JP2011242238A - 液体クロマトグラフ用フィルター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 (1)濾紙、(2)1枚以上のメンブレンフィルター、(3)焼結フィルター、を設けたフィルター、および溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、前記フィルターと、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフにより前記課題を解決する。また、前記フィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入することで、測定開始直後から精度高い測定を実施することができる。
【選択図】 図2
Description
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、1枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けた、前記フィルターである。
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフであって、
試料導入手段と分析カラムとの間に、試料導入手段側から順に、濾紙、1枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けたフィルターを備えた、前記液体クロマトグラフである。
タンパク質を含むエージング溶液をフィルターに導入してフィルターをエージング処理するエージング溶液導入手段と、
フィルターを通過した溶液が流れる流路とカラムへ導入する流路または廃液への流路とを切り替え可能な流路切り替え手段と、
をさらに備えた第七の発明に記載の液体クロマトグラフである。
分析カラムから溶出した成分を誘導体化させるための反応液を送液する反応液送液手段と、
前記溶出した成分を反応液により誘導体化させる反応手段と、
をさらに備えており、
検出手段が反応手段により誘導体化された前記溶出した成分を検出する手段である、
第七から第九のいずれかの発明に記載の液体クロマトグラフである。
(1)捕獲粒子径(孔径)が0.1μm以上の濾紙、
(2)捕獲粒子径(孔径)が5.0μm以上のメンブレンフィルター、
(3)捕獲粒子径(孔径)が5.0μm未満のメンブレンフィルター、
(4)捕獲粒子径(濾過精度)が100μm以下の焼結フィルター、
を設けたフィルターがあげられる。
(1)切り替えバルブ111をエージング溶液導入手段100とフィルター50とが接続される位置(ONの位置)に切り替え、切り替えバルブ112をフィルター50から溶出したエージング溶液が分析カラム60へ導入されない位置(ONの位置)に切り替える。
(2)0.2から1.0%のBSAまたはセリシンを含む溶液(エージング溶液)1から3mLをシリンジ101を用いてフィルター50へ導入し、エージング処理を行なう。
(3)エージング処理後、切り替えバルブ111をオートサンプラー40とフィルター50とが接続される位置(OFFの位置)に切り替え、切り替えバルブ112をフィルター50と分析カラム60とが接続される位置(OFFの位置)に切り替える。
なお、前記動作は各手段と接続されたパーソナルコンピューターなどの制御手段であらかじめ設定した制御シーケンスに従い自動的に行なうことができる。
溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、1枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けていることを特徴としている。本発明のフィルターにより、試料中の不純物を効果的に除去することができる。また、下流側に備えた分析カラムの入口側に通常設ける焼結フィルターの詰まりを防止することができるため、分析カラムの寿命を向上させることができる。特に試料が全血、血清、血漿といった血液試料の場合は、粘度の高いゲル状の不純物など従来のフィルターでは吸着除去できない、またはフィルターを詰まらせる不純物が多く含まれているが、本発明のフィルターにより前記不純物も吸着除去できるため、本発明のフィルターを用いることによる効果が大きい。
図1に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。溶離液11は1mMのEDTA2Naを含んだ20mMトリス緩衝液(pH7.65)を、溶離液12は1mMのEDTA2Naと500mMの過塩素酸ナトリウムを含んだ20mMトリス緩衝液(pH7.65)を、分析カラム60は東ソー株式会社製陰イオン交換カラム(TSKgel DEAE−NPR)を、反応液70はセロテック社製コレステロール酵素反応液(TCHO−L)を、それぞれ用いた。分析カラム60から溶出したリポ蛋白は反応液70と混合後、45℃に維持されたリアクター80内のポリテトラフルオロエチレン(PTFE)配管を通過することで反応し、反応した成分を検出器(可視吸光度計)90(測定波長:600nm)で検出する。
(条件1)
濾紙51c:
保留粒子径0.8μm、No.1650濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51d:
孔径0.45μm、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
