JP2013143917A

JP2013143917A - 線維症予防又は治療剤

Info

Publication number: JP2013143917A
Application number: JP2012005204A
Authority: JP
Inventors: Esteban Gabazza; エステバンガバザ; Satoru Kobayashi; 哲小林; Shuichi Toyofuku; 秀一豊福; Ayako Fukuda; 綾子福田; Tetsuya Hasegawa; 哲也長谷川
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Mie University NUC
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd; Mie University NUC
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2013-07-25

Abstract

【課題】線維症を治療するために有効なｓｉＲＮＡ及びこれを用いた医薬の提供。
【解決手段】ヒトＳｍａｄ３のｍＲＮＡの塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに特定な塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。
【選択図】なし

Description

本発明は、線維症治療剤に関する。具体的には、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１をコードする遺伝子を標的とするsmall interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）及びそれを用いた医薬に関する。

肺線維症とは、過剰なコラーゲンと他の細胞外マトリックスの蓄積により肺組織が線維化した症状をいう。肺線維症の中でも、特発性肺線維症は、中間生存期間平均３年で、５年生存率が２０〜４０％の予後不良の慢性難治性疾患である。肺線維症の治療としては、ステロイド剤や免疫抑制剤が用いられているが、予後を改善するような効果的な治療法は無いのが現状であり、新たな治療薬の開発が望まれている。

近年、多くの疾患が遺伝子を原因として発症することが明らかにされているが、肺線維症についても、多くの遺伝子の関与が報告されている（特許文献１−４，非特許文献１−６）。肺線維症に関与する主要な因子として、Ｓｍａｄ３（非特許文献１）、ＭＣＰ−１（特許文献３）、ＴＧＦ−β１（特許文献１−２，非特許文献２−６）等が報告されている。

一方、核酸、特にｓｉＲＮＡは、細胞に存在する特定の配列と同一あるいはほぼ同一な遺伝子のｍＲＮＡの分解を惹起し、標的遺伝子の発現を阻害する（ＲＮＡ干渉）。従って、ＲＮＡ干渉による標的遺伝子の発現阻害機能は、特定の遺伝子あるいは遺伝子群の異常な発現により惹起される疾患症状を軽減あるいは治療する上で有用である。肺線維症関連遺伝子についても、ｓｉＲＮＡを用いて当該遺伝子の発現抑制を試みた報告がなされている（特許文献１−４、非特許文献１−６）。

しかしながら、これまでに報告されている技術は、実験動物（マウスやラット）の疾患関連遺伝子に対するｓｉＲＮＡ配列の抑制効果を示したのみで、ヒト遺伝子に特異的な効果を十分に示したものではない。また、ｓｉＲＮＡの抑制効果についても、２００ｎＭ（非特許文献１），２０−５００ｎＭ（非特許文献５）における効果を示しているが、効率よく低濃度において肺線維症関連遺伝子の発現を抑制しうる核酸分子については示されていない。

Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡについては、これまでに数十種のｓｉＲＮＡが報告されているが（特許文献１、５−７）、Ｓｍａｄ３の遺伝子の全長は６２５６塩基（GeneBank Accession No. NM_005902.3）、ＭＣＰ−１の遺伝子の全長は７５７塩基（GeneBank Accession No. NM_002982.2）であり、当該遺伝子の全長から約２０ｍｅｒ程度の配列を選び出す組み合わせは無数に存在することから、その中から当該遺伝子の発現をより効率的に抑制できるｄｓＲＮＡやｓｉＲＮＡ分子を設計することは、容易なことではない。

国際公開第２００７／１０９０９７号パンフレット国際公開第２００３／０３５０８３号パンフレット特開２００７−１１９３９６号公報特表２００９−５１６５１７号公報国際公開第２００９／０６１４１７号パンフレット国際公開第２００８／１０９５４８号パンフレット国際公開第２００７／７９２２４号パンフレット

