メタノール、エタノール等のアルコールで洗浄処理することが好ましい。このようにすることで、タンパク質以外の、ＳＤＳ等のマイナス電荷を帯びた成分を、転写膜から除去でき、このような成分の第二の保持部材１２への転写が抑制されると共に、タンパク質を本来の高次構造に戻してから複合体を形成させることができるので、より高精度に核酸−タンパク質複合体を単離できる。 The transfer film after the pre-transfer is preferably washed with an alcohol such as methanol or ethanol. By doing in this way, components having negative charges such as SDS other than protein can be removed from the transfer film, and the transfer of such components to the second holding member 12 is suppressed, and the protein can be removed. Since the complex can be formed after returning to the original higher order structure, the nucleic acid-protein complex can be isolated with higher accuracy.
次いで、前転写後の転写膜上のタンパク質に、これと特異的に相互作用する塩基配列を有する核酸を作用させ、単離対象の核酸−タンパク質複合体を転写膜上で形成させる。ここで、「特異的に相互作用する」とは、水素結合、疎水結合等により、免疫反応のような選択性の高い結合を分子間で形成することを意味する。
複合体形成を行う前には、通常、転写膜のブロッキング処理及び第一の洗浄処理を行う。
Next, a nucleic acid having a base sequence that specifically interacts with the protein on the transcription film after the pre-transcription is allowed to act on the transcription film to form a nucleic acid-protein complex to be isolated on the transcription film. Here, “specifically interacts” means that a highly selective bond such as an immune reaction is formed between molecules by hydrogen bond, hydrophobic bond or the like.
Before the complex formation, a transfer film blocking process and a first washing process are usually performed.
転写膜のブロッキング処理は、目的とするもの以外の核酸が転写膜に固定（吸着）されるのを防ぐ処理であり、例えば、ブロッキング剤としてスキムミルク、ウシ血清アルブミン、ブロッキング用ポリマー等を用いて行うことができる。 The transfer membrane blocking treatment is a treatment for preventing nucleic acids other than the intended one from being fixed (adsorbed) to the transfer membrane. For example, skim milk, bovine serum albumin, a blocking polymer or the like is used as a blocking agent. be able to.
転写膜の第一の洗浄処理は、ブロッキング処理後の転写膜から、過剰のブロッキング剤を除去する処理であり、例えば、界面活性剤ｔｗｅｅｎを含むトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の、界面活性剤を含む緩衝液を用いて行うことができる。 The first cleaning process of the transfer film is a process of removing excess blocking agent from the transfer film after the blocking process. For example, a surfactant such as a Tris buffer containing the surfactant tween is used. It can carry out using the buffer solution containing.
複合体形成は、転写膜に対して核酸の添加処理、及び第二の洗浄処理を行うことで達成される。 Complex formation is achieved by performing a nucleic acid addition treatment and a second washing treatment on the transfer film.
転写膜に対する核酸の添加処理は、転写膜のタンパク質保持部に核酸を万遍なく接触させることができれば、いかなる方法で行ってもよいが、好ましい方法として、核酸を含有する溶液中に転写膜を浸漬する方法が例示できる。この場合、転写膜は、前記溶液を振とうさせながら浸漬することが好ましく、転写膜浸漬時の前記溶液の温度は２５〜３５℃であることが好ましい。このようにすることで、核酸−タンパク質複合体をより効率的に形成できる。 The nucleic acid may be added to the transfer membrane by any method as long as the nucleic acid can be uniformly contacted with the protein holding portion of the transfer membrane. However, as a preferred method, the transfer membrane is placed in a solution containing the nucleic acid. Examples of the dipping method include: In this case, the transfer film is preferably immersed while the solution is shaken, and the temperature of the solution during immersion of the transfer film is preferably 25 to 35 ° C. By doing so, the nucleic acid-protein complex can be formed more efficiently.
添加する核酸が、本来の高次構造を解除されたものである場合には、加熱処理等により、本来の高次構造に戻したものを使用することが好ましい。 When the nucleic acid to be added is one that has been released from its original higher-order structure, it is preferable to use one that has been returned to its original higher-order structure by heat treatment or the like.
