JP2013172706A - Fish assay for detecting translocation between kif5b gene and ret gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、１０番染色体上の転座を検出する蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイに関する。詳しくは、KIF5B遺伝子及びRET遺伝子の転座を検出するFISHアッセイ及びその用途等に関する。本発明は例えば非小細胞肺癌の検出に有用であり、非小細胞肺癌の診断、治療などに有益な情報を提供する。 The present invention relates to a fluorescence in situ hybridization (FISH) assay that detects a translocation on chromosome 10. Specifically, the present invention relates to a FISH assay for detecting translocation of KIF5B gene and RET gene, its use, and the like. The present invention is useful for detecting non-small cell lung cancer, for example, and provides useful information for diagnosis, treatment, etc. of non-small cell lung cancer.
現在までに、癌化関連遺伝子がいくつか知られている。特にチロシンキナーゼ遺伝子は細胞の増殖を直接制御する重要な酵素をコードしており、アミノ酸配列や欠失などによる自己リン酸化の亢進として検出されるキナーゼ活性の自発活性化により細胞を癌化に導くことが知られている。例えば、甲状腺乳頭癌ではPTC（おもに１〜３）とRETチロシンキナーゼとの融合遺伝子が２０〜６０％の頻度で認められ、PTC／RETによる腫瘍細胞の増殖にはRETキナーゼの活性化が重要である事が示されている（非特許文献１、２、３）。
To date, several canceration-related genes are known. In particular, the tyrosine kinase gene encodes an important enzyme that directly regulates cell growth, and leads to canceration by spontaneous activation of kinase activity detected as an increase in autophosphorylation due to amino acid sequence or deletion. It is known. For example, in papillary thyroid cancer, a fusion gene of PTC (mainly 1-3) and RET tyrosine kinase is observed at a frequency of 20-60%, and activation of RET kinase is important for the growth of tumor cells by PTC / RET. It has been shown (
近年、非小細胞肺癌に存在する新規な異常キナーゼの存在がつぎつぎと報告されている。従来、固形癌（特に肺癌）では遺伝子転座は殆どないと思われていたが、ALK遺伝子と棘皮動物微小管結合タンパク質様４（EML4）の融合が、日本人の非小細胞肺癌（NSCLC）のサブセットで検出された（非特許文献４）。EML4-ALK融合遺伝子の頻度は日本人の非小細胞肺癌では６％程度である。男女ともに非喫煙者に多いものの、現喫煙者からも検出されている。また、腺癌患者に多いものの、扁平上皮癌患者からも検出されている。EML4-ALK融合遺伝子を生成する遺伝子転座の検索方法としてFISHが採用されている（特許文献１）。 In recent years, the presence of novel abnormal kinases present in non-small cell lung cancer has been reported one after another. Previously, it was thought that there was almost no gene translocation in solid cancer (especially lung cancer), but the fusion of ALK gene and echinoderm microtubule-binding protein-like 4 (EML4) is Japanese non-small cell lung cancer (NSCLC) (Non-patent Document 4). The frequency of EML4-ALK fusion gene is about 6% in Japanese non-small cell lung cancer. Although both men and women are more frequent in non-smokers, they are also detected in current smokers. Moreover, although it is common in adenocarcinoma patients, it has also been detected in patients with squamous cell carcinoma. FISH has been adopted as a method for searching for gene translocations that generate EML4-ALK fusion genes (Patent Document 1).
ALK遺伝子はKIF5B遺伝子(10p11.22)とも融合することが報告されている(KIF5B-ALK)（非特許文献５）。KIF（kinesin family member）は微小管依存性の神経の軸索輸送に関与する。KIF5A、KIF5B及びKIF5CはGRIP1（グルタミン酸受容体仲介蛋白１）を介して、重鎖がAMPA型グルタミン酸受容体を含む膜小胞を微小管のプラス端方向に輸送している。ヒトKIF5B遺伝子の情報は公共のデータベースに登録されている（EntrezGene ID: 3799、SWISS-PROT ID:P33176）。 It has been reported that the ALK gene is also fused with the KIF5B gene (10p11.22) (KIF5B-ALK) (Non-patent Document 5). KIF (kinesin family member) is involved in microtubule-dependent nerve axonal transport. KIF5A, KIF5B, and KIF5C transport membrane vesicles containing AMPA-type glutamate receptors in the direction of the positive end of microtubules via GRIP1 (glutamate receptor-mediated protein 1). Information on the human KIF5B gene is registered in a public database (EntrezGene ID: 3799, SWISS-PROT ID: P33176).
２０１１年に韓国のYoung Seok JuらのグループはKIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座によってKIF5B遺伝子の一部（5'側末端）とRET遺伝子の一部（RETキナーゼ活性を有する3'側末端側）が融合することを報告した（非特許文献６）。この論文では、KIF5B遺伝子とALK遺伝子との間の転座と同様に、KIF5B-RET融合遺伝子について若年、非喫煙者の腺癌患者から三つのバリアントが同定されている。 In 2011, a group of Young Seok Ju et al. In South Korea made a part of KIF5B gene (5 'end) and a part of RET gene (3' side with RET kinase activity) by translocation between KIF5B gene and RET gene. It was reported that the terminal side was fused (Non-patent Document 6). In this paper, as well as the translocation between the KIF5B and ALK genes, three variants have been identified for KIF5B-RET fusion genes from young, non-smoker adenocarcinoma patients.
RET遺伝子はrearranged during transfectionから命名され、二つのヒトDNA配列が組み換えられた遺伝子（NIH-3T3（NIH Swissマウスの胎児の線維芽細胞から分離した培養細胞）へのトランスフェクションの過程で生じたと考えられている）として単離された。末梢神経系に発現しているRET遺伝子（10q.11.21）は受容体型チロシンキナーゼであるc-Ret受容体をコードしている。多発性内分泌腺腫症(MEN)家系ではRET遺伝子の変異を認める（非特許文献７）しかし、肺癌におけるRET遺伝子の点変異の報告はなされていない。 The RET gene was named after rearranged during transfection and is thought to have arisen during the transfection process into a gene in which two human DNA sequences were recombined (NIH-3T3, a cultured cell isolated from fetal fibroblasts of NIH Swiss mice). Isolated). The RET gene (10q.11.21) expressed in the peripheral nervous system codes for c-Ret receptor, a receptor tyrosine kinase. A mutation of the RET gene is observed in a family with multiple endocrine adenomatosis (MEN) (Non-patent Document 7). However, a point mutation of the RET gene in lung cancer has not been reported.
甲状腺癌において、オンコジェニックなRETの転座を有する細胞株は、in vivo及びin vitroにおいて、RETの阻害剤(sunitinib、vandetanib、sorafenib)に対して感受性を示す（非特許文献８、９、１０、１１）。これらRET阻害剤は既に腎臓がん、甲状腺がんなどで保険適応がなされており、ヒトに対して使用可能である。 In thyroid cancer, cell lines having an oncogenic RET translocation are sensitive to inhibitors of RET (sunitinib, vandetanib, sorafenib) in vivo and in vitro (Non-Patent Documents 8, 9, 10). 11). These RET inhibitors are already covered by insurance for kidney cancer, thyroid cancer, etc., and can be used for humans.
以上の背景の下で本発明は、癌の新たな原因遺伝子であるKIF5B-RET融合遺伝子を治療戦略に利用ないし活用せんとするものであり、KIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座を検出する方法及びその用途、当該検出法に利用可能なキット等を提供することを課題とする。 Based on the above background, the present invention uses or utilizes the KIF5B-RET fusion gene, which is a new causative gene of cancer, in the treatment strategy, and detects a translocation between the KIF5B gene and the RET gene. It is an object of the present invention to provide a kit that can be used for the detection method, its use, and the detection method.
本発明者は、非小細胞肺癌患者（日本人サンプル）から得た試料より、染色体転座によって産生される、KIF5B遺伝子の5'側の一部とRET遺伝子の3'側の一部とが融合したKIF5B-RET融合遺伝子を単離することに成功した（図９）。また、複数の検体から、韓国のグループ（非特許文献６）も報告しているバリアント1つと、類似のバリアント１つについて、そのcDNAを単離することにも成功した。一方、検討を進めた結果、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座（以下、説明の便宜上、「KIF5B-RET転座」と称する）が乳癌や大腸癌或いは甲状腺癌には認められず、肺癌に特異的なことが明らかとなった。更には、EGFR遺伝子やEML4-ALK融合遺伝子などの既知の癌遺伝子とは排他的にKIF5B-RET融合遺伝子が存在していることが判明した。即ち、KIF5B-RET融合遺伝子が癌の原因遺伝子であり、非小細胞肺癌の腫瘍形成能を示すことが示唆された。これらの事実は、KIF5B-RET転座を検出することが肺癌（特に非小細胞肺癌）の治療戦略上、極めて重要であることを意味する。 The present inventor found that a part of the 5 ′ side of the KIF5B gene and a part of the 3 ′ side of the RET gene are produced by chromosomal translocation from a sample obtained from a non-small cell lung cancer patient (Japanese sample). We succeeded in isolating the fused KIF5B-RET fusion gene (FIG. 9). In addition, we succeeded in isolating the cDNA of a variant from one specimen and one variant similar to that reported by the Korean group (Non-patent Document 6). On the other hand, as a result of investigation, a translocation between the KIF5B gene and the RET gene (hereinafter referred to as “KIF5B-RET translocation” for convenience of explanation) was not observed in breast cancer, colon cancer or thyroid cancer, and lung cancer. It became clear to be specific. Furthermore, it was found that the KIF5B-RET fusion gene exists exclusively from known oncogenes such as the EGFR gene and the EML4-ALK fusion gene. That is, it was suggested that the KIF5B-RET fusion gene is a causative gene for cancer and exhibits tumorigenicity of non-small cell lung cancer. These facts mean that detecting the KIF5B-RET translocation is extremely important for the treatment strategy of lung cancer (particularly non-small cell lung cancer).
以上の知見を得た後、本発明者は更に検討を重ね、独自の蛍光プローブを用いたKIF5B-RET転座の検出法を考案し、その有用性を検証した。その結果、当該方法がKIF5B-RET転座の検出に極めて有効であることが確認された。 After obtaining the above knowledge, the present inventor conducted further studies and devised a detection method of KIF5B-RET translocation using an original fluorescent probe, and verified its usefulness. As a result, it was confirmed that the method was extremely effective for detecting the KIF5B-RET translocation.
以下に示す本発明は、主として上記の成果ないし知見に基づく。
［１］以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイを行うことを特徴とする、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出する方法：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
［２］前記第１染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第２染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第３染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第４染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbである、［１］に記載の方法。
［３］前記プローブ１Ａの長さが100kb〜500kbであり、前記プローブ１Ｂの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ａの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ｂの長さが400kb〜900kbであり、前記プローブ４Ａの長さが800kb〜1,500kbであり、前記プローブ４Ｂの長さが900kb〜1,700kbである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記プローブ１Ａ、前記プローブ１Ｂ、前記プローブ２Ａ、前記プローブ２Ｂ及び前記プローブ４Ａの少なくとも一つが、同一の蛍光物質で標識された複数のDNA断片から構成される、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］以下の(i)〜(iv)のステップを含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法：
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセットを接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。
［６］ステップ(i)において前記(1)のプローブセット又は前記(3)のプローブセットを用いる、［５］に記載の方法。
［７］前記(1)〜(4)の中から二以上のプローブセットを選択し、選択した各プローブセットを用いて個別に前記ステップ(i)〜(iii)を行い、
前記ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する、［５］に記載の方法。
［８］前記(1)のプローブセット及び前記(3)のプローブセットが選択される、［７］に記載の方法。
［９］ステップ(i)で使用する前記染色体サンプルを調製するステップを更に含む、［５］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］前記染色体サンプルが肺癌患者由来である、［９］に記載の方法。
［１１］前記染色体サンプルが非小細胞肺癌患者由来である、［９］に記載の方法。
［１２］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌を罹患していると決定するステップを含む、非小細胞肺癌を検出する方法。
［１３］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１４］RETキナーゼ阻害剤が、スニチニブ、ソラフェニブ又はバンデタニブである、［１３］に記載の方法。
［１５］RETキナーゼ阻害剤が、RETの発現をノックダウンする化合物からなる、［１３］に記載の方法。
［１６］RETの発現をノックダウンする化合物が、抗体、小分子、ペプチド及びアプタマーからなる群より選択される一以上の化合物である、［１５］に記載の方法。
［１７］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１８］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤に加えてEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１９］EGFR阻害剤がゲフィチニブ、エルロチニブ、ラバチニブ、TAK-285、EKB-569又はバンデタニブであり、ALK阻害剤がクリゾチニブ又はCEP-28122である、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座がないと判定された場合であって、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌の患者であるときに、該対象には肺癌特異的な他の遺伝子異常が存在すると判定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［２１］［１３］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法によって決定された治療方針に従って対象を処置するステップを含む、治療方法。
［２２］前記処置に加えて、放射線処置及び／又は外科的処置を行うステップを含む、［２１］に記載の治療方法。
［２３］以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを含む、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出するためのキット：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
［２４］プローブの使用についての説明書、DNA対比染色剤、ハイブリダイゼーション用バッファー、封入剤、コントロールスライドからなる群より選択される一以上の要素を更に含む、［２３］に記載のキット。
The present invention described below is mainly based on the above-described results or knowledge.
[1] A fluorescence in situ hybridization (FISH) assay using one or more probe sets selected from the group consisting of the following (1) to (4): How to detect a translocation between:
(1) A first probe set targeting a chromosome site (first chromosome site) containing a RET gene,
A probe 1A labeled with a first fluorescent substance and a probe 1B labeled with a second fluorescent substance,
The probe 1A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the first chromosome site,
The probe 1B is a 3′-side region in the first stained other site, and is complementary to a second region that exists at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the RET gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a first probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(2) A second probe set targeting a chromosomal site (second chromosomal site) containing the KIF5B gene,
A probe 2A labeled with a first fluorescent substance and a probe 2B labeled with a second fluorescent substance,
Probe 2A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the second chromosome site,
The probe 2B is a 3′-side region in the second chromosomal site, and is complementary to a second region existing at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the KIF5B gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a second probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(3) a third probe set comprising the probe 2A and the probe 1B;
(4) Complementary to the chromosomal site containing the RET gene (3rd chromosomal site) and complementary to the probe 4A labeled with the first fluorescent substance and the chromosomal site containing the KIF5B gene (4th chromosomal site) A fourth probe set comprising a probe 4B labeled with a second fluorescent substance.
