JP2009131162A

JP2009131162A - Gene domain for reinforcing expression of annexin 4 in ovarian clear cell adenocarcinoma

Info

Publication number: JP2009131162A
Application number: JP2007308256A
Authority: JP
Inventors: Kensho Arakawa; 憲昭荒川; Yusuke Masuishi; 有佑増石; Hisashi Hirano; 久平野; Hiroshi Kawasaki; 博史川崎; Fumiki Hirahara; 史樹平原; Etsuko Miyagi; 悦子宮城
Original assignee: Yokohama National University NUC; Yokohama City University
Current assignee: Yokohama National University NUC; Yokohama City University
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2009-06-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a DNA usable for elucidating the expression-regulating mechanism of annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma and developing new antineoplastic medicines. <P>SOLUTION: Provided are the following DNA (a) or (b), wherein, the DNA (a) is a DNA comprising the same sequence as a nucleotide sequence comprising all or a part of a domain from the upstream -1534 to the downstream +1010, when the transcription-starting point of the annexin 4 gene is +1, and the DNA (b) is a DNA hybridized with a DNA complementary with the DNA (a) under stringent conditions and having biological functions equivalent to those of the DNA (a); a recombinant vector; a transformant; and a method for searching a substance controlling the transcription activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinom cells. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、卵巣明細胞腺癌に特異的に発現しているタンパク質であるアネキシン４の発現に重要な遺伝子領域とその応用に関する。 The present invention relates to a gene region important for the expression of annexin 4, which is a protein specifically expressed in ovarian clear cell adenocarcinoma, and its application.

最近、我が国では、上皮性卵巣癌の中でも悪性度の高い明細胞癌の罹患率が上昇しつつある。
卵巣明細胞腺癌はそれ自体が予後不良因子とされ、初期段階であっても転移再発例が存在する。上皮性卵巣癌に対する標準的化学療法はタキサン製剤とプラチナ製剤であり、その代表的なものはパクリタキセルとカルボプラチンの併用療法である。 Recently, in Japan, the prevalence of clear cell carcinoma with high malignancy among epithelial ovarian cancers is increasing.
Ovarian clear cell adenocarcinoma itself is considered a poor prognostic factor, and there are cases of recurrence of metastasis even at an early stage. Standard chemotherapy for epithelial ovarian cancer is a taxane and platinum formulation, typically paclitaxel and carboplatin.

上皮性卵巣癌は漿液性、粘液性、類内膜、明細胞腺癌などと組織型に富む癌である。中でも、明細胞腺癌は薬剤耐性が著しく高く、発見されるのが臨床病期初期であっても予後不良例が存在する。明細胞腺癌は現在、化学療法で主に使用されているプラチナ製剤やタキサン製剤に抵抗性であり、新しい抗悪性腫瘍薬の開発が求められている。
アネキシン４(ANX4)は、アネキシンファミリータンパク質の１つのホモログであり、腎癌明細胞癌で発現が上昇すること（非特許文献１）、過剰発現するとパクリタキセル抵抗性が上昇すること（非特許文献２）が知られている。 Epithelial ovarian cancer is a cancer rich in tissue types such as serous, mucous, endometrioid, clear cell adenocarcinoma and the like. Among them, clear cell adenocarcinoma has extremely high drug resistance, and there are cases with poor prognosis even if it is discovered in the early clinical stage. Clear cell adenocarcinoma is currently resistant to platinum and taxane preparations mainly used in chemotherapy, and there is a need for the development of new anti-neoplastic agents.
Annexin 4 (ANX4) is one homologue of annexin family protein, and its expression is increased in clear cell carcinoma of the kidney (Non-patent Document 1), and when it is overexpressed, paclitaxel resistance is increased (Non-Patent Document 2). )It has been known.

Cancer Letters 209(2004) 111-118Cancer Letters 209 (2004) 111-118 British Journal of Cancer (2000)83(1), 83-88British Journal of Cancer (2000) 83 (1), 83-88

本発明は、明細胞腺癌におけるアネキシン４遺伝子の発現調節機構を解明し、新しい抗悪性腫瘍薬の開発に役立てることを目的とする。 The object of the present invention is to elucidate the annexin 4 gene expression regulation mechanism in clear cell adenocarcinoma and to develop a new antineoplastic drug.

本発明者らは、まず、卵巣明細胞癌細胞が特異的に産生するタンパク質をプロテオミクス手法を用いて探索し、アネキシン４の発現量が明細胞癌細胞中にて著しく増加していることを見出した。アネキシン４は腎癌明細胞癌で発現が上昇すること、過剰発現するとパクリタキセル抵抗性が上昇することが知られているので、アネキシン４は卵巣明細胞癌の抗癌剤抵抗性においても重要な役割を果たしている可能性が考えられた。そこで、本発明者らは、明細胞腺癌におけるアネキシン４の発現を増強する遺伝子領域をアネキシン４遺伝子の5’-非翻訳領域中に見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の要旨は以下の通りである。 The present inventors first searched for a protein specifically produced by ovarian clear cell carcinoma cells using a proteomic technique, and found that the expression level of annexin 4 is remarkably increased in clear cell carcinoma cells. It was. Annexin 4 plays an important role in anti-cancer drug resistance of ovarian clear cell carcinoma because it is known that expression increases in clear cell carcinoma of the kidney and overexpression increases paclitaxel resistance. The possibility was considered. Therefore, the present inventors have found a gene region that enhances the expression of annexin 4 in clear cell adenocarcinoma in the 5′-untranslated region of the annexin 4 gene, and have completed the present invention.
The gist of the present invention is as follows.

（１）以下の(a)又は(b)のＤＮＡ。
(a)アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域の全部又は一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡ
(b)(a)のＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能を有するＤＮＡ
（２）アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域のヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列である（１）記載のＤＮＡ。 (1) The following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the same sequence as the nucleotide sequence of all or part of the region from upstream-1534 to downstream +1010 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1
(b) a DNA that hybridizes with a DNA complementary to the DNA of (a) under stringent conditions and has a biological function equivalent to that of the DNA of (a)
(2) The DNA according to (1), wherein the nucleotide sequence in the region from upstream -1534 to downstream +1010 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1.

（３）(a)のＤＮＡが、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡである（１）又は（２）記載のＤＮＡ。
（４）(a)のＤＮＡが、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その下流＋１７１から＋１９０までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡである（１）又は（２）記載のＤＮＡ。
（５）(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能が、明細胞腺癌細胞においてアネキシン４遺伝子の転写を活性化することである（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ。 (3) The DNA of (a) is a DNA comprising the same sequence as the entire nucleotide sequence in the region from upstream -43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1 (1 Or the DNA according to (2).
(4) When the transcription start point of the annexin 4 gene is +1, the DNA of (a) is a DNA having the same sequence as the entire nucleotide sequence in the downstream region from +171 to +190 (1) or (2) DNA as described.
(5) The DNA according to any one of (1) to (4), wherein the biological function equivalent to the DNA of (a) is to activate transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells.

（６）明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる部位を含む（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（７）明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子がＮＦ−κＢである（６）記載のＤＮＡ。
（８）明細胞腺癌が卵巣明細胞腺癌である（５）〜（７）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。 (6) The DNA according to any one of (1) to (5), which comprises a site to which a factor that activates transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can bind.
(7) The DNA according to (6), wherein the factor that activates transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells is NF-κB.
(8) The DNA according to any one of (5) to (7), wherein the clear cell adenocarcinoma is ovarian clear cell adenocarcinoma.
(9) A recombinant vector containing the DNA according to any one of (1) to (8).

（１０）さらにレポーター遺伝子を含有する（９）記載の組換えベクター。
（１１）レポーターがルシフェラーゼである（１０）記載の組換えベクター。
（１２）（９）〜（１１）のいずれかに記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１３）（１０）又は（１１）記載の組換えベクターを導入した宿主細胞である（１２）記載の形質転換体。
（１４）（１３）記載の形質転換体を用いて、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質を探索する方法。 (10) The recombinant vector according to (9), further comprising a reporter gene.
(11) The recombinant vector according to (10), wherein the reporter is luciferase.
(12) A transformant comprising the recombinant vector according to any one of (9) to (11).
(13) The transformant according to (12), which is a host cell into which the recombinant vector according to (10) or (11) is introduced.
(14) A method for searching for a substance capable of controlling annexin 4 gene transcriptional activity in clear cell adenocarcinoma cells using the transformant according to (13).

（１５）明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質が、明細胞腺癌に対する予防及び／又は治療効果を奏するものである（１４）記載の方法。
（１６）明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質が、細胞の抗癌剤感受性を上げることができるものである（１４）記載の方法。
（１７）（１）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列の全部又は一部及びその相補鎖からなる二本鎖核酸であって、アネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる前記二本鎖核酸。 (15) The method according to (14), wherein the substance capable of controlling the transcription activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells has a preventive and / or therapeutic effect on clear cell adenocarcinoma.
(16) The method according to (14), wherein the substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can increase the sensitivity of the cell to an anticancer agent.
(17) A double-stranded nucleic acid comprising the whole or a part of the nucleotide sequence of the DNA according to (1) and a complementary strand thereof, which can bind to a factor that activates transcription of the annexin 4 gene.