添加する核酸で好ましいものとしては、２０〜１００量体（塩基）の、ランダム塩基配列の１本鎖又は２本鎖ＤＮＡが例示できる。 Preferred examples of the nucleic acid to be added include 20- to 100-mer (base) single-stranded or double-stranded DNA having a random base sequence.
転写膜に対する第二の洗浄処理は、核酸の添加処理後の転写膜（前記溶液を使用した場合には、浸漬している前記溶液から引き上げられた後の転写膜）に付着している不要成分（例えば、過剰の核酸）を除去するものであり、例えば、界面活性剤を含む緩衝液での洗浄で行うことができる。ここで、界面活性剤を含む緩衝液としては、ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）を緩衝液で濃度が０．０５体積％となるように希釈した溶液が例示できる。第二の洗浄処理は、形成させた核酸−タンパク質複合体を損なわないよう、洗浄時間、洗浄回数、界面活性剤の濃度等の処理条件を適宜調節しておこなうことが好ましい。 The second washing process for the transfer film is an unnecessary component adhering to the transfer film after the addition process of the nucleic acid (the transfer film after being pulled up from the immersed solution when the solution is used). (For example, excess nucleic acid) is removed, and for example, washing with a buffer containing a surfactant can be performed. Here, as a buffer solution containing a surfactant, a solution obtained by diluting tween 20 (surfactant) with a buffer solution to a concentration of 0.05% by volume can be exemplified. The second washing treatment is preferably carried out by appropriately adjusting treatment conditions such as washing time, number of washings, surfactant concentration, etc. so as not to damage the formed nucleic acid-protein complex.
図２は、単離装置１を使用した場合の核酸−タンパク質複合体の単離方法のうち、第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用した場合の、単離方法を例示するフロー図である。 FIG. 2 shows a method of isolating nucleic acid-protein complexes when using the isolation device 1, as a first holding member 11, molecules are pre-transferred from a separation medium (gel) after two-dimensional electrophoresis. It is a flowchart which illustrates the isolation method at the time of using a later transfer film.
本実施形態（単離装置１）によれば、上記のように、目的とする核酸−タンパク質複合体が第二の保持部材１２に転写及び保持されるのに対し、タンパク質は第一の保持部材１１に保持されたままとなり、核酸は第二の保持部材１２を通過して第二のろ紙１７にまで移動して、ここで保持される。したがって、核酸−タンパク質複合体が選択的に、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に転写されて、保持される。
そして、カッターやピッカーを使用する従来法とは異なり、上記のような転写を行うことで、第一の保持部材１１に保持された核酸−タンパク質複合体が微量であっても、使用する器具や装置の制約を受けることがなく、不要成分を誤って共に取り出すことがなく、目的とする核酸−タンパク質複合体のみを簡便かつ高精度に単離できる。さらに、目的とする核酸−タンパク質複合体が多数存在する場合でも、作業時間及び労力を大幅に低減でき、極めて高い再現性が得られるので、すべての核酸−タンパク質複合体を簡便かつ高精度に単離できる。
According to the present embodiment (isolation apparatus 1), the target nucleic acid-protein complex is transferred and held by the second holding member 12 as described above, whereas the protein is the first holding member. 11, the nucleic acid passes through the second holding member 12 and moves to the second filter paper 17 where it is held. Therefore, the nucleic acid-protein complex is selectively transferred from the first holding member 11 to the second holding member 12 and held.
And unlike the conventional method using a cutter or a picker, even if the nucleic acid-protein complex held in the first holding member 11 is very small by performing the transfer as described above, Only the target nucleic acid-protein complex can be isolated easily and with high accuracy without being restricted by the apparatus and without accidentally removing unnecessary components. Furthermore, even when there are many target nucleic acid-protein complexes, the working time and labor can be greatly reduced, and extremely high reproducibility can be obtained. Can be separated.
（第二の実施形態）
図３は、本発明の第二の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。ここでも、図１の場合と同様に、単離装置の構成をより判り易く説明するために、一部の構造を分解して示している。なお、図３において、図１に示すものと同じ構成要素には、図１の場合と同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
(Second embodiment)
FIG. 3 is a schematic view schematically illustrating an isolation device according to the second embodiment of the present invention. Here, as in the case of FIG. 1, in order to explain the configuration of the isolation device more easily, a part of the structure is shown in an exploded manner. In FIG. 3, the same components as those shown in FIG. 1 are denoted by the same reference numerals as those in FIG. 1, and detailed description thereof is omitted.
