JP2019529335A - アポトーシスのモニタリングのための、ガンマ−グルタミル−l−イプシロン−リジンに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
a)試料と、本発明に従ったGGELに特異的なモノクローナル抗体とを接触させる工程、及び
b)本発明に従ったGGELに特異的なモノクローナル抗体と形成された複合体のレベルを測定する工程
を含み、試料中のGGELのレベルが、GGELに特異的なモノクローナル抗体と形成された複合体のレベルから推定される方法に関する。
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従ったGGELに特異的なモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイで測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象におけるアポトーシスをモニタリングする工程
を含む方法に関する。
a)アポトーシス誘導処置を受けている対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、請求項4に記載の方法で測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に増大すれば、アポトーシス誘導処置が有効であると推定し、又は遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは低下すれば、アポトーシス誘導処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法に関する。
a)アポトーシス阻害処置を受けている対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、請求項4に記載の方法で測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に低下すれば、アポトーシス阻害処置が有効であると推定し、又は遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは増大すれば、アポトーシス阻害処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法を提供する。
a)調節不全のアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象にアポトーシス調節処置を施す工程、
b)請求項5又は9に記載のアポトーシスのモニタリング方法を実行することによって、前記処置が対象におけるアポトーシスを調節するかどうかをモニタリングする工程、及び
c)工程b)のモニタリングの結果に基づいて、アポトーシス調節処置を継続又は修正する工程
を含む方法を目的としている。
b)対照
を含む、アポトーシスのモニタリングのためのキットもまた提供される。
a)本発明に従った敗血症のエクスビボでの診断方法によって、対象における敗血症を診断する工程、及び
b)敗血症に対する治療的処置を、敗血症に罹患していると診断された対象に施す工程
を含む方法に関する。
「ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン」、「Nε-(γ-グルタミル)-リジン」、又は「GGEL」とも呼ばれる「N-ε-(γ-グルタミル)-L-リジン」は、トランスグルタミナーゼ反応によって産生され、アポトーシスに誘導された細胞の食作用の結果放出される、イソペプチドを示す。GGEL(又は遊離GGEL)は、細胞プロテアーゼによる架橋細胞タンパク質の分解の最終産物である。
GGELに特異的なモノクローナル抗体を使用して、GGELが検出されるか、又はGGELのレベルが測定される。
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSGLLLWSPWFAYWGQGTLVTVS(配列番号1)からなる重鎖(VH)の可変ドメイン、又は配列番号1に少なくとも85%同一な配列を含む。
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIKR(配列番号2)からなる軽鎖(VL)の可変ドメイン、又は配列番号2に少なくとも85%同一な配列を含む。
対象におけるアポトーシスをモニタリングするためのエクスビボでの方法であって、
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従ったGGELに対するモノクローナル抗体で測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象におけるアポトーシスをモニタリングする工程
を含む方法が提供される。
(i)対照が健康な対象若しくは健康な対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも高ければ、アポトーシスは対象において上方調節されていると判定し、若しくは、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも低ければ、アポトーシスは対象において下方調節されていると判定する、又は
(ii)対照が、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以上であれば、アポトーシスは対象において上方調節されていると判定する、又は
