JP2013120162A

JP2013120162A - 液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法

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Publication number: JP2013120162A
Application number: JP2011269279A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2013-06-17

Abstract

【課題】液体クロマトグラフィーにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できる方法を提供する。また、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供する。
【解決手段】１つの内層と該内層を挟む２つの外層との三層構造を有し、２つの外層の孔径が同一であり、かつ、外層の孔径が内層の孔径よりも大きいフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、及び、安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法に関する。

液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定は、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で高精度に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。この用途では、再現性試験におけるヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）が１％以下程度の精度が要求される。

液体クロマトグラフィーにより安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定するための一般的な手段は、カラム充填剤粒子の粒径を小さくして均一にすることである。しかしながら、カラム充填剤粒子の粒径を小さくすると、測定系に生じる圧力値が高くなる。例えば、特許文献１には、平均粒径値が３〜４μｍのカラム充填剤粒子を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法が開示されているが、特許文献１の技術を用いた測定系の圧力値は５ＭＰａ以上と高くなるため、耐圧性の高い液体クロマトグラフが必要となる。また、このような高圧状態で長期間使用した場合、配管の詰まりや、配管の接続部分の劣化による液漏れや、カラム寿命の短縮等を引き起こしやすい。

更に、測定系の圧力値は、液体クロマトグラフに用いられるフィルタの詰まりによっても変動する。フィルタは、通常、液体クロマトグラフの流路に設置され、測定試料や試薬類等から流路に混入する夾雑物を取り除く。例えば、特許文献２には、カラムのエンドフィッティング内に、ステンレス鋼繊維を積層して焼結した繊維焼結フィルタをフリットとして設置した液体クロマトグラフィー用カラムが開示されている。

ステンレス焼結フィルタは最も一般的な液体クロマトグラフ用のフィルタであるが、血液等の生体試料を測定する場合には、血液中のタンパク質等がフィルタの表面に吸着するため測定系の圧力値が上昇しやすい。フィルタの詰まりによる測定系の圧力上昇は、上記に示した小さな粒径の充填剤を用いた高圧での測定と同様の問題を引き起こしやすい。また、フィルタへの非特異吸着により測定系の圧力値が変動して、クロマトグラムの変形を引き起こすため測定再現性が低下しやすい。

フィルタによる圧力上昇を抑制するための手段として、複数のフィルタを用いる方法が開示されている。例えば、特許文献３には、複数のフィルタを用いたヘモグロビン類の測定技術が開示されている。また、更に性能を向上させる技術として、孔径の異なるフィルタ層を有するフィルタが開示されている。例えば、特許文献４には孔径が液体通流方向で順次変化しているフィルタが、特許文献５には孔径が異なるフィルタ層を有する三層構造のフィルタが開示されている。

これらの技術は、夾雑物の非特異吸着を複数のフィルタに分散させることで、該非特異吸着による圧力上昇を緩やかにしてフィルタ寿命の延長を図るものである。特に、孔径の異なるフィルタを用いる技術は、非特異吸着をより効率良く分散させることで、圧力上昇をより緩やかにさせている。従って、これらの技術ではフィルタ寿命の延長効果以外の有益な効果（例えば、測定時間の短縮等）は期待できない。一方、孔径の異なる複数のフィルタを用いた技術では、本来夾雑物を除去するために必要な孔径（複数のフィルタの内の最小孔径）のフィルタの他に、より大きな孔径のフィルタを付属させるため、このフィルタ内での測定試料や溶離液の拡散により分離性能が低下する。特に、ヘモグロビンＡ１ｃ値を実用的なレベルの測定時間（２分以下程度）で測定する場合には分離性能の低下が大きい。

特開平０５−００５７３０号公報特開平０７−２６０７６３号公報特開平０５−１８８０４９号公報特開平０２−２６２０５４号公報特開２００６−１８９４２７号公報

本発明は、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる液体クロマトグラフィーを提供する。また、本発明は、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供する。

本発明者は、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定において、従来の非特異吸着の抑制を目的とするフィルタの欠点である分離性能の低下を抑制できるだけでなく、従来よりも高い分離性能を得る方法を見出した。即ち、特定の構造のフィルタを用いること、及び、一定の圧力範囲で測定を行うことにより、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できることを見出した。