[2] The length of the first chromosome site is 0.5 Mb to 2.0 Mb, the length of the second chromosome site is 0.5 Mb to 2.0 Mb, and the length of the third chromosome site is 0.5 Mb to 2.0 Mb. The method according to [1], wherein the length of the fourth chromosome site is 0.5 Mb to 2.0 Mb.
[3] The length of the probe 1A is 100 kb to 500 kb, the length of the probe 1B is 300 kb to 800 kb, the length of the probe 2A is 300 kb to 800 kb, and the length of the probe 2B is 400 kb. The method according to [1] or [2], wherein the length of the probe 4A is 800 kb to 1,500 kb, and the length of the probe 4B is 900 kb to 1,700 kb.
[4] At least one of the probe 1A, the probe 1B, the probe 2A, the probe 2B, and the probe 4A is composed of a plurality of DNA fragments labeled with the same fluorescent substance. ] The method as described in any one of.
[5] The method according to any one of [1] to [4], comprising the following steps (i) to (iv):
(i) bringing the probe set of any one of (1) to (4) into contact with a chromosome sample;
(ii) washing the chromosomal sample to remove probes that are not specifically hybridized to the target;
(iii) detecting a fluorescent signal;
(iv) A step of determining the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene based on the pattern of the fluorescent signal.
[6] The method according to [5], wherein the probe set of (1) or the probe set of (3) is used in step (i).
[7] Two or more probe sets are selected from the above (1) to (4), and the steps (i) to (iii) are individually performed using each selected probe set,
In the step (iv), the method according to [5], wherein the presence or absence of a translocation between the KIF5B gene and the RET gene is determined by combining the fluorescence signal patterns obtained for each probe set.
[8] The method according to [7], wherein the probe set of (1) and the probe set of (3) are selected.
[9] The method according to any one of [5] to [8], further comprising the step of preparing the chromosome sample used in step (i).
[10] The method according to [9], wherein the chromosome sample is derived from a lung cancer patient.
[11] The method according to [9], wherein the chromosome sample is derived from a non-small cell lung cancer patient.
[12] When it is determined that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene by the method according to any one of [1] to [11], the subject from which the chromosome sample is derived is a non-small cell A method of detecting non-small cell lung cancer, comprising determining to have lung cancer.
[13] When it is determined by the method according to any one of [1] to [11] that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the subject from which the chromosome sample is derived is inhibited by RET kinase A method for determining a therapeutic strategy comprising the step of determining that an agent should be treated.
[14] The method according to [13], wherein the RET kinase inhibitor is sunitinib, sorafenib or vandetanib.
[15] The method according to [13], wherein the RET kinase inhibitor comprises a compound that knocks down the expression of RET.
[16] The method according to [15], wherein the compound that knocks down the expression of RET is one or more compounds selected from the group consisting of antibodies, small molecules, peptides, and aptamers.
[17] When it is determined that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene by the method according to any one of [1] to [11], the subject from which the chromosome sample is derived is an EGFR inhibitor And / or a method of determining a therapeutic strategy comprising determining that it should be treated with an ALK inhibitor.
[18] When it is determined by the method according to any one of [1] to [11] that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the subject from which the chromosome sample is derived is inhibited by RET kinase A method for determining a therapeutic strategy comprising the step of determining that an EGFR inhibitor and / or an ALK inhibitor should be treated in addition to the agent.
[19] The method according to [17] or [18], wherein the EGFR inhibitor is gefitinib, erlotinib, lavatinib, TAK-285, EKB-569, or vandetanib, and the ALK inhibitor is crizotinib or CEP-28122.
[20] When it is determined by the method according to any one of [1] to [11] that there is no translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the subject from which the chromosome sample is derived is not A method of determining a therapeutic strategy, comprising determining when a subject has small cell lung cancer that the subject has other lung cancer-specific genetic abnormalities.
[21] A therapeutic method comprising the step of treating a subject according to a therapeutic policy determined by the method according to any one of [13] to [20].
[22] The treatment method according to [21], including a step of performing radiation treatment and / or surgical treatment in addition to the treatment.
[23] A kit for detecting a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, comprising one or more probe sets selected from the group consisting of the following (1) to (4):
(1) A first probe set targeting a chromosome site (first chromosome site) containing a RET gene,
A probe 1A labeled with a first fluorescent substance and a probe 1B labeled with a second fluorescent substance,
The probe 1A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the first chromosome site,
The probe 1B is a 3′-side region in the first stained other site, and is complementary to a second region that exists at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the RET gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a first probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(2) A second probe set targeting a chromosomal site (second chromosomal site) containing the KIF5B gene,
A probe 2A labeled with a first fluorescent substance and a probe 2B labeled with a second fluorescent substance,
Probe 2A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the second chromosome site,
The probe 2B is a 3′-side region in the second chromosomal site, and is complementary to a second region existing at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the KIF5B gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a second probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(3) a third probe set comprising the probe 2A and the probe 1B;
(4) Complementary to the chromosomal site containing the RET gene (3rd chromosomal site) and complementary to the probe 4A labeled with the first fluorescent substance and the chromosomal site containing the KIF5B gene (4th chromosomal site) A fourth probe set comprising a probe 4B labeled with a second fluorescent substance.
[24] The kit according to [23], further comprising one or more elements selected from the group consisting of instructions for using the probe, a DNA counterstain, a hybridization buffer, an encapsulant, and a control slide.
１．KIF5B-RET転座の検出方法
本発明の第１の局面はKIF5B-RET転座を検出する方法に関する。本発明の方法では、特定のプローブセットを用いたFISHアッセイを行う。プローブセットとして、以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットが用いられる。尚、本明細書で言及する染色体上の位置や配列等はヒトゲノム国際プロジェクトBuild37の結果に基づいている。
(1)第１プローブセット
RET遺伝子（43572475〜43625799:build37）を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的としたプローブセットである。第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなる。プローブ１Ａは、第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的である。プローブ１Ｂは、第１染色他部位内の3'側領域であって、第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的である。KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点は、第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置する。RET遺伝子における切断点は、通常、１０番染色体のプラス鎖43611118番塩基周辺と推測されている。
1. Method for detecting KIF5B-RET translocation The first aspect of the present invention relates to a method for detecting a KIF5B-RET translocation. In the method of the present invention, a FISH assay using a specific probe set is performed. As the probe set, one or more probe sets selected from the group consisting of the following (1) to (4) are used. The positions and sequences on the chromosome referred to in this specification are based on the results of the human genome international project Build37.
(1) First probe set
This probe set targets a chromosomal site (first chromosomal site) containing the RET gene (43572475-43625799: build37). It consists of a probe 1A labeled with a first fluorescent substance and a probe 1B labeled with a second fluorescent substance. Probe 1A is complementary to the first region, which is the 5 ′ region in the first chromosome site. The probe 1B is a 3′-side region in the first stained other site and is complementary to a second region existing at a distance from the first region. When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the RET gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, or the second region. Located at the 5 'end of the region. The breakpoint in the RET gene is usually estimated around the positive strand 43611118 base of chromosome 10.
第１染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましく1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第１染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置42,500,000と43,500,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置44,000,000と45,000,000の間とする。 The length of the first chromosome site is preferably 0.5 Mb to 2.0 Mb, more preferably 1.0 Mb to 1.5 Mb. For example, the start position of the first chromosome site is between base positions 42,500,000 and 43,500,000 of chromosome 10, and the end position is between base positions 44,000,000 and 45,000,000 of chromosome 10.
プローブ１Ａの長さは、例えば100kb〜500kb、好ましくは200kb〜490kbである。プローブ１Ａの具体例の一つは、BACクローンGSP1506F09（このクローンの他、以下で言及するBACクローンの具体例はいずれも株式会社GPS研究所から入手することができる）のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したものである。当該インサートは約200kbの長さである。一方、プローブ１Ａの他の具体例は、BACクローンGSP1506F09のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、GSP3023D06のインサート（１０番染色体の塩基位置43276632〜43432432に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、GSP3012B07のインサート（１０番染色体の塩基位置43342754〜43512026に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。当該インサートは約490kbの長さである。 The length of the probe 1A is, for example, 100 kb to 500 kb, preferably 200 kb to 490 kb. One specific example of the probe 1A is an insert of the BAC clone GSP1506F09 (in addition to this clone, all specific examples of the BAC clone mentioned below can be obtained from GPS Research Institute, Inc.) (Which consists of a sequence corresponding to base positions 43020444 to 43224507) is fluorescently labeled. The insert is approximately 200 kb long. On the other hand, other specific examples of the probe 1A include a fluorescently labeled insert of BAC clone GSP1506F09 (consisting of a sequence corresponding to base positions 43020444 to 43224507 of chromosome 10), an insert of GSP3023D06 (base position 43276632 of chromosome 10). A combination (mixture) of fluorescently labeled inserts of GSP3012B07 (consisting of sequences corresponding to base positions 43342754 to 43512026 of chromosome 10). The insert is approximately 490 kb long.
プローブ１Ｂの長さは、例えば300kb〜800kb、好ましくは500kb〜700kbである。プローブ１Ｂの具体例は、BACクローンGSP1877H08のインサート（１０番染色体の塩基位置43563936〜43735238（NCBI:Build37.2）に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1018G02のインサート（１０番染色体の塩基位置43670474〜43814797に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1070C12のインサート（１０番染色体の塩基位置43809245〜44003042に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0369G08のインサート（１０番染色体の塩基位置43893593〜44100865に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0075D03のインサート（１０番染色体の塩基位置44076856〜44195623に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。 The length of the probe 1B is, for example, 300 kb to 800 kb, preferably 500 kb to 700 kb. Specific examples of probe 1B include a fluorescently labeled insert of BAC clone GSP1877H08 (consisting of a sequence corresponding to nucleotide positions 43563936 to 43735238 (NCBI: Build37.2) of chromosome 10), and an insert of BAC clone GSP1018G02 (number 10). Chromosome labeled with a sequence corresponding to base positions 43670474 to 43814797 of the chromosome), BAC clone GSP1070C12 insert (comprised with a sequence corresponding to base positions 43809245 to 44003042 of chromosome 10), BAC clone Fluorescently labeled GSP0369G08 insert (consisting of a sequence corresponding to nucleotide positions 43893593 to 44100865 of chromosome 10), BAC clone GSP0075D03 insert (comprising a sequence corresponding to nucleotide positions 44076856 to 44195623 of chromosome 10) A combination (mixture) of labels. These inserts are all fluorescently labeled with the same fluorescent material.
(2)第２プローブセット
KIF5B遺伝子（32297938〜32345359:buid37）を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的としたプローブセットである。第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなる。プローブ２Ａは、第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的である。プローブ２Ｂは、第２染色体部位内の3'側領域であって、第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であるKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点は、第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置する。KIF5B-RET融合遺伝子には少なくとも４種類のバリアント（非特許文献６で報告された３種類と、新規バリアント１種類）が存在し、それらの間でKIF5B遺伝子における切断点は異なる（非特許文献６）。KIF5B遺伝子のエクソン１〜１５までを含む領域とRET遺伝子のチロシンキナーゼ領域が融合したバリアントの場合、KIF5B遺伝子における切断点は１０番染色体のマイナス鎖の32316377番塩基の後ろに存在する。また、新規に同定されたバリアント（図１０を参照）では、KIF5B遺伝子の切断点はエクソン２２の後ろにずれる。本発明では、例えば、特定の切断点に注目してプローブを設計する。或いは、二以上の切断点を考慮し、例えば、それらの両者が第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置するように、プローブを設計する。
(2) Second probe set
This probe set targets a chromosomal site (second chromosomal site) containing the KIF5B gene (32297938 to 32345359: buid37). The probe 2A is labeled with a first fluorescent substance and the probe 2B is labeled with a second fluorescent substance. The probe 2A is complementary to the first region which is the 5 ′ region in the second chromosome site. Probe 2B is a 3 ′ region in the second chromosome site, and is KIF5B-RET by translocation between the KIF5B gene and the RET gene that are complementary to the second region that is located at a distance from the first region. The breakpoint in the KIF5B gene when the fusion gene is generated is located at the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, or at the 5 ′ end of the second region. The KIF5B-RET fusion gene has at least four types of variants (three types reported in Non-Patent Document 6 and one new variant), and the breakpoints in the KIF5B gene are different among them (Non-Patent Document 6). ). In the case of a variant in which the
第２染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第２染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置31,000,000と32,000,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置32,500,000と33,500,000の間とする。 The length of the second chromosome site is preferably 0.5 Mb to 2.0 Mb, more preferably 1.0 Mb to 1.5 Mb. For example, the start position of the second chromosome site is set between the base positions 31,000,000 and 32,000,000 of chromosome 10, and the end position is set between the base positions 32,500,000 and 33,500,000 of chromosome 10.
プローブ２Ａの長さは、例えば300kb〜800kb、好ましくは500kb〜700kbである。プローブ２Ａの具体例は、BACクローンGSP1528C10のインサート（１０番染色体の塩基位置32417786〜32584317に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3158B05のインサート（１０番染色体の塩基位置32572458〜32735258に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1107C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32715505〜32884442に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1094C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32870561〜33033340に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。 The length of the probe 2A is, for example, 300 kb to 800 kb, preferably 500 kb to 700 kb. Specific examples of the probe 2A include a BAC clone GSP1528C10 insert (consisting of a sequence corresponding to base positions 32417786 to 32584317 of chromosome 10), and an insert of BAC clone GSP3158B05 (base position 32572458 to 32735258 of chromosome 10). And a BAC clone GSP1107C12 insert (consisting of a sequence corresponding to nucleotide positions 32715505 to 32844442 of chromosome 10), and an insert of BAC clone GSP1094C12 (chromosome 10). A combination (mixture) of those fluorescently labeled. These inserts are all fluorescently labeled with the same fluorescent material.
