JP2012533314A - 核酸の特異的解析のためのプローブ - Google Patents
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Abstract
Description
(a)核酸試料を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)前記標的断片を包含する前記断片を少なくとも部分的に一本鎖とするステップであって、該一本鎖部分が末端部分を包含し、かつ、前記一本鎖部分の長さが、前記標的断片の該一本鎖部分の少なくとも一部を、ステップ(c)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(c)ステップ(b)の少なくとも部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、前記プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮(特に、検出、増幅、および/または捕捉)するための少なくとも1つのエレメントを含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより、前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされる、
ステップと、
(d)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の該一本鎖部分の一部に直接的または間接的にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(e)前記プローブ−標的断片ハイブリッドを検出または濃縮するステップと
を含む方法を提供する。
「(c)ステップ(b)の少なくとも部分的に一本鎖の断片を、標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、各標的断片には単一のプローブを用い、」
と表現することができる。
(a)核酸試料を断片化して、前記標的核酸を含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、アニーリングしたアダプターが、該断片鎖の3’端だけ、または5’端だけにおいて、該断片にライゲーションされるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を一本鎖とするステップと、
(d)ステップ(c)の一本鎖断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、ステップ(b)において前記共通の核酸アダプターがライゲーションされる末端以外の、前記一本鎖標的断片の末端の一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、該プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、増幅プライマー結合部位、ならびに、任意選択的に、固相へと固定化するためのエレメントを含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされる、
ステップと、
(e)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の末端にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(f)該プローブのオリゴヌクレオチドB内の該増幅プライマー結合部位と、該共通の核酸アダプター内の増幅プライマー結合部位とを介する増幅により前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮し、かつ、任意選択的に、該プローブのオリゴヌクレオチドB内の該固定化エレメントを介して、前記断片を固相へと固定化するステップと
を含む。
(a)核酸を断片化して、前記標的核酸を含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)3’側または5’側におけるエキソヌクレアーゼ消化により、前記標的断片を包含する前記断片を部分的に一本鎖とするステップであって、該結果として得られる一本鎖末端部分の長さが、前記標的断片の該一本鎖末端部分の少なくとも一部を、ステップ(c)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(c)ステップ(b)の部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と(または、より具体的には、前記一本鎖部分の末端部分と)配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、該プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、固相へと固定化するためのエレメント、ならびに、任意選択的に、増幅プライマー結合部位を含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされる、
ステップと、
(d)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の末端にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(e)該プローブのオリゴヌクレオチドB内の該固定化エレメントを介して固相へと固定化することにより、かつ、任意選択的に、該プローブのオリゴヌクレオチドB内の該増幅プライマー結合部位を介して前記標的断片を増幅することにより、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む。
(a)核酸試料を断片化して、前記標的核酸を含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)任意選択的に、前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、アダプターを、該標的断片鎖の少なくとも3’端にライゲーションし、その5’端には、ステップ(f)でプローブのオリゴヌクレオチドBをライゲーションするように、該アニーリングしたアダプターを、該断片鎖の3’端、または3’端および5’端において、該断片にライゲーションするステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を一本鎖とするステップと、