本発明は、１つの内層と該内層を挟む２つの外層との三層構造を有し、２つの外層の孔径が同一であり、かつ、外層の孔径が内層の孔径よりも大きいフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する、液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。以下に本発明を詳述する。

本発明に用いるフィルタの構造の一例を示す断面図を図１に示す。フィルタ１は外層２及び外層３が一つの内層４を挟む三層構造を有する。以下、本発明に用いるフィルタの三層構造部分を単にフィルタともいう。
なお、本明細書でいうフィルタの「層」とは、孔径が実質的に同一と見なせる一定の厚みを有するフィルタの層構造をいう。また、２つの外層を個別に指す場合は、図１の外層２を流入側外層、外層３を流出側外層という。単に外層という場合は両者を指す。

内層の孔径の好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は１０μｍである。内層の孔径が０．１μｍ未満であると、測定系の圧力上昇により測定再現性が低下することがある。内層の孔径が１０μｍを超えると、通液する液体中の夾雑物を充分に捕捉できないことがある。内層の孔径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は５μｍである。
なお、本明細書におけるフィルタの孔径は、ＩＳＯ４００３のバブルポイント法により測定した平均孔径である。

本発明に用いるフィルタにおいて、外層の孔径は、内層の孔径よりも大きい。また、流入側外層と流出側外層の孔径は同一である。「外層の孔径が同一」とは、孔径の差が１μｍ以下であることを意味する。２つの外層の孔径が異なると、分離性能が低下して測定再現性が悪くなることがある。
外層の孔径の好ましい下限は５μｍ、好ましい上限は２０μｍである。外層の孔径が５μｍ未満であると、測定系の圧力上昇により測定再現性が低下することがある。外層の孔径が２０μｍを超えると、通液する液体中の夾雑物を充分に捕捉できないことがある。外層の孔径のより好ましい下限は７μｍ、より好ましい上限は１５μｍである

フィルタの厚さ（２つの外層と１つの内層の合計の厚さ）の好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は１０ｍｍである。フィルタの厚さが０．１ｍｍ未満であると、通液する液体中の夾雑物を充分に捕捉できないことがある。フィルタの厚さが１０ｍｍを超えると、測定試料や溶離液がフィルタ内で拡散して分離性能が低下し、測定再現性が悪くなる。フィルタの厚さのより好ましい下限は０．２ｍｍ、より好ましい上限は５ｍｍである。

本発明に用いるフィルタにおいて、２つの外層の厚さは同一であることが好ましい。「外層の厚さが同一」とは、厚さの差が０．１ｍｍ以下であることを意味する。２つの外層の厚さが異なると、測定再現性が悪くなることがある。

本発明に用いるフィルタにおいて、内層の厚さは、１つの外層の厚さの１〜５倍であることが好ましい。内層の厚さが１つの外層の厚さよりも小さいと、測定試料や溶離液がフィルタ内で拡散して分離性能が低下して測定再現性が悪くなることがある。内層の厚さが１つの外層の厚さの５倍を超えると、測定系の圧力上昇により測定再現性が悪くなることがある。

フィルタの形状は、溶離液等の液状試薬が流入する方向に面するろ過面が円状の円盤体、円柱体、円錐体等が好ましい。
フィルタの表面には凸部や凹部が設けられていてもよい。

フィルタのろ過面が円形の場合、直径の好ましい下限は０．５ｍｍ、好ましい上限は２０ｍｍである。フィルタの直径が０．５ｍｍ未満であると、フィルタが目詰まりを起こすことがある。フィルタの直径が２０ｍｍを超えると、フィルタ内で測定試料や移動相が拡散して分離性能が低下することがある。フィルタの直径のより好ましい下限は１ｍｍ、より好ましい上限は１０ｍｍである。

フィルタの素材としては、金属製、樹脂製、ガラス製等の液体クロマトグラフィーに用いる公知のフィルタの素材が使用できる。フィルタの素材は、具体的には例えば、アルミニウム、銅、チタン、ニッケル、鉄、クロム、スズ等の金属類や、ステンレス等の合金類や、ナイロン樹脂、フッ素樹脂、セルロース樹脂、スルホン樹脂、エーテルスルホン樹脂、オレフィン樹脂、アクリル樹脂、エステル樹脂、ビニロン樹脂、カーボネート樹脂、ウレタン樹脂、スチレン樹脂、塩化ビニル樹脂、エーテルエーテルケトン樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ノリル樹脂等の樹脂類等の樹脂類や、ジルコニア等のセラミック類や、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス等のガラス類等が好ましい。