図３に示す単離装置２は、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に、さらに、核酸−タンパク質複合体が透過可能な中間部材１９が積層されたものである。第一の保持部材１１、中間部材１９及び第二の保持部材１２は、互いの接触面同士が密着して積層されていればよい。単離装置２においては、これら三種の部材が積層され、保持構造体２０が構成されている。単離装置２は、この点以外は単離装置１と同じである。
中間部材１９は、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２への核酸−タンパク質複合体の転写を、より高精度に行うためのものである。
In the isolation device 2 shown in FIG. 3, an intermediate member 19 that is permeable to a nucleic acid-protein complex is further laminated between a first holding member 11 and a second holding member 12. The first holding member 11, the intermediate member 19, and the second holding member 12 may be stacked so that their contact surfaces are in close contact with each other. In the isolation device 2, these three types of members are stacked to form a holding structure 20. The isolation device 2 is the same as the isolation device 1 except for this point.
The intermediate member 19 is for transferring the nucleic acid-protein complex from the first holding member 11 to the second holding member 12 with higher accuracy.
例えば、図１に示す単離装置１において、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間の密着度が低く、これらの接触面同士の間に気泡等の空隙部が存在する場合には、これら保持部材間の導電性が低下することがあり、その場合、核酸−タンパク質複合体の転写を正常に行えない可能性がある。これに対して、空隙部が生じ難くなるように中間部材１９を設けることで、上記のような保持部材間の導電性の低下が抑制される。 For example, in the isolation device 1 shown in FIG. 1, the degree of adhesion between the first holding member 11 and the second holding member 12 is low, and there are voids such as bubbles between these contact surfaces. In some cases, the conductivity between the holding members may be reduced, and in this case, there is a possibility that the nucleic acid-protein complex cannot be normally transferred. On the other hand, by providing the intermediate member 19 so that the gap is less likely to occur, the above-described decrease in conductivity between the holding members is suppressed.
また、例えば、第一の保持部材１１にマイナス電荷を帯びた不要成分が保持されていたとしても、中間部材１９を設けることで、この不要成分の第二の保持部材１２への転写が抑制される。その理由は、以下の通りである。
前記不要成分としては、単離装置１のところで説明したように、タンパク質が例示できる。また、第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用した場合には、ＳＤＳ等のマイナス電荷を帯びた成分をこの転写膜から除去する操作を行ったとしても、この成分が完全には除去されず、この成分や、この成分と相互作用して形成された複合体が、転写膜に残存することがあるので、これらも前記不要成分となる。以上のような不要成分は、いずれも、マイナス電荷を帯びていたとしても、その量が微量であれば、たとえ電圧印加時に第一の保持部材１１から第二の保持部材１２へ向けて移動したとしても、目的物である核酸−タンパク質複合体よりもはるかに移動し難い。したがって、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に中間部材１９が積層され、これら保持部材間の移動距離が長くなっていることにより、前記不要成分と核酸−タンパク質複合体とでは、これらの移動のし易さの相違に基づいて、電圧印加時における移動距離の差がより大きくなる。したがって、核酸−タンパク質複合体のみをより選択的に転写することが可能となる。
For example, even if an unnecessary component having a negative charge is held in the first holding member 11, the transfer of the unnecessary component to the second holding member 12 is suppressed by providing the intermediate member 19. The The reason is as follows.
Examples of the unnecessary component include proteins as described in the isolation device 1. In addition, when a transfer film obtained by pre-transferring molecules from a separation medium (gel) after two-dimensional electrophoresis is used as the first holding member 11, a component having a negative charge such as SDS is transferred to the first holding member 11. Even if the operation of removing from the film is performed, this component is not completely removed, and this component and the complex formed by interacting with this component may remain in the transfer film. Is also an unnecessary component. Even if any of the above unnecessary components has a negative charge, it moves from the first holding member 11 to the second holding member 12 even when a voltage is applied. However, it is much more difficult to move than the target nucleic acid-protein complex. Therefore, the intermediate member 19 is laminated between the first holding member 11 and the second holding member 12, and the movement distance between these holding members is increased, so that the unnecessary component and the nucleic acid-protein complex can be obtained. Then, based on the difference in the ease of movement, the difference in the movement distance when the voltage is applied becomes larger. Therefore, only the nucleic acid-protein complex can be transcribed more selectively.