(iii)対照が、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以下であれば、アポトーシスは対象において下方調節されていると判定する
ことによって行われる。
a)調節不全のアポトーシス、すなわち、健康な対象と比較して上方調節された(増強した)若しくは下方調節された(低減した)アポトーシスに関連する疾患を診断すること、及び
b)アポトーシス調節物質処置、すなわち、アポトーシス誘導処置若しくはアポトーシス阻害処置の有効性をモニタリングすること
のために行うことができるか、又はそれを可能にする。
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従ったGGELに対するモノクローナル抗体で測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象が、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患しているか否かを診断する工程
を含む方法が提供される。
(i)対照が健康な対象若しくは健康な対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも高ければ、前記対象は、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患していると診断される、又は
(ii)対照が、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以上であれば、前記対象は、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患していると診断される。
- 神経変性障害、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、パーキンソン病、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、小脳変性、
- 血液学的障害、例えば、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、ホジキン病、骨髄異形成症候群、真性多血症、
- 自己免疫障害、例えば、劇症肝炎、移植片対宿主疾患、橋本病、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、
- 虚血性傷害、例えば、虚血再かん流傷害、腎梗塞、心筋梗塞、脳卒中、
- 毒素誘発性の疾患、例えば、アルコール性肝炎、肺線維症、敗血症、
- 細菌若しくはウイルス感染、例えば、HIV(AIDS)、B型肝炎ウイルス若しくはC型肝炎ウイルス、エボラウイルス、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)への感染、
- 又は、外傷性脊髄損傷、腫瘍反撃(免疫特権)
が含まれる。
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従ったGGELに対するモノクローナル抗体で測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象が、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患しているか否かを診断する工程
を含む方法もまた提供される。
(i)対照が健康な対象若しくは健康な対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも低ければ、前記対象は、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患していると診断される、又は
(ii)対照が、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以下であれば、前記対象は、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患していると診断される。
- がん、例えば、芽細胞腫、がん腫、白血病、リンパ腫、悪性神経膠腫、肉腫、精上皮腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、
- 前がん性疾患、例えば、毛細血管拡張性運動失調症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、骨髄異形成症候群、色素性乾皮症、
- 自己免疫障害、例えば、自己免疫性リンパ増殖症候群(I型及びII型)、全身性エリテマトーデス、免疫介在性糸球体腎炎、
- アテローム性動脈硬化症、
- 代謝障害、例えば、ニーマン・ピック病、骨粗しょう症、ウィルソン病、
- ウイルス感染、例えば、アデノウイルス、バキュロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスへの感染、
- 早期老化、例えば、ダウン症候群、プロジェリア、及び色素性乾皮症
が含まれる。
a)アポトーシス誘導処置を受けている対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従った方法で、特に、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイで測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に増大すれば、アポトーシス誘導処置が有効であると推定し、又は、遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは低下すれば、アポトーシス誘導処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法が提供される。