フィルタは、２つの外層と一つの内層を別個に作製した後に重ね合わせて得られるフィルタでもよいし、２つの外層と一つの内層を一度に調製して得られるフィルタでもよい。フィルタ又は各フィルタ層は、公知の方法により加工したフィルタ又はフィルタ層を用いることができる。例えば、上記のフィルタの素材を繊維状、膜状、シート状、ろ紙状等の薄膜状に加工したフィルタ又はフィルタ層、上記のフィルタの素材の繊維を不織布、織布、編み物状に加工したフィルタ又はフィルタ層、上記のフィルタの素材の繊維又は粉体を積層し圧縮等の方法により加工したフィルタ又はフィルタ層、上記のフィルタの素材の繊維又は粉体を積層して焼結したフィルタ又はフィルタ層等が挙げられる。

フィルタは、表面を処理した表面処理フィルタであってもよい。上記「表面」とは、測定試料が接触するフィルタの外表面及び内表面を含む。
表面処理フィルタは、ブロッキング処理フィルタ、シリコーン処理フィルタ等公知の処理方法によるフィルタが好ましい。これらの表面処理フィルタは、異なる複数種の表面処理を行った表面処理フィルタでもよい。

本発明は、上記のフィルタを用いた液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
本発明に用いるフィルタは、液体クロマトグラフの流路上に設置する。特に、測定試料が通過する流路上に設置することが好ましい。本発明に用いるフィルタは、例えば、流路配管の途中に設置するラインフィルタ、分離用カラムの直前に設置するプレフィルタ、カラムのエンドフィッティング内で充填剤に接して設置されるフリット等、公知のフィルタの使用方法として用いることが好ましい。なかでも、プレフィルタ又はフリットとしての使用が好適である。

本発明の液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、上記のフィルタを用いた上で、測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する。本明細書において、「測定系に生じる圧力値（以下、単に圧力値ともいう）」とは、液体クロマトグラフの流路において、カラムを含む送液ポンプ以降の流路全体により発生する圧力値を意味する。例えば、送液ポンプとカラムとの間に接続した圧力計により測定できる値である。また、上述した「９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下」の圧力範囲を本発明の「圧力規定値」という。

圧力値を９．８×１０^３Ｐａ未満に設定した場合は、ヘモグロビン類の測定値の再現性が低下し測定時間が長くなる。また、設定圧力値が非常に小さいため圧力値を安定させることが困難となる。圧力値を１９．６×１０^５Ｐａを超える値に設定した場合は測定値の再現性が低下する。

本発明の液体クロマトグラフィーは、送液用ポンプ、分離用カラム、検出器、試料導入機構等を備えた公知の液体クロマトグラフに、上記のフィルタを設置して行う。本発明に用いる液体クロマトグラフの例を示す構成図を図２に示す。

液体クロマトグラフィーに用いる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸は、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物、カオトロピック化合物等を適宜添加してもよい。

安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、充分なイオン交換反応が行なわれずヘモグロビン類を分離することが困難となることがある。緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超える場合、緩衝液中の塩が析出して液体クロマトグラフに悪影響を及ぼすことがある。

本発明により、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる。また、健常人血に含まれるその他のヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）、ヘモグロビンＡ２等を測定できる。また、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等を測定できる。

上述したように、本発明によれば、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビンを測定できる。本発明の安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法もまた、本発明の１つである。

本発明によれば、特定の構造のフィルタを用い、圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定することにより、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる液体クロマトグラフィーを提供できる。また、本発明によれば、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供できる。