Wang Z, Gao Z, Shi Y, Sun Y, Lin Z, Jiang H, Hou T, Wang Q, Yuan X, Zhu X, Wu H, Jin Y, J Plast Reconstr Aesthet Surg, 1193-1193, 60, 2007 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, Jeon JP, Lee TS, Oh HK, Lee YS, Park KK, Exp Mol Pathol, 48-54, 81, 2006 Takabatake Y, Isaka Y, Mizui M, Kawachi H, Shimizu F, Ito T, Hori M, Imai E, Gene Ther, 965-973, 12, 2005 Xu W, Wang LW, Shi JZ, Gong ZJ, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 300-308, 8, 2009 Liu XJ, Ruan CM, Gong XF, Li XZ, Wang HL, Wang MW, Yin JQ, Biotechnol Lett, 1609-1615, 27, 2005 福本重太郎, 末次彩子, 原田知佳, 河口知允, 濱田直樹, 前山隆茂, 桑野和善, 中西洋一, 日本呼吸器学会雑誌, 185, 46, 2008

本発明は、線維症を治療するために有効なｓｉＲＮＡ及びこれを用いた医薬を提供することに関する。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ヒトＳｍａｄ３遺伝子またはヒトＭＣＰ−１遺伝子を標的とする特定のｓｉＲＮＡが、ヒト細胞においてＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現を効果的に抑制できることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に係るものである。
１）配列番号１の塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに配列番号２の塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。
２）ｓｉＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｒ）から選ばれる上記１）のｓｉＲＮＡ。
（ａ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｃ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｄ）配列番号９に示されるセンス配列と配列番号１０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｅ）配列番号１１に示されるセンス配列と配列番号１２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｆ）配列番号１３に示されるセンス配列と配列番号１４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｇ）配列番号１５に示されるセンス配列と配列番号１６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｈ）配列番号１７に示されるセンス配列と配列番号１８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｉ）配列番号１９に示されるセンス配列と配列番号２０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｊ）配列番号２１に示されるセンス配列と配列番号２２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｋ）配列番号２３に示されるセンス配列と配列番号２４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｌ）配列番号２５に示されるセンス配列と配列番号２６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｍ）配列番号２７に示されるセンス配列と配列番号２８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｎ）配列番号２９に示されるセンス配列と配列番号３０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｏ）配列番号３１に示されるセンス配列と配列番号３２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｐ）配列番号３３に示されるセンス配列と配列番号３４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
３）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）又は２）のｓｉＲＮＡ。
４）前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）−３）のｓｉＲＮＡ。
５）前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換され、且つアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された上記１）−４）のｓｉＲＮＡ。
６）アンチセンス鎖の５’末端がモノリン酸化された上記１）〜５）のｓｉＲＮＡ。
７）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物。
８）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有するＳｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子発現抑制剤。
９）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する線維症予防又は治療剤。
１０）上記１）〜６）のいずれかのｓｉＲＮＡを有効成分として含有する肺線維症予防又は治療剤。

本発明のｓｉＲＮＡは、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現を低濃度で効率よく抑制又は阻害することができるので、線維症の予防又は治療のための医薬として有用である。

ｓｉＲＮＡによるＳｍａｄ３ｍＲＮＡの発現抑制率を示すグラフ。ｓｉＲＮＡによるＭＣＰ−１ｍＲＮＡの発現抑制率を示すグラフ。

本発明のｓｉＲＮＡが標的とする配列は、配列番号１の塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに配列番号２の塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基であるが、ここで、各群から選ばれる連続する１７〜２１塩基としては、好ましくは１９〜２１塩基であり、より好ましくは２１塩基である。
配列番号１で示される塩基配列は、Ｓｍａｄ３のｍＲＮＡの塩基配列であり、当該配列情報はＧｅｎＢａｎｋに、GeneBank Accession No. NM_005902.3として、配列番号２で示される塩基配列は、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡの塩基配列であり、当該配列情報はＧｅｎＢａｎｋに、GeneBank Accession No. NM_002982.2として、登録されている。

