JP2012528597A - 血小板グリコプロテインｖｉの核酸調節因子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、血小板機能を制御する血小板グリコプロテインＧＰＶＩの活性と相互に作用することができ、かつ、その活性を調節することができる核酸リガンドに基づいて血小板の生物学的現象を調節するための薬理学系に全般的に関する。核酸リガンドの活性を抑制する調節因子を使用してこの薬理効果を無効化し、それによって、コラーゲン結合、血小板付着、コラーゲンによって誘導される血小板活性化、及び、コラーゲンによって誘導される血小板凝集を含むＧＰＶＩの機能を回復させることによって、これらの核酸リガンドは活性的に可逆である。さらに、本発明は、核酸リガンド、リガンド及び調節因子を含む組成物、核酸リガンド及びその調節因子を生成する方法のみならず、医学治療的及び診断処置においてこれらの物質及び組成物を使用する方法にも関する。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２００９年６月３日に提出された米国仮出願第６１／１８３，８４７号、及び、２０１０年２月３日に提出された米国仮出願第６１／３００９５１号に対する優先権を主張する。これによってこれこれらの内容は、参照としてそっくりそのまま組み入まれている。
一般に、本発明は、血小板特異的タンパクであるグリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合してその活性を制御する核酸リガンドを含む抗血小板薬理学系に関する。また、核酸リガンドの活性を抑制してその薬理効果を無効化し、それによってＧＰＶＩ機能を回復させる調節因子を使用すれば、これらの核酸リガンドは、活性的に可逆である。さらに、本発明は、核酸リガンド及び／又は調節因子を含む組成物のみならず、血小板を介してもたらされる疾病及び病気を治療する際にこれらの物質及び組成物を使用する方法にも関する。
血小板は、小さい無核血液細胞であり、正常条件下ではほとんど休止しているが、付着、活性化、凝集及び血栓形成によって、血管損傷に対して直ちに反応する。血小板の主要な機能は、組織外傷後の失血及び内皮下マトリクスの露出を止めることである。血管に対するダメージによって、特に、フォンビルブラント因子（ＶＷＦ）、コラーゲン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン及びラミニン等の細胞外マトリックス成分が血液に暴露され得ることが広く知られている。これらの露出した分子と血小板との相互作用が血小板細胞を活性化させる。
血小板は、止血及び血栓形成において主な役割を有するものとして以前から認識されているが、血小板が、炎症、腫瘍増殖及び転移等の様々な他の病気において、並びに、免疫学的接種者防御において重大な役割を果たし得ることがますます認識されるようになっている。従って、血小板受容体タンパクは、血小板を介してもたらされる病気を治療又は予防する一手段として血小板機能を調節するための魅力的な標的である。
グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）は、血小板において特異的に発現される膜貫通型タンパクであるので、特に魅力的な標的である。細胞外露出を有する細胞特異的分子は、治療部位に対する接近容易性、及び、その限られた発現特性に起因する（あるとしても）最小限の不利益な副作用の可能性の両方を提供する。
グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）は、コラーゲンに対する主要な血小板シグナル伝達受容体であり、血小板活性化を媒介する細胞内シグナルの生成において役割を有することが示されている（ワトソンら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２０００、１１：２５２−２５８）。ＧＰＶＩは、２個のＩｇＣ２環からなるＩｇスーパーファミリの６２〜６５ｋＤａのグリコプロテインであり、コラーゲン結合領域を含んでおり、潜在的な薬剤標的部位の典型である。このタンパクは、インビボにおいて非常に高度にグリコシル化及びシアル化されており、１個のグリコシル化部位が外側のＩｇＣ２様ドメインにみられる。免疫グロブリンスーパーファミリの一構成要素として、ＧＰＶＩはナチュラルキラー受容体に関連する。そのシグナリングは、ＦｃＲのγ鎖を介して間接的に、又は、ＧＰＶＩの細胞質ドメインを介して直接的に媒介されることができる。ＦｃＲのγ鎖は、免疫受容活性化チロシンモチーフを含んでおり、非チロシンキナーゼＳＹＫ並びにアダプタＬＡＴ及びアダプタＬＣＰ２と共に、ホスホリパーゼＣ２及び関連する細胞内シグナル伝達経路を活性化させる（Ｌａｎｋｈｏｆら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、１９９６、７５：９５０−９５８）。
血栓形成に関連した生理学及び臨床徴候におけるＧＰＶＩの重要性が認識されるようになっている。その重要性は、ＧＰＶＩレベルと急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）及び卒中現象の発病との疫学的関連性によって（Ｂｉｇａｌｋｅら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，１５６：１９３−２００、及び、Ｂｉｇａｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９，１０１：９１１−９１５）、及び、ＧＰＶＩ欠損マウスにおいて実証された血栓形成に対する耐性（Ｄｅｎｉｓら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，２７：７２８−７３９）によって支持されている。さらに、Ｇａｗａｚらは、ＧＰＶＩが損傷された部位に特異的に結合するので、マウスにおける血管病変のシンチグラフィによる撮像において放射性同位体で識別されたＧＰＶＩを使用し得ることを示した（Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、２００５、９３:９１０−９１３）。このことは、コラーゲンがこれらの部位において露出されることを示している。Ｐｅｎｚら（ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５，１９:８９８−９０９）は、頸動脈狭窄症を有する患者から得たヒトアテローム斑が、血小板を活性化することができるコラーゲンＩ形及びＩＩＩ形の構造を含んでいたことを示した。さらに、ＧＰＶＩのブロック又は不存在によって血栓形成を防ぐことができたが、α２β１のブロックにはほとんど効果がなかった。同様に、コラーゲンを抗コラーゲン抗体でブロックすること又はコラーゲンをコラゲナーゼで分解することによって、血栓形成を予防した。
最近になって、ＧＰＶＩは、血小板機能不全及び異常なコラーゲン発現に関連した病気におけるさらに広い役割に結びつけて考えられている。このことは、血栓症等の場合における血管損傷の後の付着、並びに、様々な炎症伝達物質及びサイトカインの放出の両方において血小板が機能するという事実に一部において起因する。さらに、血小板と血管損傷部位とが反応した後に、続いて起こる血小板の活性化は、結果的にサイトカイン及び他の調節分子の放出を生じさせる。従って、血小板の異常な活性化に関連した病気は多様であるようにも思われるが、これらの病気は、血小板機能に対する依存性によって結びつけて考えられる。従って、血小板の活性化を阻害又は防止することによって、有益な治療効果を提供できる可能性がある。
血小板を介してもたらされる病気には、血管疾患のみならず、リスクの高い糖尿病に関連した様々な病気が含まれる。血小板を介してもたらされることが示された炎症性疾患には、炎症性関節炎疹及び強皮症が含まれる。炎症及び血球活性の役割は、炎症性の関節病において長い間知られている。最近になって、炎症を起こした関節の関節液中に血小板の存在が確認されている（Ｂｏｉｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、３２７：５８０−５８３）。さらに、炎症性の関節炎に罹患した患者から得た関節液中の血小板微粒子は、炎症誘発性であり、ＩＬ−１を介して滑膜線維芽細胞からのサイトカイン応答を誘発することが示されている。血小板の関節炎におけるこの炎症誘発的性質においてＧＰＶＩが重要な役割を果たすことが、薬理学的アプローチ及び遺伝学的アプローチの両者によって示されている。
血小板の表面におけるＧＰＶＩ発現に関係していることが示された他の病気には、実験的腫瘍転移（Ｊａｉｎら、Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００９，７：１７１３−１７１７）、糖尿病（Ｃａｂｅｚａら、２００４、５３：２１１７−２１２１）、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染症（Ｚａｈｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００４、５３：２１１７−２１２１）が含まれる。