本発明に用いるフィルタの構造の一例を示す断面図である。本発明に用いる液体クロマトグラフの例を示す構成図である。測定例１により得られたクロマトグラムである。測定例４により得られたクロマトグラムである。測定例１により得られたクロマトグラムである。測定例２により得られたクロマトグラムである。測定例１により得られたクロマトグラムである。測定例２により得られたクロマトグラムである。流入側外層の孔径と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。流出側外層の孔径と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。流入側外層の厚さと安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。流出側外層の孔径と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。フィルタ層の厚さ比と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例８、９及び１０の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例１１、１２及び１３の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例１４、１５及び１６の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例１７、１８及び１９の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例２０、２１及び２２の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の関係を示すグラフである。測定例２３、２４及び２５の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。測定例２６、２７及び２８の繰り返し測定時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を示すグラフである。

（製造例１）
製造例１〜３では、平均粒径の異なるヘモグロビン類測定用のカラム充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体、新中村化学工業社製）１６０ｇ、及び、２−ヒドロキシ−１、３−ジメタクリロキシプロパン（架橋性単量体、新中村化学工業社製）２０ｇの単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（重合開始剤、キシダ化学社製）１．０ｇを混合して溶解し、５重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２０００ｍＬに分散させた。
反応系を３５０ｒｐｍで撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温して１．２時間重合反応を行った。
次に、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（親水性単量体、東亞合成社製）１８０ｇ、及び、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（親水性単量体、日油社製）６０ｇ、メタノール１００ｇを溶解したイオン交換水２００ｍＬを反応系に添加して、８０℃で２時間重合反応を行った。得られた重合物を洗浄してカラム充填剤を得た。
粒度分布測定装置（ナイコンプ社製、「アキュサイザー７８０」）により、平均粒径を測定した結果、４．２μｍであった。

（製造例２）
反応系の撹拌条件を３００ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、７．１μｍであった。

（製造例３）
反応系の撹拌条件を２５０ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作してカラム充填剤を得た。製造例１と同様に平均粒径を測定した結果、１２．８μｍであった。

（実施例１）
ステンレス鋼（ＳＵＳ３１６）金属短繊維及びステンレス鋼（ＳＵＳ３１６）金属微粉末を混合して得た焼結体を圧縮成型して、以下のＡ〜Ｄの４種類フィルタ層（直径５ｍｍ）を得た（Ａ〜Ｄの符号をフィルタ層Ｎｏ．とする）。
フィルタ層Ａ：孔径３μｍ、厚さ０．５ｍｍ
フィルタ層Ｂ：孔径３μｍ、厚さ１ｍｍ
フィルタ層Ｃ：孔径１０μｍ、厚さ０．２５ｍｍ
フィルタ層Ｄ：孔径１０μｍ、厚さ０．５ｍｍ
該４種類のフィルタ層Ａ〜Ｄを用いて表１の測定例１〜７を行った。

（評価１）
評価１では、測定例１（本発明に用いる三層構造のフィルタ）、測定例２〜５（単層構造のフィルタ）、測定例６〜７（二層構造のフィルタ）を用いて評価を行い、層構造の数による影響を確認した。

（１）ヘモグロビン類測定用カラムの調製
製造例１で得たカラム充填剤０．８ｇを、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに添加して撹拌した後、５分間超音波処理して充填剤スラリーを調製した。内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのＳＵＳ３１６ステンレス製エンプティカラム（巴製作所社製）を接続した容量３０ｍＬのカラム充填用パッカー（アズワン社製）にスラリー全量を注入した。パッカーに送液ポンプ（ＧＬサイエンス社製、「ＰＵ−６１４」）を接続し、２０ＭＰａの圧力で充填してヘモグロビン類測定用カラムを得た。

（２）測定条件
図２の液体クロマトグラフ５に、上記（１）で得られたヘモグロビン類測定用カラムを接続した（図２の１１）。また、測定例１〜７の各フィルタを、インジェクションバルブ９と分離用カラム１１の間に接続した（図２の１０）。測定条件を表２に示す。

（３）圧力値の測定
上記「（２）測定条件」の条件で、溶離液Ａを送液した場合の圧力値を測定した。圧力値は、送液ポンプ７とインジェクションバルブ９の間に圧力計８（長野計器社製、「デジタル圧力計ＧＣ６１」）を接続して測定した。測定結果を表３に示す。圧力値は孔径及び厚さに依存した数値を示したが、いずれの測定例も本発明の圧力規定値（９．８×１０^３〜１９．６×１０^５Ｐａ）の範囲内であった。