本発明のｓｉＲＮＡは、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１のｍＲＮＡの上記標的配列に相補的な配列であるアンチセンス鎖と当該アンチセンス鎖に相補的な配列であるセンス鎖がハイブリダイズしてなるものであり、当該Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１のｍＲＮＡを切断する活性（ＲＮＡ干渉作用）を有し、当該ｍＲＮＡの翻訳を阻止する能力、すなわち当該Ｓｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子の発現を阻害する能力を有する。

本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド長は、センス鎖、アンチセンス鎖が同一のヌクレオチド長であっても異なっていてもよく、その全長は３０ヌクレオチド以下であり、好ましくは２５ヌクレオチド以下、より好ましくは２３ヌクレオチド以下、或いは２１ヌクレオチドである。
また、センス鎖及びアンチセンス鎖の両端は、平滑末端でもよいし、それぞれの鎖の３’側がオーバーハング（突出末端）であっても良い。ここで、「平滑末端」とは、２本鎖ＲＮＡの末端部分において、センス鎖の末端領域とそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域が、１本鎖部分を形成することなく対合している構造を意味する。また、「オーバーハング」は、ダングリングエンドとも称され、２本鎖ＲＮＡの末端部分のセンス鎖の末端領域又はそれに対合するアンチセンス鎖の末端領域において、対合する塩基が存在しないために２本鎖を形成できず、１本鎖部分（突出末端）が存在している構造を意味する。
突出末端部分の塩基数は１〜１０ヌクレオチドであり、好ましくは１〜４ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１〜２ヌクレオチドである。尚、突出末端の長さは二つの鎖の間で無関係であり、互いに異なる長さであっても良い。突出末端部分のヌクレオチドはＲＮＡでも、ＤＮＡでもよく、標的であるＳｍａｄ３のｍＲＮＡまたはＭＣＰ−１のｍＲＮＡに相補的な塩基が好ましいが、上記ＲＮＡ干渉能を保持する限り相補的でない塩基であってもよい。

本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別個の鎖から構成される１つの二本鎖ＲＮＡである他、１本の鎖がステムループ構造をとることにより形成される二本鎖ＲＮＡであってもよい。すなわち、本発明のｓｉＲＮＡには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡ、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。さらには、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端及びセンス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両端に２〜４ヌクレオチドからなるループを形成したＲＮＡも含まれる。

本発明のｓｉＲＮＡと標的配列は、同一であることが望ましいが、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる範囲において、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。具体的には、本発明のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と標的配列がハイブリダイズする限り、１又は数個（例えば、２、３、４個）のミスマッチがあってもよい。すなわち、本発明のｓｉＲＮＡには、標的配列に対して１又は数個の塩基が置換、付加若しくは欠失したものであってＲＮＡ干渉を誘導できるもの、或いは標的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、且つＲＮＡ干渉を誘導できるものが包含される。
尚、この場合のハイブリダイズ条件は、本発明のｓｉＲＮＡを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｉＲＮＡを試薬としてｉｎｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件又は高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃〜70℃で12〜160時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。これらの条件については、当業者に周知であり、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 1989)に記載されている。
また、配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))等によって計算すればよく、例えば、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ver.5.1.1；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。

また、本発明のｓｉＲＮＡには、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、センス鎖又はアンチセンス鎖の何れか一方のヌクレオチドを全てＤＮＡに変換したもの（ハイブリッド型）や、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したもの（キメラ型）が包含される。
ここで、ＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡへの変換とは、ＡＭＰをｄＡＭＰへ、ＧＭＰをｄＧＭＰへ、ＣＭＰをｄＣＭＰへ、ＵＭＰをｄＴＭＰへ変換することを意味する。
ハイブリッド型としては、センス鎖のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが好ましい。キメラ型としては、下流側（センス鎖の３’末端側、アンチセンス鎖の５’末端側）の一部のヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。具体的には、センス鎖の３’末端側及びアンチセンス鎖の５’末端側のヌクレオチドを共にＤＮＡに変換したもの、センス鎖の３’末端側又はアンチセンス鎖の５’末端側の何れかのヌクレオチドをＤＮＡに変換したものが挙げられる。また、変換するヌクレオチド長は、ＲＮＡ分子の１／２に相当するヌクレオチドまでの任意長とするのが好ましく、例えば末端から１〜１３ヌクレオチド、好ましくは１〜１０ヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡ干渉効果、ＲＮＡ分子の安定性、安全性等の点から、好適なキメラ型ｓｉＲＮＡとしては、例えばヌクレオチド長がそれぞれ１９〜２１であり、センス鎖の３’末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’末端側から１〜１０、好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが挙げられる（後記〔表２〕参照）。また、この場合、センス鎖（オーバーハングヌクレオチドを除く）とアンチセンス鎖のＤＮＡ変換数は同一であるのがより好ましい。

