JP2013048611A - ウエルシュ菌の検出方法およびウエルシュ菌検出用のキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ウエルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子、cpe遺伝子に含まれるターゲット領域に対するプライマー対のセットを設計し、かかるプライマー対のセットを用いて一本鎖核酸として遺伝子産物を増幅する。さらにかかる増幅産物を、プライマー対のセットとは異なるターゲット領域内の配列にハイブリダイズする第1プローブ結合標識高分子担体と、固相化した第2プローブ担持展開支持体を用い、核酸クロマトグラフ法を実施する。
【選択図】図1
Description
Chain Reaction)法を用いた検査方法があり、それに適したプライマーが発見されている。この方法は、鋳型の熱変性から、鋳型とプライマーのアニーリングを経て、プライマーの伸張反応までを1サイクルとするため、1分間隔で温度を上下させ得る特別な機器を必要とするだけでなく、検査に要する所要時間も約3時間程度はかかる方法である。
Amplification)法を用いる場合においては特別な機器を用いる必要がなく、RNAを鋳型として簡便にワンステップで標的核酸を増幅できる。
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸を、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとにより1本鎖核酸とすることによって増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記した(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法に関する。
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸から配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとを用いて1本鎖核酸とすることにより増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記した(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とする検出キットに関する。
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸を、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとにより1本鎖核酸とすることによって増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記した(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法である。
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸から配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとを用いて1本鎖核酸とすることにより増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記した(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とする検出キットである。
エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌を検出対象とする食中毒原因菌の検出に際して、検体試料中より任意に抽出された標的核酸を増幅させるが、上記エンテロトキシン産生ウエルシュ菌に特異的な標的核酸としては、cpe遺伝子、特にその転写産物であるmRNAに含まれる領域の核酸を例示することができる。
Microorganism Research社製)等の市販品を用いることもできる。
(B) 逆転写酵素により、標的核酸を鋳型にしてリバースプライマーの3’末端側からDNAを合成し、RNA鎖とDNA鎖からなる二本鎖核酸を形成する工程;
(C) RNA鎖とDNA鎖からなる二本鎖核酸の内、RNAのみをRNaseHにより分解して一本鎖DNAを形成する工程;
(D) ついで該一本鎖DNA(第二鋳型)とファワードプライマーが配列特異的にハイブリダイズする工程;
(E) 逆転写酵素により、該一本鎖DNAを鋳型(第二鋳型)にしてファワードプライマーの3’末端側からDNAを合成し、RNAポリメラーゼのプロモーターを有する二本鎖DNAを形成する工程;
(F) RNAポリメラーゼにより、該二本鎖DNAから一本鎖RNA(第三鋳型)を合成する工程;
(G) 該一本鎖RNA(第三鋳型)とファワードプライマーが配列特異的にハイブリダイズする工程;
(H) 逆転写酵素により、該一本鎖RNA(第三鋳型)を鋳型にしてファワードプライマーの3’末端側からDNAを合成し、RNA鎖とDNA鎖からなる二本鎖核酸を形成する工程;
(I) RNA鎖とDNA鎖からなる二本鎖核酸の内、RNAのみをRNaseHにより分解して一本鎖DNA(第四鋳型)を形成する工程;
(J) ついで該一本鎖DNA(第四鋳型)とリバースプライマーが配列特異的にハイブリダイズする工程;
(K) 逆転写酵素により、該一本鎖DNAを鋳型(第四鋳型)にしてリバースプライマーの3’末端側からDNAを合成し、RNAポリメラーゼのプロモーターを有する二本鎖DNAを形成する工程;
(L) RNAポリメラーゼにより、該二本鎖DNAから一本鎖RNA(第三鋳型)を合成する工程;
(M) 工程(G)から工程(L)を繰り返す。
上記したNASBA法により増幅された前記工程(a)の増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する。
ethanesulfonic acid)(埼京化成社製)緩衝液で洗浄及び再懸濁して調製する方法を挙げることができる。