中間部材１９は、核酸−タンパク質複合体が透過可能であれば、その材質等は特に限定されない。好ましい中間部材１９としては、ゲル状媒体が例示でき、通常の電気泳動で使用されるものが例示できるが、なかでもアクリルアミドゲル又はアガロースゲルが好ましい。 The material of the intermediate member 19 is not particularly limited as long as the nucleic acid-protein complex can pass therethrough. As the preferable intermediate member 19, a gel-like medium can be exemplified, and those used in normal electrophoresis can be exemplified, and among them, acrylamide gel or agarose gel is preferable.
中間部材１９は、シート状又はプレート状であることが好ましく、その厚さは、目的に応じて任意に調節できるが、０．５〜３ｍｍであることが好ましい。 The intermediate member 19 is preferably in the form of a sheet or plate, and the thickness can be arbitrarily adjusted according to the purpose, but is preferably 0.5 to 3 mm.
中間部材１９は、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよく、複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、層の構造、材質、厚さ、大きさ（積層面の面積）及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。
ただし、本実施形態においては、単層からなる中間部材１９でも、十分な効果を有する。
The intermediate member 19 may be either a single layer or a plurality of layers (a plurality of layers laminated in the Z direction in the figure). When the intermediate member 19 is composed of a plurality of layers, these layers are all the same. However, they may all be different, or only some may be the same. Here, “the layers are different” means that at least one of the structure, material, thickness, size (area of the laminated surface) and outer shape of the layers are different from each other.
However, in this embodiment, even the intermediate member 19 made of a single layer has a sufficient effect.
第一の保持部材１１及び中間部材１９の積層構造において、中間部材１９の積層面の大きさは、第一の保持部材１１の積層面の大きさに対して同等以下であることが好ましい。そして、第一の保持部材１１の積層面上にある核酸−タンパク質複合体が、中間部材１９の積層面と接触できる限り、中間部材１９の積層面の大きさは特に限定されないが、第一の保持部材１１の積層面に対して、３０〜１００％の大きさであることがより好ましい。下限値以上とすることで、第一の保持部材１１、中間部材１９及び第二の保持部材１２の積層構造がより安定して維持され、例えば、第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の接触を抑制する高い効果が得られる。また、上限値以下とすることで、中間部材１９の陰極１３又は陽極１４との接触を抑制する高い効果が得られる。
また、前記積層構造において、第一の保持部材１１の積層面は、中間部材１９の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
In the laminated structure of the first holding member 11 and the intermediate member 19, the size of the laminated surface of the intermediate member 19 is preferably equal to or less than the size of the laminated surface of the first holding member 11. And as long as the nucleic acid-protein complex on the laminated surface of the first holding member 11 can come into contact with the laminated surface of the intermediate member 19, the size of the laminated surface of the intermediate member 19 is not particularly limited. It is more preferable that the size is 30 to 100% with respect to the laminated surface of the holding member 11. By setting the lower limit value or more, the laminated structure of the first holding member 11, the intermediate member 19 and the second holding member 12 is more stably maintained. For example, the first holding member 11 and the second holding member The high effect which suppresses the contact of 12 is acquired. Moreover, the high effect which suppresses the contact with the cathode 13 or the anode 14 of the intermediate member 19 is acquired by setting it as below an upper limit.
In the laminated structure, the laminated surface of the first holding member 11 preferably covers the entire laminated surface of the intermediate member 19.
同様に、第二の保持部材１２及び中間部材１９の積層構造において、第二の保持部材１２の積層面は、中間部材１９の積層面の全面を被覆していることが好ましい。 Similarly, in the laminated structure of the second holding member 12 and the intermediate member 19, the laminated surface of the second holding member 12 preferably covers the entire laminated surface of the intermediate member 19.
単離装置２は、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に、さらに中間部材１９を密着させて積層する点以外は、単離装置１と同様の方法で製造できる。 The isolation device 2 can be manufactured by the same method as the isolation device 1 except that the intermediate member 19 is further closely stacked between the first holding member 11 and the second holding member 12.