また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ＲＮＡ干渉を誘導できる限り、そのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）が、糖、塩基及び／又はリン酸塩が化学修飾されたヌクレオチド類似体であっても良い。塩基が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、５位修飾ウリジン又はシチジン（例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、５−メチルオキシウリジン等）；８位修飾アデノシン又はグアノシン（例えば、８−ブロモグノシン等）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン等）；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン等）等が挙げられる。
また、糖が修飾されたヌクレオチド類似体としては、例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン原子、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ₂、ＮＨＲ、ＮＲ₂、もしくはＣＮ（ここで、Ｒは炭素数１−６のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を示す）等によって置換された２’位糖修飾、５’末端がモノリン酸化された５’末端リン酸化修飾が挙げられる。
リン酸塩が修飾されたヌクレオチド類似体としては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

また、本発明のｓｉＲＮＡは、上記ヌクレオチド類似体とは別に、センス鎖の５’末端側又は３’末端側から１〜６番目のヌクレオチド（５’末端、３’末端、又は末端以外の内部の塩基、糖）の少なくとも１つに特定の置換基又は機能性分子が直接又はリンカーを介して結合していてもよく、センス鎖の５’末端側から１〜６番目、好ましくは１〜４番目のヌクレオチドの少なくとも１つに当該置換基又は機能性分子が結合しているのが好ましい。
ここで、置換基としては、一例として、アミノ基；メルカプト基；ニトロ基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルキル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアミノアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のチオアルコキシル基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のモノ若しくはジアルキルアミノ基；炭素数１〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のアルキルチオ基；炭素数２〜４０（好ましくは２〜２０、更に好ましくは４〜１２）のポリエチレンオキサイド基；炭素数３〜３９（好ましくは３〜２１、更に好ましくは３〜１２）のポリプロピレンオキサイド基等を挙げることができる。これらの置換基を結合させることによって、ＲＮＡ干渉効果を顕著に増強させることが可能になる。

機能性分子としては、糖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｔＲＮＡを含む）、アプタマー、修飾ヌクレオチド、低分子有機・無機材料、コレステロール、デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。機能性分子を付加することにより、優れたＲＮＡ干渉効果と当該機能性分子に基づく有用効果を兼ね備えさせることができる。

上記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。

上記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、インポーチンbタンパク質、アビジン、抗体等を挙げることができる。

上記ＤＮＡとしては、具体的には、塩基長が５〜５０のＤＮＡ、好ましくは塩基長が５〜２５のＤＮＡが例示される。

上記ペプチドとしては、例えば、オクタアルギニンペプチドＲ８、核局在化シグナルペプチド配列（ＨＩＶ−１ＴａｔやＳＶ４０Ｔ抗原等）、核外移行性シグナルペプチド（ＨＩＶ−１ＲｅｖやＭＡＰＫＫ等）、細胞膜融合ペプチド等が挙げられる。上記修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型ＤＮＡ／ＲＮＡ等のリン酸骨格を修飾したもの；２’−０Ｍｅ修飾ＲＮＡ、２’−Ｆ修飾ＲＮＡ等の２’修飾ヌクレオチド；ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）やＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチドなどが挙げられる（国際公開第２００８／１４０１２６号パンフレット、国際公開第２００９／１２３１８５号パンフレット参照）。