ついで、第1プローブ配列を有するヌクレオチドが結合している標識高分子担体が、第2プローブ配列を有するヌクレオチドが展開支持体上の固相化されている位置に達した所定の位置で蓄積することにより、所定の位置に現れる着色ラインや着色スポット等の有無を検出像として直接又は蛍光可視化装置で、判定することによりウエルシュ菌の存否、および量を評価することができ、かかる評価により検出対象食中毒菌(エンテロトキシン産生ウエルシュ菌)を検出することができる。なお、上記判定は、簡便性の点で目視判定とすることが好ましい。
本発明のエンテロトキシン産生ウエルシュ菌の検出用キットとしては、上記本発明のエンテロトキシン産生ウエルシュ菌の検出のために用いることができ、試料中より任意に抽出されたエンテロトキシン産生ウエルシュ菌に特異的な標的核酸を増幅することのできる配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマー対とを備えたものである。
プライマーおよびプローブ性能を確認するため、プラスミドベクターを利用したDNAクローニングによって、cpe遺伝子領域の合成 RNAを作製した。具体的には、まず、プラスミドベクターに、ウエルシュ菌の標的遺伝子cpeのDNA断片を挿入後、宿主となる大腸菌に形質転換し、標的遺伝子領域をクローニングした組換え体を作製した。大腸菌から組み換えプラスミドを抽出した後、MEGAscript Kit(Ambion社製)を用いてプロトコールにしたがってRNAを合成した。合成RNAのコピー数は、分光光度計を用い波長260nmにおける吸光度より算出した。
オリゴヌクレオチドプローブとカルボキシル基含有ポリスチレンラテックスとを結合させるために、プローブ配列の5’末端にアミノ基を導入した5’末端アミノ基導入オリゴヌクレオチドをDNA合成機により合成した。配列番号3および10〜13のプローブ配列を有するヌクレオチドと、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(Bangs社製)とを、水溶性カルボジイミドを50mMのMES(2-Morpholinoethanesulfonic
acid、monohydrate)(同仁化学研究所社製)緩衝液中で混合し、ラテックス中のカルボキシル基とプローブのアミノ基とを結合させた後、モノエタノールアミン(和光純薬工業社製)を添加し、さらに反応させた。
オリゴヌクレオチドプローブと、カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(ポール社製)とを結合させるために、プローブ配列の3’末端にアミノ基を導入した3’末端アミノ基導入オリゴヌクレオチドをDNA合成機により合成した。上記メンブレンを水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄し活性化させた。
さらに本発明に用いられる核酸クロマトグラフ用試験片を以下のように作製した。具体的にはプローブ配列を有するヌクレオチドが結合している標識高分子担体を緩衝液に溶解して展開パッド(ADVANTEC社製)に塗布した後、乾燥させて保持部とした。さらに上記展開支持体の一端に、上記展開支持体とは重なり合わない部分で保持部を連結した。さらに、該展開支持体の他端に吸収パッド(ADVANTEC社製)を連結し、核酸クロマトグラフ測定用試験片とした。
配列番号3、4、11〜13のプローブを固相化した展開支持体と、配列番号3、10〜13のプローブと結合した標識高分子担体を用いて、核酸クロマトグラフ測定用試験片を作製し、1010コピーのin vitro合成RNAを使用して、最も効率よく核酸クロマトグラフで検出し得るプローブ対を調べた。
配列番号3のヌクレオチドを第1プローブとし、配列番号4のヌクレオチドを第2プローブとした時、最も効率よく標的核酸を検出し得ることが判明した(図1参照)。
フォワードプライマーとしては、配列番号1、5、6に示されるヌクレオチド配列を用いられた。鋳型としては実施例1の〔合成RNAの作製〕で作製したcpe RNAを用い、in vitro合成RNAをRNase
free waterで段階希釈し、100コピー/テストに調製した。またNASBA法の実施に必要な試薬は、NASBA Amplification キット(カイノス社製)を使用し、NASBA法はそのキットの操作手順に従い実施した。
Clonig 第2版に従い実施した。
フォワードプライマーとしては、配列番号1を用いると、何れのリバースプライマーともNASBA法により目的長の増幅産物が得られることが判明した(図2(A)参照)。
つぎに、フォワードプライマーとしては、配列番号1を用い、リバースプライマーとしては、その5’末端側にRNAポリメラーゼプロモーター配列が付加された配列番号2、7、8、9に示されるヌクレオチド配列が用い、10コピー/テストのin vitro合成RNAを鋳型にして、NASBA増幅時間を30分に短縮し、その他の操作は前記した実施例2の〔フォワードプライマーの決定〕と同じ操作でより高い効率でNASBA増幅可能なプライマー対を調べた。
その結果、配列番号1のフォワードプライマーの対となるリバースプライマーとしては、配列番号2を用いた時、NASBA法において最も増幅効率が優れることが判明した(図2(B)参照)。
フォワードプライマーとしては、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を用い、リバースプライマーとしては、その5’末端側にRNAポリメラーゼプロモーター配列が付加された配列番号2に示されるヌクレオチド配列を用いて、10コピー/テストのin vitro合成RNAを鋳型として、NASBA増幅を行った。また、ネガティブコントロールとしては、in vitro合成RNA の代わりに、RNase free water を用いた。
その結果、その増幅産物を目視およびイムノクロマトリーダにて検出することができ(図3参照)、しかもNASBA法によりわずか10コピーの鋳型を、増幅時間15分のきわめて短い時間で増幅させるプライマーを見いだす事に成功した。