（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定
測定例１〜７により健常人血液中の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）を上記「（２）測定条件」の条件にて測定した。
測定試料は、フッ化ナトリウム入り採血管で採血したヒト健常人血液を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により１３０倍に溶血希釈したものを用いた。この試料を連続して２０回測定した。
本発明に用いる三層構造を有するフィルタを使用した測定方法である測定例１により得られたクロマトグラムを図３に示す。測定例１により、約１分で安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（ピーク２２）を他のヘモグロビン類から良好に分離できた。
測定例２〜５は、フィルタ層Ａ〜Ｄ各一種類のみからなる単層構造のフィルタを使用した場合を示す。フィルタ層Ａのみ又はフィルタ層Ｂのみを用いた測定例２、３では、図３と同様の良好なクロマトグラムが得られたが、フィルタ層Ｃのみを用いた測定例４では、図４のクロマトグラムが得られ、測定例１〜３の場合よりも明らかに分離性能が不良であった。フィルタ層Ｄのみを用いた測定例５も測定例４と同様に分離性能が不良であった。
測定例６、７は、フィルタ層Ａ及びフィルタ層Ｃを用いた二層構造のフィルタを使用した場合を示す。測定例６、７では、図３と同様の良好なクロマトグラムが得られ、測定例１〜３と同様に安定型ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能は良好であった。

上記の測定試料を２０回測定した場合の安定型ヘモグロビンＡ１ｃのＣＶ値により、同時再現性を評価した。各ＣＶ値を表３に示す。三層構造を有するフィルタを使用した測定方法である測定例１では良好なＣＶ値が得られた。測定例２〜５の単層構造のフィルタ及び測定例６〜７の二層構造のフィルタを用いた場合は、測定例１よりＣＶ値が大きくなり、再現性に劣るものとなった。

（５）修飾ヘモグロビン類の測定
測定例１〜７により、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類を含む試料を、上記「（２）測定条件」の条件にて測定した。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を公知の方法により調製した。
試料Ｌは、健常人血にグルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血にシアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表３に示す。
測定例１の三層構造フィルタを用いた場合のΔ値は０．２％未満であり、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確に安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定できた。
測定例２〜５の単層構造のフィルタ及び測定例６〜７の二層構造のフィルタを用いた場合は、Δ値が０．２％以上であり、修飾ヘモグロビン類の影響を受けて正確な安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定ができなかった。

（６）異常ヘモグロビン類の測定
測定例１〜７により、異常ヘモグロビンのヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）を、上記「（２）測定条件」の条件にて測定した。
測定例１の三層構造フィルタを用いた場合（図５）は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離できた。測定例２の単層構造のフィルタを用いた場合（図６）は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離できなかった。測定例３〜５の単層構造のフィルタ及び測定例６〜７の二層構造のフィルタを用いた場合も図６と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離できなかった。

（７）ヘモグロビンＡ２の測定
測定例１〜７により、ヘモグロビンＡ２を含む試料（バイオラッド社製「Ａ２コントロールレベル２」）を、上記「（２）測定条件」の条件にて測定した。
測定例１の三層構造フィルタを用いた場合（図７）はヘモグロビンＡ２を良好に分離できた。測定例２の単層構造のフィルタを用いた場合（図８）は、ヘモグロビンＡ２を分離できなかった。測定例３〜５の単層構造のフィルタ及び測定例６〜７の二層構造のフィルタを用いた場合も図８と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンＡ２を分離できなかった。
評価１の（４）〜（７）により、本発明に用いる三層構造フィルタを使用することにより、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、異常ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ２を短時間で良好に分離できた。

（評価２）
評価２では、三層構造フィルタにおいて、２つの外層の孔径が異なる場合の評価を行った。

（１）流入側外層の孔径の影響
内層としてフィルタ層Ａ（孔径３μｍ）、流出側外層としてフィルタ層Ｃ（孔径１０μｍ）を用いた。流入側外層はフィルタ層Ｃと同様の仕様で、孔径のみ１〜３０μｍに変更したフィルタ層を用いた。これらのフィルタ層を用いた三層構造フィルタを調製して、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。
流入側外層の孔径と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図９に示す。流入側外層の孔径が流出側外層の孔径と同一となる付近において再現性が向上した。