- Bcl-2等の抗アポトーシスタンパク質を阻害する作用物質、例えば、オブリメルセンナトリウム(bcl-2アンチセンス)、酪酸ナトリウム、デプシペプチド、フェンレチニド、フラボピリドール、ゴシポール、ABT-737(CAS 852808-04-9)、siRNA、又はアンチセンス標的化Bcl-2、
- p53に基づく遺伝子療法、
- Phikan083(CAS 880813-36-5)、CP-31398二塩酸塩(CAS 1217195-61-3)、ヌトリン-3(CAS 548472-68-0)等のヌトリン等での、p53に基づく薬剤療法、
- IAPSを阻害する作用物質(アポトーシスタンパク質の阻害剤:タンパク質BIRC1〜8、スルビビン)、例えば、siRNA又はアンチセンス標的化XIAP(BIRC4)、
- カスパーゼに基づく薬剤療法、例えばアポプチン
が含まれる。
a)アポトーシス阻害処置を受けている対象の血漿試料中の、遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、本発明に従った方法で、特に、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイで測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に低下すれば、アポトーシス阻害処置が有効であると推定し、又は遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは増大すれば、アポトーシス阻害処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法が提供される。
敗血症は、重度の感染、典型的には、肺炎又は胃腸感染又は***を伴う症候群であり、その成功裏の治療は、依然として、非常に重要な未だ解決されていない臨床的要求である。敗血症は、集中治療室(ICU)にいる患者及び入院患者の死亡の大部分を占める、先進国における主な死因である。欧州では、敗血症に毎年約75万人の患者が罹患しており(米国での統計も同様である)、死亡率は約40%である。公共医療の費用は、患者当たり1万5千から2万ユーロの間と推定され、毎年平均100億ユーロの費用となっている。
- 炎症応答に対応するSIRS、
- 感染に対する調節不全の宿主応答によって生じる、命に関わる臓器機能障害として定義される、敗血症、
- 特に大規模な循環異常、細胞異常、及び代謝異常が、敗血症単独よりも高い死亡リスクを伴う、敗血症の亜集団として定義される、敗血症性ショック。
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象が敗血症に罹患しているかどうかを判定する工程
を含む方法に関する。
(i)対照が健康な対象若しくは健康な対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも高ければ、対象が敗血症に罹患していると判定する、又は
(ii)対照が、敗血症に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以上であれば、対象が敗血症に罹患していると判定すること
によって行われる。
本発明は更に、本発明に従った、配列GYTFTSY(配列番号3)のCDR-H1、配列NPSNGG(配列番号4)のCDR-H2、配列SGLLLWSPWFAY(配列番号5)のCDR-H3、配列RASENIYSYLA(配列番号6)のCDR-L1、配列NAKTLAE(配列番号7)のCDR-L2、及び配列QHHYGTPFT(配列番号8)のCDR-L3を含む、GGELに特異的なモノクローナル抗体を含む、ラテラルフローイムノアッセイ装置に関する。
本発明はまた、それを必要とする対象における調節不全のアポトーシスに関連する疾患を治療する方法であって、
a)調節不全のアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象にアポトーシス調節処置を施す工程、
b)本発明に従ったアポトーシスのモニタリング方法を実行することによって、前記処置が対象におけるアポトーシスを調節するかどうかをモニタリングする工程、及び
c)工程b)のモニタリングの結果に基づいて、アポトーシス調節処置を継続又は修正する工程
を含む方法に関する。
a)上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象に、アポトーシス阻害処置を施す工程、
b)本発明に従ったアポトーシスのモニタリング方法を実行することによって、前記処置が対象におけるアポトーシスを阻害するかどうかをモニタリングする工程、及び
c)工程b)のモニタリングの結果が、処置が対象におけるアポトーシスを阻害することを示せば、アポトーシス阻害処置を継続する、又は、工程b)のモニタリングの結果が、処置が対象におけるアポトーシスを阻害しないことを示せば、処置を修正する工程
を含む方法に関する。
a)下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象に、アポトーシス誘導処置を施す工程、
b)本発明に従ったアポトーシスのモニタリング方法を実行することによって、前記処置が対象におけるアポトーシスを誘導するかどうかをモニタリングする工程、及び