上記低分子有機・無機材料としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光物質；ビオチン；量子ドット；金微粒子等が挙げられる。上記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。上記脂質としては、例えば、リノール酸、ＤＯＰＥ（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）等の他、国際公開第２００９／１２３１８５号パンフレットに記載の２つの疎水基を有する２本鎖脂質が挙げられる。上記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げられる。

ここで、機能性分子を有する基としては、機能性分子の残基そのものであってもよく、また、機能性分子の残基に二官能性リンカーの一方の官能基が結合した基であってもよい。つまり、前者の場合、機能性分子が、上記センス鎖ＲＮＡの所定の部位に直接結合しており、後者の場合、機能性分子が二官能性リンカーを介して上記センス鎖ＲＮＡの所定の部位に結合している。ここで、二官能性リンカーとしては、官能基を２つ含むリンカーであれば特に制限されないが、例えば、N-スクシニミジル＝3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)−１−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-(5-アミノペンチル)-イミノジアセテックアシッド等を使用できる。
上記センス鎖ＲＮＡにおける、置換基若しくは機能性分子又はこれらを連結するリンカーの結合部位については、特に限定されるものではないが、これらがセンス鎖ＲＮＡの所定のヌクレオチドのリン酸部分の水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していることが好ましい。

本発明のｓｉＲＮＡは、具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｑ）に示すセンス配列とアンチセンス配列とから形成される二本鎖ＲＮＡ分子が例示できる。

また、キメラ型としては、センス鎖の３’末端側から１〜８のヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’末端側から１〜６のヌクレオチドを任意数、連続してＤＮＡに変換したものが好適に挙げられ、例えば上記の（ｃ）の場合を用いて例示すれば以下のとおりである。

本発明のｓｉＲＮＡの製造方法は、特に限定されないが、公知の製造方法、例えば、in vitroで化学的に合成すること、又はプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系により合成することができる。
化学的合成は、ｓｉＲＮＡ構成要素である核酸分子を含むアミダイド樹脂を原料として、核酸合成装置により合成することが可能である。
転写系による合成は、ヘアピン型ＲＮＡをトリミングする試験管内転写法により２本鎖ＲＮＡを合成することが可能である。

斯くして得られる本発明のｓｉＲＮＡは、後記実施例に示すように、ヒト肺胞上皮由来細胞においてＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現をｍＲＮＡレベルで効果的に抑制することができる。
従って、本発明のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡを投与対象内で発現可能な発現ベクターは、Ｓｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子発現抑制のための医薬、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の過剰発現に起因する疾患、例えば線維症および/または肺がんの予防・治療のための医薬、すなわち線維症および/または肺がんの予防又は治療剤として有用である。
ここで、肺の線維化を来たす疾患としては、間質性肺炎、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD: Chronic obstructive pulmonary disease）、急性呼吸促迫症候群 (ARDS: Acute respiratory distress syndrome）、炎症性肺疾患、肺感染症、放射性肺臓炎、薬剤性間質性肺炎、膠原病に伴う間質性肺炎など多岐にわたるが、原因が特定できない間質性肺炎である特発性間質性肺炎(IIPs)のうち特発性肺線維症 (IPF) が特に好ましい。特発性間質性肺炎（IIPs）には臨床病理学的疾患として、特発性肺線維症（IPF）、非特異的間質性肺炎 (NSIP)、特発性器質化肺炎 (COP/BOOP)、急性間質性肺炎 (AIP)、剥離性間質性肺炎 (DIP)、呼吸細気管支炎に伴う間質性肺疾患 (RB-ILD)、リンパ球性間質性肺炎 (LIP)等が包含される。