単離装置２を使用した場合には、単離装置１を使用した場合と同様の方法で、核酸−タンパク質複合体を単離できる。 When the isolation device 2 is used, the nucleic acid-protein complex can be isolated in the same manner as when the isolation device 1 is used.
本実施形態（単離装置２）によれば、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間で導電性の低下が抑制され、さらに、マイナス電荷を帯びた不要成分の転写が抑制されるので、核酸−タンパク質複合体をより高精度に単離できる。 According to the present embodiment (isolation apparatus 2), a decrease in conductivity is suppressed between the first holding member 11 and the second holding member 12, and transfer of unnecessary components having a negative charge is further transferred. Since it is suppressed, the nucleic acid-protein complex can be isolated with higher accuracy.
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
図３に示す単離装置を使用して、核酸−タンパク質複合体を単離した。具体的には、以下の通りである。
（核酸−タンパク質複合体を保持した第一の保持部材の作製）
配列番号１で表される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、このＤＮＡと特定的に結合することが知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）とを、表１に示す組成の緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に添加し、室温で１時間混和して、目的とするＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体（核酸−タンパク質複合体）を含む溶液（１）を得た。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、光学的に検出可能とするために、「ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ」（同仁化学社製）を使用して、波長６４７ｎｍの光の照射によって蛍光を発する蛍光物質で標識した。
また、前記ＤＮＡを添加しなかったこと以外は、前記溶液（１）の場合と同様の方法で、標識したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む溶液（２）を得た。
[Example 1]
The nucleic acid-protein complex was isolated using the isolation device shown in FIG. Specifically, it is as follows.
(Production of first holding member holding nucleic acid-protein complex)
A double-stranded DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and T7 RNA polymerase (manufactured by TAKARA), which is known to specifically bind to this DNA, are buffered with a composition shown in Table 1 ( added to the binding buffer) and mixed at room temperature for 1 hour to obtain a solution (1) containing the target DNA-T7 RNA polymerase complex (nucleic acid-protein complex). To enable optical detection, T7 RNA polymerase was labeled with a fluorescent substance that fluoresces when irradiated with light having a wavelength of 647 nm using “HiLyte Fluor 647 Labeling Kit” (manufactured by Dojindo).
Further, a solution (2) containing labeled T7 RNA polymerase was obtained in the same manner as in the case of the solution (1) except that the DNA was not added.
なお、表１中、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を、「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを、「ＮＰ−４０」はポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテルを、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを、それぞれ示す。また、「最終濃度」は、ＤＮＡ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの添加前の緩衝液における各成分の濃度を意味する。なお、ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８．０）は、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製）と水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨ調整して作製したものである。 In Table 1, “EDTA” is ethylenediaminetetraacetic acid, “DTT” is dithiothreitol, “NP-40” is polyoxyethylene (9) octylphenyl ether, “BSA” is bovine serum albumin, Each is shown. The “final concentration” means the concentration of each component in the buffer before addition of DNA and T7 RNA polymerase. The EDTA aqueous solution (pH 8.0) is prepared by adjusting pH using EDTA (manufactured by Sigma) and sodium hydroxide aqueous solution.
次いで、第一の保持部材として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのＰＶＤＦ膜（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜）を使用し、これに、得られた溶液（１）を直径６ｍｍとなるように３箇所滴下して３個のスポットを形成させた。また、このＰＶＤＦの前記スポットと重ならない位置に、得られた溶液（２）を直径６ｍｍとなるように３箇所滴下して、同様に３個のスポットを形成させた。
これにより、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを保持したＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）を作製した。得られたＰＶＤＦ膜の平面図を図４に模式的に示す。図４中、符号１１０はＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）を、符号８１は溶液（１）のスポットを、符号８２は溶液（２）のスポットを、それぞれ示す。
Next, a PVDF membrane (Durapore membrane manufactured by Millipore) having a length of 70 mm, a width of 80 mm, and a thickness of 0.2 mm is used as the first holding member, and the obtained solution (1) has a diameter of 6 mm. Three spots were dropped to form three spots. In addition, three spots of the obtained solution (2) were dropped at a position not overlapping with the spot of the PVDF so as to have a diameter of 6 mm, thereby similarly forming three spots.