(d)ステップ(c)の一本鎖断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記一本鎖標的断片の内部非末端部分と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、該プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメント(または、より具体的には、検出エレメント、増幅エレメント、および/もしくは捕捉エレメント)を含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより、前記内部非末端部分において前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされ、前記ハイブリダイゼーションが、該標的断片の5’端に、Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を形成させる、
ステップと、
(e)前記Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を切断して、前記プローブのオリゴヌクレオチドAにハイブリダイズする前記標的断片のライゲーション可能な5’端を作製するステップと、
(f)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の該一本鎖部分の一部にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(g)前記検出エレメントおよび/または濃縮エレメント(または、より具体的には、検出エレメント、捕捉エレメント、および/もしくは増幅エレメント)を介して、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む。
(a)核酸試料を断片化して、前記標的核酸を含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)任意選択的に、前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、該アニーリングしたアダプターが、該断片鎖の3’端だけにおいて、または5’端だけにおいて、該断片にライゲーションされるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を少なくとも部分的に一本鎖とするステップであって、該一本鎖部分が末端部分を包含し、かつ、前記一本鎖部分の長さが、前記標的断片の該一本鎖部分の少なくとも一部を、ステップ(d)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(d)ステップ(c)の少なくとも部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と(または、より具体的には、末端部分と)配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、標的特異的な第1の部分であって、任意選択のステップ(b)により、共通の核酸アダプターを該断片にライゲーションする場合は、前記少なくとも部分的に一本鎖の標的断片の、該共通の核酸アダプターがライゲーションされる末端以外の末端の一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、
かつ、該プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む、非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメント(または、より具体的には、検出エレメント、増幅エレメント、および/もしくは捕捉エレメント)を含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより、前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされる、
ステップと、
(e)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の該一本鎖部分の一部にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(f)必要な場合は、該標的断片の少なくとも一方の末端であって、該プローブがそれにライゲーションされず、任意選択のステップ(b)により共通の核酸アダプターを断片にライゲーションする場合にはこのようなアダプター配列を含む末端を、二本鎖とするステップと、
(g)ステップ(f)の二本鎖末端を、該プローブの標的断片に結合しない遊離末端と、分子内において非標的特異的にアニーリングさせるステップと、
(h)該プローブ−標的断片ハイブリッドのオリゴヌクレオチドBを、ステップ(f)の二本鎖末端の対応する鎖とライゲーションして、前記ハイブリッドを環状化するステップと、
(i)直鎖状分子に対する該環状分子の比を増大させる手段により、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む。
(a)標的断片を検出および/または濃縮する(または、より具体的には、検出、増幅および/もしくは捕捉する)ための少なくとも1つのエレメントを含有または保有することが可能であり、かつ、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的である、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的断片ならびに前記非標的特異的な第2の部分が、上記で規定される通りである、オリゴヌクレオチドBと、
(b)標的断片の一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、オリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む、非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖部分および前記標的断片が、上記で規定される通りである、1または複数のオリゴヌクレオチドAと、
(c)
(i)1または複数の制限エンドヌクレアーゼ、ならびに/あるいは