血小板機能及び関連する生理的疾患においてＧＰＶＩが有することが示された役割が拡大しているにもかかわらず、この受容体のアンタゴニストを発見及び開発する努力は限られていた。抗血小板療法の強度及び持続時間の能動的コントロール又は調節によって、顕著な臨床のメリットを提供することができる。したがって、ＧＰＶＩタンパクの機能を特異的に標的としてコントロールするように設計された調節可能な物質の必要性が当業界において依然として存在する。
本明細書に記載されているのは、グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的に結合する核酸リガンドに関する組成物、グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的に結合する核酸リガンドを使用した方法及び治療、並びに、その調節因子である。
一態様において、単離された核酸配列を含むＧＰＶＩリガンドを提供する。他の一実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドがリボヌクレオチドである。他の一実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドはデオキシリボ核酸である。さらに別の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドの単離された核酸配列は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含む。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、１個、２個又は３個の軸部と、１個、２個、３個又は４個の環とを含む二次構造を含む。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、５’〜３’方向に向かって、第１の軸領域、第１の環領域、第２の軸領域、第２の環領域、第３の環領域、第３の軸領域、及び、第４の環領域を含む二次構造を含む。他の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、５’〜３’方向に向かって、第１の軸部領域、第１の環領域、第２軸部領域、第２の環領域、第３の環領域、第３の軸部領域及び第４の環領域から本質的になる。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドの二次構造は、５’〜３’方向に向かって、第１の軸部、第１の環、第２の環と第３の環とにつながっている第２の軸部、第３の環と第４の環とにつながっている第３の軸部、及び、第４の環として構成されている。一実施形態において、第２の軸部は、第１の環、第２の環及び第３の環につながっている。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドの第４の環は、ＵＡＡからなる第１の共通配列を含む。他の一実施形態において、第４の環は、（Ｇ／Ａ）ＵＡＡからなる配列を含む。
一実施形態において、第３の軸部は、Ｇ−Ｃ塩基対からなる配列の後にＣ−Ｇ塩基対が続くものを含む。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、ＧＣ（Ｇ／Ａ）ＵＡＡＧＣを含む。他の一実施形態において、核酸リガンドの第３の軸部及び第４の環は、ＧＣ（Ｇ／Ａ）ＵＡＡＧＣを含む。さらに別の一実施形態において、核酸リガンドの第３の軸部及び第４の環は、ＧＣＡＵＡＡＧＣとＧＣＧＵＡＡＧＣとからなる群より選択される配列を含む。
一実施形態において、第３の環が配列ＹＤを含む。ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｄはシトシンではない。他の一実施形態において、第３の環が配列ＹＵ、ＹＧ又はＹＡを含む。さらに別の一実施形態において、第３の環は配列ＵＵ、ＵＧ、ＵＡ、ＣＵ、ＣＧ又はＣＡを含む。他の一実施形態において、第３の環は配列ＹＤからなる。
一実施形態において、第１の環は配列ＧＡＣを含む。
一実施形態において、単離された核酸ＧＰＶＩリガンドの配列の長さは、約２０ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、又は、約３０ｎｔから約３５ｎｔである。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、配列番号７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１４及び配列番号：１５からなる群より選択される単離された核酸配列を含む。他の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、配列番号：２８〜配列番号：３３からなる群より選択される単離された核酸配列を含む。さらに別の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＥＦ−１−ＲＮＡ、ＥＦ−２−ＲＮＡ、ＥＦ−３−ＲＮＡ、Ｅ２−６−ＲＮＡ、ＥＦ−２２−ＲＮＡ及びＥＦ−３１−ＲＮＡからなる群より選択される単離されたＲＮＡ核酸配列を含む。他の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＥＦ−１−変形型、ＥＦ−２−変形型、ＥＦ−３−変形型、Ｅ２−６−変形型、ＥＦ−２２−変形型、及び、ＥＦ−３１−変形型からなる群より選択される単離されたＲＮＡ核酸配列を含む。他の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、配列番号：２８〜配列番号：３３からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％同一の単離された核酸配列を含む。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＲＢ４２４、ＲＢ４２６、ＲＢ４２７、ＲＢ４２８、ＲＢ４２９、ＲＢ４３０、ＲＢ４４５、ＲＢ４４６、ＲＢ４４７、ＲＢ４３１、ＲＢ４３２、ＲＢ４３３、ＲＢ４３４、ＲＢ４３５、ＲＢ４３６、ＲＢ４３９、ＲＢ４４０、ＲＢ４４１、ＲＢ４４２、ＲＢ４４３及びＲＢ４４４からなる群より選択される。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＲＢ４４８、ＲＢ４５２、ＲＢ４５３、ＲＢ４５５、ＲＢ４６０、ＲＢ４６２、ＲＢ４６６、ＲＢ４７８、ＲＢ４８０、ＲＢ４８８、ＥＢ４９０、ＲＢ４９１、ＲＢ４９２、ＲＢ４９３、ＲＢ４９５、ＲＢ４９６、ＲＢ４９７、ＲＢ４９８、ＲＢ４９９、ＲＢ５００、ＲＢ５０２、ＲＢ５０３、ＲＢ５０４、ＲＢ５０５、ＲＢ５０６、ＲＢ５０７、ＲＢ５０８、ＲＢ５１７、ＲＢ５１８、ＲＢ５１９、ＲＢ５２０、ＲＢ５２１、ＲＢ５２２、ＲＢ５２３、ＲＢ５２４、ＲＢ５２５、ＲＢ５２６、ＲＢ５２７、ＲＢ５２８、ＲＢ５３１、ＲＢ５３２、ＲＢ５３３、ＲＢ５３４、ＲＢ５３５、ＲＢ５３６、ＲＢ５３７、ＲＢ５３８、ＲＢ５４０、ＲＢ５４１、ＲＢ５４２、ＲＢ５４６、ＲＢ５４７、ＲＢ５４８、ＲＢ５４９、ＲＢ５５０、ＲＢ５５１、ＲＢ５５２、ＲＢ５５３、ＲＢ５５４、ＲＢ５５５、ＲＢ５５６、ＲＢ５６０、ＲＢ５６１、ＲＢ５６６、ＲＢ５６７、ＲＢ５６９、ＲＢ５７０、及び、ＲＢ５７１からなる群より選択される。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドの単離された核酸配列は、１つ又はそれ以上のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの両方の混合物を含む。
一実施形態においては、単離された核酸ＧＰＶＩリガンドの配列の１つ以上のヌクレオチドが修飾されている。他の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが２’ヒドロキシル位置に修飾を含む。他の一実施形態において、その修飾は、２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロからなる群より選択される。さらに別の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル・シトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン又は２’−Ｏ−メチルグアノシンである。さらに別の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、２’フルオロシチジン又は２’フルオロウリジンである。