プローブ２Ｂの長さは、例えば400kb〜900kb、好ましくは600kb〜800kbである。プローブ２Ｂの具体例は、BACクローンGSP1544E09のインサート（１０番染色体の塩基位置31658954〜31808161に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1541C10のインサート（１０番染色体の塩基位置31800804〜31962808に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1023E07のインサート（１０番染色体の塩基位置31903114〜32124185に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1581D09のインサート（１０番染色体の塩基位置32067160〜32239503に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3119B09のインサート（１０番染色体の塩基位置32233254〜32404265（NCBI:Build37.2）に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。 The length of the probe 2B is, for example, 400 kb to 900 kb, preferably 600 kb to 800 kb. Specific examples of probe 2B include fluorescently labeled inserts of BAC clone GSP1544E09 (consisting of sequences corresponding to base positions 31658954 to 31808161 of chromosome 10), and inserts of BAC clone GSP1541C10 (base positions 31800804 to 31916808 of chromosome 10). And a BAC clone GSP1023E07 insert (consisting of a sequence corresponding to nucleotide positions 31903114 to 32124185 of chromosome 10), and a BAC clone GSP1581D09 insert (chromosome 10). Of BAC clone GSP3119B09 (comprising a sequence corresponding to base positions 32233254 to 32404265 (NCBI: Build37.2) of chromosome 10). A combination (mixture) of labels. These inserts are all fluorescently labeled with the same fluorescent material.
(3)第３プローブセット
KIF5B遺伝子に関するプローブと、RET遺伝子に関するプローブを組み合わせたプローブセットである。具体的には、プローブ２Ａとプローブ１Ｂを組み合わせてプローブセットとする。
(3) Third probe set
This probe set combines a probe related to the KIF5B gene and a probe related to the RET gene. Specifically, the probe 2A and the probe 1B are combined to form a probe set.
(4)第４プローブセット
KIF5B遺伝子に関するプローブと、RET遺伝子に関するプローブを組み合わせたプローブセットである。RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる。プローブ４ＡはRET遺伝子の全長をカバーし、プローブ４ＢはKIF5B遺伝子の全長をカバーする。
(4) Fourth probe set
This probe set combines a probe related to the KIF5B gene and a probe related to the RET gene. Complementary to the chromosomal site containing the RET gene (3rd chromosomal site), complementary to the probe 4A labeled with the first fluorescent substance and the chromosomal site containing the KIF5B gene (4th chromosomal site), The probe 4B is labeled with a fluorescent substance. Probe 4A covers the full length of the RET gene, and probe 4B covers the full length of the KIF5B gene.
第３染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第３染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置42,500,000と43,500,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置44,000,000と45,000,000の間とする。一方、第４染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第４染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置31,000,000と32,000,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置32,500,000と33,500,000の間とする。 The length of the third chromosome site is preferably 0.5 Mb to 2.0 Mb, more preferably 1.0 Mb to 1.5 Mb. For example, the start position of the third chromosome site is between base positions 42,500,000 and 43,500,000 of chromosome 10, and the end position is between base positions 44,000,000 and 45,000,000 of chromosome 10. On the other hand, the length of the fourth chromosome site is preferably 0.5 Mb to 2.0 Mb, more preferably 1.0 Mb to 1.5 Mb. For example, the start position of the fourth chromosome site is between base positions 31,000,000 and 32,000,000 of chromosome 10, and the end position is between base positions 32,500,000 and 33,500,000 of chromosome 10.
プローブ４Ａの長さは、例えば800kb〜1,500kb、好ましく1,000kb〜1,300kbである。プローブ４Ａの具体例は、BACクローンGSP1506F09のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1877H08のインサート（１０番染色体の塩基位置43563936〜43735238に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1018G02のインサート（１０番染色体の塩基位置43670474〜43814797に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1070C12のインサート（１０番染色体の塩基位置43809245〜44003042に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0369G08のインサート（１０番染色体の塩基位置43893593〜44100865に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0075D03のインサート（１０番染色体の塩基位置44076856〜44195623に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。 The length of the probe 4A is, for example, 800 kb to 1,500 kb, preferably 1,000 kb to 1,300 kb. Specific examples of the probe 4A include a fluorescently labeled insert of BAC clone GSP1506F09 (consisting of a sequence corresponding to base positions 43020444 to 43224507 of chromosome 10), and an insert of BAC clone GSP1877H08 (base positions of chromosome 1043563936 to 43335238). And a BAC clone GSP1018G02 insert (consisting of sequences corresponding to nucleotide positions 43670474 to 43814797 of chromosome 10), and a BAC clone GSP1070C12 insert (chromosome 10). Of BAC clone GSP0369G08 (comprising a sequence corresponding to base positions 43893593 to 44100865 of chromosome 10), BAC clone GSP0075D03 Fluorescent insert (consisting of a sequence corresponding to base positions 44076856 to 44195623 of chromosome 10) Despite his identification is a combination (mixture). These inserts are all fluorescently labeled with the same fluorescent material.
プローブ４Ｂの長さは、例えば900kb〜1,700kb、好ましくは1,200kb〜1,500kbである。プローブ４Ｂの具体例は、BACクローンGSP1544E09のインサート（１０番染色体の塩基位置31658954〜31808161に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1541C10のインサート（１０番染色体の塩基位置31800804〜31962808に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1023E07のインサート（１０番染色体の塩基位置31903114〜32124185に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1581D09のインサート（１０番染色体の塩基位置32067160〜32239503に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3119B09のインサート（１０番染色体の塩基位置32233254〜32404265に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1528C10のインサート（１０番染色体の塩基位置32417786〜32584317に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3158B05のインサート（１０番染色体の塩基位置32572458〜32735258に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1107C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32715505〜32884442に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1094C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32870561〜33033340に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。 The length of the probe 4B is, for example, 900 kb to 1,700 kb, preferably 1,200 kb to 1,500 kb. Specific examples of probe 4B include fluorescently labeled inserts of BAC clone GSP1544E09 (consisting of sequences corresponding to base positions 31658954 to 31808161 of chromosome 10), and inserts of BAC clone GSP1541C10 (base positions of 31800804 to 31916808). And a BAC clone GSP1023E07 insert (consisting of a sequence corresponding to nucleotide positions 31903114 to 32124185 of chromosome 10), and a BAC clone GSP1581D09 insert (chromosome 10). Of BAC clone GSP3119B09 (consisting of a sequence corresponding to base positions 32233254 to 32404265 of chromosome 10), BAC clone GSP1528C10 Fluorescent insert (consisting of a sequence corresponding to base positions 32417786 to 32584317 of chromosome 10) Identified, an insert of BAC clone GSP3158B05 (consisting of a sequence corresponding to base positions 32572458 to 32735258 of chromosome 10), an insert of BAC clone GSP1107C12 (corresponding to base positions 32715505 to 32884442 of chromosome 10) A combination (mixture) of fluorescently labeled inserts of BAC clone GSP1094C12 (consisting of sequences corresponding to base positions 32870561 to 33033340 of chromosome 10). These inserts are all fluorescently labeled with the same fluorescent material.
本発明では、比較的長いプローブ（上記の具体例においては約200kb（プローブ１Ａ）〜約1370kb（プローブ４Ｂ））を使用する。従って、プローブと標的配列との相補性は、本発明で意図する特異的なハイブリダイゼーションが達成される限りにおいて、高度に厳密でなくてもよい。標的配列との間の配列同一性は、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である。 In the present invention, a relatively long probe (in the above specific example, about 200 kb (probe 1A) to about 1370 kb (probe 4B)) is used. Accordingly, the complementarity between the probe and the target sequence may not be highly stringent as long as the specific hybridization intended in the present invention is achieved. The sequence identity with the target sequence is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
各プローブは、転座の切断点及びKIF5B-RET転座の配列データに関して本明細書で提供される情報、及び本明細書で引用する文献の記載に基づいて設計可能である。KIF5B-RET転座についてはいくつかの変異体（バリアント）の存在が知られているが、別の変異体の存在の可能性は否定されない。特定の変異体を認識するように設計したプローブが一又は複数の別のバリアントを認識できることもある。 Each probe can be designed based on the information provided herein regarding the translocation breakpoint and the sequence data of the KIF5B-RET translocation, and the literature references cited herein. Regarding the KIF5B-RET translocation, the existence of several variants (variants) is known, but the possibility of the existence of another variant cannot be ruled out. A probe designed to recognize a particular variant may recognize one or more other variants.
上記の通り、本発明において使用するプローブは株式会社GSP研究所のBAC(バクテリア人工染色体)クローンを利用して調製することができる。BACは大腸菌細胞において比較的長いDNA断片をクローニングするために使用されるベクターである。上記の具体例においては、プローブ１Ａを除き、複数のBACクローンを利用することによって、カバーする範囲の広いプローブ（同一の蛍光物質で標識された複数のDNA断片から構成される）を得ている。 As described above, the probe used in the present invention can be prepared using a BAC (bacterial artificial chromosome) clone of GSP Laboratory. BAC is a vector used to clone relatively long DNA fragments in E. coli cells. In the above specific example, except for the probe 1A, a plurality of BAC clones are used to obtain a probe with a wide range of coverage (consisting of a plurality of DNA fragments labeled with the same fluorescent substance). .
本発明で使用する第１プローブセット及び第２プローブセットは、いわゆる「ブレイクアパート(break-apart)」プローブに該当する。これらのプローブセットを用いた場合、典型的には、プローブセットを構成する各プローブの蛍光シグナルが、KIF5B-RET転座が生じていないサンプルでは隣接して或いは重なって検出され、KIF5B-RET転座が生じているサンプルでは染色体の分離のために離れた位置に検出される。 The first probe set and the second probe set used in the present invention correspond to so-called “break-apart” probes. When these probe sets are used, typically, the fluorescence signal of each probe constituting the probe set is detected adjacent to or overlapping with the sample in which the KIF5B-RET translocation has not occurred, and the KIF5B-RET translocation is detected. In samples where loci occur, they are detected at remote locations for chromosome segregation.
第１プローブセットはRET遺伝子に関するプローブセットである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ１Ａとプローブ１Ｂが近接した状態で染色体にハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ１Ａとプローブ１Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズする。従って、プローブ１Ａの蛍光シグナルとプローブ１Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。 The first probe set is a probe set for the RET gene. When this probe set is used, if KIF5B-RET translocation does not occur (that is, in the case of a non-translocation type sample), the probe 1A and probe 1B hybridize to the chromosome in close proximity, and the KIF5B-RET translocation occurs. If so (ie, in the case of a translocation sample), the probe 1A and the probe 1B are hybridized to the chromosome in a state of being separated. Therefore, it is possible to determine the presence or absence of the KIF5B-RET translocation based on the positional relationship between the fluorescent signal of the probe 1A and the fluorescent signal of the probe 1B.
第２プローブセットはKIF5Bに関するプローブセットである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ２Ｂが近接した状態でハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ２Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズする。従って、プローブ２Ａの蛍光シグナルとプローブ２Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。 The second probe set is a probe set for KIF5B. When the probe set is used, if the KIF5B-RET translocation does not occur (that is, in the case of a non-translocated sample), the probe 2A and the probe 2B will hybridize in close proximity, and the KIF5B-RET translocation has occurred. For example, in the case of a translocation sample, the probe 2A and the probe 2B are hybridized to the chromosome in a state where they are separated. Therefore, it is possible to determine the presence or absence of the KIF5B-RET translocation based on the positional relationship between the fluorescent signal of the probe 2A and the fluorescent signal of the probe 2B.
第３プローブセットはKIF5B遺伝子の5'末端側（即ち、KIF5B−RET融合遺伝子を構成する領域）を標的としたプローブ２Ａと、RET遺伝子の3'末端側（即ち、KIF5B−RET融合遺伝子を構成する領域）を標的としたプローブ１Ｂの組合せである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ１Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ１Ｂが近接した状態でハイブリダイズする。従って、プローブ２Ａの蛍光シグナルとプローブ１Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。第３プローブセットによれば、転座に伴うKIF5Bの切断及びRET遺伝子の切断の両者を把握することができる。従って、本発明の目的において最も有用性の高いプローブセットであるといえる。また、現在までに報告される（本願明細書で新規に報告するものも含む）全てのバリアントを認識するプローブセットと考えられる。 The third probe set comprises the probe 2A targeting the 5 ′ end of the KIF5B gene (ie, the region constituting the KIF5B-RET fusion gene) and the 3 ′ end of the RET gene (ie, the KIF5B-RET fusion gene). This is a combination of the probe 1B targeting the region). When this probe set is used, if the KIF5B-RET translocation does not occur (that is, in the case of a non-translocation type sample), the probe 2A and probe 1B are hybridized to the chromosome in a separated state, and the KIF5B-RET translocation occurs. If so (that is, in the case of a translocation type sample), the probe 2A and the probe 1B are hybridized in close proximity. Therefore, it is possible to determine the presence or absence of the KIF5B-RET translocation based on the positional relationship between the fluorescent signal of the probe 2A and the fluorescent signal of the probe 1B. According to the third probe set, both KIF5B cleavage and RET gene cleavage associated with translocation can be grasped. Therefore, it can be said that it is the most useful probe set for the purpose of the present invention. Further, it is considered to be a probe set that recognizes all variants reported to date (including those newly reported in the present specification).
第４プローブセットはRET遺伝子に関するプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子に関するプローブ４Ｂの組合せである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ４Ａとプローブ４Ｂが染色体にハイブリダイズ可能であり、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ４Ａとプローブ４Ｂは染色体にハイブリダイズできない。従って、蛍光シグナルが検出できるか否かによってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。 The fourth probe set is a combination of a probe 4A relating to the RET gene and a probe 4B relating to the KIF5B gene. When the probe set is used, if the KIF5B-RET translocation does not occur (that is, in the case of a non-translocated sample), the probe 4A and the probe 4B can hybridize to the chromosome, and the KIF5B-RET translocation has occurred. For example, in the case of a translocation sample, the probe 4A and the probe 4B cannot hybridize to the chromosome. Therefore, the presence or absence of the KIF5B-RET translocation can be determined depending on whether or not a fluorescent signal can be detected.