金属網51g:
濾過精度60μm、ステンレス金網、日本精線製
(条件2)
濾紙51c:
保留粒子径0.8μm、No.1650濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51d:
孔径0.45μm、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター51g:
濾過精度10μm、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
(条件3)
濾紙51c:
保留粒子径0.8μm、No.1650濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51d:
保留粒子径10μm、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51e:
孔径0.45μm、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
金属網51g:
濾過精度60μm、ステンレス金網、日本精線製
(条件4)
濾紙51c:
保留粒子径0.8μm、No.1650濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51d:
保留粒子径10μm、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51e:
孔径0.45μm、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター51g:
濾過精度10μm、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
オートサンプラー40から血清を15μL/回で5分ごとに注入し、フィルター50の圧力を観察した。なお、溶離液の送液条件は溶離液11が100%で流速は0.5mL/minである。また、フィルター50の条件は前記条件2および条件4とした。
フィルター50の条件を前述の条件1から4のいずれかとし、溶離液の送液条件を溶離液11が75%で溶離液12が25%とし、溶離液11と溶離液12との合計流量を0.5mL/minとした他は、実施例1と同様な方法で評価を行なった。結果を表2に示す。初期圧力からの圧力の差圧(かっこ内の数値)を見ると、条件1に比べて条件3が、条件2に比べて条件4が、それぞれ圧力上昇が小さいことがわかる。このことから、メンブレンフィルターとして、捕獲粒子径(孔径)が5μm以上のメンブレンフィルターと捕獲粒子径(孔径)が5μm未満のメンブレンフィルターとを組み合わせて使用すると、フォルターの詰まりが生じにくくなり、圧力上昇が抑えられるため、フィルターの交換回数を減少させることができる点で好ましいといえる。
図1に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。オートサンプラー40から血清を15μL/回で5分ごとに8回注入し、その後フィルター50を新しいものに交換してからカラムの圧力を観察した。溶離液の送液条件は、溶離液11が75%で溶離液12が25%であり、溶離液11と溶離液12との合計流量は0.5mL/minである。フィルター50の条件は前述の条件1から4のいずれかであり、フィルター50内のパッキン(図2の51f)はフィルター有効径が9mm径となるものを使用した。また、ステンレス鋼の破砕粉末の粒子を焼結して作成した焼結フィルター(濾過精度1μm)を分析カラム60の両端(入口側/出口側)に設けている。
図1に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。分析を実施する前に、フィルター50中の濾紙51c、メンブレンフィルター51d・51e、焼結フィルター51gの全部または一部をエージング処理を行なった後、血清試料を5回連続測定した。エージング処理は、0.5%のBSA溶液(純水による溶解液)をシリンジで2.0mL導入することで実施した。本実施例の測定条件を以下に示す。
(測定条件)
フィルター50(前述の条件4):
濾紙51c:
保留粒子径0.8μm、No.1650濾紙、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51d:
保留粒子径10μm、ポリエステル繊維フィルター、アドバンテック東洋製
メンブレンフィルター51e:
孔径0.45μm、セルロース混合エステルフィルター、アドバンテック東洋製
焼結フィルター51g:
濾過精度10μm、ステンレス繊維焼結タイプフィルター、日本精線製
溶離液11:
1mMのEDTA2Naを含んだ20mMトリス緩衝液(pH7.65)
溶離液12:
1mMのEDTA2Naと500mMの過塩素酸ナトリウムを含んだ20mMトリ
ス緩衝液(pH7.65)
ポンプ21・22・23:DP−8020(東ソー株式会社製)
ポンプ21・22の流速:0.5mL/min
ポンプ21・22のグラジエント条件
0から2.0min 溶離液11:溶離液12=82.8:17.2
2.0から4.0min 溶離液11:溶離液12=78.2:21.8
4.0から5.5min 溶離液11:溶離液12=76.4:23.6
5.5から7.0min 溶離液11:溶離液12=67.4:32.6
7.0から8.0min 溶離液11:溶離液12=0.0:100.0