（１８）（１）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列の一部が配列番号３のヌクレオチド配列である（１７）記載の二本鎖核酸。
（１９）（１７）記載の二本鎖核酸を含有する組成物。
（２０）試薬として使用される（１９）記載の組成物。
（２１）医薬として使用される（１９）記載の組成物。
（２２）アネキシン４が関与する疾患を予防及び／又は治療するための医薬として使用される（２１）記載の組成物。 (18) The double-stranded nucleic acid according to (17), wherein a part of the nucleotide sequence of the DNA according to (1) is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
(19) A composition containing the double-stranded nucleic acid according to (17).
(20) The composition according to (19), which is used as a reagent.
(21) The composition according to (19), which is used as a medicine.
(22) The composition according to (21), which is used as a medicament for preventing and / or treating a disease involving annexin 4.

（２３）アネキシン４が関与する疾患が明細胞腺癌である（２２）記載の組成物。
（２４）明細胞腺癌が卵巣明細胞腺癌である（２３）記載の組成物。
（２５）細胞の抗癌剤感受性を上げることができる薬剤として使用される（１９）記載の組成物。 (23) The composition according to (22), wherein the disease associated with annexin 4 is clear cell adenocarcinoma.
(24) The composition according to (23), wherein the clear cell adenocarcinoma is ovarian clear cell adenocarcinoma.
(25) The composition according to (19), which is used as a drug capable of increasing the sensitivity of a cell to an anticancer drug.

本発明により、明細胞癌におけるアネキシン４遺伝子の発現に重要なプロモーターおよびエンハンサーが転写開始点(+1)の上流-1534から下流+1010の領域に含まれていることが明らかとなった。この領域を利用して、アネキシン４が関与する疾患（例えば、卵巣や腎臓における明細胞腺癌）の予防及び／又は治療薬や細胞の抗癌剤感受性を上げる薬剤の探索を行うことができる。 According to the present invention, it has been clarified that a promoter and an enhancer important for the expression of the annexin 4 gene in clear cell carcinoma are contained in a region from upstream -1534 to downstream +1010 of the transcription start point (+1). Using this region, it is possible to search for preventive and / or therapeutic agents for diseases involving annexin 4 (for example, clear cell adenocarcinoma in the ovary and kidney) and drugs that increase the sensitivity of cells to anticancer agents.

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明は、以下の(a)又は(b)のＤＮＡを提供する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
The present invention provides the following DNA (a) or (b):

(a)アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域の全部又は一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡ
(b)(a)のＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能を有するＤＮＡ
(a)のＤＮＡについて、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域のヌクレオチド配列の一例を以下に示す。この配列は、卵巣明細胞腺癌細胞株OVISE及びOVTOKOに由来する。 (a) DNA comprising the same sequence as the nucleotide sequence of all or part of the region from upstream 1534 to downstream +1010 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1
(b) a DNA that hybridizes with a DNA complementary to the DNA of (a) under stringent conditions and has a biological function equivalent to that of the DNA of (a)
An example of the nucleotide sequence of the region from upstream 1534 to downstream +1010 of the DNA of (a), where the transcription start point of the annexin 4 gene is +1, is shown below. This sequence is derived from the ovarian clear cell adenocarcinoma cell lines OVISE and OVTOKO.

5’-cgtggctatgcacccggctaattatttatttattttttgttttcttttctttttttctttctttttcttttctttcttcctctttttttttttttttttttttagacaatgtctcactctgtcgcccaggctggcgtgcagtggcgcaatctcagcttactgagcctctgcctcccgggcttgggtgtttatcccacctcatccgactgaatagctgggactacaggcgcatgccaccacacccggctatatatatgttttttttttttttttttttgagatgggatttcaccacattggccaggcttatctcgaactcctgggctaaagtgatccacttgccctggcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccactgtgcccagccttaattttttaagttatcatatgcagataaaagaggcagaaccagttttagtatccaaatcagtctgatcctaaaacccgtgctctaaaccatattaaaccaccttttaaaattacatcttaatgaaataatttaatgttacctctccagctttaagggtgccattaaccacttagattttgatgtgtcggatggaaaacactccccaaacgggctattctctgttttttaaaaaaactgaatttgcctatagactcaacggattcattctgcaagcattcactacgtggcgaaatcggtgctgggcatgggtgcaaagacgacctagccctagttggtgtcttcaagaggctgcgtccagcaggggaagcagatatgaaaacacagaactattacaagggatgagcgccgcgccaagccgaacctgggagctacggacagtgtctaaactttagtcactcacaggagtacaaagatccggggctgctcctaactcctactccaaagctttcctggcctgctgggcgcacagggaagagggaagtgctggaaacttttgggaatgtgtgttttcatgtgaaagaggggaatgaaatgtatccttcagatttcactttctacttttccggccacgggctcggcacgacctgccgttgggagacgaacggtttcccgaggtggggggaagcgcggatttgccgcgggactccggcttggcgcggagctgggcgcggcaggcgcagggaggaactggcgaggtggcccgggctcggccctccgagggtgtggagcgcccgggaaacgggaccccaagaatccaactgctcccaccctgcgcggccaggagcggggctggcgatactggggacactgtccaatccgggcagggggcgaggccgggggaccgggcgggcctggggagcaggcacgtgtggagggcggacccgccgggggtcgaggcctgcctctccgagagctcctggcgcggccgtcccggcccggggccccaggtgcgcttcccctagagagggattttccggtctcgtgggcagaggaacaaccaggaacttgggctcagtctccaccccacagtggggcggatccgtcccggataagacccgctgtctggccctgagtagggTGTGACCTCCGCAGCCGCAGAGGAGGAGCGCAGCCCGGCCTCGgtacgaggggtaaaggggctccgggccgggggtcctgggctcagggaacggggagcgtggcccgggagcgtctcgcggggatgcccggctccgcgctgcaccccagagtgggtgctcgccgccggcttgcgggcaagcccgggcggccacagggtggagggggccagcgggccctggactcgctccgggtgggcgagagggaggcgagcgcggtgcttaaccgctggcaccatccaggacatccagggccgcttacacggctcaggacgcgggtcagagaccacggcagttatttattcagtccatgtgctaggctttgcatcaaaaagaaaggaccgagataatcttgcctgtagctaactcctcctaacacctcttacagtttactttttaattctttactccatttaagaaacttactcctttctcctagatccttaccactttcttaccttctcgtgtgtctaatgccctcggcacagtgcccggcacatcggagtctgattattatagggtccatgacttgagttggctggtggcgcagtctcagcattttgtcatgactttgaccagctggagactttggtgccaaggaggaaggcttctcaaccatttaccggcagaagtgacccccggggcaatgcaagtcttctgagctgacagagcagagtgggtcctgcataactcgtgctttacatggaactgggcatctgctctctcctgctgacagtgggaaggatagataaggtgtccctctccaagttatccattctcctgcccaccagtccatgacaccccaccacccccttccactccctactgtttgccctttaattttttgttttgttttgttttgagacgaggtctcactcctgtagcccaggctggagtgcagtggctggatacagttcactctgcctcccaggctcaggtgtttcacccacctcaacctcctgagtagctgaga-3’（配列番号１）
大文字はエキソン１bの領域を示す。その５’末端は、MCAS、OVISE、OVTOKO細胞のアネキシン４遺伝子５’-RACE産物の末端であり、これを転写開始点（+1）とした。下線部は+171〜+190領域を示す。 5'- tgcgggcaagcccgggcggc- 3 '(SEQ ID NO: 1)
Capital letters indicate the region of exon 1b. The 5 ′ end is the end of the 5′-RACE product of the annexin 4 gene of MCAS, OVISE, and OVTOKO cells, and this was used as the transcription start point (+1). The underlined portion indicates the +171 to +190 region.

(b)のＤＮＡについて、(a)のＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5〜1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.) at Unit 2.10を参照されたい。 With respect to the DNA of (b), the DNA that hybridizes with the DNA complementary to the DNA of (a) under stringent conditions comprises all or part of the DNA complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. There should be at least 80% identity (preferably at least 95%, more preferably at least 98%). Hybridization is performed under stringent conditions. The stability of the nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming that the Tm drops by 1 ° C. due to a 1% mismatch, the temperature of the final wash of the hybridization reaction must be lowered. For example, when a sequence having 95% or more identity with a probe is required, the final washing temperature must be lowered by 5 ° C. In fact, for 1% mismatch, the Tm will vary between 0.5 and 1.5 ° C. An example of stringent conditions is to hybridize in 5x SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature. An example of moderately stringent conditions is a wash at 42 ° C. in 3 × SSC. The salt concentration or temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid. For further guidance on such conditions, see Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY; and Ausubel et al. (Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John See Wiley & Sons. NY) at Unit 2.10.

(a)のＤＮＡは、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡであってもよい。
アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域のヌクレオチド配列の一例を以下に示す。 The DNA of (a) may be a DNA having the same sequence as the entire nucleotide sequence in the region from upstream −43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1.
An example of the nucleotide sequence of the region from upstream −43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1 is shown below.