（２）流出側外層の孔径の影響
内層としてフィルタ層Ａ（孔径３μｍ）、流入側外層としてフィルタ層Ｃ（孔径１０μｍ）を用いた。流出側外層はフィルタ層Ｃと同様の仕様で、孔径のみ１〜３０μｍに変更したフィルタ層を用いた。これらのフィルタ層を用いた三層構造フィルタを調製して、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。
流出側外層の孔径と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１０に示す。流出側外層の孔径が流入側外層の孔径と同一となる付近において再現性が向上した。
以上から、２つの外層の孔径が同一となる場合に再現性が向上した。

（評価３）
評価３では、本発明に用いる三層構造フィルタにおいて、２つの外層の厚さが異なる場合の評価を行った。

（１）流入側外層の厚さの影響
内層としてフィルタ層Ａ（厚さ０．５ｍｍ）、流出側外層としてフィルタ層Ｃ（厚さ０．２５ｍｍ）を用いた。流入側外層はフィルタ層Ｃと同様の仕様で、厚さのみ０．１〜１ｍｍに変更したフィルタ層を用いた。これらのフィルタ層を用いた三層構造フィルタを調製して、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。
流入側外層の厚さと安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１１に示す。流入側外層の厚さが流出側出層の厚さと同一となる付近において再現性が向上した。

（２）流出側外層の厚さの影響
内層としてフィルタ層Ａ（厚さ０．５ｍｍ）、流入側外層としてフィルタ層Ｃ（厚さ０．２５ｍｍ）を用いた。流出側外層はフィルタ層Ｃと同様の仕様で、厚さのみ０．１〜１ｍｍに変更したフィルタ層を用いた。これらのフィルタ層を用いた三層構造フィルタを調製して、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。
流出側外層の厚さと安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１２に示す。２つの外層の厚さが同一となる付近において再現性が向上した。
以上から、２つの外層の厚さが同一となる場合に再現性が向上した。

（評価４）
評価４では、本発明に用いる三層構造フィルタにおいて、内層と外層の厚さの比率の影響の評価を行った。
内層としてフィルタ層Ａの厚さを０．２〜０．８ｍｍに変更したフィルタ層、外層としてフィルタ層Ｃの厚さを０．１〜０．４ｍｍに変更したフィルタ層を用い、フィルタ全体の厚さを１ｍｍとした。なお、２つの外層は同じ厚さのフィルタ層を用いた。これらを組み合わせて三層構造フィルタを調製して、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。
１つの外層の厚さを１とした場合の内層の厚さ比と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１３に示す。内層の厚さ比が１〜５の場合において再現性が向上した。

（評価５）
評価５では本発明の圧力規定値について評価を行った。
上記製造例１〜３の粒径の異なる充填剤を用い、更に、測定時の流速を故意に変えて測定系の圧力値を変化させて測定を行った。これらの評価に用いた測定例８〜２２を表４に示す。