本発明の各プローブセットを構成するプローブは片方が第１蛍光物質で標識されており、他方が第２蛍光物質（第１蛍光物質と異なる蛍光シグナルを生ずる蛍光物質）で標識されている。これによって、各プローブに由来する蛍光シグナルを識別しつつ検出することが可能となる。蛍光物質を例示すると、Texas Red（登録商標）、FITC、7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC、APC-CyTM7、オレゴングリーン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートである。プローブの蛍光標識は公知の方法で行えばよい。例えば、標準的プロトコールに従い、ランダムプライミング法やニックトランスレーション法で標識化することができる。 One of the probes constituting each probe set of the present invention is labeled with a first fluorescent substance, and the other is labeled with a second fluorescent substance (a fluorescent substance that generates a fluorescent signal different from that of the first fluorescent substance). This makes it possible to detect the fluorescent signal derived from each probe while identifying it. Examples of fluorescent materials include Texas Red (registered trademark), FITC, 7-AAD, Alexa Fluor (registered trademark) 488, Alexa Fluor (registered trademark) 350, Alexa Fluor (registered trademark) 546, Alexa Fluor (registered trademark) 555. , Alexa Fluor (registered trademark) 568, Alexa Fluor (registered trademark) 594, Alexa Fluor (registered trademark) 633, Alexa Fluor (registered trademark) 647, Cy TM 2, DsRED , PerCP TM, R-Phycoerythrin, Propidium Iodide, AMCA , DAPI, ECFP, MethylCoumarin, Allophycocyanin, Cy TM 3, Cy TM 5, Rhodamine-123, Tetramethylrhodamine, PE, PE-Cy TM 5, PE-Cy TM 5.5, PE-Cy TM 7, APC, APC-Cy TM 7 Oregon green, carboxyfluorescein, carboxyfluorescein diacetate. The fluorescent labeling of the probe may be performed by a known method. For example, labeling can be performed by a random priming method or a nick translation method according to a standard protocol.
本発明の好ましい一態様では、第１プローブセット又は第３プローブセットを用いる。より好ましい態様では第３プローブセットを用いる。上記の通り、第３プローブセットによれば、KIF5B遺伝子の転座と、RET遺伝子の転座の両方を把握することができることから、最も信頼性の高い判定が可能となる。第３プローブセットを用いる場合において、他のプローブセットを併用すれば、更に信頼性の高い判定結果を得ることができる。ここでの併用の例としては、第３プローブセットと第１プローブセットの併用、全プローブセット（第１プローブセット〜第４プローブセット）の併用を挙げることができる。 In a preferred embodiment of the present invention, the first probe set or the third probe set is used. In a more preferred embodiment, the third probe set is used. As described above, according to the third probe set, since it is possible to grasp both the KIF5B gene translocation and the RET gene translocation, the most reliable determination is possible. In the case where the third probe set is used, a more reliable determination result can be obtained by using another probe set in combination. Examples of the combined use here include the combined use of the third probe set and the first probe set, and the combined use of all probe sets (first probe set to fourth probe set).
本発明の方法では、例えば、以下のステップ(i)〜(iv)を行う。
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセット（即ち第１プローブセット、第２プローブセット、第３プローブセット、第４プローブセットのいずれか）を接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。
In the method of the present invention, for example, the following steps (i) to (iv) are performed.
(i) contacting the chromosome sample with any one of the probe sets (1) to (4) (that is, any of the first probe set, the second probe set, the third probe set, and the fourth probe set). ;
(ii) washing the chromosomal sample to remove probes that are not specifically hybridized to the target;
(iii) detecting a fluorescent signal;
(iv) A step of determining the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene based on the pattern of the fluorescent signal.
ステップ(i)の染色体サンプルは、対象から採取した試料（例えば、血液、皮膚組織、毛髪）から常法によって調製される。本発明において用語「対象」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物をいう。ヒト以外の哺乳動物は、家畜動物、ペット、実験動物、及びヒト以外の霊長類を含み、具体例を挙げれば、ニワトリ、ウマ、雌牛、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク及びウサギである。典型的な対象はヒトである。好ましい対象は肺癌患者である。肺癌患者の中でも非小細胞肺癌患者又は非小細胞肺癌を罹患するリスクのある肺癌患者は特に好ましい対象である。 The chromosome sample of step (i) is prepared by a conventional method from a sample (eg, blood, skin tissue, hair) collected from the subject. In the present invention, the term “subject” refers to a human or a non-human mammal. Mammals other than humans include livestock animals, pets, laboratory animals, and non-human primates. Specific examples include chickens, horses, cows, pigs, goats, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, minks and It is a rabbit. A typical subject is a human. A preferred subject is a patient with lung cancer. Among lung cancer patients, non-small cell lung cancer patients or lung cancer patients at risk of suffering from non-small cell lung cancer are particularly preferred subjects.
ステップ(i)〜(iii)は、FISHアッセイにおいて必須且つ基本的な工程であり、当業者であれば後述の実施例を参考にして適切な条件を設定することができる。また、その実施の際には、in situハイブリダイゼーションの一般的な条件を記述するLeitch at al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v 2 (1994)を参照することができる。ここで、FISHアッセイでは、核酸プローブと染色体上の標的配列（プローブ特異的なDNA配列）との間のハイブリダイゼーションを検出する。ここでの用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のDNA又はDNAとRNA相補鎖の結合過程、または形成された二本鎖分子を意味する。本発明におけるハイブリダイゼーション条件は、染色体サンプルや採用するプローブセットによって変動し得るが、当業者であれば予備実験を通して容易に設定可能である。また、ハイブリダイゼーション条件として、高ストリンジェンシー条件ないし低ストリンジェンシー条件を採用可能である。温度、塩濃度、ホルムアミド濃度等のパラメータの調整によって、適切なハイブリダイゼーション条件を設定することができる。また、ハイブリダイゼーションに基づく蛍光シグナルを至適化するために、ハイブリダイゼーション工程（即ちステップ(i)）或いはそれに続く洗浄工程（即ちステップ(ii)）の中でハイブリダイゼーション条件を変動させることにしてもよい。一般に、高ストリンジェンシー条件を採用すればバックグラウンドシグナルを低減させることができるが、同時に感度も低下する。高ストリンジェンシー条件の例は、0.1 x SSPE、0.1% SDS、65℃での反応であり、中ストリンジェンシー条件の例は、0.2 x SSOE、0.1%SDS、50℃での反応であり、低ストリンジェンシー条件の例は、1 x SSPE、0.1% SDS、50℃での反応である。 Steps (i) to (iii) are essential and basic steps in the FISH assay, and those skilled in the art can set appropriate conditions with reference to the examples described below. In doing so, see Leitch at al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v 2 (1994), which describes the general conditions of in situ hybridization. it can. Here, in the FISH assay, hybridization between a nucleic acid probe and a target sequence (probe-specific DNA sequence) on a chromosome is detected. As used herein, the term “hybridization” refers to a process of binding two DNAs or a DNA and an RNA complementary strand for the formation of a double-stranded molecule, or a formed double-stranded molecule. The hybridization conditions in the present invention may vary depending on the chromosome sample and the probe set employed, but those skilled in the art can easily set them through preliminary experiments. Moreover, high stringency conditions or low stringency conditions can be employed as hybridization conditions. Appropriate hybridization conditions can be set by adjusting parameters such as temperature, salt concentration, and formamide concentration. In addition, in order to optimize the fluorescence signal based on hybridization, hybridization conditions are changed in the hybridization step (ie, step (i)) or the subsequent washing step (ie, step (ii)). Also good. In general, if high stringency conditions are employed, the background signal can be reduced, but at the same time the sensitivity is reduced. An example of high stringency conditions is a reaction at 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65 ° C, an example of medium stringency conditions is a reaction at 0.2 x SSOE, 0.1% SDS, 50 ° C, and a low stringency An example of a Genci condition is a reaction at 1 × SSPE, 0.1% SDS, 50 ° C.
ステップ(ii)に続くステップ(iii)では、蛍光シグナルを検出する。FISHアッセイにおけるハイブリダイゼーションシグナルは、核酸プローブの蛍光標識を蛍光顕微鏡等を通して可視化することによって検出される。 In step (iii) following step (ii), a fluorescent signal is detected. The hybridization signal in the FISH assay is detected by visualizing the fluorescent label of the nucleic acid probe through a fluorescence microscope or the like.
本発明では、ステップ(iii)で得られた蛍光シグナルのパターン（蛍光像）に基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する（ステップ(iv)）。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。本発明で使用するプローブセットでは、片方のプローブが特定の蛍光物質で標識されており、他方のプローブは当該蛍光物質と異なる蛍光シグナルを生ずる別の蛍光物質で標識されている。例えば、第３プローブセットとして、TexRed標識のプローブ２ＡとFITC標識のプローブ１Ｂを採用した場合、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座が生じている染色体サンプルでは、典型的には、二つの蛍光シグナルが併合したシグナル（黄色）が検出される。他方、転座が生じていない染色体サンプルでは、二つの蛍光シグナル（赤色のシグナルと緑色のシグナル）が離れて別々に検出される。第１プローブセットや第２プローブセットを採用した場合にあっては、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座が生じている染色体サンプルでは二つの蛍光シグナルが離れて別々に検出され、転座が生じていない染色体サンプルでは、典型的には、二つの蛍光シグナルが近接して観察されるか、或いは二つの蛍光シグナルが併合したシグナル（黄色）が検出される。このように、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無は、蛍光シグナルのパターンに反映される。従って、蛍光シグナルのパターンによって、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定できる。 In the present invention, the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene is determined based on the fluorescence signal pattern (fluorescence image) obtained in step (iii) (step (iv)). The determination here can be automatically / mechanically performed without depending on the determination of a person having specialized knowledge such as a doctor or a laboratory technician, as is apparent from the determination criteria. In the probe set used in the present invention, one probe is labeled with a specific fluorescent substance, and the other probe is labeled with another fluorescent substance that generates a fluorescent signal different from the fluorescent substance. For example, when TexRed-labeled probe 2A and FITC-labeled probe 1B are employed as the third probe set, a chromosome sample in which a translocation occurs between the KIF5B gene and the RET gene typically has two fluorescent lights. A merged signal (yellow) is detected. On the other hand, in a chromosomal sample in which no translocation has occurred, two fluorescent signals (red signal and green signal) are detected separately. When the first probe set or the second probe set is used, two fluorescent signals are detected separately in the chromosome sample in which a translocation occurs between the KIF5B gene and the RET gene. In a chromosomal sample that has not occurred, two fluorescent signals are typically observed in close proximity, or a combined signal (yellow) of the two fluorescent signals is detected. Thus, the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene is reflected in the pattern of the fluorescent signal. Therefore, the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene can be determined by the pattern of the fluorescent signal.
ステップ(iv)での判定は、好ましくは対照（テストサンプル）との比較に基づき行われる。ここでの対照は、例えば、非小細胞肺癌患者由来の染色体サンプル、或いは前癌性の病変を示す患者由来の染色体サンプルである。また、前癌性の病変がない患者の染色体サンプル、癌を罹患していない患者由来のサンプル、健常者由来の染色体サンプル等を対照として用いることもできる。細胞株由来の染色体サンプルを対照として採用することもできる。 The determination in step (iv) is preferably made on the basis of a comparison with a control (test sample). The control here is, for example, a chromosomal sample derived from a non-small cell lung cancer patient or a chromosomal sample derived from a patient exhibiting a precancerous lesion. In addition, a chromosomal sample of a patient without a precancerous lesion, a sample derived from a patient not suffering from cancer, a chromosomal sample derived from a healthy person, and the like can also be used as controls. A chromosome sample derived from a cell line can also be used as a control.
本発明の一態様では、二以上のプローブセットを選択し、選択した各プローブセットを用いて個別にステップ(i)〜(iii)を行う。そして、ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する。このように、複数のプローブセットを併用すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。好ましくは、この態様において選択されるプローブセットの中に、第１プローブセットと第３プローブセットを含めることとする。 In one embodiment of the present invention, two or more probe sets are selected, and steps (i) to (iii) are individually performed using each selected probe set. Then, in step (iv), the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene is determined by combining the fluorescence signal patterns obtained for each probe set. As described above, if a plurality of probe sets are used in combination, a more reliable determination result can be obtained. Preferably, the probe set selected in this aspect includes the first probe set and the third probe set.
２．KIF5B-RET転座の検出方法の応用
本発明の第２の局面は、本発明の検出方法の応用・用途に関する。この局面の一態様は、非小細胞肺癌を検出する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）が非小細胞肺癌を罹患していると決定するステップを含む。ここでの決定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。対象が非小細胞肺癌を罹患しているか否かを明らかにすることは、適切な治療方針を決定する上で重要である。本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象が腺癌を罹患していると決定することにしてもよい。また、本発明の検出方法の結果に基づき、予後の判定を行うことにしてもよい。例えば、予後不良、中間、良好な予後のいずれかに分類されるかを決定することができる。
2. Application of KIF5B-RET translocation detection method The second aspect of the present invention relates to application and use of the detection method of the present invention. One embodiment of this aspect relates to a method for detecting non-small cell lung cancer, and a subject (patient) from which a chromosomal sample is derived when it is determined by the detection method of the present invention that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene. ) Is determined to have non-small cell lung cancer. The determination here can be made automatically / mechanically without depending on the judgment of a person having specialized knowledge, such as a doctor or laboratory technician, as is apparent from the judgment criteria. Identifying whether a subject has non-small cell lung cancer is important in determining an appropriate treatment strategy. When it is determined by the detection method of the present invention that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, it may be determined that the subject from which the chromosomal sample is derived has adenocarcinoma. Moreover, you may decide to determine prognosis based on the result of the detection method of this invention. For example, it can be determined whether the prognosis is poor, intermediate, or good.