8.0から10.0min 溶離液11:溶離液12=90.0:10.0
ポンプ23の流速:0.2mL/min
測定時間:10分/テスト
ミキサー30:ミキサーC(東ソー株式会社製)
オートサンプラー40:AS−8020(東ソー株式会社製)
試料注入量:2.0μL(血清)/テスト
分析カラム(陰イオン交換カラム)60:
TSKgel DEAE−NPR(カラムサイズ 内径3.0mmID 長さ15
mm、東ソー株式会社製)
反応液(コレステロール酵素反応液)70:TCHO−L(セロテック社製)
リアクター80:内径0.25mm×長さ30mのPTFE配管
リアクター80温度:45℃
検出器(可視吸光度計)90:UV−8020(東ソー株式会社製)
検出器90の検出波長:600nm
試料の回収率として、測定5回目の各リポ蛋白の測定結果(各リポ蛋白のピーク面積の総和)を100%としたときの、測定1回目から4回目までの面積(%)を算出した。結果を表4に示す。また、図3に実験1のエージング処理を行なったときの測定5回目の測定結果のクロマトグラムを示す。なお、本実施例で用いた血清の総コレステロールは、177mg/dLである。
図1に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例3と同じである。分析を実施する前に、フィルター50中の全ての構成要素(濾紙51c、メンブレンフィルター51d・51e、焼結フィルター51f)について、下記に示すエージング溶液をシリンジで1.0mL導入することでフィルター50をエージング処理した。
(エージング溶液)
溶液1:0.5%のBSAを含む20mMトリス緩衝液(pH7.5)
溶液2:0.5%のBSAと250mMの過塩素酸ナトリウムを含む20mMトリス
緩衝液(pH7.5)
溶液3:0.5%のBSAと500mMの過塩素酸ナトリウムを含む20mMトリス
緩衝液(pH7.5)
溶液4:0.5%のBSAと250mMの塩化ナトリウムを含む20mMトリス緩衝
液(pH7.5)
溶液5:0.5%のBSAと250mMの硝酸アンモニウムを含む20mMトリス緩
衝液(pH7.5)
溶液6:0.5%のBSAと150mMのチオシアン酸カリウムを含む20mMトリ
ス緩衝液(pH7.5)
溶液7:0.5%のBSAと100mMのグアニジン塩酸を含む20mMトリス緩衝
液(pH7.5)
溶液8:0.5%セリシン水溶液
溶液9:0.5%のセリシンを含む250mM過塩素酸ナトリウム水溶液
血清試料を5回連続測定後、測定試料の回収率として、測定5回目の各リポ蛋白の測定結果(各リポ蛋白のピーク面積の総和)を100%としたときの測定1回目から4回目までの面積(%)を算出した。結果を表5に示す。
図1に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例3と同じである。分析を実施する前に、フィルター50中の全ての構成要素(濾紙51c、メンブレンフィルター51d・51e、焼結フィルター51f)について、下記に示すエージング溶液をシリンジで2.0mL導入することでフィルター50をエージング処理した。
(エージング溶液)
溶液10:0.5%のBSAを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
溶液11:0.5%のBSAを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)
溶液12:0.5%のBSAを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)
溶液13:0.5%のBSAを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
溶液14:0.5%のBSAを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.6)
溶液15:0.5%のBSAを含む20mMトリス緩衝液(pH8.5)
溶液16:0.5%のBSAを含む20mMトリス緩衝液(pH9.5)
溶液17:0.5%のセリシンを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
溶液18:0.5%のセリシンを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.6)
溶液19:0.5%のセリシンを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)
血清試料を5回連続測定後、測定試料の回収率として、測定5回目の各リポ蛋白の測定結果(各リポ蛋白のピーク面積の総和)を100%としたときの測定1回目から4回目までの面積(%)を算出した。結果を表6に示す。
図5に示すリポ蛋白分析装置を用いて評価を行なった。測定条件は実施例3と同じである。図5の装置はオートサンプラーとエージング溶液導入手段とが一体となった態様となっている。下記に示すエージング処理を自動的に実施した後に血清試料中のリポ蛋白分析を連続5回実施した。
(エージング処理方法)
実験A:
フィルター50と分析カラム60との間の流路切り換えバルブ112をONとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター50から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液11を流しながらエージング溶液