本発明のｓｉＲＮＡを医薬として使用する場合、そのままでも使用することができるが、高度分岐環状シクロデキストリン又はシクロアミロースと複合体を形成させてもよい。ここで、高度分岐環状デキストリンとは、枝作り酵素をアミロペクチンに作用させて生産されるものであり、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度５０〜５０００のグルカンをいう。ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である。高度分岐環状デキストリンの好適な形態として、上記グルカンの内分岐環状構造部分の重合度が１０〜１００であるもの、上記グルカンの外分岐構造部分の重合度が４０以上であるもの、上記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が平均で１０から２０であるものが例示される。また、高度分岐環状シクロデキストリンは市販されており、本発明では市販品を使用することもできる。
シクロアミロースは、グルコースがα１，４結合により結合した環状α−１，４−グルカンであり、へリックス構造の内側に立体的で奥行きのある空洞部分を有している。本発明に使用されるシクロアミロースにおけるグルコースの重合度としては、特に制限されるものではないが、例えば１０〜５００、好ましくは１０〜１００、更に好ましくは２２〜５０が例示される。シクロアミロースは、アミロマルターゼ等の酵素を利用して、グルコースから調製することができる。また、シクロアミロースは市販されており、本発明では市販品を使用することもできる（国際公開第２００９／６１００３号パンフレット参照）。

本発明のｓｉＲＮＡは、１以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて常法により、医薬組成物として製剤化することができる。当該医薬組成物は、経肺投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、注射等の何れの投与形態の組成物であってもよく、投与は全身性又は局所的のいずれでもよい。その剤形は、その投与経路に応じて、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、坐剤、エアロゾル、スプレーなど、使用に適したいかなるものでもよい。

例えば、経鼻投与では、有効成分を、適当な溶媒（生理食塩水、アルコールなど）に溶解し、その溶液を鼻に注入又は点鼻することによって送達することができる。あるいは、経肺投与又は経鼻投与では、有効成分を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレーを噴出させる形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送達されるように弁を設けることにより決定することができる。更に粉末吸入剤としての投与も可能である。

注射の場合、有効成分は、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に溶剤として処方することができ、好ましくはハンクス液やリンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することができる。この溶剤は、懸濁剤や安定剤、及び／又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有してよい。あるいは有効成分は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの適切な賦形剤と共に再構成するために、粉末形態にすることができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。

経口投与する場合には、本発明の治療剤は、例えば錠剤、顆粒、散剤、乳剤、カプセル、シロップ、水性又は油性懸濁液、又はエリキシルの形態であり得る。錠剤又は丸薬形態の場合は、胃腸管内での分散及び吸収を遅延させ、それにより長時間持続した作用をもたらすために、組成物をコーティングすることができる。

薬学的に許容される担体又は賦形剤としては、限定されるものではないが、液体（例えば水、油、生理食塩水、デキストロース水溶液、エタノールなど）、固体（例えばアカシアガム、ゼラチン、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、タルク、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、ケラチン、コロイド状シリカ、乾燥脱脂乳、グリセロールなど）が挙げられる。また、本発明の治療剤は、通常の医薬組成物に配合される補助剤、防腐剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、乳化剤、及びｐＨ緩衝剤などのうち適当なものを含有してもよい。

本発明の医薬組成物には、本発明のｓｉＲＮＡを、０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、有効量を適用すれば特に制限されないが、例えば、体重１ｋｇあたり、好ましくは０．０００１〜１００ｍｇであり、更に好ましくは０．００２〜１ｍｇである。

本発明の医薬組成物においては、本発明のｓｉＲＮＡに換えて、投与対象内で当該ｓｉＲＮＡを発現可能な発現ベクターを用いることも可能である。
この場合の発現ベクターは、例えば、本発明のｓｉＲＮＡをコードすることができるＤＮＡを、適当な遺伝子治療用ベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等に挿入することにより構築することができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ｓｉＲＮＡの作製
下記表３に示されるＳｍａｄ３遺伝子またはＭＣＰ−１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子を設計し、各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成法によって合成し、ＨＰＬＣ精製法にて精製して使用した。

実施例２Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現抑制効果の評価（in vitro）
（１）細胞
ヒト肺胞上皮由来のＡ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いた。