他の一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであると決定する。換言すれば、RETキナーゼ阻害剤で処置を受けるべき候補として対象が同定される。当該決定に基づき治療方針が決定され得る。例えば、一又は二以上のRETキナーゼ阻害剤による処置が推薦又は処方されることになる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。尚、第１プローブセット又は第３プローブセットの使用によってRET遺伝子の転座が証明される染色体サンプルが由来する患者に対しても、同様の決定を行ってもよい。 Another embodiment relates to a method for determining a therapeutic strategy, and when the detection method of the present invention determines that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the subject (patient) from which the chromosomal sample is derived is treated as a RET kinase. Determine that the inhibitor should be treated. In other words, the subject is identified as a candidate to be treated with a RET kinase inhibitor. A treatment policy can be determined based on the determination. For example, treatment with one or more RET kinase inhibitors will be recommended or prescribed. Moreover, treatment / treatment or the like may be performed on the subject based on the determination. Note that the same determination may be made for a patient from which a chromosomal sample whose RET gene translocation is proved by using the first probe set or the third probe set is derived.
本明細書において用語「処置」又は「治療」を使用する場合には、疾病（例えば非小細胞肺癌）又は病態の予防、寛解、防止または治癒が意図される。症状が現れた後の処置は、当該症状及び／又は関連する症状の減少、寛解又は除去、或いは悪化の防止を目的とする。症状が現れる前の処置（即ち、予防処置は）は、典型的には、症状が現れるリスクを減少すること、或いは症状が現れた場合に重症度を和らげることを目的とする。 As used herein, the term “treatment” or “therapy” is intended to prevent, ameliorate, prevent or cure a disease (eg, non-small cell lung cancer) or condition. Treatment after symptoms appear is aimed at reducing, ameliorating or eliminating the symptoms and / or related symptoms, or preventing exacerbations. Treatment before symptoms appear (ie, preventive treatment) is typically aimed at reducing the risk of symptoms appearing or reducing the severity if symptoms appear.
RETキナーゼ阻害剤の例は、スニチニブ（SUNITINIB）、ソラフェニブ（SORATINIB）及びバンデタニブ（VANDETANIB）である。RETキナーゼ阻害剤として、RETの発現をノックダウンする化合物を使用することもできる。当該化合物の例は、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーである。RETの発現を阻害可能な分子であれば、一般に、RETの発現をノックダウンすることが可能である。例えばRNAi、アンチセンスRNA、リボザイム、miRNA等を利用可能である。当該技術分野で既知の様々な遺伝子ノックダウン戦略を採用することができる。 Examples of RET kinase inhibitors are sunitinib (SUNITINIB), sorafenib (SORATINIB) and vandetanib (VANDETANIB). As a RET kinase inhibitor, a compound that knocks down the expression of RET can also be used. Examples of such compounds are antibodies, small molecules, peptides, aptamers. In general, any molecule that can inhibit the expression of RET can knock down the expression of RET. For example, RNAi, antisense RNA, ribozyme, miRNA and the like can be used. Various gene knockdown strategies known in the art can be employed.
RETキナーゼ阻害剤が、RET及び／又はRETキナーゼ活性の発現（例えば、転写、翻訳及び／又は安定性）を阻害するものであってもよい。阻害剤はRET特異的であっても、非特異的（例えば、非特異的キナーゼ阻害剤、マルチターゲットインヒビター）であってもよい。いくつかのRETキナーゼ阻害剤が開発され、その臨床応用が検討されている。RETキナーゼ活性の下流には、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ(PI3K)や細胞外シグナルキナーゼ１／２(ERK)(Wixted JH et al. J Biol Chem 2011)、STAT3(Hwang JH et al. Mol Endocrinol 2003;17: 1155-1166)などがある。このような下流シグナル伝達経路を阻害する薬剤をRETキナーゼ阻害剤の代替又は補助として使用することもできる。
The RET kinase inhibitor may be one that inhibits expression of RET and / or RET kinase activity (eg, transcription, translation and / or stability). Inhibitors may be RET-specific or non-specific (eg, non-specific kinase inhibitors, multi-target inhibitors). Several RET kinase inhibitors have been developed and their clinical application is being investigated. Downstream of RET kinase activity, phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K),
スニチニブは、2008年4月に承認され、同年6月に発売された消化管間質腫瘍(GIST)と腎臓癌を対象とした抗癌剤であり、血管新生に関与するVEGF（血管内皮細胞増殖因子）受容体と、腫瘍増殖に関与するPDGF（血小板由来増殖因子）受容体、RETなど複数の受容体を標的としている。ソラフェニブは、腎臓癌および切除不能肝細胞癌に適応拡大された、Braf、RETなどをターゲットとした複数の受容体を標的とする阻害剤である。バンデタニブは、EGFR、VEGFをターゲットとするため血管新生抑制作用が有るが、RETも阻害するため米国FDAでは甲状腺髄様癌に適応が承認されている。 Sunitinib is an anticancer agent for gastrointestinal stromal tumor (GIST) and kidney cancer that was approved in April 2008 and launched in June 2008, and is involved in angiogenesis VEGF (vascular endothelial growth factor) It targets multiple receptors such as the receptor, PDGF (platelet-derived growth factor) receptor involved in tumor growth, and RET. Sorafenib is an inhibitor targeting multiple receptors targeting Braf, RET, etc., which has been expanded for kidney cancer and unresectable hepatocellular carcinoma. Vandetanib has an anti-angiogenic action because it targets EGFR and VEGF, but it also inhibits RET, so the US FDA has approved it for medullary thyroid cancer.
ある態様では、KIF5B-RET転座を有すると判定された対象は、転座部位以降の部位にRET変異を有するとも判定される。RET変異は例えば活性化変異である。RETの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意の変異である。例えば、RETの活性化変異がRETの恒常的活性化をもたらしてもよい。また、RET阻害剤の使用に関連する或いは起因する二次的なRET活性化の変異型であってもよい。RETシグナル活性の増加を生じる変異は、例えば、RETシグナルの増加を起こすキナーゼドメインでの点変異、欠失、挿入、複製、逆位、或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及び他のRET変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。 In some embodiments, a subject determined to have a KIF5B-RET translocation is also determined to have a RET mutation at a site following the translocation site. The RET mutation is, for example, an activation mutation. An activating mutation of RET is any mutation that results in increased activity compared to the wild type mutation. For example, activating mutations in RET may result in constitutive activation of RET. It may also be a secondary RET activation variant associated with or resulting from the use of a RET inhibitor. Mutations that cause an increase in RET signal activity are caused, for example, by point mutations, deletions, insertions, replications, inversions, or combinations of two or more thereof in the kinase domain that cause an increase in RET signal. It can also be determined that a subject determined to have both a KIF5B-RET translocation and other RET mutations should be treated with a RET kinase inhibitor. Moreover, treatment / treatment or the like may be performed on the subject based on the determination.
本発明の更なる一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）をEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定する。この態様では、(1)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はEGFR変異を有する、(2)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はALK転座変異を有する、或いは(3)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はEGFR変異とALK転座変異を有する、と判断されることになる。EGFR変異は例えば活性化変異である。EGFRの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意のEGFR変異である。EGFRの活性化変異がEGFRの恒常的活性化をもたらしてもよい。EGFRシグナルの増加と関連する癌が、細胞外ドメイン内に欠失があるEGFRの変異型を発現していてもよい。ある態様では、変異型のEGFRはEGFRvIIIである。EGFRシグナル活性の増加を生じる変異は、例えば、EGFRシグナルの増加を起こすキナーゼドメインでの点変異、欠失、挿入、複製、逆位或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及びEGFR変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ活性及び／又はEGFR活性阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。EGFR阻害剤の例はゲフィチニブ、エルロチニブ、ラバチニブ、TAK-285、EKB-569及びバンデタニブである。 A further aspect of the present invention relates to a method for determining a therapeutic strategy, and a subject (patient) from which a chromosomal sample is derived when it is determined by the detection method of the present invention that there is a translocation between the KIF5B gene and the RET gene. Should be treated with an EGFR inhibitor and / or an ALK inhibitor. In this aspect, (1) a subject determined to have a KIF5B-RET translocation has an EGFR mutation, (2) a subject determined to have a KIF5B-RET translocation has an ALK translocation mutation, or ( 3) A subject determined to have the KIF5B-RET translocation will be determined to have an EGFR mutation and an ALK translocation mutation. The EGFR mutation is, for example, an activation mutation. An activating mutation of EGFR is any EGFR mutation that results in increased activity compared to the wild type mutation. Activating mutations in EGFR may result in constitutive activation of EGFR. A cancer associated with increased EGFR signal may express a variant of EGFR with a deletion in the extracellular domain. In some embodiments, the variant EGFR is EGFRvIII. Mutations that cause an increase in EGFR signal activity are caused, for example, by point mutations, deletions, insertions, replications, inversions, or combinations of two or more thereof in the kinase domain that cause an increase in EGFR signal. It can also be determined that a subject determined to have both a KIF5B-RET translocation and an EGFR mutation should be treated with an inhibitor of RET kinase activity and / or EGFR activity. Moreover, treatment / treatment or the like may be performed on the subject based on the determination. Examples of EGFR inhibitors are gefitinib, erlotinib, lavatinib, TAK-285, EKB-569 and vandetanib.
ALK転座変異は、例えば、EML4-ALKである。ALK転座変異は例えば活性化変異である。ALKの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意のALK変異である。ALKの活性化変異がALKの恒常的活性化をもたらしてもよい。ALK活性の増加を生じる変異は、例えば、ALKの点変異、欠失、挿入、複製、或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及びALK転座等変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ活性及び／又はALK活性阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。ALK阻害剤の例はクリゾチニブ及びCEP-28122である、 The ALK translocation mutation is, for example, EML4-ALK. An ALK translocation mutation is, for example, an activation mutation. An activating mutation of ALK is any ALK mutation that results in increased activity compared to the wild type mutation. An activating mutation of ALK may result in constitutive activation of ALK. Mutations that result in increased ALK activity are caused, for example, by ALK point mutations, deletions, insertions, replications, or combinations of two or more thereof. It can also be determined that a subject determined to have both a KIF5B-RET translocation and a mutation such as an ALK translocation should be treated with an inhibitor of RET kinase activity and / or ALK activity. Moreover, treatment / treatment or the like may be performed on the subject based on the determination. Examples of ALK inhibitors are crizotinib and CEP-28122
ところで、本発明の検出方法（FISH解析）の結果から、KIF5B-RET転座が存在しないことが判明した場合には、EGFR変異やEML4-ALK転座など、肺癌特異的な遺伝子異常が存在する可能性が高くなり、これらの遺伝子異常の検索を更に進めることが重要となる。そこで、本発明の更なる一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座がないと判定された場合であって、染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌の患者であるときに、当該対象には肺癌特異的な他の遺伝子異常が存在すると判定する。 By the way, when it is found from the result of the detection method (FISH analysis) of the present invention that the KIF5B-RET translocation does not exist, there are lung cancer-specific gene abnormalities such as EGFR mutation and EML4-ALK translocation. The possibility increases and it is important to further search for these gene abnormalities. Accordingly, a further aspect of the present invention relates to a method for determining a therapeutic strategy, wherein the detection method of the present invention determines that there is no translocation between the KIF5B gene and the RET gene, and a chromosomal sample is derived from the method. When the subject is a patient with non-small cell lung cancer, the subject is determined to have other genetic abnormalities specific to lung cancer.
以上の説明から明らかな通り、本願では、本発明の方法によって決定された治療方針に従って対象を処置するステップを含む治療方法も提供される。本発明の治療方法の治療対象疾患は、典型的には非小細胞肺癌（NSCLC）である。但し、他の癌の治療への本発明の適用も想定される。用語「癌」は広義に解釈される。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。癌はその発生の母体となった臓器の名、もしくは発生母組織の名で呼ばれ、主なものを列記すると、舌癌、歯肉癌、咽頭癌、上顎癌、喉頭癌、唾液腺癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、副腎癌、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、子宮癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、尿道癌、網膜芽細胞腫、結膜癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、睾丸腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などである。そして、さらに発生臓器の部位の特徴によって、上・中・下咽頭癌、上部・中部・下部食道癌、胃噴門癌、胃幽門癌、子宮頚癌、子宮体癌などと細分類されているが、これらが限定的ではなく本発明の「癌」としての記載に含まれる。 As is apparent from the above description, the present application also provides a therapeutic method comprising the step of treating a subject according to a therapeutic policy determined by the method of the present invention. The disease to be treated by the treatment method of the present invention is typically non-small cell lung cancer (NSCLC). However, application of the present invention to the treatment of other cancers is also envisaged. The term “cancer” is interpreted broadly. In the present invention, the term “cancer” is used interchangeably with “tumor”. It may also include benign tumors, benign malignant border lesions, and malignant tumors before the pathological diagnosis is confirmed, that is, before any benign or malignant tumor is confirmed. possible. Cancer is called the name of the organ that developed it, or the name of the mother tissue. The main cancers are: tongue cancer, gingival cancer, pharyngeal cancer, maxillary cancer, laryngeal cancer, salivary gland cancer, esophageal cancer. , Stomach cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, thyroid cancer, adrenal cancer, pituitary tumor, pineal tumor, uterine cancer, ovarian cancer, Vaginal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, urethral cancer, retinoblastoma, conjunctival cancer, glioma, glioblastoma, skin cancer, leukemia, malignant lymphoma, testicular tumor, osteosarcoma, striated muscle Tumor, leiomyosarcoma, angiosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, Ewing sarcoma. And it is subdivided into upper, middle and lower pharyngeal cancer, upper / middle / lower esophageal cancer, gastric cardia cancer, gastric pyloric cancer, cervical cancer, endometrial cancer, etc. These are not limiting and are included in the description of the present invention as “cancer”.