5’-ggatccgtcccggataagacccgctgtctggcccTGAGTAGGGTGTGACCTCCGCAGCCGCAGAGGAGGAGCGCAGCCCGGCCTCGgtacgaggggtaaaggggctccgggccgggggtcctgggctcagggaacggggagcgtggcccgggagcgtctcgcggggatgcccggctccgcgctgcaccccagagtgggtgctcgccgccggcttgcgggcaagcccgggcggccacagggtggagggggccagcgggccctggactcgctccgggtgggcgagagggaggcgagcgcggtgcttaaccgctggcaccatccaggacatccagggccgcttacacggctcaggacgcgggtcagagaccacggcagttatttattcagtccatgtgctaggctttgcatcaaaaagaaaggaccgagataatcttgcctgtagctaactcctcctaacacctcttacagtttactttttaattctttactccatttaagaaacttactcctttctcctagatccttaccactttcttaccttctcgtgtgtctaatgccctcggcacagtgcccggcacatcgga-3’（配列番号２）
大文字はエキソン１bの領域を示す。その５’末端は、MCAS、OVISE、OVTOKO細胞のアネキシン４遺伝子５’-RACE産物の末端であり、これを転写開始点（+1）とした。下線部は+171〜+190領域を示す。 5'-ggatccgtcccggataagacccgctgtctggcccTGAGTAGGGTGTGACCTCCGCAGCCGCAGAGGAGGAGCGCAGCCCGGCCTCGgtacgaggggtaaaggggctccgggccgggggtcctgggctcagggaacggggagcgtggcccgggagcgtctcgcggggatgcccggctccgcgctgcaccccagagtgggtgctcgccgccggct tgcgggcaagcccgggcggc cacagggtggagggggccagcgggccctggactcgctccgggtgggcgagagggaggcgagcgcggtgcttaaccgctggcaccatccaggacatccagggccgcttacacggctcaggacgcgggtcagagaccacggcagttatttattcagtccatgtgctaggctttgcatcaaaaagaaaggaccgagataatcttgcctgtagctaactcctcctaacacctcttacagtttactttttaattctttactccatttaagaaacttactcctttctcctagatccttaccactttcttaccttctcgtgtgtctaatgccctcggcacagtgcccggcacatcgga-3 ' ( SEQ ID NO: 2)
Capital letters indicate the region of exon 1b. The 5 ′ end is the end of the 5′-RACE product of the annexin 4 gene of MCAS, OVISE, and OVTOKO cells, and this was used as the transcription start point (+1). The underlined portion indicates the +171 to +190 region.

(a)のＤＮＡは、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その下流＋１７１から＋１９０までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡであってもよい。
アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その下流＋１７１から＋１９０までの領域のヌクレオチド配列の一例を以下に示す。 The DNA of (a) may be a DNA consisting of the same sequence as the entire nucleotide sequence in the region from downstream +171 to +190 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1.
An example of the nucleotide sequence in the region from +171 to +190 downstream of the annexin 4 gene when the transcription start point is +1 is shown below.

5’-tgcgggcaagcccgggcggc-3’（配列番号３）
配列番号３のヌクレオチド配列は、卵巣明細胞腺癌細胞株OVISE及びOVTOKOのアネキシン４遺伝子の第１イントロン内に存在する転写開始点(+1)の下流+171〜+190の領域の配列である。この配列の相補鎖には、転写因子ＮＦ−κＢのコンセンサス配列gggRNNYYcc（配列番号４）に類似の配列を含んでいる。 5'-tgcgggcaagcccgggcggc-3 '(SEQ ID NO: 3)
The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is the sequence of the region from +171 to +190 downstream of the transcription start point (+1) present in the first intron of the annexin 4 gene of the ovarian clear cell adenocarcinoma cell lines OVISE and OVTOKO . The complementary strand of this sequence contains a sequence similar to the consensus sequence gggRNNYYcc (SEQ ID NO: 4) of the transcription factor NF-κB.

(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能としては、明細胞腺癌細胞においてアネキシン４遺伝子の転写を活性化することを挙げることができる。
本発明のＤＮＡは、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる部位を含むとよい。明細胞腺癌としては、卵巣明細胞腺癌、腎明細胞腺癌などを例示することができるが、卵巣明細胞腺癌が好ましい。明細胞腺癌細胞としては、OVTOKO、OVISE、HAC2、RMG-I、RMG-II、KK、KOC-7c、HCH-１、SMOV-2、OVAS、OVMANA、OVSAYOなどを例示することができるが、OVTOKO、OVISEが好ましい。 Examples of biological functions equivalent to the DNA of (a) include activation of annexin 4 gene transcription in clear cell adenocarcinoma cells.
The DNA of the present invention may contain a site to which a factor that activates transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can bind. Examples of clear cell adenocarcinoma include ovarian clear cell adenocarcinoma and renal clear cell adenocarcinoma, and ovarian clear cell adenocarcinoma is preferred. Examples of clear cell adenocarcinoma cells include OVTOKO, OVISE, HAC2, RMG-I, RMG-II, KK, KOC-7c, HCH-1, SMOV-2, OVAS, OVMANA, OVSAYO, etc. OVTOKO and OVISE are preferable.

明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子は、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化するものであればいかなるものであってもよいが、ＮＦ−κＢファミリータンパク質（具体的には、RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50（p105/ＮＦ−κＢ1）、p52（p100/ＮＦ−κＢ2））を例示することができる。この因子が結合できる否かは、ゲルシフトアッセイ（後述の実施例１を参照）により、調べることができる。 The factor that activates the transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells may be any factor that activates the transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells, but the NF-κB family Examples of the protein include RelA (p65), RelB, c-Rel, p50 (p105 / NF-κB1), and p52 (p100 / NF-κB2). Whether or not this factor can be bound can be examined by gel shift assay (see Example 1 described later).

本発明のＤＮＡを含むレポーターベクターを利用すれば、アネキシン４の転写を制御できる物質を探索することができる。この場合、レポーターベクターに含まれる本発明のＤＮＡは、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域を含むことが好ましい。 By using a reporter vector containing the DNA of the present invention, a substance capable of controlling the transcription of annexin 4 can be searched. In this case, the DNA of the present invention contained in the reporter vector preferably contains a region from upstream −43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1.

また、本発明のＤＮＡをプロモーターとして利用すれば、明細胞腺癌細胞／組織に特異的に目的の遺伝子を発現させることができるベクターを作成することができる。例えば、本発明のＤＮＡ配列をタンパク質遺伝子のコード領域の上流に連結したプラスミドを作成すれば、明細胞腺癌細胞／組織に特異的に目的のタンパク質（例えばp５３などの抗腫瘍タンパク質や緑蛍光タンパク質（GFP）など）を発現させることができる。この場合、レポーターベクターに含まれる本発明のＤＮＡは、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域を含むことが好ましく、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域を含むことがより好ましい。 In addition, when the DNA of the present invention is used as a promoter, a vector capable of specifically expressing a target gene in clear cell adenocarcinoma cells / tissue can be prepared. For example, if a plasmid in which the DNA sequence of the present invention is ligated upstream of the coding region of a protein gene, a target protein (for example, an antitumor protein such as p53 or green fluorescent protein) specifically for clear cell adenocarcinoma cells / tissues is prepared. (GFP) etc.) can be expressed. In this case, the DNA of the present invention contained in the reporter vector preferably includes a region from upstream −43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1, and from upstream −1534 to downstream. More preferably, it includes a region up to +1010.

本発明は、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターも提供する。
本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。 The present invention also provides a recombinant vector containing the DNA of the present invention.
The recombinant vector containing the DNA of the present invention can be obtained by appropriately applying the DNA of the present invention by a known method (for example, the method described in Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be obtained by inserting into an appropriate expression vector.

発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。 As expression vectors, plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. Bacteriophages, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, insect pathogenic viruses such as baculoviruses, and the like can be used.

発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。 A promoter, enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV40 replication origin, and the like may be added to the expression vector.
The expression vector may be a fusion protein expression vector. Various fusion protein expression vectors are commercially available: pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), pET CBD Fusion System 34b-38b (Novagen), pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b (Novagen), pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen).

本発明の組換えベクターは、さらにレポーター遺伝子を含有してもよい。レポーターとしては、発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼなど）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなど）などを例示することができるが、ルシフェラーゼが汎用されていて、便利である。レポーター遺伝子は、公知の塩基配列に基づいて、常法により調製することができる。また、レポーター遺伝子を含むベクター（例えば、プロメガ社のpGL3シリーズ、pGL4シリーズなど）が市販されているので、このようなレポーターベクターに本発明のＤＮＡを組み込んでもよい。 The recombinant vector of the present invention may further contain a reporter gene. Examples of the reporter include luminescent proteins (for example, luciferase) and fluorescent proteins (for example, GFP, YFP, CFP, BFP, Venus, etc.), but luciferase is widely used and convenient. The reporter gene can be prepared by a conventional method based on a known base sequence. In addition, since vectors containing reporter genes (for example, pGL3 series and pGL4 series from Promega) are commercially available, the DNA of the present invention may be incorporated into such reporter vectors.

本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。また、明細胞腺癌細胞（例えば、OVTOKO、OVISE、HAC2、RMG-I、RMG-II、KK、KOC-7c、HCH-１、SMOV-2、OVAS、OVMANA、OVSAYOなど）でもよい。 A transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing the DNA of the present invention into a host.
Hosts include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus, etc.), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, Sf cells, etc.), animal cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells, etc.), plant cells and the like. Also, clear cell adenocarcinoma cells (for example, OVTOKO, OVISE, HAC2, RMG-I, RMG-II, KK, KOC-7c, HCH-1, SMOV-2, OVAS, OVMANA, OVSAYO, etc.) may be used.