（２）培養条件
１×１０⁵個の細胞を１０％牛胎児血清含有のＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's modified Eagle's Medium, 100 unit/mLペニシリン, 100 μg/mLストレプトマイシン含有）を１２ウェルプレートに播種する。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養後、４０％コンフルエントとなったＡ５４９細胞の培地を無血清培地に交換した。

（３）前処理・ｓｉＲＮＡ添加量
ｓｉＲＮＡとして、上記表３に示すオリゴヌクレオチドを用い、細胞が４０％コンフルエントとなった時点で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ (インビトロジェン社)を用いて上記細胞への導入を行った。
具体的には、各ウェルあたり２．０μＬＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を９８μＬＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン）に添加し、５分間室温でインキュベーションした（Ａ溶液）。
０．２μＭｓｉＲＮＡ溶液０．６２５μＬを９９．３７５μＬＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した（Ｂ溶液）。Ａ及びＢ溶液を混和し、室温で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１２−ウェルプレート各ウェルにＡＢ混液を添加した。ｓｉＲＮＡ最終濃度が、０．１ｎＭとなるように添加した。

（４）後処理
（ｉ）サイトカイン処理
ｓｉＲＮＡ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混液を添加６時間後、培地を０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）及びサイトカイン（１ｎｇ／ｍＬＩＬ−１β及び１ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−α）含有Ｄ−ＭＥＭ培地に交換し、１２時間培養した。培養後上清をサンプリングした。

（ｉｉ）細胞中全ＲＮＡ抽出
細胞中全ＲＮＡ抽出には、自動核酸抽出装置ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０（富士フイルム株式会社）とＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０の専用キットであるＱｕｉｃｋＧｅｎｅＲＮＡｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｋｉｔＳ（富士フイルム株式会社）を用いた。細胞を１．０ｍＬＰＢＳで洗浄し、細胞溶解液０．５ｍＬを添加し、細胞中に含まれる全ＲＮＡの抽出を行った。０．５ｍＬ溶解液（ＬＲＣ、メルカプトエタノール添加済み）を添加した１２ウェルプレートをシーソー型振盪機で５分間撹拌した。ピペッティングにより液を５−６往復させてよく混ぜ、液をエッペンドルフチューブへ移した。エタノールを４２０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで１５秒間撹拌後、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０で処理を行なった。ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８１０での処理中、ＤＮａｓｅ（ＲＱ１ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅＤＮａｓｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。抽出した全ＲＮＡサンプルは、次処理を行うまで−８０(Ｃ冷蔵庫にて保管した。

（iii）全ＲＮＡのｃＤＮＡ化
培養細胞から抽出された全ＲＮＡサンプル中のＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）を、２６０ｎｍにおける吸光度の測定値から計算した（対照：ＴＥバッファー）。この値をもとに、各サンプルにおいてＲＮＡ量が０．１μｇに相当する溶液量を９６ウェルプレートに入れた。これに蒸留水を加えて全量１２μＬとし、さらにQuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるgDNA Wipeout Buffer ２μＬを加え、ボルテックス混和後、４２(Ｃで２分間インキュベートし、その後４(Ｃに冷却した。これにQuantiTect Reverse Transcription Kit（ＱＩＡＧＥＮ）に含まれるQuantiscript Reverse Transcriptase １μＬ、Quantiscript RT Buffer ４μＬ、及びRT Primer Mix １μＬを加え、混和し、４２(Ｃで１５分間インキュベートした。続いてQuantiscript Reverse Transcriptaseを失活させるため９５(Ｃで３分間加熱した後、４(Ｃに冷却した。
この調製液（ｃＤＮＡ調製原液）をＴＥバッファーで５倍希釈し、標的遺伝子（Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１）をターゲットとしたＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。
また、ｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで５０倍希釈し、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを選定しＰＣＲ用ｃＤＮＡ溶液とした。なお、コントロールサンプル（ｓｉＲＮＡ非投与）のｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１、１０、１００、及び１０００倍希釈し、Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１をターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。同様にコントロールサンプルｃＤＮＡ調製原液をＴＥバッファーで１０、１００、１０００、及び１００００倍希釈し、ＧＡＰＤＨをターゲットとしたＰＣＲ検量線用サンプルとした。