This produced a PVDF membrane (first holding member) holding the DNA-T7 RNA polymerase complex and T7 RNA polymerase. A plan view of the obtained PVDF membrane is schematically shown in FIG. In FIG. 4, reference numeral 110 indicates a PVDF film (first holding member), reference numeral 81 indicates a spot of the solution (1), and reference numeral 82 indicates a spot of the solution (2).
（単離装置の作製）
上記のＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを保持したＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）に加え、第二の保持部材として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのニトロセルロース膜（ライフテクノロジー社製）を、中間部材であるゲル状媒体として縦４０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍの１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを、第一のろ紙及び第二のろ紙として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ１ｍｍのろ紙（ライフテクノロジー社製）にＴｒｉｓ−酢酸緩衝液を含浸させたものを、陰極及び陽極として縦１００ｍｍ、横１００ｍｍの白金メッキ電極を、直流電源装置としてバイオクラフト社製のものを、それぞれ使用し、図３に示す単離装置を作製した。
(Production of isolation device)
In addition to the above-described PVDF membrane (first holding member) holding the DNA-T7 RNA polymerase complex and T7 RNA polymerase, the second holding member is a nitrocellulose membrane (life technology of 70 mm length, 80 mm width, 0.2 mm thickness) 10% (w / v) polyacrylamide gel having a length of 40 mm, a width of 50 mm, and a thickness of 1 mm as a gel-like medium as an intermediate member, and a length of 70 mm and a width of 80 mm as a first filter paper and a second filter paper. 1 mm thick filter paper (Life Technology) impregnated with Tris-acetate buffer, 100 mm long and 100 mm wide platinum-plated electrodes as cathode and anode, and DC power supply manufactured by Biocraft Were used to produce the isolation device shown in FIG.
（核酸−タンパク質複合体の単離）
作製した単離装置において、１０分間、３０Ｖの電圧を印加した。
次いで、蛍光検出装置（ＧＥヘルスケア社製「タイフーン」）を使用して、ニトロセルロース膜（第二の保持部材）上の蛍光シグナルを検出し、その蛍光量を測定した。このとき、同じ蛍光検出装置により、ニトロセルロース膜の撮像データを取得した。撮像データ取得の条件は、蛍光検出モードで、励起波長６３３ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ、ＰＭＴ５００Ｖとした。取得したニトロセルロース膜の撮像データを図５に示す。図５中、（ａ）はニトロセルロース膜のうち、溶液（１）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域の撮像データであり、（ｂ）はニトロセルロース膜のうち、溶液（２）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域の撮像データである。
(Isolation of nucleic acid-protein complex)
In the produced isolation device, a voltage of 30 V was applied for 10 minutes.
Next, using a fluorescence detection device (“Typhoon” manufactured by GE Healthcare), the fluorescence signal on the nitrocellulose membrane (second holding member) was detected, and the amount of fluorescence was measured. At this time, imaging data of the nitrocellulose film was acquired by the same fluorescence detection apparatus. The imaging data acquisition conditions were a fluorescence detection mode, an excitation wavelength of 633 nm, a fluorescence wavelength of 670 nm, and a PMT of 500 V. The acquired imaging data of the nitrocellulose membrane is shown in FIG. In FIG. 5, (a) is imaging data of a region immediately below the PVDF film in which three spots of the solution (1) are formed in the nitrocellulose film, and (b) is a solution of the nitrocellulose film. It is imaging data of the area | region immediately under the PVDF film | membrane in which three spots of (2) were formed.
図５（ａ）から明らかなように、ニトロセルロース膜のうち、溶液（１）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域には、３個の明確な蛍光スポット（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３）が観測された。一方、図５（ｂ）から明らかなように、ニトロセルロース膜のうち、溶液（２）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域には、蛍光スポットがごく僅か観測されたのみであった。
図５（ａ）及び（ｂ）におけるそれぞれの３個のスポットの蛍光量の平均値を図６に示す。図６中、（Ａ）は図５（ａ）の３個のスポットの蛍光量の平均値を示し、（Ｂ）は図５（ｂ）の３個のスポットの蛍光量の平均値を示す。
図６中の（Ａ）に対応する、図５（ａ）の蛍光量の平均値は２０．０であり、標準偏差は４．４であった。一方、図６中の（Ｂ）に対応する、図５（ｂ）の蛍光量の平均値は８．７であり、標準偏差は１．５であった。これら２群のｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った結果、０．０１＜Ｐ＜０．０５となり、有意水準５％で平均値に差があることが示された。
As is clear from FIG. 5 (a), in the nitrocellulose membrane, three distinct fluorescent spots (No. 1) are formed in the region immediately below the PVDF membrane on which the three spots of the solution (1) are formed. No. 2, No. 3) were observed. On the other hand, as is clear from FIG. 5B, only a few fluorescent spots were observed in the region immediately below the PVDF film in which the three spots of the solution (2) were formed in the nitrocellulose film. Met.