組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子を含有する組換えベクターを導入した宿主細胞を用いて、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質を探索することができる。 In order to introduce a recombinant vector into a host, the method described in Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 (for example, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, transfection method, Injection method, lipofection method, electroporation method, transduction method, scrape loading method, shotgun method, etc.) or infection.
Using a host cell into which a recombinant vector containing the DNA of the present invention and a reporter gene has been introduced, a substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can be searched.

本発明の探索方法は、例えば、以下の工程を含む。
（ａ）本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子を含有する組換えベクターを導入した宿主細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記被験物質を接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を調べ、被験物質を接触させない細胞における発現量と比較する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる被験物質を選択する工程。 The search method of the present invention includes the following steps, for example.
(A) a step of contacting a test substance with a host cell into which a recombinant vector containing the DNA of the present invention and a reporter gene has been introduced;
(B) a step of examining the expression level of the reporter gene in the cell contacted with the test substance and comparing it with the expression level in the cell not contacted with the test substance, and (c) based on the comparison result of (b), Selecting a test substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in adenocarcinoma cells.

被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。
被験物質と接触させる前に、本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入し、培養しておくとよい。宿主細胞としては、OVTOKO、OVISE、HAC2、RMG-I、RMG-II、KK、KOC-7c、HCH-１、SMOV-2、OVAS、OVMANA、OVSAYOを例示することができ、OVTOKO細胞が好ましい。 The test substance may be any substance, such as protein, peptide, vitamin, hormone, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, low molecular weight compound, nucleic acid (DNA, RNA, oligonucleotide, mononucleotide, etc.), lipid, other than the above Natural compounds, synthetic compounds, plant extracts, fractions of plant extracts, mixtures thereof and the like.
Prior to contacting with a test substance, a recombinant vector containing the DNA of the present invention and a reporter gene may be introduced into a host cell and cultured. Examples of host cells include OVTOKO, OVISE, HAC2, RMG-I, RMG-II, KK, KOC-7c, HCH-1, SMOV-2, OVAS, OVMANA, and OVSAYO, and OVTOKO cells are preferred.

本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子を含有する組換えベクターを導入した宿主細胞と被験物質とを接触させるには、例えば、本発明のＤＮＡとレポーター遺伝子を含有する組換えベクターを導入した宿主細胞を培養している培地に被験物質を添加すればよい。被験物質の添加量は、被験物質や宿主細胞の種類などに応じて、適宜決定すればよい。 In order to bring the host cell introduced with the recombinant vector containing the DNA of the present invention and the reporter gene into contact with the test substance, for example, the host cell introduced with the recombinant vector containing the DNA of the present invention and the reporter gene is cultured. The test substance may be added to the culture medium. The addition amount of the test substance may be appropriately determined according to the test substance, the type of host cell, and the like.

被験物質を接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現量は、レポーター遺伝子の種類に応じた方法で調べることができる。例えば、レポーターがルシフェラーゼの場合には、本発明のDNA（転写開始点上流、少なくとも-43から+541までを含む）を連結したルシフェラーゼベクターを培養細胞に導入し、24から48時間後にタンパク質を抽出し、基質であるATPとルシフェリンを加えることで起きる発光を測定することにより、発現量を調べることができる。同様の方法で、被験物質を接触させない細胞における発現量も調べ、被験物質を接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。この比較結果の基づき、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる被験物質を選択する。例えば、レポーターの発現が上昇している場合、被験物質は明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を増加できると判定される。レポーターの発現が低下している場合、被験物質は明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を低下させると判定できる。明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を低下させる物質は、明細胞腺癌に対する予防及び／又は治療効果を奏すること、細胞の抗癌剤感受性を上げることが期待できる。 The expression level of the reporter gene in the cell contacted with the test substance can be examined by a method according to the type of the reporter gene. For example, when the reporter is luciferase, the luciferase vector linked with the DNA of the present invention (upstream of the transcription start point, including at least -43 to +541) is introduced into cultured cells, and the protein is extracted 24 to 48 hours later. The amount of expression can be examined by measuring the luminescence generated by adding the substrates ATP and luciferin. In the same manner, the expression level in cells not contacted with the test substance is also examined, and the result when the test substance is contacted is compared with the result when the test substance is not contacted. Based on this comparison result, a test substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells is selected. For example, when the expression of the reporter is increased, it is determined that the test substance can increase the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells. When the reporter expression is decreased, it can be determined that the test substance decreases the transcription activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells. A substance that decreases the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can be expected to exert a preventive and / or therapeutic effect on clear cell adenocarcinoma and increase the sensitivity of the cell to an anticancer agent.

また、本発明は、上記の(a)又は(b)のＤＮＡのヌクレオチド配列の全部又は一部及びその相補鎖からなる二本鎖核酸であって、アネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる前記二本鎖核酸も提供する。(a)及び(b)のＤＮＡは上記の通りである。上記の(a)又は(b)のＤＮＡのヌクレオチド配列の全部又は一部としては、配列番号３のヌクレオチド配列が好ましい。配列番号３のヌクレオチド配列は、卵巣明細胞腺癌細胞株OVISE及びOVTOKOのアネキシン４遺伝子の第１イントロン内に存在する転写開始点(+1)の下流+171〜+190の領域の配列である。この配列の相補鎖には、転写因子ＮＦ−κＢのコンセンサス配列gggRNNYYcc（配列番号４）に類似の配列を含んでいる。 The present invention also relates to a double-stranded nucleic acid consisting of all or part of the nucleotide sequence of the DNA of the above (a) or (b) and its complementary strand, and a factor that activates transcription of the annexin 4 gene Also provided are said double stranded nucleic acids capable of binding. The DNAs (a) and (b) are as described above. As the whole or a part of the nucleotide sequence of the DNA of (a) or (b) above, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is preferable. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is the sequence of the region from +171 to +190 downstream of the transcription start point (+1) present in the first intron of the annexin 4 gene of the ovarian clear cell adenocarcinoma cell lines OVISE and OVTOKO . The complementary strand of this sequence contains a sequence similar to the consensus sequence gggRNNYYcc (SEQ ID NO: 4) of the transcription factor NF-κB.

本発明の二本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子のいずれであってもよい。また、本発明の二本鎖核酸は、天然型核酸のみならず、修飾核酸（例えば、トリステル結合をもつ修飾核酸、メチルホスホネート結合をもつ修飾核酸、ホスホロチオエート結合をもつ修飾核酸、ホスホロジチオエート結合をもつ修飾核酸、ホスホロアミンデート結合をもつ修飾核酸などのリン酸結合部位を修飾した修飾核酸、α−アノマー型修飾核酸、ポリアミド核酸などの糖部を修飾した修飾核酸など）も含むものである。 The double-stranded nucleic acid of the present invention may be any of DNA, RNA, and a chimeric molecule of DNA and RNA. In addition, the double-stranded nucleic acid of the present invention is not limited to natural nucleic acids, but also modified nucleic acids (for example, modified nucleic acids having trister bonds, modified nucleic acids having methylphosphonate bonds, modified nucleic acids having phosphorothioate bonds, phosphorodithioate bonds) Modified nucleic acids modified with phosphate binding sites such as modified nucleic acids with phosphoroaminedate bonds, modified nucleic acids modified with sugar moieties such as α-anomeric modified nucleic acids, polyamide nucleic acids, and the like.

本発明の二本鎖核酸のヌクレオチド数は、１０〜５０個が適当であり、１０〜２０個が好ましい。
本発明の二本鎖核酸は、公知の化学合成法又は生化学的合成法で製造することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成装置を用いて製造することができる。 The number of nucleotides of the double-stranded nucleic acid of the present invention is suitably 10-50, preferably 10-20.
The double-stranded nucleic acid of the present invention can be produced by a known chemical synthesis method or biochemical synthesis method. For example, it can be produced using a commercially available DNA synthesizer.

本発明の二本鎖核酸は、アネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子のＤＮＡ上の結合部位と同じ配列を有すると考えられるので、本発明の二本鎖核酸が核内に存在すると、アネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が本発明の二本鎖核酸に結合し、本来のゲノムＤＮＡ上の結合部位への結合が競合的に阻害される。その結果、アネキシン４遺伝子の発現が抑制される。従って、本発明の二本鎖核酸は、アネキシン４遺伝子の発現を抑制するための試薬又は医薬として、利用することができる。本発明の二本鎖核酸を含む医薬は、アネキシン４が関与する種々の疾患（例えば、明細胞腺癌（腎明細胞腺癌、卵巣明細胞腺癌）の予防及び／治療に用いることができる。また、アネキシン４が過剰発現すると、細胞のパクリタキセル抵抗性が上昇することが報告されている（British Journal of Cancer (2000)83(1), 83-88）ので、本発明の二本鎖核酸を含む医薬は、抗癌剤の感受性を上げるために使用することができる。 Since the double-stranded nucleic acid of the present invention is considered to have the same sequence as the binding site on the DNA of the factor that activates transcription of the annexin 4 gene, when the double-stranded nucleic acid of the present invention is present in the nucleus, the annexin Factors that activate the transcription of the four genes bind to the double-stranded nucleic acid of the present invention, and binding to the binding site on the original genomic DNA is competitively inhibited. As a result, the expression of the annexin 4 gene is suppressed. Therefore, the double-stranded nucleic acid of the present invention can be used as a reagent or a medicine for suppressing the expression of annexin 4 gene. The medicament containing the double-stranded nucleic acid of the present invention can be used for the prevention and / or treatment of various diseases involving annexin 4 (for example, clear cell adenocarcinoma (kidney clear cell adenocarcinoma, ovarian clear cell adenocarcinoma)). In addition, it has been reported that when annexin 4 is overexpressed, the paclitaxel resistance of the cells is increased (British Journal of Cancer (2000) 83 (1), 83-88). Can be used to increase the sensitivity of anticancer agents.