一実施形態において、修飾を含む１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン，２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、６−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、５−メトキシアミン−Ｏ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メトキシシトシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）ウリジン、（ａｃｐ３Ｕ）、及び、２，６−ジアミノプリンからなる群より選択される。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、少なくとも１つの修飾された糖部位を含む。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、少なくとも１つの修飾されたホスフェート骨格を含む。
一実施形態において、単離された核酸ＧＰＶＩリガンドの配列は、その３’端部に反転したチミンを含む。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドがスペーサを含む。他の一実施形態において、スペーサがグリコールスペーサである。他の一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドの第２の環がグリコールスペーサを含む。さらに別の一実施形態においては、核酸ＧＰＶＩリガンドの第２の環がグリコールスペーサからなる。さらに別の一実施形態において、グリコールスペーサは、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトの組み込みによって提供される。さらに別の一実施形態において、グリコールスペーサは、単離されたヌクレオチドＧＰＶＩリガンド配列の最初の内部ヌクレオチドの３’末端に付着しており、かつ、単離されたヌクレオチドＧＰＶＩリガンド配列の第１の内部ヌクレオチドに隣接する第２の内部ヌクレオチドの５’末端に付着している。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは脂肪族アミノリンカーを含む。他の一実施形態において、脂肪族アミノリンカーは、単離された核酸ＧＰＶＩリガンド配列の５’末端に付着している。さらに別の一実施形態において、脂肪族アミノリンカーは、単離された核酸ＧＰＶＩリガンド配列の３’末端に付着している。さらに別の一実施形態において、脂肪族アミノリンカーは、６−（トリフルオロアセトアミノ）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイトの組み込みによって提供される。
一実施形態において、単離された核酸ＧＰＶＩリガンドは少なくとも１つの親水性部位に連結されている。他の一実施形態において、少なくとも１つの親水性部位はポリアルキレングリコールである。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、単離された核酸配列の５’末端及び／又は３’末端に付着したポリアルキレン部位を含む。他の一実施形態において、このポリアルキレン部位はリンカーによって付着される。さらに別の一実施形態において、リンカーは脂肪族アミノリンカーである。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、６炭素アミノリンカーを使用して、４０ＫＤのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位に連結される。他の一実施形態において、６炭素アミノリンカーは、アミド連結を介してＰＥＧ部位に付着している。さらに別の一実施形態において、ＰＥＧ部位は、リジン等の１つ又はそれ以上のアミノ酸に付着した２つの２０ＫＤのＰＥＧ部位であり、アミド結合を介して６炭素アミノリンカーに付着している。
一実施形態において、第１核酸ＧＰＶＩリガンドはホスホロチオエート結合を含む。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、ＧＰＶＩ（配列番号：１）に特異的に結合する。他の一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、ＧＰＶＩ（配列番号：２）の細胞外のドメインに特異的に結合する。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、約２０ナノモル（ｎＭ）以下の解離定数を有する。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、約４００ピコモル（ｐＭ）から約１０ｎＭの解離定数を有する。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、約１００ｐＭから約１０ｎＭの解離定数を有する。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、コラーゲンに対するＧＰＶＩの結合を阻害する。他の一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、ＧＰＶＩを介した細胞内シグナル伝達を阻害する。他の一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドを使用したＧＰＶＩを介した細胞内シグナル伝達の阻害は、イノシトール三リン酸の生成を低減すること、又は、細胞内カルシウム濃度の変動を阻害することを含む。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）、及び／又はコンブルキシンに対するＧＰＶＩの結合を阻害する。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、コラーゲン及びＣＲＰの両方に対するＧＰＶＩの結合を阻害する。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、コラーゲンに対するＧＰＶＩの結合を阻害するが、ＣＲＰに対するＧＰＶＩの結合を阻害しない。他の一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドは、コラーゲン及びＣＲＰの両方に対するＧＰＶＩの結合を阻害するが、コンブルキシンに対するＧＰＶＩの結合を阻害しない。
一実施形態において、ＧＰＶＩに対する核酸ＧＰＶＩリガンドの結合は、ＧＰＶＩの活性な立体構造を安定させる。他の一実施形態において、ＧＰＶＩに対する核酸ＧＰＶＩリガンドの結合は、ＧＰＶＩの不活性な立体構造を安定させる。さらに別の一実施形態において、ＧＰＶＩに対する核酸ＧＰＶＩリガンドの結合は、ＧＰＶＩとＦｃＲγサブユニットとの間の相互作用を阻害する。
他の一実施形態において、ＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合は、ＧＰＶＩ活性を阻害するか又は低下させる。さらに別の一実施形態において、ＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合は、ＧＰＶＩがＦｃＲγ鎖と相互作用するのを無効化又は低下させる。さらに別の一実施形態において、血小板の表面に発現されたＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合は、血小板付着を阻害するか又は低下させる。さらに別の一実施形態において、血小板の表面に発現されたＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合は、血小板活性化を阻害するか又は低下させる。さらに別の一実施形態において、血小板の表面に発現されたＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合は、血小板凝集を阻害するか又は低下させる。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＧＰＶＩの変異体に結合し、該変異体の機能を低下又は阻害するものであり、前記ＧＰＶＩ変異体は、配列番号：１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、ＧＰＶＩに対する解離定数（「Ｋｄ」）が約１００マイクロモル（μＭ）未満、約１μＭ未満、約５００ナノモル（ｎＭ）未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ピコモル（ｐＭ）未満、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、又は、約２００ｐＭ未満である。
