JP2013133424A - 抗酸化剤、食品褐変防止剤、抗酸化飲料、およびホモゲンチジン酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】光合成細菌の発酵エキスには、抗酸化物質が含有され、発酵エキスをそのまま抗酸化剤や食品褐変防止剤として使用することができる。前記光合成細菌は、ロドシュードモナス・パルストリスであることが好ましい。また、前記抗酸化物質はホモゲンチジン酸であり、発酵エキスを抗酸化飲料とすることができる。
【選択図】なし
Description
(1) 光合成細菌の培養
ロドシュードモナス・パルストリス(NITE P−1166)を、蒸留水1L、MgSO4・7H2O 1g、酵母エキス 2g、ポリペプトン 10gを含む前培養用培地にて、5000ルクスの蛍光灯照射下、27℃、2週間で静置条件で前培養した。
次に本培養を行った。本培養は、蒸留水1L、MgSO4・7H2O 1g、酵母エキス 2g、ポリペプトン 10gを含む本培養用培地に終濃度1×105細胞/mlとなるように前記NITE P−1166を植菌し、5000ルクスの蛍光灯照射下、27℃で静置条件で行った。
上記(1)で得た本培養後の培養液100mlを、10000rpm、10分間遠心分離を行った。上清を0.45μmのメンブレンフィルターでろ過してろ液を得た。このろ液を「発酵エキス」と称する。下記条件にて、発酵エキスに含まれる成分をHPLCで分析した。HPLCでの分析結果を図1に示す。なお、本培養の培養液について、前記発酵エキスと同様に操作して対照試料を得た。これを「発酵前の培地」と称する。この発酵前の培地について、上記と同様に操作してHPLCによる分析を行った。結果を図2に示す。図1と図2とを比較して明らかなように、発酵エキスには保持時間9.7分にピークが存在した。
HPLC装置:Agilent社製1100シリーズ、
カラム:ZIC−HILIC、
流速:500μL/min、
移動相:20mMギ酸アンモニウム:アセトニトリル=20:80、
検出器:UV、
測定波長:300nm
上記(1)で得た本培養後の培養液100mlを、10000rpm、10分間遠心分離を行った。上清を0.45μmのメンブレンフィルターでろ過し、ろ液を1M塩酸でpH2に調整した後、エーテル50mLで3回抽出した。各エーテル層を混合し、30℃でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、水を加えて溶解後、再度0.45μmのメンブレンフィルターでろ過を行った。このろ液に含まれる成分を下記HPLC条件で分析し約37分付近のピークを分取した。この操作を繰り返して行い、ピーク物質の分取を行った。
カラム:COSMOSIL packed column、5C18−MS−II、10×250mm、
流量:2mL/min、
検出:300nm、UV検出器、
移動相:
A;0.01%トリフルオロ酢酸水溶液、B;メタノールとし、以下のグラジエント条件とした。
0分〜20分:A97%、B3%
20分〜60分:A97%、B3%→A50%、B50%のリニアグラジエント
60分〜90分:A50%、B50%
上記(3)で分取したピーク物質について、日本分光製V−570を使用して290nm(λmax(H2O))でUVスペクトルを測定した。結果を図3に示す。極大吸収波長λmax(H2O)は290nmであった。
上記(3)で得たピーク物質について、下記条件にてNMRを測定した。結果を図4に示す。3.60(2H,s,CH2)、6.73(2H,m,ArH)、6.81(1H,d,ArH)にピークが存在した。なお、重溶媒(D2O)のピークは、4.8である。
溶媒:D2O、
標準物質:TSP(Trimethylsilyl propanoic acid)
上記(3)で得たピーク物質について、下記条件にてLC/MS/MS分析を行った。MS/MSスペクトルを図5に表示。質量分析の結果、ESIMS m/z 167[M−H]−、ESIMS/MS m/z 123、122、108であった。
HPLC装置:Agilent社製1100シリーズ
質量分析装置:エービーサイエックス社製API2000
カラム:ZIC−HILIC