102(血清:500mM過塩素酸ナトリウム溶液=1:1)2μLをオートサン
プラー40より1.5分間隔で8回フィルター50に導入することにより、エージ
ング処理を実施した。エージング処理後流路切り換えバルブ112をOFFにし、
連続5回分析した。
フィルター50と分析カラム60との間の流路切り換えバルブ112をONとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター50から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液11を流しながらエージング溶液
102(血清)2μLをオートサンプラー40より1.5分間隔で6回フィルター
50に導入することにより、エージング処理を実施した。エージング処理後、流路
切り換えバルブ112をOFFにし、連続5回分析した。
フィルター50と分析カラム60との間の流路切り換えバルブ112をONとする
ことで、エージング処理に伴いフィルター50から溶出したエージング溶液がカラ
ムに導入されないようにした状態で、溶離液12を流しながらエージング溶液
102(血清)2μLをオートサンプラー40より1.5分間隔で6回フィルター
50に導入することにより、エージング処理を実施した。エージング処理後、流路
切り換えバルブ112をOFFにし、連続5回分析した。
21、22、23:ポンプ
30:ミキサー
40:オートサンプラー
41:洗浄液
42、101:シリンジ
43:サンプルループ
44、111、112:六方バルブ
45:ニードル
46:試料
47、103:3方バルブ
50:フィルター
51:フィルターケース
51a:フィルターケース入口
51b:フィルターケース出口
51c:濾紙
51d、51e:メンブレンフィルター
51f:パッキン
51g:金属網または焼結フィルター
52:フィルターハウジング
52a:フィルターハウジング入口
52b:フィルターハウジング出口
52c:フィルターケース押さえ
52d:フィルターハウジング締付用ノブ
60:分析カラム
70:反応液
80:リアクター
90:検出器
100:エージング溶液導入手段
102:エージング溶液
Claims (11)
- 溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフで用いる、試料導入手段と分析カラムとの間に備えたフィルターであって、
試料導入手段側から順に、濾紙、1枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けた、前記フィルター。 - フィルターに設けるメンブレンフィルターがそれぞれ異なる孔径を有した2枚以上のメンブレンフィルターであり、かつ試料導入手段側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径が分析カラム側に設けたメンブレンフィルターの有する孔径よりも大きい、請求項1に記載のフィルター。
- 請求項1または2に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理した、エージング処理フィルター。
- エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、請求項3に記載のエージング処理フィルター。
- 請求項1または2に記載のフィルターにタンパク質を含むエージング溶液を導入して処理する、フィルターのエージング処理方法。
- エージング溶液がさらにカオトロピックイオンを含んでいる、請求項5に記載のフィルターのエージング処理方法。
- 溶離液を送液する溶離液送液手段と、試料を導入する試料導入手段と、導入された試料を分離する分析カラムと、分析カラムから溶出した成分を検出する検出手段と、を備えた液体クロマトグラフであって、
試料導入手段と分析カラムとの間に、試料導入手段側から順に、濾紙、1枚以上のメンブレンフィルター、焼結フィルター、を設けたフィルターを備えた、前記液体クロマトグラフ。 - タンパク質を含むエージング溶液をフィルターに導入してフィルターをエージング処理するエージング溶液導入手段と、
フィルターを通過した溶液が流れる流路とカラムへ導入する流路または廃液への流路とを切り替え可能な流路切り替え手段と、
をさらに備えた請求項7に記載の液体クロマトグラフ。 - 試料導入手段とエージング溶液導入手段とが一体となった、請求項8に記載の液体クロマトグラフ。
- 分析カラムから溶出した成分を誘導体化させるための反応液を送液する反応液送液手段と、
前記溶出した成分を反応液により誘導体化させる反応手段と、
をさらに備えており、
検出手段が反応手段により誘導体化された前記溶出した成分を検出する手段である、
請求項7から9のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。 - 試料がリポ蛋白を含む血液試料である、請求項7から10のいずれかに記載の液体クロマトグラフ。
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JP5521218B2 (ja) | 2014-06-11 |
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