一態様においては、ＧＰＶＩリガンドに対する調節因子であって、ＧＰＶＩリガンドの活性を部分的に又は完全に無効化する調節因子を提供する。
一実施形態において、調節因子は、単離された核酸配列を含む。他の一実施形態において、調節因子は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ポリペプチド配列、又は、これらのあらゆる組み合わせを含む。
一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドの調節因子は、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、及び、ロックされた核酸（ＬＮＡ）からなる群より選択される。
一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドの調節因子は、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）及びロックされた核酸（ＬＮＡ）からなる群より選択され、前記調節因子は、ＧＰＶＩ核酸リガンドの少なくとも一部分に特異的に結合するか又は相互作用する。
一実施形態において、前記調節因子は、核酸結合タンパク又はペプチド、小分子、オリゴ糖、核酸結合脂質、ポリマー、ナノ粒子、並びに、ミクロスフェアからなる群より選択され、前記調節因子は、ＧＰＶＩ核酸リガンドの少なくとも一部分に結合するか又は相互作用する。
一実施形態において、調節因子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの混合物を含む核酸調節因子である。他の一実施形態において、核酸調節因子は、少なくとも１つの修飾されたデオキシリボヌクレオチド及び／又は少なくとも１つの修飾されたリボヌクレオチドを含む。
一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩ核酸リガンドの少なくとも一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。他の一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの環の少なくとも一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。他の一実施形態において、調節因子は、少なくとも、核酸ＧＰＶＩリガンドの第１の環、第２の軸部及び第２の環に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。他の一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの第３の環、第３の軸部、第４の環及び第１の軸部に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。
一実施形態において、調節因子は、単離された核酸配列を含み、前記配列の長さが、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、又は、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔである。
一実施形態において、核酸調節因子配列のヌクレオチドの１つ以上が修飾されている。他の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが２’ヒドロキシル位置に修飾を含む。他の一実施形態において、修飾は、２’−Ｏ−メチル及び２’−フルオロからなる群より選択される。さらに別の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、又は、２’−Ｏ−メチルチミジンである。さらに別の一実施形態において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドは、２’フルオロシチジン、２’フルオロウリジン、２’フルオロアデノシン、又は、２’フルオログアノシンである。
一実施形態において、核酸調節因子の１つ又はそれ以上のヌクレオチドの修飾は、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、６−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミン−Ｏ−メチルウラシル、５−メトキシアミン−Ｏ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メトキシシトシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、及び、２，６−ジアミノプリンからなる群より選択される修飾を含む。
一実施形態において、調節因子は、少なくとも１つの修飾された糖部位を含む。
一実施形態において、調節因子は、少なくとも１つの修飾されたホスフェート骨格を含む。
一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの第４の環に対して生理的条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。他の一実施形態において、オリゴヌクレオチド調節因子は、配列３’−ＡＵＵ−５’を含む。
一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの第１の環に対して生理的条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。他の一実施形態において、オリゴヌクレオチド調節因子は、配列３’−ＣＵＧ−５’を含む。
一実施形態において、調節因子は、配列番号：７４−８８からなる群より選択される配列を含む。他の一実施形態において、調節因子は、ＲＢ４１６、ＲＢ４１７、ＲＢ４１８、ＲＢ４１９、ＲＢ４２０、ＲＢ４２１、ＲＢ４２２、ＲＢ４２３、ＲＢ５１３、ＲＢ５１４、ＲＢ５１５、ＲＢ５１６、ＲＢ５４３、ＲＢ５４４及びＲＢ５４５からなる群より選択される。
一実施形態において、調節因子は、核酸ＧＰＶＩリガンドの二次構造を崩壊させる。他の一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの二次構造を安定させる。
一実施形態において、調節因子は、核酸ＧＰＶＩリガンドの三次構造を崩壊させる。
他の一実施形態において、調節因子は、ＧＰＶＩリガンドの二次構造を安定させる。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドに対する調節因子の結合は、ＧＰＶＩリガンドの自己不活性化位置を暴露させ、それによってＧＰＶＩリガンドの二次構造を崩壊させ、ヌクレアーゼによる核酸ＧＰＶＩリガンドの破壊を促進する。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンド−ＧＰＶＩ複合体に対する調節因子の結合は、ＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドの結合を低減又は解消する。
他の一態様において、ＧＰＶＩリガンドの活性を調節する方法を提供する。
一実施形態において、核酸ＧＰＶＩリガンドを投与された接種者に対してＧＰＶＩリガンドの調節因子を投与することによって、ＧＰＶＩに対する核酸リガンドの活性を調節する方法を提供する。一実施形態において、調節因子は、オリゴヌクレオチド調節因子又はその誘導体であってもよく、特定の実施形態においては、核酸ＧＰＶＩリガンドの一部分に対して相補的である。
さらなる一態様において、ＧＰＶＩリガンドを使用してＧＰＶＩ機能を制御する方法を提供する。
一実施形態において、ＧＰＶＩ機能を制御する方法は、治療的有効量のＧＰＶＩリガンドを接種者に投与するステップを含む。他の一実施形態において、この方法は、ＧＰＶＩリガンドの調節因子を接種者に投与するステップをさらに含む。
他の一態様において、血小板を介してもたらされる疾病又は病気を治療又は改善する方法を提供する。
一実施形態において、この方法は、ＧＰＶＩに結合するＧＰＶＩリガンドの治療的有効量を必要性がある接種者に投与するステップを含む。他の一実施形態において、接種者は、リスクが高い糖尿病と診察された者である。さらに別の一実施形態において、接種者は、転移のリスクが高い癌と診察された者である。
一実施形態において、血小板を介してもたらされる疾病又は病気は、脳血管障害、急性冠動脈症候群、糖尿病関連疾患、自己免疫炎症性疾患、及び、癌からなる群より選択される。