医薬として用いる場合には、本発明の二本鎖核酸は、局所的または全身的に生体に投与される。生体への投与は、生体内に核酸を導入できる方法であればいかなる投与法によってもよい。本発明の二本鎖核酸をそれ自体あるいは薬理学上許容される賦形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤などにより経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤又は外用剤などにより非経口的に投与することができる。 When used as a medicine, the double-stranded nucleic acid of the present invention is administered to a living body locally or systemically. Administration to a living body may be performed by any administration method as long as a nucleic acid can be introduced into the living body. The double-stranded nucleic acid of the present invention is mixed with itself or a pharmacologically acceptable excipient, diluent, etc., orally by tablet, capsule, granule, powder or syrup, or injection It can be administered parenterally by suppositories, patches or external preparations.

これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトールのような糖類；トウモロコシデンプン、バイレショデンプン、コムギデンプンのような澱粉；炭酸カルシムム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムのような無機物；結晶セルロース；カンゾウ末、ゲンチアナ末のような植物末など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム；タルク；水素添加植物油；マクロゴール；シリコーン油など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化合物など）、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムなど）、乳化剤（例えば、アラビアゴム、コレステロール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、薬用セッケンなど）、保存剤（例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸、ホウ酸、クロロブタノール、ベンジルアルコールなど）、矯味剤（例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなど）、矯臭剤（例えば、芳香性精油類など）などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。 These formulations include excipients (eg, sugars such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol; starches such as corn starch, potato starch, wheat starch; calcium carbonate, calcium sulfate, sodium bicarbonate, sodium chloride Inorganic substances such as crystalline cellulose; plant powder such as licorice powder, gentian powder, etc., lubricant (eg, magnesium stearate; talc; hydrogenated vegetable oil; macrogol; silicone oil, etc.), binder (eg, hydroxy) Propylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol, compounds similar to the above-mentioned excipients, etc., disintegrating agents (eg, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, sodium alginate, etc.), emulsifiers (eg, gum arabic, cholesterol, sugar Polyoxyl 40 acrylate, sorbitan sesquioleate, polysorbate 80, sodium lauryl sulfate, medicated soap, etc., preservatives (eg, benzoic acid, sodium benzoate, paraoxybenzoic acid ester, dehydroacetic acid, boric acid, chlorobutanol, benzyl alcohol) Etc.), flavoring agents (for example, lactose, sucrose, glucose, mannitol, etc.), flavoring agents (for example, aromatic essential oils, etc.), and the like.

注射剤の製剤形態をとる場合には、注射用水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油などの溶剤、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどの保存剤、水素添加ヒマシ油、ポリソルベートなどの界面活性剤、ベンジルアルコール、クロロブタノールなどの無痛化剤、クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸などの緩衝剤、CMC-Na、ポリビニルピロリドンなどの懸濁化剤などを使用するとよい。 In the case of taking the formulation form of injections, water for injection, solvents such as sesame oil, soybean oil, corn oil, inert gases such as nitrogen and carbon dioxide, chelating agents such as EDTA and thioglycolic acid, and anticorrosives such as ascorbic acid Preservatives such as oxidizing agents, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, surfactants such as hydrogenated castor oil, polysorbate, soothing agents such as benzyl alcohol and chlorobutanol, citric acid, acetic acid Buffering agents such as sodium salt of phosphoric acid and boric acid, and suspending agents such as CMC-Na and polyvinylpyrrolidone may be used.

あるいはまた、一般の遺伝子導入法で用いられる製剤形態（例えば、センダイウイルス等を用いた膜融合リポソーム製剤、リポフェクトアミン等のカチオン性脂質を用いる製剤、レトロウイルスやアデノウイルス等のウイルス製剤など）をとってもよい。
投与は、疾患の種類、疾病の状態の重篤度、投与方法、患者の年齢や応答性などによるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、成人１回あたり、有効成分の量として、約1 μg〜100 mgの投与量で、１日１回〜数回、経口投与または静注する。 Alternatively, formulation forms used in general gene transfer methods (for example, membrane fusion liposome formulations using Sendai virus, formulations using cationic lipids such as lipofectamine, virus formulations such as retrovirus and adenovirus) You may take
Administration depends on the type of disease, the severity of the disease state, the method of administration, the age and responsiveness of the patient, etc., but over the period until the effectiveness of the treatment is observed or the reduction of the disease state is achieved. It may be performed at an appropriate dose, administration method, and frequency. For example, the dose of about 1 μg to 100 mg of the active ingredient per adult is administered orally or intravenously once to several times a day.

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
方法
卵巣癌細胞株：卵巣明細胞腺癌細胞株OVISEおよびOVTOKO、粘液性腺癌細胞株MCASはこれらの細胞株は横浜市立大学木原生物学研究所の安光英太郎准教授により分与された。これらの細胞株は10%ウシ胎児血清を含むRPMI培地中にて培養した。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1]
Methods Ovarian cancer cell lines: Ovarian clear cell adenocarcinoma cell lines OVISE and OVTOKO and mucinous adenocarcinoma cell line MCAS were distributed by Associate Professor Eitaro Anmitsu of Kihara Biological Research Institute, Yokohama City University. These cell lines were cultured in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum.

発現解析：OVISE,OVTOKO, MCAS細胞および漿液性、粘液性、明細胞の組織型を示す卵巣癌組織検体を対象に、アネキシン4（ANX4）タンパク質およびmRNAの発現量をウエスタンブロット法およびリアルタイムRT-PCR法を用いて解析した。抗ヒトANX4抗体はサンタクルズ社から購入した。 Expression analysis: Western blotting and real-time RT-expression of annexin 4 (ANX4) protein and mRNA expression in OVISE, OVTOKO, MCAS cells and ovarian cancer tissue specimens showing serous, mucous and clear cell histology Analysis was performed using the PCR method. Anti-human ANX4 antibody was purchased from Santa Cruz.

5’-Rapid amplification cDNA ends法： OVISE,OVTOKO, MCAS細胞から抽出した全RNAを、ANX4-RTプライマー（5’-CATGGCATTGAATCCTGAAGCAGC-3’）（配列番号５）を用いて、パワースクリプト（クロンテック社）により逆転写を行った。得られたcDNAにターミナルデオキシトランスフェラーゼ(インビトロジェン社)を用いてポリC配列を付加し、それを鋳型として、オリゴdI-dGプライマーおよびANX4-R01プライマー(5’-CTCTTGTAGGCTGTCCTGATCTCCT-3’)（配列番号６）を用いてPCRを行い、ANX4遺伝子の5’非翻訳領域を増幅した。得られたDNA断片の塩基配列を解析して転写開始点（+1）を決定した。 5'-Rapid amplification cDNA ends method: Total RNA extracted from OVISE, OVTOKO, MCAS cells using ANX4-RT primer (5'-CATGGCATTGAATCCTGAAGCAGC-3 ') (SEQ ID NO: 5), PowerScript (Clontech) Reverse transcription was carried out. Poly C sequence was added to the obtained cDNA using terminal deoxytransferase (Invitrogen), and using it as a template, oligo dI-dG primer and ANX4-R01 primer (5′-CTCTTGTAGGCTGTCCTGATCTCCT-3 ′) (SEQ ID NO: 6) ) Was used to amplify the 5 ′ untranslated region of the ANX4 gene. The base sequence of the obtained DNA fragment was analyzed to determine the transcription start point (+1).