本発明の治療方法によれば、例えば、癌の発生を防止すること、癌の症状を減少させること、及び／又は癌の成長を阻害することができる。本発明の治療方法の一態様では、RET阻害剤、ALK阻害剤、EGFR阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物が投与される。これらの化合物は、癌の処置を目的とした外科手術及び／又は放射線療法の前又は後に投与されてもよい。手術や放射線療法は癌を処置するための一般的な方法である。手術は癌発生のリスクを減少させる予防的措置としても採用され得る。例えば、大腸癌発生のリスクのある対象（例えば家族性大腸ポリポージスの患者）は、癌発生リスクを減少させるため、大腸の切除を受けることがある。肺癌の前癌病変AAH(異型性腺腫様過形成)の患者も肺切除を受けることがある。一態様では、これらの患者に対しても、RET阻害剤が手術前又は後に投与される。 According to the treatment method of the present invention, for example, the occurrence of cancer can be prevented, the symptoms of cancer can be reduced, and / or the growth of cancer can be inhibited. In one embodiment of the treatment method of the present invention, one or more compounds selected from the group consisting of a RET inhibitor, an ALK inhibitor, and an EGFR inhibitor are administered. These compounds may be administered before or after surgery and / or radiation therapy intended for the treatment of cancer. Surgery and radiation therapy are common methods for treating cancer. Surgery can also be employed as a preventive measure to reduce the risk of developing cancer. For example, a subject at risk of developing colorectal cancer (eg, a patient with familial colorectal polyposis) may undergo resection of the large intestine to reduce the risk of developing cancer. Patients with precancerous lesions of lung cancer AAH (atypical adenomatous hyperplasia) may also undergo lung resection. In one aspect, these patients are also administered a RET inhibitor before or after surgery.
本発明の治療方法の一態様では、RET阻害剤、ALK阻害剤、EGFR阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とともに、一以上の癌医薬が使用される。例えば、RET阻害剤とともに、化学療法剤及び／又は免疫療法剤が投与される。癌医薬は、癌を罹患した患者或いは癌発生リスクのある対象を処置する目的で使用される医薬である。癌医薬は、例えば、免疫療法剤、化学療法剤及び癌ワクチンからなる群より選択される一以上の成分を含有する。 In one embodiment of the treatment method of the present invention, one or more cancer drugs are used together with one or more compounds selected from the group consisting of a RET inhibitor, an ALK inhibitor, and an EGFR inhibitor. For example, a chemotherapeutic agent and / or an immunotherapeutic agent is administered together with a RET inhibitor. A cancer drug is a drug used for the purpose of treating a patient suffering from cancer or a subject at risk of developing cancer. The cancer medicament contains one or more components selected from the group consisting of, for example, an immunotherapeutic agent, a chemotherapeutic agent, and a cancer vaccine.
化学療法剤とは、癌細胞を直接ターゲットとする化学的又は生物学的な剤である。化学療法剤のいくつかは、持続的生存に依存する癌細胞の細胞活性を阻害するように機能する。化学療法剤の例は、アルキル化剤／アルカロイド、代謝拮抗剤、ホルモン又はホルモン類似体、抗悪性腫瘍剤である。化学療法剤の具体例は、これらに限定されるものではないが、アミノグリコシド、アスパラキナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンHCL、シスプラチン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCL、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド(VP-16-2139)、フロクスウリジン、フルオロウラシル（5-FU）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ2a、リュープロリド酢酸塩(LHRH放出因子類似体)、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミンHCL(ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（op'-DDD）、ミトキサントロンHCL、オクトレオチド、ブリカマイシン、プロカルバジンHCL、ストレプトゾシン、タミキシフェンクエン酸塩、ペメトレキセート、チオグアニン、チオテバ、ブンブラスチン硫酸塩、アムサクリン(m-AMSA)、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチルーGAG、メチルグリオキサールビスーグアニルヒドラゾンーMGBG）、ベントスタチン（２‘デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチルーCCNU）、テニポシド（VM−２６）及びビンデシン硫酸塩である。 A chemotherapeutic agent is a chemical or biological agent that directly targets cancer cells. Some chemotherapeutic agents function to inhibit the cellular activity of cancer cells that depend on sustained survival. Examples of chemotherapeutic agents are alkylating agents / alkaloids, antimetabolites, hormones or hormone analogs, antineoplastic agents. Specific examples of chemotherapeutic agents include, but are not limited to, aminoglycosides, asparakinase, busulfan, carboplatin, chlorambucil, cytarabine HCL, cisplatin, dactinomycin, daunorubicin HCL, estramustine phosphate sodium, etoposide (VP-16-2139), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (Hydroxycarbamide), Ifosfamide, Interferon alfa 2a, Leuprolide acetate (LHRH releasing factor analog), Lomustine (CCNU), Mechlorethamine HCL (nitrogen mustard), mercaptopurine, mesna, mitotane (op'-DDD), mitoxantrone HCL, octreotide, bricamycin, procarbazine HCL, streptozocin, tamoxifen citrate, pe Metrexate, thioguanine, thioteba, bunblastine sulfate, amsacrine (m-AMSA), azacitidine, erythropoietin, hexamethylmelamine (HMM), interleukin 2, mitoguazone (methyl-GAG, methylglyoxal bis-guanylhydrazone-MGBG), bentostatin (2 'Deoxycoformycin), semustine (methyl-CCNU), teniposide (VM-26) and vindesine sulfate.
本発明の治療方法を実施する際、ホルモン療法を併用することにしてもよい。ホルモン療法では、癌を有する又は癌を有するリスクがある対象に対してホルモン又はホルモン代替物或いはホルモン誘導体を投与する。具体例はエストロゲン療法（例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール（例えば乳癌および前立腺癌）の使用）、抗エストロゲン療法（例えば、タモキシフェン（例えば乳癌）の使用）、プロゲステロン療法（例えばメドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール（例えば乳癌および子宮体癌）の使用）、アンドロゲン遮断（例えばフルタミドなどの抗アンドロゲン物質（例えば前立腺癌）の使用）である。 When carrying out the treatment method of the present invention, hormone therapy may be used in combination. In hormone therapy, hormones or hormone substitutes or hormone derivatives are administered to a subject who has cancer or is at risk of having cancer. Specific examples include estrogen therapy (eg, use of diethylstilbestrol and ethinyl estradiol (eg, breast cancer and prostate cancer)), anti-estrogen therapy (eg, use of tamoxifen (eg, breast cancer)), progesterone therapy (eg, medroxyprogesterone and methoxyprogesterone acetate). Guest rolls (eg use of breast cancer and endometrial cancer), androgen blockade (eg use of antiandrogens such as flutamide, eg prostate cancer).
３．KIF5B-RET転座の検出用キット
本発明の更なる局面はKIF5B-RET転座を検出するためのキットに関する。本発明のキットは、本発明の検出方法を簡便且つ効率的に行うことを可能にする。本発明のキットは必須要素（必須成分）として、上記の第１プローブセット、第２プローブセット、第３プローブセット又は第４プローブセットを含む。２種類以上のプローブセットを含んでいても良い。例えば、第１プローブセットと第３プローブセットを含むキットが提供される。各プローブセットの詳細は上述の通りであるため、ここでの説明は省略する。
3. KIF5B-RET translocation detection kit A further aspect of the present invention relates to a kit for detecting the KIF5B-RET translocation. The kit of the present invention makes it possible to perform the detection method of the present invention simply and efficiently. The kit of the present invention includes the first probe set, the second probe set, the third probe set, or the fourth probe set as an essential element (essential component). Two or more types of probe sets may be included. For example, a kit including a first probe set and a third probe set is provided. Since the details of each probe set are as described above, description thereof is omitted here.
本発明のキットが他の要素を含んでいてもよい。他の要素の例は、プローブの使用にすいての説明書、DAPIなどのDNA対比染色剤、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄バッファー、溶媒、封入剤(mounting media)、コントロールスライド、反応容器、その他の器具である。診断目的の説明書を更に含んでいてもよい。また、癌患者由来の染色体サンプルにおけるKIF5B-RET転座の検出（陽性同定）が、当該患者をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであることを示す説明書等を更に含んでいてもよい。更には、治療方針を決定するための指針や説明を含んでいてもよい。 The kit of the present invention may contain other elements. Examples of other elements include instructions for probe usage, DNA counterstains such as DAPI, hybridization buffers, wash buffers, solvents, mounting media, control slides, reaction vessels, and other It is an instrument. It may further include instructions for diagnostic purposes. Moreover, the detection (positive identification) of the KIF5B-RET translocation in a chromosome sample derived from a cancer patient may further include an instruction or the like indicating that the patient should be treated with a RET kinase inhibitor. Further, it may include guidelines and explanations for determining a treatment policy.
＜肺癌におけるKIF5B-RET転座＞
１．材料と方法
（１）サンプルの調製
非小細胞肺癌（n=277）は、RNA抽出に十分な材料が入手可能である外科的切除例から回収した。癌のステージ分類は、IASLCの肺癌ステージガイドラインに従った。２００４年WHO分類システムによって腫瘍を分類した。７０％以上の腫瘍含量のある凍結腫瘍組織を更なる分析に使用した。腫瘍の大部分（n=157）を、RT-PCRによるmRNAレベルの解析にも使用した。得られたデータは、β−アクチンのmRNAレベルで補正した（即ち、β−アクチンの発現が十分に証明された検体が使用された）。
<KIF5B-RET translocation in lung cancer>
1. Materials and Methods (1) Sample Preparation Non-small cell lung cancer (n = 277) was recovered from surgical resections where sufficient material was available for RNA extraction. Cancer staging was in accordance with the IASLC Lung Cancer Stage Guidelines. Tumors were classified by the 2004 WHO classification system. Frozen tumor tissue with a tumor content greater than 70% was used for further analysis. The majority of tumors (n = 157) were also used for mRNA level analysis by RT-PCR. The obtained data was corrected at the mRNA level of β-actin (ie, a sample with a well-proven expression of β-actin was used).
腫瘍を外科的切除後、急速冷凍し、−８０℃で保存した。トータルRNAをIsogen(Nippon gene, Tokyo, Japan)キットで抽出した。RNA濃度を測定し、十分量回収されたものを逆転写に供した。Superscript II enzyme (Roche社)を用いたキットによって、0.5〜1μgのトータルRNAからcDNAを合成した。 Tumors were snap frozen after surgical resection and stored at -80 ° C. Total RNA was extracted with an Isogen (Nippon gene, Tokyo, Japan) kit. The RNA concentration was measured, and a sufficient amount recovered was subjected to reverse transcription. CDNA was synthesized from 0.5 to 1 μg of total RNA by a kit using Superscript II enzyme (Roche).
（２）RT-PCR及び変異解析
KIF5B-RETのRT−PCR解析には以下の配列のプライマーセットを用いた。フォワードプライマー(AAATGAGCTCAACAGATGGCGTAA：配列番号１)はKIF5B遺伝子のエクソン１２に対応する。一方、リバースプライマー(AGAACCAAGTTCTTCCGAGGGAAT：配列番号２)はRET遺伝子のエクソン１２に対応する。PCRによる増幅は、調製したcDNAを用い、製造元のガイドラインに基づいてTakara EXTaq(Takara Bio Inc. Shiga Japan)を使用して行った。４０サイクルの増幅を行った。得られたPCR産物（バリアントタイプ１であれば681bp、バリアントタイプ３であれば1395bp）をアガロースゲル電気泳動で分析するとともに、ダイレクトシーケンスも行った。
(2) RT-PCR and mutation analysis
For RT-PCR analysis of KIF5B-RET, a primer set having the following sequence was used. The forward primer (AAATGAGCTCAACAGATGGCGTAA: SEQ ID NO: 1) corresponds to exon 12 of the KIF5B gene. On the other hand, the reverse primer (AGAACCAAGTTCTTCCGAGGGAAT: SEQ ID NO: 2) corresponds to exon 12 of the RET gene. Amplification by PCR was performed using Takara EXTaq (Takara Bio Inc. Shiga Japan) based on the manufacturer's guidelines using the prepared cDNA. Forty cycles of amplification were performed. The obtained PCR product (681 bp for
非小細胞肺癌におけるEGFRの遺伝子解析は、現在日本では保険適応の範囲内で行われている。パラフィン切片を解析会社に送付し、ゲノムDNAからのダイレクトシーケンスを依頼した。Kras遺伝子変異解析は、過去に発明者らが報告した方法に準じて施行された。Braf遺伝子変異及びErbB2遺伝子変異は、既知の変異を有する特異的な部位を含むプライマーを使用したダイレクトシーケンスで解析した。 Genetic analysis of EGFR in non-small cell lung cancer is currently conducted within the scope of insurance indication in Japan. A paraffin section was sent to an analysis company and requested for direct sequencing from genomic DNA. Kras gene mutation analysis was performed according to the method previously reported by the inventors. Braf gene mutation and ErbB2 gene mutation were analyzed by direct sequencing using primers containing specific sites with known mutations.