一実施形態において、脳血管障害は、血栓症、血栓塞栓症又は一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）である。他の一実施形態において、急性冠動脈症候群は、冠状動脈血栓症、不安定狭心症又は心筋梗塞に起因するものである。さらに別の一実施形態において、糖尿病関連疾患は、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管症、アテローム性動脈硬化、虚血性脳血管障害、末梢血管疾患、急性腎損傷又は慢性腎不全である。他の一実施形態において、自己免疫炎症性疾患は、強皮症、慢性関節リウマチであるか、又は、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸感染及び強直性脊椎炎からなる群より選択される炎症性自己免疫疾患である。一実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌、脳腫瘍、骨癌及び肝臓癌から選択される。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、非経口投与、静脈内注射、皮内送達、関節内送達、滑膜内送達、脊髄腔内送達、動脈内送達、心臓内送達、筋肉内送達、皮下送達、眼窩内送達、嚢内送達、脊髄内送達、胸骨内送達、局所的送達、経皮貼布送達、直腸内送達、膣坐剤又は尿道坐剤による送達、腹膜送達、経皮的送達、鼻内噴霧による送達、手術移植による送達、体内外科塗料による送達、輸液ポンプによる送達又はカテーテルによる送達によって投与される。
他の一態様においては、ＧＰＶＩリガンドを投与することによってその必要性がある接種者を治療する方法であって、前記ＧＰＶＩリガンドが血小板機能を制御する方法を提供する。
一実施形態において、治療的有効量のＧＰＶＩを投与する。
一実施形態において、この治療的有効量は、血小板付着及び／又は凝集を低減又は阻害する。
一態様において、ＧＰＶＩに結合する核酸ＧＰＶＩリガンドの治療的有効量を含む医薬品組成物を提供する。
一態様において、治療的有効量の調節因子を含む医薬品組成物であって、前記調節因子が、ＧＰＶＩに結合する核酸ＧＰＶＩリガンドの活性を制御する医薬品組成物を提供する。
一実施形態において、前記医薬品組成物は、ＧＰＶＩリガンド及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む。他の一実施形態において、前記医薬品組成物が静脈内注射に適した液体である。さらに別の一実施形態において、前記医薬品組成物は、皮下注射に適した液体又は分散液である。
一態様において、ＧＰＶＩ核酸リガンド及び／又はそのＧＰＶＩ核酸リガンドの活性を制御する調節因子の治療的有効量を含むキットを提供する。
図１は、ＳＥＬＥＸ核酸リガンド選択工程の略図である。
図２は、ＧＰＶＩに対する核酸リガンドを同定するために実行したＳＥＬＥＸ繰り返しのための選択条件を示している。
図３は、ＧＰＶＩに対する核酸リガンドを濃縮し、トレース３２Ｐで末端をラベルしたライブラリの結合曲線を示している。
図４Ａ−図４Ｂは、第１０周目の選抜後の「Ｅ／Ｆ」連続選抜における個々のクローンについて同定された一次ランダム領域由来配列、及び、第１０周目の選抜後の「Ｅ２」連続選抜における個々のクローンについて同定された一次ランダム領域由来配列を示している。
図５は、ＧＰＶＩ結合に必要な予想される最小限の一次配列、及び、選択手順において同定された配列について予想される保存二次構造を示している。「Ｌ」は環を表し、「Ｓ」は軸部を表す。
図６は、ＧＰＶＩに対するＥＦ−３ ＧＰＶＩリガンドの結合を表したグラフであり、タンパク相互作用中にＥＦ−３の３’固定領域を覆い隠すように、３’プライマーをＥＦ−３にアニーリングさせているものと、させていないものとを示している。
図７は、親ＧＰＶＩリガンドであるＥＦ−２及びＥＦ−３と比較した、短縮されたリガンドのＧＰＶＩに対する結合曲線のグラフである。
図８は、ＥＦ−３及びＥＦ−３１ ＧＰＶＩリガンド短縮変異体のいくつかの短縮の配列及び予想二次構造を示している。
図９は、短縮された配列であるＥＦ−３ Ｔ２及びＥＦ−２ Ｔ２ ＧＰＶＩリガンドの予想二次構造及び不活性な点変異の位置を示している。
図１０は、ＧＰＶＩ核酸リガンド変異体についてのＧＰＶＩ結合分析の結果を示している。
図１１は、様々なＧＰＶＩ核酸リガンドの予想二次構造及び糖置換を示している。
図１２は、ＧＰＶＩ核酸リガンド変異体についてのＧＰＶＩ結合分析の結果を示している。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、核酸配列中の２個のヌクレオチドの間に組み込まれたヘキサエチレングリコールスペーサホスホラミダイト及びスペーサホスホラミダイトを示している。
図１４Ａ及び図１４Ｂは、リンカーを介してＧＰＶＩリガンドに結合することができるＰＥＧ部位、及び、結合した部位の構造を示している。
図１５は、ＥＦ−２及びＥＦ−３ ＧＰＶＩリガンド短縮変異体を用いたときに、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、不活性化点変異を含む変異体と比較して、コントロールに対する割合として表したグラフである。
図１６は、選択したＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を変化させたときに、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対するパーセンテージとして表したグラフである。
図１７は、選択したＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を変化させたときに、コラーゲン関連ペプチドによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対するパーセンテージとして表したグラフを示している。
図１８は、選択したＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を変化させたときに、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対するパーセンテージとして表したグラフを示している。
図１９は、選択したＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を変化させたときに、コラーゲン関連ペプチドによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対するパーセンテージとして表したグラフを示している。
図２０は、血小板を濃縮した血漿においてＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１の濃度を変化させたときに、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
図２１は、全血液流に暴露させたコラーゲン塗布面上の血小板蓄積に対するＧＰＶＩ核酸リガンドの効果を、不活性なコントロールリガンドを最大反応％として表したグラフである。
図２２は、血小板レセプタであるＰ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ１２及びＰＡＲ−１と比較した、ＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１の結合特異性を表したグラフを示している。
図２３は、血小板レセプタＧＰ１ｂα−フォンウィルブランド因子相互作用又は血小板トロンボキサンＡ２受容体と比較した、ＧＰＶＩに対するＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１の結合特異性を表すグラフを示している。
図２４は、短縮配列ＧＰＶＩリガンドであるＥＦ２−Ｔ２及びＥＦ３−Ｔ２の予想される二次構造、並びに、これらのリガンドとＧＰＶＩリガンド調節因子ＲＢ４１６−４２３との間の相補性の部位を示している。
図２５は、ＧＰＶＩリガンドＥＦ２−Ｔ２単独又は様々なＧＰＶＩリガンド調節因子の様々な濃縮との組み合わせの場合に、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
図２６は、ＧＰＶＩリガンドＥＦ３−Ｔ２単独又は様々なＧＰＶＩリガンド調節因子の様々な濃縮との組み合わせの場合に、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
図２７は、ＧＰＶＩリガンドＲＢ４９０単独又は様々なＧＰＶＩリガンド調節因子の様々な濃縮との組み合わせの場合に、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
図２８は、ＧＰＶＩリガンド調節因子ＲＢ５１５を用いたＧＰＶＩ核酸リガンドＲＢ４９０の抗ＧＰＶＩ活性の無効化の持続性を表すグラフを示している。