レポーターベクターの作成：市販のヒトゲノムDNA（ノバジェン社）を鋳型にして、ANX4遺伝子の転写開始点上流-1534から下流+1010までの領域を、ANX4-1534Fプライマー（5'-CGTGGCTATGCACCCGGCTAA-3'）（配列番号７）とANX4+1010R-BglIIプライマー（5'-TGGAAGATCTTCTCAGCTACTCAGGAGGTTGAGGTGGGT-3'（配列番号８）、下線部はBglIIサイト）を用いて、KOD-plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡績社）により増幅し、PCR産物をBglII切断後pGL3-basicルシフェラーゼベクター（プロメガ社）のマルチクローニングサイト（MCS）内のSmaIおよびBglIIサイトに挿入した。この挿入配列をもとにStuI(-181)サイトもしくBamHI（-43）サイトを用いて、-181もしくは-43の上流または下流を欠損させた。その他の様々な3’領域欠損体はPCR法を用いて作製した。センスプライマーとしてANX4遺伝子-43領域に相当するプライマー ANX4-43F（5'-GGATCCGTCCCGGATAAGACC-3'）（配列番号９）を、アンチセンスプライマーとしてBglIIサイトを付加した各3’下流域に対応するプライマー(ANX4+27R-BglII; 5'-TGGAAGATCTTCCTCCTCTGCGGCTGCGGA-3'（配列番号１０）、ANX4+150R-BglII; 5'-TGGAAGATCTTCTGGGGTGCAGCGCGGAGC-3'（配列番号１１）、 ANX4+282R-BglII; 5'-TGGAAGATCTTCCTGGATGGTGCCAGCGGT-3'（配列番号１２）、 ANX4+397R-BglII; 5'-TGCTAGATCTAGGCAAGATTATCTCGGTCC-3'（配列番号１３）、 ANX4+541R-BglII; 5'-TGGAGATCTTCCGATGTGCCGGGCACTGTG-3'（配列番号１４）、下線部はBglIIサイト)を用いてPCRを行い、pGL3-basicベクターのSmaI／BglIIサイトに挿入した。+171-+190領域の欠損体を作成するためには、-43から+541までの領域を挿入したプラスミドを鋳型にしてPCR法を用いて作製した。センスプライマーはRV-primer3（pGL3-basicのMCSの上流に対応、プロメガ社）、アンチセンスプライマーにはANX4+170-R（5'-AGCCGGCGGCGAGCACCCAC-3'）（配列番号１５）を用いて、KOD-plus-DNAポリメラーゼによりpGL3-basicのMCS上流域を含むANX4遺伝子+170から-43までの断片を増幅し、KpnI（MCS内）切断を行った。またANX4-191-F（5'-CACAGGGTGGAGGGGGCCAG-3'）（配列番号１６）とGLprimer2（pGL3-basicのMCSの下流に対応、プロメガ）を用いてMCS下流域を含むANX4遺伝子+191から+541までの断片を増幅し、BglII(MCS内)で切断した。この２つの断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’リン酸化を行った後、pGL3-basicベクターのKpnI/BglIIサイトに同時に導入した。同様に、ANX4-180-Rmut（5'-CTTGgCCGCAAGCCGGCGGCGAGCACCCAC-3'）（配列番号１７）およびANX4-181-Fmut（5'-CgtaGGCGGCCACAGGGTGGAGGGGGCCAG-3'）（配列番号１８）を用いてNF-κB認識配列の変異体を作成した。 Preparation of reporter vector: ANX4-1534F primer (5'-CGTGGCTATGCACCCGGCTAA-3 ') (ANX4534 transcription region upstream-1534 to downstream +0101 using commercially available human genomic DNA (Novagen) as a template) Amplified with KOD-plus-DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) using SEQ ID NO: 7) and ANX4 + 1010R-BglII primer (5'-TGGA AGATCT TCTCAGCTACTCAGGAGGTTGAGGTGGGT-3 '(SEQ ID NO: 8) underlined BglII site) The PCR product was cleaved with BglII and inserted into the SmaI and BglII sites in the multicloning site (MCS) of the pGL3-basic luciferase vector (Promega). Based on this insertion sequence, upstream or downstream of -181 or -43 was deleted using StuI (-181) site or BamHI (-43) site. Various other 3 ′ region deletions were prepared using PCR. Primer ANX4-43F (5'-GGATCCGTCCCGGATAAGACC-3 ') (SEQ ID NO: 9) corresponding to the ANX4 gene-43 region as a sense primer and a primer corresponding to each 3' downstream region with a BglII site added as an antisense primer ( ANX4 + 27R-BglII; 5'-TGGA AGATCT TCCTCCTCTGCGGCTGCGGA-3 '(SEQ ID NO: 10), ANX4 + 150R-BglII; 5'-TGGA AGATCT TCTGGGGTGCAGCGCGGAGC-3' (SEQ ID NO: 11), ANX4 + 282R-BglII; 5 ' -TGGA AGATCT TCCTGGATGGTGCCAGCGGT-3 '(SEQ ID NO: 12), ANX4 + 397R-BglII; 5'-TGCT AGATCT AGGCAAGATTATCTCGGTCC-3' (SEQ ID NO: 13), ANX4 + 541R-BglII; 5'-TGG AGATCT TCCGATGTGCCGGGCACTGTG-3 ' PCR was performed using SEQ ID NO: 14), and the underlined portion is the BglII site), and inserted into the SmaI / BglII site of the pGL3-basic vector. In order to create a deletion of the + 171- + 190 region, a plasmid in which a region from −43 to +541 was inserted was used as a template to prepare a deletion. The sense primer is RV-primer3 (corresponding to the upstream of pGL3-basic MCS, Promega), and the antisense primer is ANX4 + 170-R (5'-AGCCGGCGGCGAGCACCCAC-3 ') (SEQ ID NO: 15). A fragment from ANX4 gene +170 to -43 including the MCS upstream region of pGL3-basic was amplified with -plus-DNA polymerase, and KpnI (within MCS) was cleaved. In addition, using ANX4-191-F (5'-CACAGGGTGGAGGGGGCCAG-3 ') (SEQ ID NO: 16) and GLprimer2 (corresponding to the downstream of MCS of pGL3-basic, Promega) + ANX4 gene including MCS downstream region +191 to +541 The fragment was amplified and cut with BglII (in MCS). These two fragments were subjected to 5 ′ phosphorylation using T4 polynucleotide kinase and then simultaneously introduced into the KpnI / BglII site of the pGL3-basic vector. Similarly, NF-κB recognition sequence using ANX4-180-Rmut (5′-CTTGgCCGCAAGCCGGCGGCGAGCACCCAC-3 ′) (SEQ ID NO: 17) and ANX4-181-Fmut (5′-CgtaGGCGGCCACAGGGTGGAGGGGGCCAG-3 ′) (SEQ ID NO: 18) A mutant of was created.

ルシフェラーゼアッセイ：OVISE、OVTOKOおよびMCAS細胞を24穴プレートに播種し24時間培養後、各ウェルの細胞に構築したプロモーターベクターと内部標準としてpSV-・・galactosidasae controlベクター（プロメガ社）をFuGENE HD試薬（ロシュ社）を用いて導入した。48時間培養後ルシフェラーゼ活性を測定し、β-ガラクトシダーゼ活性に対して補正を行った。 Luciferase assay: OVISE, OVTOKO and MCAS cells were seeded in 24-well plates and cultured for 24 hours. Then, the promoter vector constructed in each well cell and pSV- · galactosidasae control vector (Promega) as an internal standard were added to FuGENE HD reagent ( Roche). After culturing for 48 hours, luciferase activity was measured and corrected for β-galactosidase activity.

ゲルシフトアッセイ：ゲルシフトアッセイに用いる二本鎖DNAプローブは、ANX4遺伝子のNF-kappa B認識配列を含む22塩基の合成オリゴヌクレオチドとその相補鎖をアニーリングさせることにより調製した。センス鎖の配列は5’-TTGCGGGCAAGCCCGGGCGGCC-3’（配列番号１９）、その変異型の配列は 5’-TTGCGGcCAAGCgtaGGCGGCC-3’（小文字は変異導入箇所を示す）（配列番号２０）である。作製した二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ-³²P］-ATPで標識した。MCAS、OVTOKOおよびOVISE細胞から抽出した核タンパク質と³²P標識プローブを25℃で反応させ、５％アクリルアミドゲルで展開後、Typhoon 9400蛍光スキャナー（GEヘルスケア）にて解析した。比較対照として転写因子SP1の22塩基対コンセンサスオリゴヌクレオチド（プロメガ社）を使用した。 Gel shift assay: The double-stranded DNA probe used in the gel shift assay was prepared by annealing a 22-base synthetic oligonucleotide containing the NF-kappa B recognition sequence of the ANX4 gene and its complementary strand. The sequence of the sense strand is 5′-TTGCGGGCAAGCCCGGGCGGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 19), and the mutant type sequence is 5′-TTGCGGcCAAGCgtaGGCGGCC-3 ′ (lower case indicates the position of mutation introduction) (SEQ ID NO: 20). The 5 ′ end of the prepared double-stranded oligonucleotide was labeled with [γ- ³² P] -ATP using T4 polynucleotide kinase. The nucleoprotein extracted from MCAS, OVTOKO and OVISE cells was reacted with ³² P-labeled probe at 25 ° C., developed on a 5% acrylamide gel, and analyzed with a Typhoon 9400 fluorescence scanner (GE Healthcare). A 22 base pair consensus oligonucleotide of transcription factor SP1 (Promega) was used as a comparative control.