(ii)共通の核酸アダプター、または、保有される分子タグにおいておよび/もしくはそれを介して前記断片にアニーリングする該末端において互いに異なる、このようなアダプターの複数の変化形と
を含むキットが提供される。
平滑末端を生成させるため、制限酵素消化したヒトゲノムDNAを、T4 DNAポリメラーゼと共にインキュベートした。その後、Taqポリメラーゼを付加することにより3'アデノシン突出を生成させ、この産物を、T4 DNAリガーゼを用いる別個の反応において、3’突出チミジンを伴うアダプターにライゲーションした。次いで、共通のプローブ−オリゴヌクレオチドBと併せて、in silicoでデザインした17のプローブ−オリゴヌクレオチドAを、反応混合物へと添加した。次いで、反応物を熱変性させ、プローブを、制限酵素消化したゲノムDNA試料中の17の特異的なゲノム断片の一本鎖末端にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、プローブ上のビオチンを用いて、固相(ビーズ)によりプローブを捕捉した。ストリンジェントな洗浄後、プローブをビーズにライゲーションし、プローブおよびアダプターのそれぞれに位置する1つの共通のプライマー対を用いるPCRにより、すべての断片を増幅した。ゲル電気泳動およびqPCRにより結果を解析した。
表2で概観される5つの個別の反応において組み合わされる10の異なる制限酵素を用いて、ゲノムDNAを制限酵素消化した。各制限酵素10単位ずつを用いて、37℃で2時間にわたり、1μgのDNAを消化した。
1倍濃度の専用緩衝液(50mMのKAc、3mMのMgAc、20mMのトリスAc、1mMのDTT、0.1μg/μlのBSA)中に3単位のT4ポリメラーゼならびに0.1mMのdNTPを、15μlの全反応容量中で用いて、0.5μgの消化したゲノムDNAから、平滑末端を生成させた。2つの濃縮反応を個別に実施し、制限酵素消化したゲノムDNAを添加しない1つのさらなる陰性対照反応を実施した。すべての反応物を、12℃で15分間にわたり、かつ、65℃で20分間にわたりインキュベートした。
1倍濃度の専用緩衝液5μl中に1UのSAPを添加することにより、5'リン酸を除去した。反応物を、37℃で15分間にわたり、かつ、65℃で15分間にわたりインキュベートした。
1倍濃度の専用緩衝液5μl中に5UのTaqポリメラーゼ、0.5mMのdATPを添加することにより、アデノシンによる3'突出末端を生成させた。反応物を、72℃で20分間にわたりインキュベートした。
15単位のT4 DNAリガーゼを用いて、0.83μMのアミン修飾したアダプター(全断片末端の5倍濃度)、ならびに1mMのATPを、ゲノムDNAにライゲーションした。全反応容量は、1倍濃度の専用緩衝液中に30μlであった。反応物を、16℃で一晩にわたりインキュベートし、かつ、65℃で20分間にわたり熱不活化した。
30μlの反応物のうちの12.5μl、0.1nMの各プローブ−オリゴヌクレオチドAならびに7.73nMのビオチニル化プローブ−オリゴヌクレオチドB、27.27%のホルムアミドならびに0.7倍濃度のBind&Wash緩衝液を、27.5μlの全反応容量中で用いて(1倍濃度のB&W緩衝液:1MのNaCl、5mMのEDTA、0.1%のTween−20、10mMのトリスHCl pH7.5)、プローブのハイブリダイゼーションを実施した。反応物を、95℃で10分間、75℃で30分間、68℃で30分間、62℃で30分間、55℃で30分間、46℃で10時間、10℃で一晩にわたりインキュベートした。
対象のDNA試料に由来するゲノムDNAを、切断のまれな制限酵素により消化する。それにより、制限断片が末端配列を共有しなくなるため、II型酵素を用いることが好ましい場合がある。後続のステップにおけるプロセシングに適するように、該酵素は5'突出をさらに残すものとする。
Claims (39)
- 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮する方法であって、
(a)核酸試料を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)前記断片の末端に、共通の核酸アダプターまたはその複数の変化形を非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、標的断片鎖の3’端および/または5’端だけにアダプターがライゲーションされ、その他方の末端ではステップ(e)でプローブのオリゴヌクレオチドBが標的断片鎖にライゲーションされるように、アニーリングしたアダプターが断片鎖の前記末端において断片にライゲーションされ、かつ、前記変化形のアダプターが、保有される分子タグにおいておよび/またはアダプターが前記断片にアニーリングする末端において互いに異なるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を少なくとも部分的に一本鎖とするステップであって、一本鎖部分が末端部分を包含し、かつ、前記一本鎖部分の長さが、前記標的断片の一本鎖部分の少なくとも一部をステップ(d)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(d)ステップ(c)の少なくとも部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメントを含有または保有することが可能である一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされるステップと、
(e)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の一本鎖部分の一部に直接的または間接的にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(f)前記プローブ−標的断片ハイブリッドを検出または濃縮するステップと
を含む方法。 - ステップ(d)において、前記標的断片を、各々が異なる第1の標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドAを有する複数の核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させ、これにより複数の異なる標的断片をそれぞれ前記プローブにアニーリングさせうる、複数の標的DNAを検出または濃縮する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の核酸プローブにおいて、オリゴヌクレオチドBが、各プローブにおいて同じである共通の配列を含む、請求項2に記載の方法。