測定例８〜１０では、外層として同一の厚さを有する２つのフィルタ層Ｃ、内層として１つの外層の厚さの４倍の厚さを有するフィルタ層Ｂからなる三層構造フィルタを用い、製造例１〜３の充填剤を用いて、流速を０．１〜３．３ｍＬ／分の間で変更したこと以外は、評価１の「（４）安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定」と同様にして、同時再現性を評価した。この場合の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１４に示す。本発明の圧力規定値内においてＣＶ値は良好であった。本発明に用いる三層構造フィルタであっても、圧力規定値外ではＣＶ値が悪化した。
測定例１１〜１３では、外層として同一の厚さを有する２つのフィルタ層Ｄ、内層として１つの外層と同一の厚さを有するフィルタ層Ａからなる三層構造フィルタを用い、製造例１〜３の充填剤を用いて、測定例８〜１０と同様に流速を変更して同時再現性を評価した。この場合の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃのＣＶ値（％）の関係を図１５に示す。測定例１１〜１３も測定例８〜１０と同様の挙動を示した。
以上から、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定の再現性を向上させるためには、本発明に用いる三層構造フィルタを使用し、かつ、本発明の圧力規定値内において測定する必要があることが分かった。なお、流速の変化による圧力変動及び充填剤の粒径の違いによる圧力変動で同様の挙動を示したことから、再現性の変化は流速及び充填剤の粒径の影響ではなく、圧力値による影響である。
測定例１４〜１６では、フィルタ層Ｂのみを用いた単層構造のフィルタを用い、製造例１〜３の充填剤を用いて、測定例８〜１０と同様に流速を変更して同時再現性を評価した。この場合の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１６に示す。単層構造のフィルタを使用した場合、圧力値に関わりなくＣＶ値が悪かった。
測定例１７〜１９では、フィルタ層Ｃ及びフィルタ層Ａのみを用いた二層構造のフィルタを用い、製造例１〜３の充填剤を用いて、測定例８〜１０と同様に流速を変更して同時再現性を評価した。この場合の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１７に示す。二層構造のフィルタを使用した場合、圧力値に関わりなくＣＶ値が悪かった。
測定例２０〜２２は、流入側外層としてフィルタ層Ｃ（厚さ０．２５ｍｍ）、内層としてフィルタ層Ａ（厚さ０．５ｍｍ）、流出側外層としてフィルタ層Ｄ（厚さ０．５ｍｍ）を用いた三層構造フィルタを使用して、測定例８〜１０と同様に流速を変更して同時再現性を評価した。この場合の平均圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値（％）の関係を図１８に示す。２つの外層が異なる厚さのフィルタを使用した場合、圧力値に関わりなくＣＶ値が悪かった。また、孔径の異なる２つの外層を用いた場合も、測定例２０〜２２と同様の挙動を示した。

（評価６）
評価６では、健常人血液試料を合計３０００回繰り返し測定した際の圧力値と安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値の再現性の推移を確認した。これらの評価に用いた測定例２３〜２８を表５に示す。

測定例２３〜２５は、本発明に用いる三層構造のフィルタを使用し、初期の圧力値の異なる例である。２００回の測定毎に同時再現性を評価した時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を図１９に示す。
圧力規定値内の測定例２３は、３０００回測定までＣＶ値が１％以下を維持できた。圧力規定値外の測定例２４及び測定例２５は、初期からＣＶ値が高く、約２５００回測定で更にＣＶ値が悪化した。
単層構造フィルタを用いた測定例２６、二層構造フィルタを用いた測定例２７、２つの外層の孔径の異なる三層構造を用いたフィルタの測定例２８について、２００回の測定毎に同時再現性を評価した時の安定型ヘモグロビンＡ１ｃ値のＣＶ値の推移を図２０に示す。
測定例２６〜２８は初期からＣＶ値が高く、約１５００回測定で更にＣＶ値が悪化した。
以上から、２つの外層が同一の構造を有する三層構造フィルタを用い、本発明の圧力規定値内の測定条件においてのみ、初期から良好なＣＶ値を示し、長期間良好なＣＶ値を維持できた。

本発明によれば、安定型ヘモグロビンＡ１ｃを短時間で再現性良く測定できる液体クロマトグラフィーを提供できる。また、本発明によれば、短時間で再現性良く安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンとを同時測定できる方法を提供できる。

１フィルタ
２流入側外層
３流出側外層
４内層
５液体クロマトグラフ
６溶離液切替バルブ
７送液ポンプ
８圧力計
９インジェクションバルブ
１０プレフィルタ
１１分離用カラム
１２検出器
１３溶離液
１４オートサンプラ
１５廃液容器
２１安定型ヘモグロビンＡ１ｃ
２２ヘモグロビンＡ０
２３ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
２４ヘモグロビンＳ
２５ヘモグロビンＣ
２６ヘモグロビンＡ２

Claims

１つの内層と該内層を挟む２つの外層との三層構造を有し、２つの外層の孔径が同一であり、かつ、外層の孔径が内層の孔径よりも大きいフィルタを液体クロマトグラフの流路上に設置し、
該液体クロマトグラフの測定系に生じる圧力値を９．８×１０^３Ｐａ以上、１９．６×１０^５Ｐａ以下に設定する、
液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
２つの外層の厚さは同一であり、かつ、内層の厚さが１つの外層の厚さの１〜５倍である請求項１記載の液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
請求項１又は２記載の液体クロマトグラフィーによる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を用いる安定型ヘモグロビンＡ１ｃと異常ヘモグロビンの同時測定法。