流速:500μL/min
移動相:20mMギ酸アンモニウム:アセトニトリル=20:80、
質量分析条件:ESI、陰イオンモード、DP=−30、CE=−30
抽出物質のUV分析結果を示す図3、NMR結果を示す図4、およびLC/MS/MS分析結果を示す図5から、上記ピーク物質をホモゲンチジン酸と同定した。
実施例1の(2)で得た「発酵エキス」と「発酵前の培地」とについて、下記方法に基づいてホモゲンチジン酸量、ポリフェノール量、DPPHラジカル消去活性、pH、色、臭気とを測定した。結果を表1に示す。
(1)ホモゲンチジン酸量の測定
実施例1で使用したHPLC装置を使用し、HPLC−UV検出器を用いて絶対検量線法によって定量を行った。
分析試料100μLに蒸留水1.6mL、Folin−Denis試薬100μLを加えた後、攪拌し、10%Na2CO3溶液200μLを添加した。室温・暗室で30分放置後760nmにおける吸光度を測定した。また、没食子酸を標準物質として用い、結果は没食子酸相当量として表示した。
96穴プレートに、分析試料50μL、エタノール50μL、0.2M、MES緩衝液(pH6.0)50μL、0.75mMのDPPH溶液50μLを加え、室温かつ暗室条件で20分放置した後、515nmにおける吸光度(A)を測定した。なお、エタノールの終濃度は50%になるようにした。
DPPH溶液に代えて同量のエタノール溶液50μLを使用し、上記と同様に操作して吸光度(B)を測定した。また、分析試料に代えて同量の蒸留水を使用し、上記と同様に操作して吸光度(C)を測定した。
各濃度のトロロックスのエタノール溶液を調製してトロロックス検量線を作成した。試料の抗酸化力は、DPPHラジカル消去活性(%)=(C−(A−B))/C×100、に従って算出した。各試料の濃度は、トロロックス相当量(μM)に換算した。
各分析試料について、pHを測定し、色および臭気を官能試験により観察した。
下記方法によりβ−カロテンの酸化抑制効果を測定した。
β−カロテン2mgを10mLのクロロホルムに溶解し、リノール酸20μL、界面活性剤(東京化成工業株式会社製、商品名「Tween−40」)200mgを1mLの上記クロロホルム溶液に溶解した。クロロホルムをエバポレーターにて45℃で乾固し、飽和酸素45mL、0.2Mリン酸緩衝液(pH6.8)5mLを加え、強く攪拌してβ−カロテン含有エマルジョンを調製した。
96穴マイクロプレートに上記で調製したエマルジョンを250μLと実施例1の(2)で得た「発酵エキス」30μLとを加え攪拌し、50℃に保ち、30分間隔で測定波長492nmの吸光度を測定した。また、前記発酵エキスに代えて、実施例1の(2)で得た「発酵前の培地」についても同様に操作して吸光度を測定した。更に、対照として、発酵エキスに代えて、同量の蒸留水を使用し、上記と同様に操作して吸光度を測定した。結果を図6に示す。
分子状酸素によりリノール酸が自動酸化されて生じるリノール酸過酸化物によってβ−カロテンが退色する程度をβ−カロテンの490nmの吸光度で測定するものである。図6に示すように、培地は、β−カロテンの酸化抑制効果が低いが、実施例1の発酵エキスは、200分の経過後も吸光度の低下が少なく酸化抑制効果に優れた。
下記方法により発酵エキスの還元力を測定した。
0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.6)500μL、実施例1の(2)で得た「発酵エキス」250μL、2%ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム250μLを添加し、50℃で20分間加温した。冷却後、10%トリクロロ酢酸を500μL添加し、6000rpm、5分遠心分離した。上清500μLに蒸留水500μLを添加した後、0.1%塩化鉄(III)100μLを加えた。分光光度計にて700nmを測定した。前記発酵エキスに代えて、発酵エキスを蒸留水にて10%に希釈した試料についても同様に測定した。結果を図7に示す。更に、実施例1の(2)で得た「発酵前の培地」について上記と同様に操作し、分光光度計にて測定した。結果を併せて図7に示す。