c)工程b)のモニタリングの結果が、処置が対象におけるアポトーシスを誘導することを示せば、アポトーシス誘導処置を継続する、又は、工程b)のモニタリングの結果が、処置が対象におけるアポトーシスを誘導しないことを示せば、処置を修正する工程
を含む方法に関する。
a)本発明の敗血症の診断方法、すなわち、
i.対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを測定する工程、
ii.前記測定されたGGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
iii.対照との比較に基づいて、前記対象が敗血症に罹患しているかどうかを判定する工程
を含む方法によって、敗血症を有する疑いがある対象における敗血症を診断する工程、並びに
b)敗血症に対する治療的処置を、敗血症に罹患していると診断された対象に施す工程
を含む方法に関する。
本発明はまた、
a)本発明に従ったガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体、及び
b)対照
を含む、アポトーシスのモニタリングのためのキットに関する。
a)本発明に従ったガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体、及び
b)対照
を含む、敗血症の診断及び/又はモニタリングのためのキットに関する。
ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体の開発
材料及び方法
mAbの開発、免疫原の調製、及び免疫化レジメ。
マウスを、グルタルアルデヒドを介してキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合したガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)で免疫化し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水に対して透析した(1×(PBS))。
ハイブリドーマ細胞を、Galfre及びMilstein(1981)のいずれかの箇所に記載されている方法によって産生した。上清を、Maxisorpマイクロタイタープレートのウェルに固定化されたウシ血清アルブミン(BSA)に結合したGGELに対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によってスクリーニングした。固定化された抗原を含有するウェルを、ハイブリドーマ上清と1時間インキュベートし、その後、0.05%のTween 20を含有するPBS(PBST)中に1対2000で希釈したヤギ抗マウス(H+L)ペルオキシダーゼコンジュゲートと1時間インキュベートした。結合した抗体を、ウェルをテトラメチルベンジジン基質(TMB)と5分間インキュベートすることによって視覚化し、2NのH2SO4で反応を停止させた。吸光値を、450nmで、Spectramax i3(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)で判定した。ウェルを、各インキュベーションの間にPBSTで4回すすいだ。作業容積はウェル当たり100μLであり、対照ウェルは培養培地とインキュベートした。全てのインキュベーションは、37℃で行った。ELISAにおける抗体検出の閾値を、陰性対照の平均から決定した。
mAbのIgクラスを、市販のマウスmAbアイソタイピングキット(ISO-1)を製造者の指示に従って(Sigma社)用いて判定した。このプロジェクトのために開発された全ての抗体は、IgMであった。ハイブリドーマ細胞系を、限界希釈によってクローニングし、細胞系を非選択培地において大量に成長させ、ウシ胎児血清/ジメチルスルホキシド(92:8[容積/容積])中でゆっくりと凍結させることによって保存し、液体窒素中で保管した。
選択されたハイブリドーマを、10%ウシ胎児血清(FCS)を添加したRPMI-1640中で培養した。インキュベーター内で、37℃、5%CO2、及び95%湿度で2週間培養した後、上清を水に対して透析して、IgMを3回沈殿させた。2000gで30分間、+4℃での遠心分離の後、ペレットを、1MのNaClを添加した20mMのリン酸緩衝液、pH8.00中で再懸濁した。次いで、PBSに対する透析を3回行った。沈殿した抗体の濃度を、Spectradrop(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)を用いて280nmでの吸光度を使用して計算した。
選択された各ハイブリドーマの特異性を検証するために、イソペプチド(GGEL)を模倣する抗原性タンパク質を、以下のように合成した。
選択されたクローンを、クローンの特性を判定するために、競合ELISA試験を使用して試験した。したがって、BSA-GGELを、マイクロタイタープレート上に、重炭酸塩緩衝液、pH9.50中に10μg/mLの濃度で吸着させた。ある濃度の精製抗体(2μg/mLの1G1h1、又は0.5μg/mLのAB424)を、5μg/mLの開始濃度で段階的に2倍ずつ希釈された、Table 3(表3)及びTable 4(表4)の各競合抗原性タンパク質とインキュベートした。37℃で1時間インキュベートした後、マイクロタイタープレートを洗浄し、ヤギ抗マウス(H+L)ペルオキシダーゼコンジュゲートを30分間、37℃で添加した。TMBを5分間使用して顕色を行い、2NのH2SO4を使用して反応を停止させた。吸光値を、450nmで、Spectramax i3(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)で判定した。ウェルを、各インキュベーションの間にPBSTで4回すすいだ。作業容積はウェル当たり100μLであり、対照ウェルは培養培地とインキュベートした。各抗原性タンパク質の比較は、最初のシグナル(いかなる競合物質も伴わない)の50%の阻害濃度を計算することによって行った。