結果および考察
異なる組織型を示す様々な卵巣腫瘍組織および細胞株におけるANX4の発現量をウエスタンブロット法により比較したところ、ANX4の発現量は明細胞腺癌細胞や組織中にて増加していることが認められた（図１上左と下）。さらにこれは、mRNAレベルにおいても同様の結果が得られた（図１上右）ことから、ANX4の発現は転写レベルで制御されていることが示唆された。そこで明細胞腺癌細胞におけるANX4の転写調節機構を解析するために、まず5’-rapid amplification cDNA ends法を用いてANX4遺伝子の5’非翻訳領域（図２）を調べたところ、上記３種の細胞株では同一の転写開始点が使用されていることが明らかになった。次に転写開始点(+1)の上流約1534 bpから下流 1010 bpまでの領域を用いてプロモーターアッセイを行った。その結果、MCASと比べて2種の明細胞腺癌細胞にて非常に高い転写活性を示した（図３）。さらにそこから転写開始点上流域を欠損させた場合は、明細胞腺癌細胞とMCAS細胞の転写活性の変化の比率は相対的に同じであったが、転写開始点下流域を欠損させた場合は、MCAS細胞では変化が見られないが、２種の明細胞腺癌細胞における転写活性は著しく減少した（図４）。第１イントロン内に存在する+171〜+190の領域には転写因子NF-κBの認識配列の類似配列が存在しており（図５）、本配列を欠損もしくは変異導入することで、CCA細胞では転写活性の著しい低下が認められたが、MCAS細胞では変化は見られなかった（図６）。ゲルシフトアッセイを行った結果、転写因子SP1の結合活性は３種の細胞間で大きな差は見られなかったが、本配列と結合する核内タンパク質は明細胞腺癌細胞にのみ活性化していることが明らかになった（図７）。したがってCCAにおけるANX4の発現には+171〜+190の領域が重要なエンハンサーとして機能していると考えられる。 Results and discussion ANX4 expression levels in various ovarian tumor tissues and cell lines with different tissue types were compared by Western blotting. ANX4 expression levels increased in clear cell adenocarcinoma cells and tissues. Was observed (upper left and lower in FIG. 1). Furthermore, the same result was obtained at the mRNA level (upper right in FIG. 1), suggesting that the expression of ANX4 is regulated at the transcription level. Therefore, in order to analyze the transcriptional regulatory mechanism of ANX4 in clear cell adenocarcinoma cells, we first examined the 5 'untranslated region (Fig. 2) of the ANX4 gene using the 5'-rapid amplification cDNA ends method. It was revealed that the same transcription start point was used in this cell line. Next, a promoter assay was performed using a region from about 1534 bp upstream to 1010 bp downstream of the transcription start point (+1). As a result, compared with MCAS, 2 types of clear cell adenocarcinoma cells showed very high transcriptional activity (FIG. 3). Furthermore, when the region upstream of the transcription start point was deleted, the rate of change in transcriptional activity of clear cell adenocarcinoma cells and MCAS cells was relatively the same, but when the region downstream of the transcription start point was deleted No change was observed in MCAS cells, but the transcriptional activity in the two types of clear cell adenocarcinoma cells was significantly reduced (FIG. 4). A sequence similar to the recognition sequence of the transcription factor NF-κB is present in the region of +171 to +190 in the first intron (FIG. 5), and CCA cells can be obtained by deleting or mutating this sequence. In Fig. 6, a significant decrease in transcriptional activity was observed, but no change was observed in MCAS cells (Fig. 6). As a result of the gel shift assay, the binding activity of the transcription factor SP1 was not significantly different among the three types of cells, but the nuclear protein binding to this sequence was activated only in clear cell adenocarcinoma cells. Became clear (Fig. 7). Therefore, it is considered that the region from +171 to +190 functions as an important enhancer for the expression of ANX4 in CCA.

本発明により、明細胞癌におけるアネキシン４遺伝子の発現に重要なプロモーターおよびエンハンサーが転写開始点(+1)の上流-1534から下流+1010の領域に含まれていることが明らかとなった。この領域を挿入したレポーターベクターを用いて、アネキシン４の転写を制御できる物質を探索することができる。アネキシン４の転写を制御できる物質は、アネキシン４が関与する疾患、例えば、明細胞腺癌の予防及び／又は治療や細胞の抗癌剤感受性を上げる薬剤として利用できる。また、前記領域に含まれる二本鎖核酸は、転写因子阻害分子（デコイオリゴヌクレオチド）として利用すれば、アネキシン４の転写を抑制することができると考えられるので、アネキシン４が関与する疾患、例えば、明細胞腺癌の予防及び／又は治療や細胞の抗癌剤感受性を上げる薬剤としての効果が期待される。 According to the present invention, it has been clarified that a promoter and an enhancer important for the expression of the annexin 4 gene in clear cell carcinoma are contained in a region from upstream -1534 to downstream +1010 of the transcription start point (+1). Using a reporter vector inserted with this region, a substance capable of controlling the transcription of annexin 4 can be searched. A substance capable of controlling the transcription of annexin 4 can be used as an agent for preventing and / or treating a disease involving annexin 4, for example, clear cell adenocarcinoma and increasing the sensitivity of a cell to an anticancer agent. Moreover, since it is considered that the double-stranded nucleic acid contained in the region can suppress the transcription of annexin 4 when used as a transcription factor inhibitor molecule (decoy oligonucleotide), for example, a disease involving annexin 4, for example, Expected to be effective as an agent for preventing and / or treating clear cell adenocarcinoma and increasing the sensitivity of cells to anticancer agents.

ANX4は卵巣明細胞腺癌で発現上昇している。ANX4のタンパク質およびmRNAの発現量を調べるためにウエスタンブロッティングとリアルタイムＰＣＲ解析を行った。その結果、タンパク質レベル、mRNAレベルともに、明細胞腺癌にANX4の発現上昇が確認された。また卵巣癌患者組織検体中のANX4発現量を調べたところ明細胞腺癌組織にのみANX4が高レベルに発現していることが認められた。ANX4 is upregulated in ovarian clear cell adenocarcinoma. Western blotting and real-time PCR analysis were performed to examine the expression levels of ANX4 protein and mRNA. As a result, increased expression of ANX4 was confirmed in clear cell adenocarcinoma at both protein and mRNA levels. In addition, when the expression level of ANX4 in tissue samples of ovarian cancer patients was examined, it was found that ANX4 was expressed at a high level only in clear cell adenocarcinoma tissues. ANX4遺伝子の5’-非翻訳領域。ANX4遺伝子には２種類の開始エキソンがデータベース上に存在した。卵巣癌細胞株３種を用いて、５’-RACEを行ったところ、３種の細胞からシングルバンドが検出された。DNAシークエンス解析からこのバンドはエキソン1b含有型cDNAであることが明らかになった。エキソン１b含有型 mRNAの発現量を調べるために、エキソン１ｂに対応するセンスプライマーとエキソン２に対応するアンチセンスプライマーを用いてRT-PCRを行った。5'-untranslated region of ANX4 gene. There were two types of starting exons in the ANX4 gene in the database. When 5'-RACE was performed using three ovarian cancer cell lines, a single band was detected from the three cells. DNA sequence analysis revealed that this band was exon 1b-containing cDNA. In order to examine the expression level of exon 1b-containing mRNA, RT-PCR was performed using a sense primer corresponding to exon 1b and an antisense primer corresponding to exon 2. ANX4遺伝子の明細胞腺癌特異的な発現上昇には、転写開始点下流域が重要である。ANX4遺伝子の転写開始点上流-1534から下流＋1010塩基までの領域をpGL3-basicベクターに連結し、その5’または3’領域の欠損させた様々な変異体を作成した。各々の作成したベクターと、内部標準としてβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターと共に３種の卵巣癌細胞株に一過的に発現させて、ルシフェラーゼアッセイを行った。相対的なルシフェラーゼ活性を、pGL3-basicベクターの活性に対する比率で示した。The downstream region of the transcription start point is important for the specific expression increase of ANX4 gene in clear cell adenocarcinoma. The region from the transcription start point upstream-1534 to downstream +1010 bases of the ANX4 gene was ligated to the pGL3-basic vector, and various mutants lacking the 5 'or 3' region were prepared. A luciferase assay was performed by transiently expressing each of the prepared vectors and a β-galactosidase expression vector as an internal standard in three ovarian cancer cell lines. Relative luciferase activity was expressed as a ratio to the activity of the pGL3-basic vector. ANX4遺伝子の明細胞腺癌特異的な発現上昇には、転写開始点下流+150から+282の領域が重要である。ANX4遺伝子の転写開始点から上流-43から下流＋1010までの領域における様々な3’領域欠損体とβ-ガラクトシダーゼ発現ベクターを３種の卵巣癌細胞株に共発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。相対的なルシフェラーゼ活性を、pGL3-basicベクターの活性に対する比率で示した。In the clear cell adenocarcinoma-specific expression increase of ANX4 gene, the region from +150 to +282 downstream of the transcription start point is important. Various 3 'region deletions and β-galactosidase expression vectors in the region from upstream -43 to downstream +1010 from the transcription start point of ANX4 gene were co-expressed in three ovarian cancer cell lines, and luciferase assay was performed. Relative luciferase activity was expressed as a ratio to the activity of the pGL3-basic vector. ANX4遺伝子の転写開始点下流+150から+282の領域の塩基配列。転写因子結合部位予測プログラムTFSEARCH（http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html）によって得られた結果を示す。+171〜+190領域には転写因子ＮＦ−κＢの認識配列が存在した。The nucleotide sequence of the region from +150 to +282 downstream of the transcription start point of the ANX4 gene. The results obtained by the transcription factor binding site prediction program TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html) are shown. A recognition sequence for the transcription factor NF-κB was present in the +171 to +190 region. 明細胞腺癌特異的なANX4遺伝子の発現には転写開始点下流+171から+190の領域に存在するＮＦ−κＢの認識配列が重要である。ANX4遺伝子の-43〜+541領域を挿入したベクターおよびその+171〜+190領域の欠損体とＮＦ−κＢ認識配列の変異体を作成し、β-ガラクトシダーゼ発現ベクターと共に３種の卵巣癌細胞株に共発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。各々の相対的な転写活性を、pGL3-basicベクターの活性に対する比率として示した。For the expression of ANX4 gene specific for clear cell adenocarcinoma, the recognition sequence of NF-κB existing in the region from +171 to +190 downstream of the transcription start point is important. A vector in which the -43 to +541 region of the ANX4 gene was inserted, a deletion of the +171 to +190 region and a mutant of the NF-κB recognition sequence were prepared, and three ovarian cancer cell lines along with β-galactosidase expression vectors And luciferase assay was performed. The relative transcriptional activity of each was shown as a ratio to the activity of the pGL3-basic vector. ANX4遺伝子の+171〜+190領域に結合する転写因子は、明細胞腺癌細胞において活性化している。３種の卵巣癌細胞株から核タンパク質を抽出し、³²P標識したDNAプローブと反応させた。プローブの100倍過剰量の非標識のオリゴヌクレオチド（wt）もしくはその変異型 (mut)を競合的に反応させることで、タンパク質のプローブに対する結合特異性を評価した。A transcription factor that binds to the +171 to +190 region of the ANX4 gene is activated in clear cell adenocarcinoma cells. Nuclear proteins were extracted from three ovarian cancer cell lines and reacted with ³² P-labeled DNA probes. The binding specificity of the protein to the probe was evaluated by competitively reacting a 100-fold excess of unlabeled oligonucleotide (wt) or its mutant (mut).

＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトアネキシン４の転写開始点(+1)の上流-1534から+1010の領域のDNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトアネキシン４の転写開始点(+1)の上流-43から+541の領域のDNA配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトアネキシン４の転写開始点(+1)の下流+171〜+190の領域のDNA配列を示す。＜配列番号４＞
配列番号４は、転写因子ＮＦ−κＢのコンセンサス配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ANX4-RTプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ANX4-R01プライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、ANX4-1534FプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、ANX4+1010R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、ANX4-43FプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ANX4+27R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ANX4+150R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ANX4+282R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、ANX4+397R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、ANX4+541R-BglIIプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、ANX4+170-RプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、ANX4-191-FプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、ANX4-180-RmutプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、ANX4-181-FmutプライマーのDNA配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、ゲルシフトアッセイに用いた二本鎖ＤＮＡプローブのセンス鎖の配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、ゲルシフトアッセイに用いた二本鎖ＤＮＡプローブのセンス鎖の変異型の配列を示す。 <SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of the region from −1534 to +1010 upstream of the transcription start point (+1) of human annexin 4.
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the DNA sequence of the region from −43 to +541 upstream of the transcription start point (+1) of human annexin 4.
<SEQ ID NO: 3>
SEQ ID NO: 3 shows the DNA sequence of the region from +171 to +190 downstream of the transcription start point (+1) of human annexin 4. <SEQ ID NO: 4>
SEQ ID NO: 4 shows the consensus sequence for transcription factor NF-κB.
<SEQ ID NO: 5>
SEQ ID NO: 5 shows the DNA sequence of ANX4-RT primer.
<SEQ ID NO: 6>
SEQ ID NO: 6 shows the DNA sequence of ANX4-R01 primer.
<SEQ ID NO: 7>
SEQ ID NO: 7 shows the DNA sequence of ANX4-1534F primer.
<SEQ ID NO: 8>
SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence of ANX4 + 1010R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 9>
SEQ ID NO: 9 shows the DNA sequence of ANX4-43F primer.
<SEQ ID NO: 10>
SEQ ID NO: 10 shows the DNA sequence of ANX4 + 27R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 11>
SEQ ID NO: 11 shows the DNA sequence of ANX4 + 150R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 12>
SEQ ID NO: 12 shows the DNA sequence of ANX4 + 282R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 13>
SEQ ID NO: 13 shows the DNA sequence of ANX4 + 397R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 14>
SEQ ID NO: 14 shows the DNA sequence of ANX4 + 541R-BglII primer.
<SEQ ID NO: 15>
SEQ ID NO: 15 shows the DNA sequence of ANX4 + 170-R primer.
<SEQ ID NO: 16>
SEQ ID NO: 16 shows the DNA sequence of ANX4-191-F primer.
<SEQ ID NO: 17>
SEQ ID NO: 17 shows the DNA sequence of ANX4-180-Rmut primer.
<SEQ ID NO: 18>
SEQ ID NO: 18 shows the DNA sequence of ANX4-181-Fmut primer.
<SEQ ID NO: 19>
SEQ ID NO: 19 shows the sequence of the sense strand of the double-stranded DNA probe used in the gel shift assay.
<SEQ ID NO: 20>
SEQ ID NO: 20 shows the sequence of the mutant type of the sense strand of the double-stranded DNA probe used in the gel shift assay.

Claims

以下の(a)又は(b)のＤＮＡ。
(a)アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域の全部又は一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡ
(b)(a)のＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能を有するＤＮＡ The following DNA (a) or (b):
(a) DNA comprising the same sequence as the nucleotide sequence of all or part of the region from upstream 1534 to downstream +1010 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1
(b) a DNA that hybridizes with a DNA complementary to the DNA of (a) under stringent conditions and has a biological function equivalent to that of the DNA of (a)

アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−１５３４から下流＋１０１０までの領域のヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列である請求項１記載のＤＮＡ。 The DNA according to claim 1, wherein the nucleotide sequence of the region from upstream -1534 to downstream +1010 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1.

(a)のＤＮＡが、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その上流−４３から下流＋５４１までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡである請求項１又は２記載のＤＮＡ。 The DNA of (a) is a DNA comprising the same sequence as the entire nucleotide sequence in the region from upstream -43 to downstream +541 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1. The DNA described.

(a)のＤＮＡが、アネキシン４遺伝子の転写開始点を＋１としたときに、その下流＋１７１から＋１９０までの領域の全部のヌクレオチド配列と同一の配列からなるＤＮＡである請求項１又は２記載のＤＮＡ。 The DNA of (a) is a DNA comprising the same sequence as the entire nucleotide sequence in the region from downstream +171 to +190 when the transcription start point of the annexin 4 gene is +1. DNA.

(a)のＤＮＡと同等の生物学的機能が、明細胞腺癌細胞においてアネキシン４遺伝子の転写を活性化することである請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ。 The DNA according to any one of claims 1 to 4, wherein the biological function equivalent to the DNA of (a) is to activate transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells.

明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる部位を含む請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ。 The DNA according to any one of claims 1 to 5, comprising a site to which a factor that activates transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells can bind.

明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子がＮＦ−κＢである請求項６記載のＤＮＡ。 The DNA according to claim 6, wherein the factor that activates transcription of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells is NF-κB.

明細胞腺癌が卵巣明細胞腺癌である請求項５〜７のいずれかに記載のＤＮＡ。 The DNA according to any one of claims 5 to 7, wherein the clear cell adenocarcinoma is ovarian clear cell adenocarcinoma.

請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。 A recombinant vector containing the DNA according to any one of claims 1 to 8.

さらにレポーター遺伝子を含有する請求項９記載の組換えベクター。 The recombinant vector according to claim 9, further comprising a reporter gene.

レポーターがルシフェラーゼである請求項１０記載の組換えベクター。 The recombinant vector according to claim 10, wherein the reporter is luciferase.

請求項９〜１１のいずれかに記載の組換えベクターを含む形質転換体。 A transformant comprising the recombinant vector according to any one of claims 9 to 11.

請求項１０又は１１記載の組換えベクターを導入した宿主細胞である請求項１２記載の形質転換体。 The transformant according to claim 12, which is a host cell into which the recombinant vector according to claim 10 or 11 has been introduced.

請求項１３記載の形質転換体を用いて、明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質を探索する方法。 A method for searching for a substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells using the transformant according to claim 13.

明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質が、明細胞腺癌に対する予防及び／又は治療効果を奏するものである請求項１４記載の方法。 The method according to claim 14, wherein the substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells has a preventive and / or therapeutic effect on clear cell adenocarcinoma.

明細胞腺癌細胞におけるアネキシン４遺伝子の転写活性を制御できる物質が、細胞の抗癌剤感受性を上げることができるものである請求項１４記載の方法。 The method according to claim 14, wherein the substance capable of controlling the transcriptional activity of the annexin 4 gene in clear cell adenocarcinoma cells is capable of increasing the sensitivity of the cell to an anticancer agent.

請求項１記載のＤＮＡのヌクレオチド配列の全部又は一部及びその相補鎖からなる二本鎖核酸であって、アネキシン４遺伝子の転写を活性化する因子が結合できる前記二本鎖核酸。 A double-stranded nucleic acid consisting of all or part of the nucleotide sequence of the DNA of claim 1 and its complementary strand, to which a factor that activates transcription of the annexin 4 gene can be bound.

請求項１記載のＤＮＡのヌクレオチド配列の一部が配列番号３のヌクレオチド配列である請求項１７記載の二本鎖核酸。 The double-stranded nucleic acid according to claim 17, wherein a part of the nucleotide sequence of the DNA according to claim 1 is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

請求項１７記載の二本鎖核酸を含有する組成物。 A composition comprising the double-stranded nucleic acid according to claim 17.

試薬として使用される請求項１９記載の組成物。 20. A composition according to claim 19 for use as a reagent.

医薬として使用される請求項１９記載の組成物。 20. A composition according to claim 19 for use as a medicament.

アネキシン４が関与する疾患を予防及び／又は治療するための医薬として使用される請求項２１記載の組成物。 The composition according to claim 21, which is used as a medicament for preventing and / or treating a disease associated with annexin 4.

アネキシン４が関与する疾患が明細胞腺癌である請求項２２記載の組成物。 The composition according to claim 22, wherein the disease involving annexin 4 is clear cell adenocarcinoma.

明細胞腺癌が卵巣明細胞腺癌である請求項２３記載の組成物。 24. The composition of claim 23, wherein the clear cell adenocarcinoma is ovarian clear cell adenocarcinoma.

細胞の抗癌剤感受性を上げることができる薬剤として使用される請求項１９記載の組成物。 The composition of Claim 19 used as a chemical | medical agent which can raise the anticancer agent sensitivity of a cell.