（５）Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現量の測定方法
Ｓｍａｄ３またはＭＣＰ−１に由来するｃＤＮＡ産物２．５μＬを鋳型として、１２．５μＬ QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN)と、ヒト由来Ｓｍａｄ３遺伝子、ヒト由来ＭＣＰ−１遺伝子又はヒト由来ＧＡＰＤＨ遺伝子の２．５ μＬ QuntiTect Primer Assay (QIAGEN)を用いて、滅菌蒸留水にて最終容量２５μＬとしたＰＣＲ反応溶液を調製した。調製した溶液は、Applied Biosystems 7500 (Life Technologies Japan)にて、９５(Ｃで５分間加熱した後、１）９５℃，１０秒、２）６０℃，３５秒のサイクルを４０回繰り返した後に、９５℃から６０℃に徐冷し、熱解離測定を行った。ＰＣＲ増幅過程に由来するＣｔ（Threshold Cycle）値を基に、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値による各標的遺伝子の増幅割合を補正し、標的遺伝子のｍＲＮＡ抑制効果を評価した。結果を図１および図２に示す。
ｓｉＲＮＡ番号が、ｃ，ｅおよびｍのものは、０．１ｎＭの濃度においても４０％以上のＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１の発現抑制効率を有していることがわかった。特に、ｓｉＲＮＡ番号が、ｃおよびｅのｓｉＲＮＡは、０．１ｎＭにおいても６０％以上の抑制効率を示した。

Claims

配列番号１の塩基番号６４７〜６６７番の塩基、１８１６〜１８３６番の塩基、２３５９〜２３８７番の塩基、３６７０〜３６９０番の塩基及び５４８６〜５５０６番の塩基、並びに配列番号２の塩基番号３７７〜４１０番の塩基、４７３〜４９３番の塩基、５３３〜５６０番の塩基及び５９９〜６３１番の塩基よりなる群から選ばれる連続する１７〜２１塩基を標的配列とし、全長が３０ヌクレオチド以下であるｓｉＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡが、以下の（ａ）〜（ｒ）から選ばれる請求項１記載のｓｉＲＮＡ。
（ａ）配列番号３に示されるセンス配列と配列番号４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｂ）配列番号５に示されるセンス配列と配列番号６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｃ）配列番号７に示されるセンス配列と配列番号８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｄ）配列番号９に示されるセンス配列と配列番号１０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｅ）配列番号１１に示されるセンス配列と配列番号１２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｆ）配列番号１３に示されるセンス配列と配列番号１４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｇ）配列番号１５に示されるセンス配列と配列番号１６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｈ）配列番号１７に示されるセンス配列と配列番号１８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｉ）配列番号１９に示されるセンス配列と配列番号２０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｊ）配列番号２１に示されるセンス配列と配列番号２２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｋ）配列番号２３に示されるセンス配列と配列番号２４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｌ）配列番号２５に示されるセンス配列と配列番号２６に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｍ）配列番号２７に示されるセンス配列と配列番号２８に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｎ）配列番号２９に示されるセンス配列と配列番号３０に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｏ）配列番号３１に示されるセンス配列と配列番号３２に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
（ｐ）配列番号３３に示されるセンス配列と配列番号３４に示されるアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡ
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された請求項１〜３の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端の末端側からオーバーハングヌクレオチドを除いた連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換され、且つアンチセンス鎖の５’末端の末端側から連続する１〜１０ヌクレオチドがＤＮＡに変換された請求項１〜４の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
アンチセンス鎖の５’末端がモノリン酸化された請求項１〜５の何れか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを有効成分として含有するＳｍａｄ３またはＭＣＰ−１遺伝子発現抑制剤。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを有効成分として含有する線維症予防又は治療剤。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡを有効成分として含有する肺線維症予防又は治療剤。