配列
1G1h1モノクローナル抗体でのガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)の定量
材料及び方法
競合ELISAによるGGELの定量。競合ELISA。
BSA-GGELを、50mMの重炭酸塩溶液、pH9.50中に10μg/mLの濃度で、マイクロタイタープレート上に吸着させた。プレートを一晩、実験室温度でインキュベートした。飽和を、0.5%BSA及び5%ショ糖を添加した0.1Mのリン酸緩衝液で行った(図3、工程1)。希釈した試料を、抗体溶液の存在下で1時間、37℃で添加し、正確な数のGGELが「被覆された」BZGOを2倍ずつ希釈し、標準として使用した(図3、工程2及び工程3)。PBSTで3回洗浄した後、PBST中に1:2000で希釈した二次抗体を、30分、37℃でインキュベートした。TMBを5分間使用して顕色を行い、2NのH2SO4を使用して反応を停止させた(図3、工程4)。吸光値を、450nmで、Spectramax i3(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)で判定した。GGELの定量を、GrapPad Prismバージョン5.0(GraphPad software社、San Diego、USA)を使用して4パラメータ行にプロットされた標準を使用して行った。結果の正値性の閾値を、3.33標準偏差に加えられたブランクの平均を考慮して決定した。
1G1h1抗体を、競合ELISAによるGGELの定量に使用した。既知量のGGELを伴うBSA(BZGO)に結合した標準化されたN-アルファ-Cbz-グルタミン酸メチルエステル(Z-GluOme)を、GGELの定量のための標準として使用した。図2は、SoftMax Pro 6.5を使用して4-パラメータ行を使用して計算されたGGEL濃度の定量についての標準曲線を示す。
アポトーシス性の細胞によって放出される遊離GGELのインビトロでの検出
材料及び方法
細胞系。
アポトーシス誘導に使用した細胞系は、ヒト前骨髄球性白血病細胞HL-60であった。HL-60を、10%ウシ胎児血清(FCS)、1%ストレプトマイシン/ペニシリン、及び200mMのL-グルタミンを添加したRPMI培地において培養した。
細胞を、先に記載した細胞培養培地において1×10E6細胞/mLで播種した。アポトーシスの誘導を、1μmol/Lの濃度のスタウロスポリンを使用して8時間行った。スタウロスポリンは、ストレプトマイセス・スタウロスポレサ(Streptomyces staurosporesa)の培養液から単離されたアルカロイドである。これは、強力な、細胞膜透過性タンパク質キナーゼC阻害剤、並びにPKA、PKG、CAMKII、及びミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)等の他のキナーゼである。0.2〜1μMで、スタウロスポリンは、細胞アポトーシスを誘導する。処理後、細胞を800gで10分間遠心分離し、上清をGGELの定量に使用した。
競合ELISAによるGGELの定量。競合ELISA。BSA-GGELを、50mMの重炭酸塩溶液、pH9.50中に10μg/mLの濃度で、マイクロタイタープレート上に吸着させた。プレートを一晩、実験室温度でインキュベートした。飽和を、0.5%BSA及び5%ショ糖を添加した0.1Mのリン酸緩衝液で行った(図3、工程1)。細胞上清を、抗体溶液の存在下で1時間、37℃で添加し、正確な数のGGELが「被覆された」BZGOを2倍ずつ希釈し、標準として使用した(図3、工程2及び工程3)。PBSTで3回洗浄した後、PBST中に1:2000で希釈した二次抗体を、30分、37℃でインキュベートした。TMBを5分間使用して顕色を行い、2NのH2SO4を使用して反応を停止させた(図3、工程4)。吸光値を、450nmで、Spectramax i3(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)で判定した。GGELの定量を、GrapPad Prismバージョン5.0(GraphPad software社、San Diego、USA)を使用して、4パラメータ行にプロットされた標準を使用して行った。
値は、平均±SD又は頻度及び割合として表す。群間の差は、必要に応じて、独立T検定、カイ二乗検定、フィッシャーの正確確率検定、又はANOVAによって判定した。P<0.05を統計的に有意であると見なした。分析は、GraphPad prismバージョン5.0(GraphPad software社、San Diego、California、USA)を使用して行った。
図3は、スタウロスポリンによるアポトーシスの誘導後の、又はスタウロスポリン処理なしでの、HL-60細胞における1G1h1抗体でのGGELの定量の結果を示す。アポトーシスに誘導されたHL-60細胞におけるGGEL濃度は、アポトーシスに誘導されなかったHL-60細胞と有意に異なった。
早期敗血症のバイオマーカーとしてのガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)の同定