- 各プローブにおける前記共通の配列が、検出エレメントおよび/または濃縮エレメントを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記複数の核酸プローブが、同じオリゴヌクレオチドBを含む、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸試料が、ゲノムDNAまたはその亜画分を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸試料が、cDNAまたはその亜画分を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的断片が、少なくとも30ヌクレオチドを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において、前記断片化が、(i)酵素的断片化、および/または(ii)物理的断片化である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素的断片化が、制限エンドヌクレアーゼを介する、請求項9に記載の方法。
- 前記酵素的断片化が、核酸試料中の標的DNAに近接するその認識配列が多型である酵素を介し、これにより前記標的DNAの前記検出または濃縮がハプロタイプ特異的となる、請求項9または請求項10に記載の方法。
- 前記断片化が、ステップ(c)の前に、前記核酸試料のアリコートを1または複数の酵素的方法および/または物理的方法のそれぞれ異なる組合せに供し、かつ、断片化された核酸試料の前記アリコートをプールすることによる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)において、少なくとも部分的に一本鎖とすることが、(i)変性または(ii)エキソヌクレオリシスによる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドAの前記標的特異的な第1の部分が、前記少なくとも部分的に一本鎖である標的断片の末端における一本鎖部分と配列が相補的である少なくとも10ヌクレオチドを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分の長さが、少なくとも20ヌクレオチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドBにより含有または保有されている前記濃縮エレメントが、増幅エレメントおよび/または捕捉エレメントである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅エレメントおよび捕捉エレメントが、それぞれ増幅プライマー結合部位および固相へと固定化するためのエレメントである、請求項16に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドBが固相へと固定化される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドBが、分子タグをさらに保有または含有する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)において、オリゴヌクレオチドBの前記ライゲーションが、前記標的断片の末端に対してなされる、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)において、前記プローブ−標的断片ハイブリッド内の前記標的断片が、前記増幅プライマー結合部位にハイブリダイズしたプライマーから増幅される、請求項17に記載の方法。
- ステップ(f)において、前記プローブ−標的断片ハイブリッド内の前記標的断片が、前記固定化エレメントを介して固相へと固定化される、請求項17に記載の方法。
- ステップ(f)において、前記プローブ−標的断片ハイブリッド内の前記標的断片、またはその増幅産物が配列決定される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記共通の核酸アダプターが、増幅のためのエレメントを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)において、前記プローブ−標的断片ハイブリッド内の前記標的断片が、プローブのオリゴヌクレオチドB内およびアダプター内の増幅エレメントを介して増幅される、請求項24に記載の方法。
- 前記共通の核酸アダプターが分子タグを保有する、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非特異的アニーリングが、断片の末端を、アダプターの少なくとも一方の末端に対して粘着末端とすることによりなされ、断片鎖の3’端または5’端における断片へのアダプターの前記ライゲーションが、断片またはアダプターを、それぞれライゲーションの前に選択的に脱リン酸化することによりなされる、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において、核酸試料の前記断片化が、複数の核酸試料を個別に断片化することを含み、ステップ(b)が、それらの試料の断片に、異なる分子タグを保有する変化形のアダプターをそれぞれライゲーションし、前記アダプターをライゲーションした断片化された核酸試料をプールすることを含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)において、前記断片が、部分的に一本鎖とされるが、完全に一本鎖とされるわけではない、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において、前記断片化が、請求項10に記載する通りになされ、ステップ(b)が、プールされた、前記断片にアニーリングする末端において異なる変化形アダプターのアリコートを、断片にライゲーションすることを含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)において、オリゴヌクレオチドAの前記標的特異的な第1の部分が、前記少なくとも部分的に一本鎖の標的断片における一本鎖の内部非末端部分と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含み、前記内部非末端部分をオリゴヌクレオチドAの前記標的特異的な第1の部分にハイブリダイズすることにより、前記標的断片への前記プローブのアニーリングを行い、前記標的断片の5’端に、Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を形成させ、かつ、前記Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を切断して、前記プローブのオリゴヌクレオチドAにハイブリダイズする前記標的断片のライゲーション可能な5’端を作製することをさらに含む、請求項1から13、および15から30のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(e)において、オリゴヌクレオチドBの前記ライゲーションが、前記標的断片の前記ライゲーション可能な5’端に対してなされる、請求項31に記載の方法。