（３）蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）
（３−１）プローブ
KIF5B遺伝子用のプローブとして、バクテリア人工染色体（BAC）（GSP研究所保有のもの）を利用した。また、RET遺伝子用のプローブにもBACを利用した。詳細には、株式会社GSP研究所が保有する20万種類のバクテリア人工染色体（BAC）クローンライブラリーからRET遺伝子座周辺に対応するBACクローンと、KIF5B遺伝子座周辺に対応するBACクローンを米国特許６,６６２,１１３号（Digital correlation of test samples and the screening of interactions between the same）の方法を使用して検索した。その結果、RET遺伝子座周辺BACクローン8種類（GSP1506F09、GSP3023D06、GSP3012B07、GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08、GSP0075D03）とKIF5B遺伝子座周辺BACクローン9種類（GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09、GSP3119B09、GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12、GSP1094C12）を選択した。BACクローンは、クロラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上にストリークし、37℃、オーバーナイトで生育させた。各BACクローン由来のシングルコロニーを選択し、37℃、オーバーナイトで生育させ、確立した手法を用いてBAC DNAを抽出した。これらのBAC DNAにFluorescein12-dUTP(FITC)（PerkinElmer,Massachusetts,USA）又はTexRed-5-dUTP（PerkinElmer, Massachusetts,USA）をNickTranslation Kit (株式会社GSP研究所)を使用して標識し、以下の4種類のFISHプローブセットを作製した（図１〜６、１１、１２を参照）。
(3) Fluorescence in situ hybridization (FISH)
(3-1) Probe
As a probe for the KIF5B gene, a bacterial artificial chromosome (BAC) (owned by GSP Laboratory) was used. BAC was also used as a probe for the RET gene. Specifically, US Patent No. 6 shows BAC clones corresponding to the RET locus and BAC clones corresponding to the vicinity of the KIF5B locus from 200,000 kinds of bacterial artificial chromosome (BAC) clone libraries owned by GSP Laboratory, Inc. , 662, 113 (Digital correlation of test samples and the screening of interactions between the same). As a result, 8 types of BAC clones around the RET locus (GSP1506F09, GSP3023D06, GSP3012B07, GSP1877H08, GSP1018G02, GSP1070C12, GSP0369G08, GSP0075D03) and 9 types of BAC clones around the KIF5B locus (GSP1544E09, GSP1541C15GSP, GSP1541C10GSP GSP3158B05, GSP1107C12, GSP1094C12) were selected. BAC clones were streaked on LB agar plates containing chloramphenicol and grown overnight at 37 ° C. Single colonies from each BAC clone were selected and grown overnight at 37 ° C., and BAC DNA was extracted using established techniques. These BAC DNAs were labeled with Fluorescein12-dUTP (FITC) (PerkinElmer, Massachusetts, USA) or TexRed-5-dUTP (PerkinElmer, Massachusetts, USA) using NickTranslation Kit (GSP Laboratories, Inc.), and Four types of FISH probe sets were prepared (see FIGS. 1 to 6, 11, and 12).
（第１プローブセット）
プローブ１Ａとプローブ１ＢからなるRETスプリット二重カラーFISHプローブセット（RET Split Dual Color FISH Probe）。２種類のプローブセット（第１プローブセットａと第１プローブセットｂ）を用意した。
＜第１プローブセットａ＞
プローブ１Ａ：GSP1506F09のインサートをTexRed標識したもの
プローブ１Ｂ：GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
＜第１プローブセットｂ＞
プローブ１Ａ：GSP1506F09、GSP3023D06及びGSP3012B07のインサートをTexRed標識したもの(3種類のDNA断片の混合物)
プローブ１Ｂ：GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
(First probe set)
RET split dual color FISH probe set consisting of probe 1A and probe 1B. Two types of probe sets (first probe set a and first probe set b) were prepared.
<First probe set a>
Probe 1A: GSP1506F09 insert labeled with TexRed Probe 1B: GSP1877H08, GSP1018G02, GSP1070C12, GSP0369G08 and GSP0075D03 inserts FITC-labeled (mixture of 5 types of DNA fragments)
<First probe set b>
Probe 1A: GSP1506F09, GSP3023D06 and GSP3012B07 inserts labeled with TexRed (mixture of three DNA fragments)
Probe 1B: FISP-labeled inserts of GSP1877H08, GSP1018G02, GSP1070C12, GSP0369G08 and GSP0075D03 (mixture of 5 types of DNA fragments)
（第２プローブセット）
プローブ２Ａとプローブ２ＢからなるKIF5Bスプリット二重カラーFISHプローブセット（KIF5B Split Dual Color FISH Probe）
プローブ２Ａ： GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12及びGSP1094C12の各インサートをTexRed標識したもの（４種類のDNA断片の混合物）
プローブ２Ｂ： GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09及びGSP3119B09をFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
(Second probe set)
KIF5B Split Dual Color FISH Probe Set consisting of Probe 2A and Probe 2B
Probe 2A: GSP1528C10, GSP3158B05, GSP1107C12 and GSP1094C12 inserts labeled with TexRed (mixture of four DNA fragments)
Probe 2B: FISP-labeled GSP1544E09, GSP1541C10, GSP1023E07, GSP1581D09 and GSP3119B09 (mixture of 5 DNA fragments)
（第３プローブセット）
プローブ１Ｂとプローブ２ＡからなるKIF5B/RET, SY転座二重カラーFISHプローブセット（KIF5B/RET, SY Translocation Dual Color FISH Probe）
(Third probe set)
KIF5B / RET, SY translocation dual color FISH probe consisting of probe 1B and probe 2A (KIF5B / RET, SY Translocation Dual Color FISH Probe)
（第４プローブセット）
プローブ４Ａとプローブ４ＢからなるKIF5B/RET, DY転座二重カラーFISHプローブセット（KIF5B/RET, DY Translocation Dual Color FISH Probe）
プローブ４Ａ：GSP1506F09、GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをTexRed標識したもの（６種類のDNA断片の混合物）
プローブ４Ｂ：GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09、GSP3119B09、GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12及びGSP1094C12の各インサートをFITC標識したもの（９種類のDNA断片の混合物）
(4th probe set)
KIF5B / RET, DY translocation dual color FISH probe consisting of probe 4A and probe 4B (KIF5B / RET, DY Translocation Dual Color FISH Probe)
Probe 4A: GSP1506F09, GSP1877H08, GSP1018G02, GSP1070C12, GSP0369G08 and GSP0075D03 inserts labeled with TexRed (mixture of 6 DNA fragments)
Probe 4B: FISP-labeled inserts of GSP1544E09, GSP1541C10, GSP1023E07, GSP1581D09, GSP3119B09, GSP1528C10, GSP3158B05, GSP1107C12 and GSP1094C12 (mixture of 9 types of DNA fragments)
（３−２）FISH用薄切スライド標本の作製
FISH用のスライドは、標準の細胞遺伝学的な手法を用いて調製した。パラフィン包埋した標本は、ミクロトームで5μmに薄切し、アミノシランコーティングスライドガラスに貼り付け40±3℃の恒温槽内で一昼夜十分に乾燥させた。
(3-2) Preparation of sliced slide specimens for FISH
FISH slides were prepared using standard cytogenetic techniques. The paraffin-embedded specimen was sliced to 5 μm with a microtome, attached to an aminosilane-coated slide glass, and thoroughly dried overnight in a constant temperature bath at 40 ± 3 ° C.
（３−３）脱パラフィン操作
染色操作の直前に脱パラフィンを行う。検体を60℃のオーブンの中に30分間置き、続いて、スライドを下記の順に各液に浸す。
キシレン（100vol%）5分→キシレン（100vol%）5分→キシレン（100vol%）5分→エタノール（100vol%）3分→エタノール（100vol%）3分→エタノール（95vol%）3分→エタノール（80vol%）3分→エタノール（70vol%）3分→エタノール（50vol%）3分→精製水3分→精製水3分
(3-3) Deparaffinization operation Deparaffinization is performed immediately before the staining operation. The specimen is placed in an oven at 60 ° C. for 30 minutes, and then the slide is immersed in each solution in the following order.
Xylene (100vol%) 5 minutes → Xylene (100vol%) 5 minutes → Xylene (100vol%) 5 minutes → Ethanol (100vol%) 3 minutes → Ethanol (100vol%) 3 minutes → Ethanol (95vol%) 3 minutes → Ethanol ( 80 vol%) 3 minutes → ethanol (70 vol%) 3 minutes → ethanol (50 vol%) 3 minutes → purified water 3 minutes → purified water 3 minutes
（３−４）FISH検出用キット試薬(K5599)の調製
（ａ）濃縮前処理試薬(K5599, Vial 1)の調製法
濃縮前処理試薬を精製水で20倍希釈し、前処理試薬とする。調製後の前処理試薬は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、前処理液が混濁した場合は使用せず廃棄する。
（ｂ）濃縮SSC緩衝液(K5599、Vial4)の調製法
濃縮SSC緩衝液を精製水で20倍希釈し、SSC緩衝液とする。調製後のSSC緩衝液は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、洗浄液が混濁した場合は使用せず廃棄する。
（ｃ）濃縮洗浄液(K5599、Vial 3)の調製法
濃縮洗浄液を精製水で20倍希釈し、洗浄液とする。調製後の洗浄液は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、洗浄液が混濁した場合は使用せず廃棄する。尚、その他の試薬はそのまま用いる。
(3-4) Preparation of FISH Detection Kit Reagent (K5599) (a) Preparation Method of Concentration Pretreatment Reagent (K5599, Vial 1) Dilute the concentration pretreatment reagent 20 times with purified water to prepare a pretreatment reagent. The pretreatment reagent after preparation is stable for 1 month when stored at 2-8 ° C. If the pretreatment liquid becomes turbid during storage, discard it without using it.
(B) Preparation method of concentrated SSC buffer solution (K5599, Vial4) The concentrated SSC buffer solution is diluted 20 times with purified water to obtain an SSC buffer solution. The prepared SSC buffer is stable for 1 month when stored at 2-8 ° C. If the cleaning solution becomes turbid during storage, discard it without using it.
(C) Preparation of concentrated washing liquid (K5599, Vial 3) The concentrated washing liquid is diluted 20 times with purified water to obtain a washing liquid. The cleaning solution after preparation is stable for 1 month when stored at 2-8 ° C. If the cleaning solution becomes turbid during storage, discard it without using it. Other reagents are used as they are.
（３−５）FISH検出法
（ａ）前処理
前処理試薬を染色ドーゼに入れ、あらかじめ温浴槽で前処理試薬が95〜99℃に達するまで温める。温まった前処理試薬に検体組織スライドを浸漬し、温浴槽で前処理試薬の温度を95〜99℃に保ちながら10分間反応させる。染色ドーゼを温浴槽から取り出し、検体組織スライドを浸漬したまま常温で15分間放置する。検体組織スライドを前処理試薬から取り出し、精製水に浸漬し、軽くすすぐ。更に精製水を新しいものに交換し、同様の操作を2回行う。検体組織スライドを洗浄液中に5分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、5分間浸漬する。
(3-5) FISH detection method (a) Pretreatment A pretreatment reagent is put into a staining doze and warmed in advance in a warm bath until the pretreatment reagent reaches 95-99 ° C. The specimen tissue slide is immersed in the warmed pretreatment reagent, and is allowed to react for 10 minutes while maintaining the temperature of the pretreatment reagent at 95 to 99 ° C. in a hot tub. Remove the stained doze from the hot tub and leave it for 15 minutes at room temperature with the specimen tissue slide immersed. Remove the specimen tissue slide from the pretreatment reagent, immerse it in purified water and lightly rinse. Furthermore, the purified water is replaced with a new one, and the same operation is performed twice. Immerse the specimen tissue slide in the washing solution for 5 minutes. Replace the cleaning solution with a new one and immerse for 5 minutes.
（ｂ）タンパク分解酵素処理
検体組織スライドの過剰水分を注意深く拭き取る。タンパク分解酵素試薬5〜8滴（250μL）で検体組織を覆い、室温で5〜15分反応させる。噴射ビンに入れた洗浄液で静かにすすぎ、洗浄液中に3分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、3分間浸漬する。検体組織スライドを下記のエタノール上昇系列の順に各液に浸漬したのち、検体組織を乾燥させる。
エタノール（70％）2分→エタノール（85％）2分→エタノール（100％）2分
(B) Proteolytic enzyme treatment Excess moisture on the specimen tissue slide is carefully wiped off. Cover the specimen tissue with 5-8 drops (250 μL) of proteolytic enzyme reagent and react at room temperature for 5-15 minutes. Rinse gently with the cleaning solution in the spray bottle and immerse in the cleaning solution for 3 minutes. Replace the cleaning solution with a new one and soak for 3 minutes. After immersing the specimen tissue slide in each solution in the following ethanol ascending series, the specimen tissue is dried.
Ethanol (70%) 2 minutes → Ethanol (85%) 2 minutes → Ethanol (100%) 2 minutes
（ｃ）プローブ試薬の熱変性及びハイブリダイゼーション
検体組織にプローブ試薬(10μL)を滴下し、更にカバーグラスで検体組織を覆い、カバーグラスの周りをカバーグラスシーラーで封入する。検体組織スライドをHybridizer (S2450)に設置して、82℃の5分間のプローブ及び標的DNAを変性させる。変性の後、引き続いて37℃で16時間〜72時間反応させる。尚、過剰なFISHプローブを洗浄後（以下を参照）、検体は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）で対比染色した。
(C) Thermal denaturation and hybridization of probe reagent A probe reagent (10 μL) is dropped onto a sample tissue, and the sample tissue is covered with a cover glass, and the cover glass is sealed with a cover glass sealer. Place the specimen tissue slide on the Hybridizer (S2450) to denature the probe and target DNA for 5 minutes at 82 ° C. After denaturation, the reaction is continued at 37 ° C. for 16 to 72 hours. After washing the excess FISH probe (see below), the specimen was counterstained with 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
（ｄ）プローブ試薬の洗浄
SSC緩衝液を染色ドーゼに入れ、あらかじめ温浴槽でSSC緩衝液が65℃に達するまで温める。検体組織スライドをオーブンから取り出し、カバーグラスシーラーをゆっくりとはがす。溝つき染色ドーゼに常温のSSC緩衝液を入れ、カバーグラスをつけたままの検体組織スライドを浸漬し、ピンセットでゆっくりとカバーグラスをはずす。65℃に加温したSSC緩衝液を入れた染色ドーゼに検体組織スライドを移し替え、温浴槽でSSC緩衝液の温度を65℃に保ちながら10分間浸漬する。検体組織スライドを染色ドーゼから取り出し、洗浄液に3分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、3分間浸漬する。検体組織スライドを下記のエタノール上昇系列の順に各液に浸漬したのち、検体組織を乾燥さる。
エタノール（70％）2分→エタノール（85％）2分→エタノール（100％）2分
(D) Cleaning the probe reagent
Put the SSC buffer in the staining doze and warm in advance in a warm bath until the SSC buffer reaches 65 ° C. Remove the specimen tissue slide from the oven and slowly remove the cover glass sealer. Place SSC buffer at room temperature in a grooved staining doze, immerse the specimen tissue slide with the cover glass on, and slowly remove the cover glass with tweezers. Transfer the specimen tissue slide to a staining doze containing SSC buffer heated to 65 ° C, and immerse for 10 minutes while maintaining the temperature of the SSC buffer at 65 ° C in a warm bath. Remove the specimen tissue slide from the staining doze and immerse in the washing solution for 3 minutes. Replace the cleaning solution with a new one and soak for 3 minutes. After immersing the specimen tissue slide in each solution in the following ethanol ascending series, the specimen tissue is dried.