上記した実施例1〜3で得られたそれぞれの結果においてエンテロトキシン遺伝子を有するウエルシュ菌のみを検出することができるかについて確かめるため、エンテロトキシン遺伝子を有するウエルシュ菌としては、NCTC8239株を使用し、またエンテロトキシン遺伝子を持たないウエルシュ菌株としては、ACTT13124株を使用し、本発明のプライマーセット、プローブセットを用いてそれぞれの特異性について調べた。
エンテロトキシン産生ウエルシュ菌から抽出した核酸を試料として用いた場合には、核酸クロマトでライン検出されるが、エンテロトキシン非産生のウエルシュ菌から抽出した核酸を試料として用いた場合には、核酸クロマト上にラインは検出されなかった。即ち、cpe遺伝子を有するエンテロトキシン産生ウエルシュ菌は検出可能だが、cpe遺伝子を保持しないウエルシュ菌は検出されないことが解った。従って、上記プライマー対およびプローブ対は、エンテロトキシン産生ウエルシュ菌を特異的に検出し得ると判明した(図4参照)。
上記の実施例1〜4で得られた結果により、食品試料中のエンテロトキシン産生ウエルシュ菌を検出できるかについて、実際にカレー材料を用いて調べた。カレー材料には、野菜や肉類、果物、調味料、香辛料、油などが含まれている。カレー材料としては、カリー屋カレー(ハウス食品社製)を用い、培養したエンテロトキシン産生ウエルシュ菌をカレー材料1gあたり106cfu添加し、ウエルシュ菌入りの食品試料とした。
食品試料としてウエルシュ菌を添加していないカレー材料を用いた場合、ラインは検出されないが、食中毒を発症するに足る菌数のエンテロトキシン産生ウエルシュ菌を添加した食品試料を用いた場合は、ラインの検出が確認された(図5参照)。
検査対象となる試料の任意性を調べる為、食品試料に加え、血液成分である血漿を試料としエンテロトキシン産生ウエルシュ菌を検出できるかについて実験した。培養したエンテロトキシン産生ウエルシュ菌を血漿中に1mLあたり106cfu添加し、ウエルシュ菌入りの血漿試料とした。
ウエルシュ菌を添加していない血漿試料を用いた場合、ラインは検出されないが、食中毒を発症するに足る菌数のエンテロトキシン産生ウエルシュ菌を添加した血漿試料を用いた場合は、ラインの検出が確認された(図6参照)。
Claims (5)
- エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌を検出対象とする食中毒菌の検出方法であって、検体試料中より任意に抽出された標的核酸を増幅することができる配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマー対とを備えたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法。
- エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌を検出対象とする食中毒菌の検出方法であって、検体試料中より任意に抽出された標的核酸をNASBA法に代表される(核酸増幅)技術を使い、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’の末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとにより一本鎖核酸として増幅するようにしたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法。
- エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌を検出対象とする食中毒菌の検出方法であって、検体試料中より任意に抽出された標的核酸を増幅した核酸を、配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第1のプローブと、該第1のプローブと対をなすところの、配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第2のプローブとにより検出するようにしたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法。
- エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌(clostridium perfringens)を検出対象とする食中毒原因菌の検出方法であって、
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸を、配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとにより1本鎖核酸とすることによって増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とするウエルシュ菌の検出方法。 - エンテロトキシン(cpe)遺伝子を有するウエルシュ菌(clostridium perfringens)を検出対象とする食中毒原因菌を検出するためのものであって、
(a)検体試料中より任意に抽出された標的核酸から配列番号1に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示されるヌクレオチド配列及びその5’末端側に付加されたRNAポリメラーゼプロモーター配列からなるリバースプライマーとを用いて1本鎖核酸とすることにより増幅させる工程;
(b)前記増幅産物を、核酸クロマト法を用いて、展開支持体に担持された配列番号3に示されるヌクレオチド配列からなる第2プローブ及び標識高分子担体に結合した配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなる第1プローブとハイブリダイズさせて検出する工程;
(c)検出像を判定することによりウエルシュ菌の有無を評価する工程;
上記(a)〜(c)の工程を備えたことを特徴とするウエルシュ菌検出用のキット。
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