図２９は、ＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１の予測される二次構造、及び、そのリガンドとＧＰＶＩリガンド調節因子ＲＢ５１５との予測される相互作用を示している。
図３０は、ＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１単独又は様々なＧＰＶＩリガンド調節因子ＲＢ５１５の様々な濃縮との組み合わせを用いたときに、コラーゲンによって誘導された血小板凝集及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
図３１は、血小板を濃縮した血漿においてＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１単独又は様々なＧＰＶＩリガンド調節因子ＲＢ５１５の様々な濃縮との組み合わせを用いたときに、コラーゲンによって誘導された血小板凝集及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導された血小板凝集を、コントロールに対する割合として表したグラフを示している。
詳細な説明
本発明は、血小板細胞膜グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合する核酸リガンドの医薬品組成物、そのリガンドの調節因子、及び、血小板を介してもたらされる疾病及び病気を治療するためのそれらの使用方法を提供する。さらに、ＧＰＶＩ核酸リガンド及び／又はそのＧＰＶＩリガンドの調節因子を含む医薬製剤を提供する。
Ａ．定義
この「約」という用語は、本明細書において用いられているように、重量、時間、用量等の量のように測定可能な値を表す場合には、そのような変動が開示されている方法を実行するのに適切である限り、所定量から±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は、±０．１％の変動を含むように意図されている。
「核酸リガンド」は、標的分子と相互作用することを可能にする三次構造を形成することができる核酸であり、本明細書において「リガンド」又は「アプタマ」とも称される。「ＧＰＶＩ核酸リガンド」又は「ＧＰＶＩリガンド」又は「抗ＧＰＶＩリガンド」又は「核酸ＧＰＶＩリガンド」は、ＧＰＶＩに対して特異的に結合するリガンド又はアプタマを表す。これらの用語は、生理的環境下で意図した標的分子との複合体を形成することができる特異的結合部位を有するオリゴヌクレオチドを表す。標的分子に対するリガンドの結合の親和性は、リガンドと標的分子との間の相互作用の解離定数（Ｋｄ）を単位として定義される。一般に、標的に対するリガンドのＫｄは、約１ｎＭ〜約１００ｎＭである。一般に、結合の特異性は、リガンド及び環境中の無関係な物質又は付随物質に対する解離定数と比較した、標的に対するリガンドの相対的な解離定数として定義される。一般的に、標的に対するリガンドのＫｄは、環境中の無関係な物質又は付随物質に対するＫｄの１／１０、１／５０、１／１００、又は、１／２００未満であろう。
「リガンド調節因子ペア」又は「リガンドと調節因子とのペア」は、標的分子に対する特定のリガンドと、そのリガンドと標的との相互作用が調節されるように、リガンドの二次構造及び／又は三次構造を変化させるリガンド調節因子とを含むように意図されている。調節因子は、リガンドの一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチドであり得る。調節因子は、リガンドの標的結合親和性力を、生理的条件下において、１０％から１００％、２０％から１００％、２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％低下させるか、又は、１０％から１００％の間の範囲内の任意のパーセンテージで低下させるように、リガンドの立体構造を変化させることができる。
「調節因子（modulator）」、「拮抗剤（antidote）」、「調節因子（regulator)」又は「制御因子（control agent）」は、本明細書に記載されているようなリガンド又はアプタマに結合することができ、かつ、リガンドとその標的分子（例えばリガンドの構造の修飾による）との間の相互作用を所望の態様で変化させることができる薬学的に許容可能なあらゆる物質を表す。
本明細書で使用されるように、「調節する（modulate）」は、活性の低下、上昇又は他のいくつかの測定可能な変化を意味する。
「薬学的に許容可能（Pharmaceutically acceptable）」であることは、本明細書で使用されるように、連邦の規制機関若しくは州政府によって承認されていること、又は、米国薬局方若しくは人間に使用するための他の一般に認識されている薬局方に一覧されていることを意味する。
薬学的有効量は、病状の発生を阻害、防止する、又は、病状を治療（ある程度まで症状を緩和する）するのに必要な用量である。薬学的有効量は、疾病の種類、使用する組成物、投与経路、治療する哺乳動物の種類、調査する特定の哺乳動物の物理的特性、併用薬剤、及び、医学分野の当業者が認識する他の要因に応じて変わる。核酸リガンド及び調節因子の能力に応じて、一般に、１日当たりに体重１ｋｇ当たりで０．１ｍｇ〜１００ｍｇの量の有効成分を投与する。
「安定化された核酸分子」は、安定化されていない核酸分子と比較して、インビボにおいて（例えばエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼによって）容易に分解されない核酸分子を表す。安定化は、オリゴヌクレオチド骨格のホスフェート部分の糖内部の化学的置換の長さ及び／又は二次構造及び／又は短縮の作用であってもよい。安定化は、例えば、分子を安定させることができる二次構造をコントロールすることによって達成することができる。例えば、核酸分子の３’末端が上流領域に対して相補的であれば、その部分は、折り返して、分子を安定化させる「軸環（stem loop）」構造を形成することができる。
「結合親和性」及び「結合活性」という用語は、リガンド分子が標的に結合する又は標的に結合しない傾向を表すように意図されている。前記相互作用のエネルギー論が「結合活性」及び「結合親和性」において重要である。なぜなら、これらが、相互作用するパートナの必要濃度、これらのパートナが会合することができる速度、及び、溶液中の結合した分子及び自由分子の相対濃度を定義するからである。エネルギー論は、特に、解離定数Ｋｄの決定によって特徴付けられる。
本明細書で使用されているように、「治療」又は「治療すること」は、哺乳動物における疾病のあらゆる治療を意味するものであり、次のこと：（ａ）病気に対して防御すること、すなわち、臨床症状を生じさせないこと；（ｂ）病気を抑制すること、すなわち、臨床症状の発生を阻止、改善、低下又は抑制すること；及び／又は、（ｃ）病気を軽減すること、すなわち、臨床症状の後退を生じさせることを含む。最終誘起現象が未知若しくは潜在的であることもあり、又は、その現象の発生のかなり後まで患者が判明しないので、「予防すること（preventing）」と「防ぐこと（suppressing）」こととを区別することが必ずしも可能ではないことは、人間医学分野の当業者によって理解されるであろう。したがって、本明細書で使用されているように、「予防(prophylaxis)」という用語は、「治療」の一要素として、本明細書で定義されているような「保護すること」及び「抑制する」を含むように意図されている。「保護(protection)」という用語は、本明細書で使用されているように、「予防」を含むように意図されている。
「有効量」という用語は、治療している病気又は病状の治療を提供するのに充分な量を意味する。これは、患者、疾病、及び、もたらされる治療に応じて変わるだろう。
本明細書で使用されているように、ＧＰＶＩ核酸リガンド「変異体」は、ＧＰＶＩ核酸リガンドと本質的に同じ機能を発揮する変異体を包含し、本質的に同じ構造を含む。
Ｂ．グリコプロテインＶＩ
グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）は、血小板細胞の表面で特異的に発現される。コラーゲンが介在したＧＰＶＩの活性化は血小板付着及び凝集において重要な役割を果たすことが多数の研究によって示されている。従って、ＧＰＶＩは、血小板とコラーゲンによってもたらされる病気を治療するためのますます興味深い治療標的である。
生理学的止血と病理学的血栓形成との間の境界は非常に狭いので、コラーゲンによってもたらされるＧＰＶＩ活性化に対して、血小板活性の微調節された制御を提供できることが必要である。従って、本明細書では、開示されているＧＰＶＩリガンドの活性を調節又は制御することができる調節因子成分も提供する。