材料及び方法
本発明者らは、血漿中のGGELが酵素イムノアッセイ(EIA)で測定可能か否かを判定することを試みた。このプロトコルは、1/20で希釈した血漿試料でのGGEL定量競合EIA(実施例2及び実施例3を参照されたい)に基づくものであった。10人の健康な個体の対照血漿試料を、正常な血漿中のGGELのバックグラウンドレベルを決定するために使用した。試験は、11人の患者から1日目及び3日目に得た22の敗血症試料で行った。1日目は、患者が入院した日であり、発熱及びSIRSの症候性の特徴が検出された(table 1(表1)を参照されたい)。陽性試験を陰性試験から区別するために、カットオフ値を10の対照血漿試料から計算した。
GGEL濃度の有意な増強がブランク試料と比較して群D+1及び群D+3で観察されたため、この試験を使用して、敗血症の血漿がブランク血漿から区別され得ることが実証された(図4)。したがって、GGELの存在は、早期敗血症の有効なバイオマーカーである。
異なる病状におけるガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)の投与
材料及び方法
試料
血漿を、フランス、パリのラリボワジエール病院のCentre de Ressources Biologiquesから入手した。入院時T1、及び退院時T2の2つの異なる時点で、心不全/呼吸器不全(HRF)(n=106)、外傷(n=90)、敗血症性ショック(n=130)、又は重度の敗血症(n=38)の4つの異なる臨床的病状に相当する364の血漿試料を得た。
抗原BSA-GGELを、50mMの重炭酸塩溶液、pH9.50を有するマイクロタイタープレート上に吸着させた。プレートを一晩、室温でインキュベートした。飽和を、0.5%BSA及び5%ショ糖を添加した0.1Mのリン酸緩衝液で行った。希釈された試料を、抗GGEL抗体溶液の存在下で1時間、37℃で添加し、正確な数のGGELが「被覆された」BZGOを2倍ずつ希釈し、標準として使用した。PBSTで3回洗浄した後、TMBを10分間使用して顕色を行い、2NのH2SO4を使用して反応を停止させた。吸光値を、450nmで、Spectramax i3(登録商標)自動マイクロプレートリーダー(Molecular Devices社、Sunnydale、USA)で判定した。GGELの定量を、SoftMaxPro 6.5.1(Molecular Devices社、Sunnydale、California、USA)を使用して片対数線にプロットされた標準を使用して行った。
変数を記述統計によって分析して、そのケースの臨床的特徴を評価した。全ては平均±S.D.として報告し、分散の一方向分析を使用して分析して、研究対象の試料間の何らかの統計上の差の存在を推定した。両側の確率値を表に列挙し、統計的有意性のレベルをp<0.05と設定した。全ての統計分析は、GraphPad Prismバージョン5.0(GraphPad software社、San Diego、California、USA)又はJMPソフトウェアバージョン12(SAS Institute Inc.社、Cary、North Carolina、USA)を用いて行った。
異なる病状間のGGEL濃度の比較
血漿中のGGEL濃度のレベルは、他よりも外傷群において有意に高かった(p<0.01)。正常試料(22μmol.L-1)よりも高いレベルのGGEL濃度が、敗血症性ショック試料(39.29μmol.L-1)及び重度の敗血症試料(28.47μmol.L-1)で見られたが、結果は有意ではなかった(図7)。
GGELのレベルは、外傷においてT1からT2で有意に増大し、T1の平均45.61±19.72から111.14±24μmol.L-1まで増大した(図8)。他の病状では、血漿中のGGEL濃度の有意ではない増大が見られた。
各患者の血漿で、GGEL濃度の変化を、ΔGGEL=[GGEL]T2-[GGEL]T1として計算した。病状毎のΔGGELの平均を分析し、結果は、外傷及び敗血症性ショックではそれぞれ38.75±22.78及び21.58±10.2μmol.L-1であり、HRF及び重度の敗血症よりも高かった(Table 9(表9))。しかし、異なる病状間で有意ではない結果が認められた。
2 検出区域
3 試験領域
4 対照領域
5 吸収パッド
6 試料パッド
7 試料ポート
8 ハウジング
9 コンジュゲートパッド
10 試験ライン
11 対照ライン
Claims (16)
- 配列番号3の配列のCDR-H1、配列番号4の配列のCDR-H2、配列番号5の配列のCDR-H3、配列番号6の配列のCDR-L1、配列番号7の配列のCDR-L2、及び配列番号8の配列のCDR-L3を含む、ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的な単離モノクローナル抗体。
- 配列番号1の配列の重鎖の可変ドメイン、又は配列番号1に少なくとも85%同一な配列を含む、請求項1に記載の単離モノクローナル抗体。
- 配列番号2の配列の軽鎖の可変ドメイン、又は配列番号2に少なくとも85%同一な配列を含む、請求項1又は2に記載の単離モノクローナル抗体。
- 試料中のガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)のレベルを測定するための方法であって、
a)試料と、請求項1から3のいずれか一項に記載のGGELに特異的なモノクローナル抗体とを接触させる工程、及び
b)GGELに特異的なモノクローナル抗体と形成された複合体のレベルを測定する工程