- ステップ(f)において、前記検出または濃縮が、直鎖状分子に対する環状分子の比を増大させる手段によりなされ、ステップ(e)とステップ(f)との間において、少なくとも標的断片の一方の末端であって、プローブがそれにライゲーションされず、ステップ(b)において断片にライゲーションされる共通の核酸アダプター配列を含むことになる末端を、二本鎖とするステップと、前記二本鎖末端を、プローブの標的断片に結合しない遊離末端と、分子内において非標的特異的にアニーリングさせるステップと、プローブ−標的断片ハイブリッドのオリゴヌクレオチドBを、前記二本鎖末端の対応する鎖とライゲーションして、前記ハイブリッドを環状化するステップとをさらに含む、請求項1から10、24、ならびに26から32のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(f)において、直鎖状分子に対する環状分子の比を増大させる前記手段が、エキソヌクレアーゼ処理および/またはローリングサークル増幅による、請求項33に記載の方法。
- 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮する方法であって、
(a)核酸試料を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、アニーリングしたアダプターが、断片鎖の3’端だけまたは5’端だけにおいて、断片にライゲーションされるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を一本鎖とするステップと、
(d)ステップ(c)の一本鎖断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、ステップ(b)において共通の核酸アダプターがライゲーションされる末端以外の前記一本鎖標的断片の末端の一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、増幅プライマー結合部位、および、任意選択的に固相へと固定化するためのエレメントを含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされるステップと、
(e)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の末端にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(f)プローブのオリゴヌクレオチドB内の増幅プライマー結合部位と、共通の核酸アダプター内の増幅プライマー結合部位とを介する増幅により前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮し、かつ、任意選択的に、プローブのオリゴヌクレオチドB内の固定化エレメントを介して、前記断片を固相へと固定化するステップと
を含む方法。 - 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮する方法であって、
(a)核酸を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)3’側または5’側におけるエキソヌクレアーゼ消化により、前記標的断片を包含する前記断片を部分的に一本鎖とするステップであって、結果として得られる一本鎖末端部分の長さが、前記標的断片の一本鎖末端部分の少なくとも一部を、ステップ(c)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(c)ステップ(b)の部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、固相へと固定化するためのエレメント、ならびに、任意選択的に増幅プライマー結合部位を含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされるステップと、
(d)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の末端にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(e)プローブのオリゴヌクレオチドB内の固定化エレメントを介して固相へと固定化することにより、かつ、任意選択的に、プローブのオリゴヌクレオチドB内の増幅プライマー結合部位を介して前記標的断片を増幅することにより、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む方法。 - 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮する方法であって、
(a)核酸試料を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)任意選択的に、前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、アダプターが、標的断片鎖の少なくとも3’端にライゲーションされ、5’端において、ステップ(f)でプローブのオリゴヌクレオチドBが標的断片鎖にライゲーションされるように、アニーリングしたアダプターが、断片鎖の3’端、または3’端および5’端において断片にライゲーションされるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を一本鎖とするステップと、