ＧＰＶＩは、３３９個のアミノ酸残基の長さのグリコプロテインである(GenBank Accession No.Q９ＨＣＮ６、配列番号：１として開示されている)。アミノ酸残基１〜２０は、３１９個のアミノ酸を有する成熟したタンパクを生産するために切断されるシグナル配列を表す。ＧＰＶＩは、２個の細胞外免疫グロブリンドメイン、ムチン様コア、ショートペプチドリンカー配列、膜貫通領域、及び、Ｆｙｎ及びＬｙｎ Ｓｒｃファミリーキナーゼに結合する短い細胞質尾部を有する。Ｓｙｋの集合及び活性化を可能にし、かつ、免疫レセプタによって使用されるものと多くの親和性がある下流シグナル経路の活性化を開始させるように、ＧＰＶＩは、ＦｃＲγ鎖と構造的に複合化されている。ＧＰＶＩをコードする遺伝子は、ヒト染色体１９の白血球レセプタクラスター（ＬＲＣ）に見られる。ＧＰＶＩ又はＦｃＲγ鎖のいずれかを欠くマウスでは、コラーゲンに対する血小板応答が著しく阻害され、血栓形成が減少した。さらに、新規なモノクローナル抗ヒトＧＰＶＩ抗体（ＯＭ４）のＦａｂ断片は、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体を用いた場合に見られた出血時間の長期化を伴わずに、ラットの血栓症モデルにおいてインビボにおける血栓形成を阻害する。
ＧＰＶＩ細胞外ドメイン（配列番号：２）は、コラーゲンタイプＩ−ＩＶに特異的に結合することが示されている（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２００８、１９：３２−４２）。さらに、コラーゲンタイプＩ−ＩＶは、血小板活性化、凝集及び付着を支援することがわかっている。一方で、非原線維コラーゲン、タイプＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩは、血小板凝集を伴わずに、弱い付着を生じさせるだけである。従って、血小板を介してもたらされる病気又は疾病の治療に役立ち得る医薬品を作成するために、ＧＰＶＩ細胞外ドメインに対して結合するＧＰＶＩリガンドを特定するために研究を行った。
Ｃ．ＧＰＶＩに対する核酸リガンドの発生
ＳＥＬＥＸ法を使用して、ＧＰＶＩタンパクに特異的に結合する核酸リガンドを同定した。その後、ＧＰＶＩリガンドの特性を理解するために、ＳＥＬＥＸによって最初に得たリガンドを完全に特性評価した。そのような特性評価には、配列決定、保存配列を決定するための配列比較、二次構造予測、並びに、ＧＰＶＩに特異的に結合して阻害する求められる機能に最も重要なリガンド部位を特定するための切断部分及び突然変異の分析が含まれる。最適なリガンド配列及び二次構造を特定した後に、製薬使用のためにそのリガンドを最適化するために修飾を加えた。これらの修飾の具体例は、ペグ化、核酸リガンド内部のスペーサの使用、及び、核酸リガンドの糖部分及びホスフェート部分に対する選択された修飾を含む。使用した様々な修飾の結果としてリガンド機能を監視するために、結合分析を実行した。
ＳＥＬＥＸは、指数関数的増殖によるリガンドの系統的進化を表す。この方法は、標的分子に対する高度な特異的結合性を有する核酸分子のインビトロ的進化を可能にする。ＳＥＬＥＸ法は、例えば、米国特許第７０８７７３５号、第５４７５０９６号、及び、第５２７０１６３号に記載されている（ＷＯ９１／１９８１３も参照されたい）。
ＳＥＬＥＸ法は、結合親和性及び選択性の事実上あらゆる所望の基準を達成するために、同一の一般的な選択機構を用いながら、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、結合、分離及び増幅の段階的反復とを含む。ＳＥＬＥＸ法は、結合に好適な状況下において混合物を標的分子に接触させるステップと、標的分子に特異的に結合した核酸から非結合核酸を分離するステップと、核酸と標的分子との複合体を解離させるステップと、リガンドを増幅した核酸混合物を作るために、核酸と標的分子との複合体から解離させた核酸を増幅するステップと、標的分子に対して高度に特異的で高親和性のリガンドを作るために望ましいサイクル数にわたって、結合、分離、解離、及び、増幅のステップを反復するステップとを含む。
基礎的なＳＥＬＥＸ法は、多くの特別な目標を達成するために変更されてきた。例えば、米国特許第５７０７７９６号は、湾曲ＤＮＡ等のような特別な構造特性を有する核酸分子を選択するために、ゲル電気泳動と併用してＳＥＬＥＸを使用することを記載する。米国特許第５７６３１７７号は、標的分子に結合する能力がある及び／又は標的分子に光架橋する能力がある及び／又は標的分子を光不活化する能力がある光反応性基を含むリガンドを選択するための、ＳＥＬＥＸをベースとした方法を記載する。米国特許第５５８０７３７号は、密接に関連する複数の分子を区別することができる高度に特異的なリガンドを同定するための、カウンタＳＥＬＥＸと呼ばれる方法を記載する。米国特許第５５６７５８８号及び第５８６１２５４号は、標的分子に対する高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと、標的分子に対する低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの高度に効率的な分離を達成する、ＳＥＬＥＸをベースとした方法を記載する。米国特許第５４９６９３８号は、ＳＥＬＥＸプロセスを実行した後に、改良されたリガンドを得る方法を記載する。米国特許第５７０５３３７号は、リガンドを標的に共有結合で結合させる方法を記載する。
小さいペプチドに対する核酸リガンドを溶液中において同定する実現可能性が米国特許第５６４８２１４号において実証されている。標的分子の特定部位を標的とするリガンドを生産するために、リガンドを用いた親和溶出を使用できることが、米国特許第５７８０２２８号において例示されている。米国特許第５７８０２２８号は、特定のレクチンに結合する高親和性リガンドの生産に関するものである。特定の組織（細胞種の群を含む）に対する核酸リガンドを調製する方法が米国特許第６１２７１１９号に記載されている。コウシの腸のホスファターゼに対する修飾された高親和性リガンドを生産することが米国特許第６６７３５５３号に記載されている。米国特許第６７１６５８０号は、核酸リガンドを同定するための、ロボット操作の使用を含む自動プロセスを記載する。
ＳＥＬＥＸプロセスは、その最も基本的な形態において、以下の連続的ステップによって定義されるものであってもよい。
１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に、不変の配列の部位（すなわち、候補混合物の各配列が同一の位置に同一の配列を含む）と、ランダム化された配列の部位とを含む。不変の配列部位は、（ａ）以下に記載されている増幅ステップを支援するように、（ｂ）標的に結合することがわかっている配列を模倣するように、又は、（ｃ）候補混合物中の核酸の所定の構造配置の濃度を高めるように選択される。ランダム化された配列は、完全にランダム化されていてもよい（すなわち、任意の位置において１つの塩基を発見する確率が４分の１である）し、又は、部分的にのみランダム化されていてもよい（例えば、任意の位置において１つの塩基を発見する確率が０％〜１００％の任意のレベルから選択され得る）。
２）標的と候補混合物の核酸とが結合するのに好適な条件下において、選択した標的に候補混合物を接触させる。これらの条件下では、標的と候補混合物の核酸との相互作用は、標的とその標的に対して最も強い親和性を有する核酸とによる核酸標的複合体を形成するものとして考えることができる。
３）標的に対して最も高い親和性を有する核酸を標的に対してより低い親和性を有する核酸から分離する。最も親和性が高い核酸に対応する配列は極めて少ない数（おそらく核酸の１分子のみ）でしか候補混合物中に存在しないので、候補混合物中の相当量の核酸が分離時に保持されるように分離基準を設定することが一般に望ましい（おおよそ５％〜５０％）。
４）その後、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸の濃度を高めた新しい候補混合物を作成するために、標的に対して比較的高い親和性を有するものとして分離時に選択された核酸を増幅する。
５）上記の分離ステップ及び増幅ステップを繰り返すことによって、新たに作成される候補混合物に含まれる結合性が弱い配列が徐々に少なくなり、標的に対して平均程度の親和性を有する核酸が一般に増加するであろう。その極限まで行くと、ＳＥＬＥＸプロセスは、初めの候補混合物中の核酸配列を代表する１個又は少数のユニークな核酸であって、標的分子との最も高い親和性の相互作用を可能にする特異的な二次及び三次構造に折りたたまれる核酸を含む候補混合物が与えられるであろう。