試料の還元力により、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム中の鉄イオンが還元され、それが塩化鉄(III)との複合体を700nmの吸光度測定により検出するものである。図7に示すように、発酵エキスは発酵前の培地と比較して優れた還元力を有することが判明した。
(1) ロドシュードモナス・パルストリス(NITE P−1166)を、蒸留水1L、MgSO4・7H2O 1g、酵母エキス 2g、ポリペプトン 10gを含む前培養用培地にて、5000ルクスの蛍光灯照射下、2週間で静置条件で前培養した。
次に本培養を行った。本培養は、蒸留水に粉砕青パパイヤを30重量%となるように加えた培地に、終濃度1×105細胞/mlとなるように前培養して得たNITE P−1166を植菌し、5000ルクスの蛍光灯照射下、2週間の静置条件で行った。
(2)上記(1)で得た本培養後の培養液100mlを、10000rpm、10分間遠心分離を行った。上清を0.45μmのメンブレンフィルターでろ過してろ液を得た。このろ液を発酵エキス試料と称する。また、本培養前の培地を発酵前の培地試料とした。この2種の試料について実施例2と同様にしてホモゲンチジン酸、ポリフェノール含有量、pHおよび色について測定しまたは観察を行った。結果を表2に示す。
(1) 実施例1では、2ヶ月間の本培養によって発酵エキスに濃度75.5ppmのホモゲンチジン酸を生成したが、粉砕青パパイヤを培地とした実施例5でも同様にホモゲンチジン酸を生成した。これにより、天然物を培地に使用する場合でも光合成細菌によりホモゲンチジン酸が生成されることが判明した。なお、実施例5での生成量は、わずか2週間の培養で24.4ppmである。青パパイヤを培地に使用することで効率的にホモゲンチジン酸を生産しうることが判明した。
(2) 表2に示すように、発酵エキスにはポリフェノールが142ppm含まれる。ホモゲンチジン酸やポリフェノールは抗酸化力を有するため、発酵エキスは抗酸化飲料、抗酸化食品などとして飲食可能である。
アスコルビン酸、ホモゲンチジン酸、没食子酸、クロロゲン酸、トロロックス、ケルセチン、カテキンのDPPHラジカル消去活性を評価した。
96穴プレートに、上記分析試料50μL、エタノール50μL、0.2M、MES緩衝液(pH6.0)50μL、0.75mMのDPPH溶液50μLを加え、室温かつ暗室条件で20分放置した後、515nmにおける吸光度(A)を測定した。なお、エタノールの終濃度は50%になるようにした。
DPPH溶液に代えて同量のエタノール溶液50μLを使用し、上記と同様に操作して吸光度(B)を測定した。また、分析試料に代えて同量の蒸留水を使用し、上記と同様に操作して吸光度(C)を測定した。
各濃度のトロロックスのエタノール溶液を調製してトロロックス検量線を作成した。試料の抗酸化力は、DPPHラジカル消去活性(%)=(C−(A−B))/C×100、に従って算出した。各試料の濃度は、トロロックス相当量(μM)に換算した。結果を図8に示す。
本実験は、安定なラジカルであるDPPH(1,1―ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル)の分析試料による消去を、515nmの吸光度測定により検出するものである。図8に示すように、ホモゲンチジン酸によるDPPHラジカル消去活性は、没食子酸についで高い結果となった。このDPPHラジカル消去活性は、従来から抗酸化剤として多用されるアスコルビン酸100μMで約35%であるが、ホモゲンチジン酸は同量で約70%の活性を示し、アスコルビン酸の2倍も高い。
Claims (5)
- 光合成細菌の発酵エキスを有効成分とする抗酸化剤。
- 光合成細菌の発酵エキスを有効成分とする食品褐変防止剤。
- 光合成細菌の発酵エキスを有効成分とする抗酸化飲料。
- 前記光合成細菌は、ロドシュードモナス・パルストリスであることを特徴とする、請求項1記載の抗酸化剤、請求項2記載の食品褐変防止剤、または請求項3記載の抗酸化飲料。
- 光合成細菌の発酵エキスからホモゲンチジン酸を抽出することを特徴とする、ホモゲンチジン酸の生産方法。
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