(d)ステップ(c)の一本鎖断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記一本鎖標的断片の内部非末端部分と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメントを含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより、前記内部非末端部分において前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされ、前記ハイブリダイゼーションが、標的断片の5’端に、Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を形成させるステップと、
(e)前記Flapエンドヌクレオリシスによる切断のための基質を切断して、前記プローブのオリゴヌクレオチドAにハイブリダイズする前記標的断片のライゲーション可能な5’端を作製するステップと、
(f)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の一本鎖部分の一部にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(g)前記検出エレメントおよび/または濃縮エレメントを介して、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む方法。 - 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮する方法であって、
(a)核酸試料を断片化して、前記標的DNAを含有する標的断片を包含する核酸断片を生成させるステップと、
(b)任意選択的に、前記断片の末端に、共通の核酸アダプターを非標的特異的にアニーリングさせるステップであって、アダプターが標的断片鎖の3’端および/または5’端だけにライゲーションされ、その他方の末端で、ステップ(e)でプローブのオリゴヌクレオチドBが標的断片鎖にライゲーションされるように、アニーリングしたアダプターが、断片鎖の前記末端において断片にライゲーションされるステップと、
(c)前記標的断片を包含する前記断片を少なくとも部分的に一本鎖とするステップであって、一本鎖部分が末端部分を包含し、かつ、前記一本鎖部分の長さが、前記標的断片の一本鎖部分の少なくとも一部をステップ(d)のプローブとハイブリダイズさせるのに十分であるステップと、
(d)ステップ(c)の少なくとも部分的に一本鎖の断片を、単一の標的特異的核酸プローブのオリゴヌクレオチドAおよびBと接触させるステップであって、
(i)オリゴヌクレオチドAが、前記標的断片の前記一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分であって、任意選択のステップ(b)により、共通の核酸アダプターを断片にライゲーションする場合は、前記少なくとも部分的に一本鎖の標的断片の、共通の核酸アダプターがライゲーションされる末端以外の末端の一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む標的特異的な第1の部分を、一方の末端において含み、
かつ、プローブのオリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
(ii)オリゴヌクレオチドBが、前記標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメントを含有または保有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的であり、
それにより、前記標的断片が、オリゴヌクレオチドAの標的特異的な第1の部分とハイブリダイズすることにより、前記プローブにアニーリングし、その結果として、1つの標的断片当たり1つの標的特異的プローブ結合イベントだけがもたらされるステップと、
(e)前記プローブのオリゴヌクレオチドBを、前記プローブのオリゴヌクレオチドAとハイブリダイズする前記標的断片の一本鎖部分の一部にライゲーションして、プローブ−標的断片ハイブリッドを作製するステップと、
(f)必要な場合は、標的断片の少なくとも一方の末端であって、プローブがそれにライゲーションされず、任意選択のステップ(b)により共通の核酸アダプターを断片にライゲーションする場合にこのようなアダプター配列を含む末端を、二本鎖とするステップと、
(g)ステップ(f)の二本鎖末端を、プローブの標的断片に結合しない遊離末端と、分子内において非標的特異的にアニーリングさせるステップと、
(h)プローブ−標的断片ハイブリッドのオリゴヌクレオチドBを、ステップ(f)の二本鎖末端の対応する鎖とライゲーションして、前記ハイブリッドを環状化するステップと、
(i)直鎖状分子に対する環状分子の比を増大させる手段により、前記プローブ−標的断片ハイブリッドを濃縮するステップと
を含む方法。 - 核酸試料中に存在する標的デオキシリボ核酸(DNA)を検出または濃縮するためのキットであって、
(a)標的断片を検出および/または濃縮するための少なくとも1つのエレメントを含有または保有することが可能であり、かつ、その一方の末端を包含する少なくとも一部が、オリゴヌクレオチドAの非標的特異的な第2の部分と配列が相補的である、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記標的断片ならびに前記非標的特異的な第2の部分が、請求項1に記載の通りである、オリゴヌクレオチドBと、
(b)標的断片の一本鎖部分の少なくとも一部と配列が相補的な少なくとも10ヌクレオチドを含む、標的特異的な第1の部分を一方の末端において含み、かつ、オリゴヌクレオチドBの一方の末端を包含する少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む非標的特異的な第2の部分を他方の末端において含む、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖部分および前記標的断片が、請求項1に記載の通りである、1または複数のオリゴヌクレオチドAと、
(c)
(i)1または複数の制限エンドヌクレアーゼ、ならびに/あるいは
(ii)共通の核酸アダプター、または、保有される分子タグにおいておよび/もしくは前記断片にアニーリングする末端において互いに異なるようなアダプターの複数の変化形と
を含むキット。
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