The average value of the fluorescence amount of each of the three spots in FIGS. 5 (a) and 5 (b) is shown in FIG. In FIG. 6, (A) shows the average value of the fluorescence amounts of the three spots in FIG. 5 (a), and (B) shows the average value of the fluorescence amounts of the three spots in FIG. 5 (b).
The average value of the fluorescence amount in FIG. 5A corresponding to (A) in FIG. 6 was 20.0, and the standard deviation was 4.4. On the other hand, the average value of the fluorescence amount in FIG. 5B corresponding to (B) in FIG. 6 was 8.7, and the standard deviation was 1.5. As a result of performing the t-test of the students of these two groups, it was found that 0.01 <P <0.05, indicating that there is a difference in the mean value at a significance level of 5%.
図５（ａ）で、電圧印加前のＰＶＤＦ膜における溶液（１）のスポットと同数（３個）の蛍光スポットが明確に観測され、図５（ｂ）で蛍光スポットがほとんど観測されなかったことから、図５（ａ）で検出された蛍光シグナルは、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体に由来するものであり、電圧の印加により、ＰＶＤＦ膜からニトロセルロース膜に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは転写されず、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体が選択的に転写されたことを確認できた。ＤＮＡは、ニトロセルロース膜を通過して、第二のろ紙に移動したと推測された。なお、図５（ｂ）で蛍光スポットがごく僅か観測されたのは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの蛍光物質による標識時に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに結合しなかった蛍光物質が僅かに存在し、この遊離した状態の蛍光物質が溶液（２）中に存在して、電圧印加時にＰＶＤＦ膜からニトロセルロース膜に転写されたことが原因であると推測された。 In FIG. 5A, the same number (three) of fluorescent spots as the spots of the solution (1) in the PVDF film before voltage application were clearly observed, and almost no fluorescent spots were observed in FIG. 5B. Thus, the fluorescence signal detected in FIG. 5 (a) is derived from the DNA-T7 RNA polymerase complex, and when voltage is applied, T7 RNA polymerase is not transcribed from the PVDF membrane to the nitrocellulose membrane. It was confirmed that the T7 RNA polymerase complex was selectively transcribed. It was speculated that the DNA passed through the nitrocellulose membrane and moved to the second filter paper. In FIG. 5 (b), only a few fluorescent spots were observed when there was a slight amount of fluorescent material that did not bind to T7 RNA polymerase when labeled with the fluorescent material of T7 RNA polymerase. Was present in the solution (2), and was assumed to be caused by the transfer from the PVDF film to the nitrocellulose film when a voltage was applied.
本発明は、医学、工学、薬学、理学、農学等の生命科学分野において、核酸とタンパク質との相互作用の分析に利用可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for analyzing the interaction between nucleic acids and proteins in the life science fields such as medicine, engineering, pharmacy, science, and agriculture.
１，２・・・単離装置、１０，２０・・・保持構造体、１１，１１０・・・第一の保持部材、１２・・・第二の保持部材、１３・・・陰極、１４・・・陽極、１５・・・直流電源装置、１９・・・中間部材（ゲル状媒体）、９１・・・核酸−タンパク質複合体、９２・・・タンパク質、９３・・・核酸 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1, 2 ... Isolation apparatus 10, 20 ... Holding structure 11, 110 ... 1st holding member, 12 ... 2nd holding member, 13 ... Cathode, 14 * ..Anode, 15 ... DC power supply, 19 ... intermediate member (gel-like medium), 91 ... nucleic acid-protein complex, 92 ... protein, 93 ... nucleic acid
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