Ethanol (70%) 2 minutes → Ethanol (85%) 2 minutes → Ethanol (100%) 2 minutes
（ｅ）封入
検体組織スライドに封入剤(DAPI含有封入剤、Vial 5 10〜15μL)を滴下し、カバーグラスをかけて封入する。
（４）免疫組織染色
抗体製造元のガイドラインに従って行った。抗体の結合は、Linkerを用いた増強システムを用いて検出した(ダコ・ジャパン株式会社)。抗RET抗体としてRETのC末端を認識するもの（Vector Laboratories 社製のclone 3F8抗体ならびにEpitomics社anti-RET rabbit monoclonal antibody, 3454-1）を使用した。Dako社のDouble staining chromogenic in situ hybridization kit(Dako DuoCISH SK108)を用いてアルカリフォスファターゼ標識した抗Tex RED抗体（赤で発色）及びペルオキシダーゼ標識した抗FITC抗体（青で発色）にて蛍光ラベルを可視化し、光学顕微鏡での観察が可能とし、免疫組織染色との比較を行った。
(E) Encapsulation An encapsulant (DAPI-containing encapsulant, Vial 5 10 to 15 μL) is dropped onto a specimen tissue slide, and covered with a cover glass.
(4) Immunohistochemical staining It was performed according to the guidelines of the antibody manufacturer. Antibody binding was detected using an enhancement system using Linker (Dako Japan, Inc.). Anti-RET antibodies that recognize the C-terminus of RET (clone 3F8 antibody manufactured by Vector Laboratories and anti-RET rabbit monoclonal antibody 3454-1 manufactured by Epitomics) were used. Fluorescent labels were visualized with alkaline phosphatase-labeled anti-Tex RED antibody (colored in red) and peroxidase-labeled anti-FITC antibody (colored in blue) using Dako's Double staining chromogenic in situ hybridization kit (Dako DuoCISH SK108) Observation with an optical microscope was possible, and comparison with immunohistochemical staining was performed.
２．結果
RT-PCR法及び長距離ゲノムPCR法は、細胞株又は新鮮腫瘍標本からKIF5B-RET融合遺伝子の検出に適用可能な方法である。しかしながら、大多数の臨床的NSCLC腫瘍試料はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本であり、いずれの方法もFFPEからKIF5B-RET転座を検出するのは事実上、極めて困難である。本発明者は、上記の通り、KIF5B-RET転座を検出するためのプローブセットを新たに設計するとともに、それを用いたFISH法を開発した。プローブセットの性能を評価するために、臨床検体（KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体と、KIF5B-RET融合遺伝子を認めないNSCLC標本）を用いて検討した。この検討では第１プローブセットを用いた。第１プローブセットは、RET遺伝子の5'側の領域にハイブリダイズするTexRed標識プローブ（プローブ１Ａ）とRET遺伝子及びその3'側の領域にハイブリダイズするFITC標識プローブ（プローブ１Ｂ）からなる。KIF5B-RET転座が存在すれば、二つのプローブは離れた位置で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが離れた位置に観察される。KIF5B-RET転座が存在しなければ、二つのプローブがごく近接した状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが併合し、黄色のドットが観察される。KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体についてのFISH（第１プローブセットａを使用）の結果（蛍光検出像）を図７に示す。鮮明な赤色のドットと緑色のドットが離れた状態で検出されている（丸囲い）。別の第１プローブセット（第１プローブセットｂ）を用いると、より鮮明なスプリットシグナルを認めた（図１３）。
2. result
RT-PCR and long-range genomic PCR are methods applicable to the detection of KIF5B-RET fusion genes from cell lines or fresh tumor specimens. However, the majority of clinical NSCLC tumor samples are formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) specimens, and it is virtually difficult to detect a KIF5B-RET translocation from FFPE with either method. As described above, the inventor newly designed a probe set for detecting the KIF5B-RET translocation and developed a FISH method using the probe set. In order to evaluate the performance of the probe set, examination was performed using clinical specimens (specimens that recognized the KIF5B-RET fusion gene and NSCLC specimens that did not recognize the KIF5B-RET fusion gene). In this examination, the first probe set was used. The first probe set consists of a TexRed labeled probe (probe 1A) that hybridizes to the 5 ′ region of the RET gene, and a FITC labeled probe (probe 1B) that hybridizes to the RET gene and its 3 ′ region. If the KIF5B-RET translocation is present, the two probes hybridize to the chromosome at distant positions, and as a result, the red and green dots are observed at distant positions. If the KIF5B-RET translocation does not exist, the two probes hybridize to the chromosome in close proximity, resulting in the combination of red and green dots and the observation of yellow dots. FIG. 7 shows the result (fluorescence detection image) of FISH (using the first probe set a) for the specimen in which the KIF5B-RET fusion gene is observed. A clear red dot and a green dot are detected (circled). When another first probe set (first probe set b) was used, a clearer split signal was observed (FIG. 13).
一方、第３プローブセットを用いて同様の検討を行った。第３プローブセットは、KIF5B遺伝子の5'側の領域にハイブリダイズするTexRed標識プローブ（プローブ２Ａ）とRET遺伝子及びその3'側領域にハイブリダイズするFITC標識プローブ（プローブ１Ｂ）からなる。KIF5B-RET転座が存在すれば、二つのプローブはごく近接した状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが併合し、黄色のドットが観察される。KIF5B-RET転座が存在しなければ、二つのプローブが離れた状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが離れた位置に観察される。KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体についてのFISHの結果（蛍光検出像）を図８に示す。赤色のドットと緑色のドットが併合した黄色のドットが認められる（丸囲い）。以上の通り、KIF5B-RET転座の検出に各プローブセットが有効であることが示された。 On the other hand, the same examination was performed using the third probe set. The third probe set consists of a TexRed labeled probe (probe 2A) that hybridizes to the 5 ′ region of the KIF5B gene, a RET gene and a FITC labeled probe (probe 1B) that hybridizes to the 3 ′ region thereof. If the KIF5B-RET translocation is present, the two probes will hybridize to the chromosome in close proximity, resulting in the combination of red and green dots and the observation of yellow dots. If the KIF5B-RET translocation does not exist, the two probes are separated and hybridize to the chromosome, and as a result, red dots and green dots are observed at separate positions. FIG. 8 shows the FISH result (fluorescence detection image) for a sample in which the KIF5B-RET fusion gene is observed. A yellow dot in which a red dot and a green dot are merged is recognized (circled). As described above, it was shown that each probe set was effective in detecting the KIF5B-RET translocation.
最近、１０番染色体にともに存在するKIF5B-RET融合遺伝子が複数の韓国人の非小細胞肺癌（NSCLC）において検出された（非特許文献６）。この報告では３種類の異なる変異体が同定されている。本発明者らの研究グループは、日本人検体（腺癌１７６例、扁平上皮癌１０１例）の患者由来の非小細胞肺癌（２７７例）における、KIF5B-RET融合遺伝子の頻度をRE-PCRで検討した。その結果、先の報告と同一の２種類の変異体が３人について検出された。図９に示したのはバリアント１タイプの転座であり、KIF5B遺伝子のエクソン１５以前とRET遺伝子のエクソン１２以降が融合して転座している。新規バリアントはKIF5Bのエクソン２２とRET遺伝子のエクソン１２が融合していた（図１０）。KIF5B-RET融合遺伝子を認める全ての腫瘍は腺癌であり、また、たばこ非喫煙者である非小細胞肺癌患者であり、喫煙者と比較して頻繁に発生した。コントロールとして乳癌（６０例）、大腸癌（１０例）、甲状腺乳頭腺癌（１例）でも検討を行ったが、変異体は認めなかった。変異体を認めた３人の正常肺組織からは変異体は検出されなかった。EGFR、Kras、Braf、ErbB2、EML4-ALK転座など、既知の肺癌発生関連遺伝子異常をもつ腺癌（１４８例）中にはKIF5B-RET転座は認めなかった。扁平上皮癌からも転座は認めなかった。これらの結果は、KIF5B-RET融合遺伝子が癌発生関連遺伝子であることを示唆する。また、mRNAレベルでRET遺伝子発現を検討した結果（１５７例の腺癌症例）、RETの発現は、KIF5B-RET転座例で(腫瘍／正常比)161.760±123.488、KIF5B-RET転座陰性例では5.901±17.148(n=154)であり、で有意に高値であった（p=0.0044）。このことからも、KIF5B-RET転座を起こしているとRETが活性化されているため、RET阻害剤が効果的な治療であるといえる。尚、シークエンスの結果から変異が確認された症例に免疫組織化学的検討を行ったところ、Epitomics社の抗体を用いて染色陽性が確認された（図１４）。染まり方をG1(顆粒状)、G2(び慢性)に分類し、G2且つ染色範囲が50％以上であればRETの転座がある可能性が高いとした（相関が有ると思われる）。Vector Laboratories社製の抗体では転座例との有意な相関を認めなかった。
Recently, a KIF5B-RET fusion gene that coexists on chromosome 10 has been detected in multiple Korean non-small cell lung cancers (NSCLC) (Non-patent Document 6). In this report, three different mutants have been identified. Our research group uses RE-PCR to determine the frequency of KIF5B-RET fusion genes in non-small cell lung cancer (277 cases) derived from patients of Japanese specimens (176 adenocarcinomas and 101 squamous cell carcinomas). investigated. As a result, the same two types of mutants as in the previous report were detected in 3 persons. FIG. 9 shows a
本発明の検出方法によれば、KIF5B-RET転座の有無を判定可能である。KIF5B-RET転座の存在を確認することは肺癌（特に非小細胞肺癌）の治療方針を決定する上で重要且つ有益である。本発明には、テーラーメイド医療の実現への貢献が期待される。 According to the detection method of the present invention, the presence or absence of the KIF5B-RET translocation can be determined. Confirming the presence of the KIF5B-RET translocation is important and beneficial in determining the therapeutic strategy for lung cancer (particularly non-small cell lung cancer). The present invention is expected to contribute to the realization of tailor-made medicine.
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims. The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.
配列番号１、２：人工配列の説明：プライマー SEQ ID NOs: 1 and 2: Description of artificial sequence: Primer
Claims (24)
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。 A fluorescence in situ hybridization (FISH) assay is performed using one or more probe sets selected from the group consisting of the following (1) to (4): How to detect the locus:
(1) A first probe set targeting a chromosome site (first chromosome site) containing a RET gene,
A probe 1A labeled with a first fluorescent substance and a probe 1B labeled with a second fluorescent substance,
The probe 1A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the first chromosome site,
The probe 1B is a 3′-side region in the first stained other site, and is complementary to a second region that exists at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the RET gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a first probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(2) A second probe set targeting a chromosomal site (second chromosomal site) containing the KIF5B gene,
A probe 2A labeled with a first fluorescent substance and a probe 2B labeled with a second fluorescent substance,
Probe 2A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the second chromosome site,
The probe 2B is a 3′-side region in the second chromosomal site, and is complementary to a second region existing at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the KIF5B gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a second probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(3) a third probe set comprising the probe 2A and the probe 1B;
(4) Complementary to the chromosomal site containing the RET gene (3rd chromosomal site) and complementary to the probe 4A labeled with the first fluorescent substance and the chromosomal site containing the KIF5B gene (4th chromosomal site) A fourth probe set comprising a probe 4B labeled with a second fluorescent substance.
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセットを接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。 The method according to any one of claims 1 to 4, comprising the following steps (i) to (iv):
(i) bringing the probe set of any one of (1) to (4) into contact with a chromosome sample;
(ii) washing the chromosomal sample to remove probes that are not specifically hybridized to the target;
(iii) detecting a fluorescent signal;
(iv) A step of determining the presence or absence of translocation between the KIF5B gene and the RET gene based on the pattern of the fluorescent signal.
前記ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する、請求項５に記載の方法。 Select two or more probe sets from (1) to (4) above, and individually perform the steps (i) to (iii) using each selected probe set,
6. The method according to claim 5, wherein in step (iv), the presence or absence of a translocation between the KIF5B gene and the RET gene is determined by combining the fluorescence signal patterns obtained for each probe set.
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。 A kit for detecting a translocation between the KIF5B gene and the RET gene, comprising one or more probe sets selected from the group consisting of the following (1) to (4):
(1) A first probe set targeting a chromosome site (first chromosome site) containing a RET gene,
A probe 1A labeled with a first fluorescent substance and a probe 1B labeled with a second fluorescent substance,
The probe 1A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the first chromosome site,
The probe 1B is a 3′-side region in the first stained other site, and is complementary to a second region that exists at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the RET gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a first probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(2) A second probe set targeting a chromosomal site (second chromosomal site) containing the KIF5B gene,
A probe 2A labeled with a first fluorescent substance and a probe 2B labeled with a second fluorescent substance,
Probe 2A is complementary to the first region which is the 5 ′ side region in the second chromosome site,
The probe 2B is a 3′-side region in the second chromosomal site, and is complementary to a second region existing at a distance from the first region,
When the KIF5B-RET fusion gene is generated by translocation between the KIF5B gene and the RET gene, the breakpoint in the KIF5B gene is the 3 ′ end of the first region, between the first region and the second region, Or a second probe set located at the 5 ′ end of the second region;
(3) a third probe set comprising the probe 2A and the probe 1B;
(4) Complementary to the chromosomal site containing the RET gene (3rd chromosomal site) and complementary to the probe 4A labeled with the first fluorescent substance and the chromosomal site containing the KIF5B gene (4th chromosomal site) A fourth probe set comprising a probe 4B labeled with a second fluorescent substance.
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