を含み、試料中のGGELのレベルが、GGELに特異的なモノクローナル抗体と形成された複合体のレベルから推定される方法。 - 対象におけるアポトーシスのモニタリングのためのエクスビボでの方法であって、
a)対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイで測定する工程、
b)前記測定された遊離GGELのレベルと対照とを比較する工程、及び
c)対照との比較に基づいて、前記対象におけるアポトーシスをモニタリングする工程
を含む方法。 - 対照との比較に基づいて、前記患者におけるアポトーシスをモニタリングする工程が、
(i)対照が健康な対象若しくは健康な対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも高ければ、アポトーシスは対象において上方調節されていると判定し、若しくは、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが対照の遊離GGELレベルよりも低ければ、アポトーシスは対象において下方調節されていると判定する、又は
(ii)対照が、上方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以上であれば、アポトーシスは対象において上方調節されていると判定する、又は
(iii)対照が、下方調節されたアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象若しくは対象集団に由来する場合、対象の血漿試料中の遊離GGELのレベルが、対照の遊離GGELレベル以下であれば、アポトーシスは対象において下方調節されていると判定する
ことによって行われる、請求項5に記載の方法。 - アポトーシスのモニタリングが、調節不全のアポトーシス、すなわち、上方調節された又は下方調節されたアポトーシスに関連する疾患の診断を可能にする、請求項5又は6に記載の方法。
- アポトーシスのモニタリングが、敗血症の診断を可能にする、請求項7に記載の方法。
- 遊離GGELのレベルが、ELISA、間接イムノアッセイ、競合イムノアッセイ、又はサンドイッチイムノアッセイによって測定される、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
- アポトーシスのモニタリングのための、請求項1から3のいずれか一項に記載のガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体の使用。
- 対象におけるアポトーシス誘導処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
a)アポトーシス誘導処置を受けている対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、請求項4に記載の方法で測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に増大すれば、アポトーシス誘導処置が有効であると推定し、又は遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは低下すれば、アポトーシス誘導処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法。 - 対象におけるアポトーシス阻害処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
a)アポトーシス阻害処置を受けている対象の血漿試料中の遊離ガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)イソペプチドのレベルを、請求項4に記載の方法で測定する工程、
b)工程a)の測定を適時に反復する工程、及び
c)遊離GGELのレベルが経時的に低下すれば、アポトーシス阻害処置が有効であると推定し、又は遊離GGELのレベルが経時的に不変であるか若しくは増大すれば、アポトーシス阻害処置が有効ではないと推定する工程
を含む方法。 - それを必要とする対象における調節不全のアポトーシスに関連する疾患を治療する方法であって、
a)調節不全のアポトーシスに関連する疾患に罹患している対象にアポトーシス調節処置を施す工程、
b)請求項5又は9に記載のアポトーシスのモニタリング方法を実行することによって、前記処置が対象におけるアポトーシスを調節するかどうかをモニタリングする工程、及び
c)工程b)のモニタリングの結果に基づいて、アポトーシス調節処置を継続又は修正する工程
を含む方法。 - a)請求項1から3のいずれか一項に記載のガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体、及び
b)対照
を含む、アポトーシスのモニタリングのためのキット。 - それを必要とする対象における敗血症を治療する方法であって、
a)請求項8に記載の敗血症のエクスビボでの診断方法によって、対象における敗血症を診断する工程、及び
b)敗血症に対する治療的処置を、敗血症に罹患していると診断された対象に施す工程
を含む方法。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載のガンマ-グルタミル-L-イプシロン-リジン(GGEL)に特異的なモノクローナル抗体を含む、ラテラルフローイムノアッセイ装置。
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