レセプタを含む１つのタンパクの２つ以上のエピトープに対する親和性を有する２個以上の結合領域を有する二価結合を生じさせるために、ＳＥＬＥＸを使用することができる。特に、一実施形態において、ＧＰＶＩレセプタの２つ以上の部位に対する親和性を有する核酸リガンドを選択するために、このプロセスを使用することができる。例えば、特定の実施形態において、リガンドは、Ｃ２領域の少なくとも２つの部分に結合することができる。特定の実施形態において、リガンドは、二量体の立体構造を乱すこと又は安定させることによって、ＧＰＶＩレセプタの二量体化に影響を与える。これらの実施形態において、調節因子は、核酸リガンドが結合するエピトープの１つのみ、１つ以上、又は、すべてに対する結合を抑制するように設計されたものであってもよい。調節因子は、例えば、レセプタのＣ２−１領域又はＣ２−２領域等の単一のエピトープのみに対する結合を阻害するものであってもよい。
例えば、米国特許第７０８７７３５号に記載されているようなＳＥＬＥＸ法を使用して、ＧＰＶＩに対して特異的な核酸リガンドを、その分子の細胞外ドメインに相当する短鎖ペプチドに対してＳＥＬＥＸを実行することによって得ることができる。あるいは、例えば、米国特許第６７３０４８２号に記載されているようなＳＥＬＥＸ法を使用して、未処理の血小板、タンパクを増やした血小板膜画分、精製したＧＰＶＩ、又は、ＧＰＶＩレセプタを特異的に過剰発現する細胞系に対してＳＥＬＥＸを実行することによって、ＧＰＶＩに対して特異的な核酸リガンドを分離することができる。
さらに、ＳＥＬＥＸプロセスは、米国特許第５７８０２２８号に記載されているような競合親和溶出機構を使用して、特異的なＧＰＶＩ核酸リガンドを単離するように意図されたものであってもよい。例えば、ＧＰＶＩに対して特異的な核酸リガンドを分離するために、コラーゲン、コンブルキシン、若しくは、ＣＲＰ、又は、関連化合物等のような、ＧＰＶＩの活性化剤又は結合剤を充分な量で加えることによって、タンパクに結合したリガンドの溶出を実行することができる。
ＧＰＶＩレセプタは、組み換え技術によって発現される精製されたタンパクであって、ＳＥＬＥＸ法のために使用されるタンパクであってもよい。特定の実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは、生理的条件下においてＧＰＶＩレセプタに結合する。生理的条件は、一般に塩の濃度及び溶液のｐＨに関する。インビトロにおいて、生理的条件は、一般に、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、及び、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むバッファ（ｐＨ約７．４）において再現される。特定の実施形態においては、核酸リガンドの集合を選別して、血小板でみられるタンパクを対象とするリガンドを含む濃縮された集合を与えるために、天然の、典型的には活性化されていない血小板を上述されているように使用する。その後、求められるＧＰＶＩレセプタを過剰発現する安定な細胞系、又は、そのタンパクを一時的にトランスフェクトした細胞系のいずれかに対してその濃縮した集合を使用する。リガンド競合調査を行うこと又は細胞内シグナル経路に対する影響を識別することのいずれかを通じて、これらの細胞から単離されたレセプタ又は細胞全体のいずれかに対して修飾したＳＥＬＥＸ法を使用することによって、第２周目の選抜を実行することができる。
特定の実施形態において、ＧＰＶＩ標的に対して特異的な核酸リガンドを、固定されたタンパクを使用して同定することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、精製されたタンパクを、化学的リンカーによって固体マトリクスに結合させることができる。他の実施形態においては、固定人工膜に結合したタンパク及び混合物の特定の画分を単離するために、特定のタンパクを過剰発現する細胞から得た細胞膜を、陰イオン性界面活性剤（例えば、コール酸エステル）等の洗剤を使用して抽出することができる。一般に、脂質及びタンパクが、（通常はビーズ等のサポートマトリクス上にある）固定人工膜の炭化水素鎖と共に再構成して層を形成する間に、洗剤を除去することによって再構成を実行することができると考えられる。
アゴニストによって特別な特異的な血小板機能及び／又はＧＰＶＩによって誘導される細胞内シグナル現象を阻害する能力を求めるように核酸リガンドを選抜することによって、ＧＰＶＩに対して特異的なこれらのＳＥＬＥＸ法によって分離された核酸リガンドであって、求められる機能的活性を有する核酸リガンドを同定することができる。求められる核酸リガンドは、単に相手に結合するだけでなく、レセプタシグナリングの阻害剤でもあるので、血小板活性に対して与えるリガンドの影響を評価することによって、求められる機能を有するリガンドを同定することができる。これには、ＧＰＶＩによって制御されることがわかっている種々のシグナル経路に対してリガンドが与える影響の評価が含まれていもよい。例えば、ＧＰＶＩシグナリングは、ＧＰＶＩタンパクのクラスター化、及び、ホスホリパーゼＣγ２を活性化する事象の局所的シグナル連鎖を開始するためキナーゼの活性化を生じさせ、Ｃａ２＋濃度を上昇させること及びプロテインキナーゼＣを活性化することに関与するセカンドメッセンジャである１，４，５−イノシトール三リン酸及びジアシルグリセロールを放出することができる。これらのセカンドメッセンジャ系又はセカンドメッセンジャシグナルのあらゆるものを当業者に周知の方法を用いて測定することができる。
さらに、ＧＰＶＩ核酸リガンドの存在下又は非存在下におけるＧＰＶＩのコラーゲン結合を、これらのシステムにおいて測定することができる。
血小板を多く含む血漿及び洗浄血小板調合物の中で実行する光透過凝集測定（Light Transmittance Aggregometry）、又は、全血液中で実行するインピーダンス凝集測定法(Impedance Aggregometry)等の血小板機能分析において血小板凝集を抑制する能力を求めるようにリガンドを選抜することもできる。さらに、静的条件において又は流動全血中において、コラーゲン塗布面との血小板相互作用を抑制する能力を求めるように、リガンドを選抜することができる。所定のレセプタの既知のアゴニストによって生じる細胞内シグナリング現象をブロックするリガンドの能力によって、ＧＰＶＩに対する所定の核酸リガンドの特異性をさらに同定することができる。例えば、ＧＰＶＩの阻害物質である核酸リガンドは、例えば、ヘビＣ型レクチン・コンブルキシン、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）によって生じるシグナリングを阻害すると予想することができる。ＧＰＶＩ以外のレセプタを活性化するアゴニストによって凝集が生じる場合には、血小板凝集に対して影響を与えないことによって、ＧＰＶＩに対する所定の核酸リガンドの特異性をさらに選別することができる。
上記方法の任意のものを単独又は組み合わせて利用することによって、ＧＰＶＩに対して特異的な複数の核酸リガンドが生じるであろう。求められる阻害特性を有する核酸リガンドを同定したら、そのリガンドの調節因子を以下に説明するように同定することができる。
Ｄ．ＧＰＶＩに対する核酸リガンド
本明細書に開示されているＧＰＶＩリガンドは、好ましくは、核酸リガンド等のリガンドである。ＧＰＶＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（アミノ酸残基Ｇｌｎ２１−Ｌｙｓ２６７、配列番号：２）に特異的に結合するＧＰＶＩリガンドを、以下の実施例１においてより詳細に記載されているＳＥＬＥＸ法を使用して選択した。その後、そのリガンドを、安定性、ＧＰＶＩに対する親和性、及び／又は、ＧＰＶＩ活性を制御する能力を増加させるように修飾した。
本発明のＧＰＶＩ核酸リガンドは、単離された核酸配列で構成されている。その核酸配列は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、また、修飾されたリボ核酸又はデオキシリボ核酸を用いて合成することができる。本明細書に記載されているように、ＲＮＡの塩基構造を利用する場合には、その構造は、塩基配列中にチミジン（Ｔ）の代わりにウリジン（Ｕ）を含む。本明細書に記載されている特定の実施形態においては、核酸の配列がＲＮＡ配列として記載されている。同様に、本明細書に記載されている特定の実施形態において、核酸リガンドが最初にＤＮＡ分子であると確認された場合には、核酸の配列がＤＮＡ配列として記載されている。ＤＮＡ配列としてテキスト形式で示されているヌクレオチドの配列が、対応するＲＮＡ配列の記載を固有に与えることは当然である。この場合、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）をウリジン（Ｕ）で置き換えることによって、ヌクレオチドの対応するＲＮＡ配列が得られる。同様に、ＲＮＡ配列としてテキスト形式で示されている配列が、対応するＤＮＡ配列の記載を固有に与えることは当然である。この場合、ＲＮＡ配列中のウリジン（Ｕ）をチミン（Ｔ）で置き換えることによって、ヌクレオチドの対応するＤＮＡ配列が得られる。
ＳＥＬＥＸ法で得られたいくつかのＧＰＶＩ核酸リガンドの配列を決定し、それらの配列を並べた。図４に示されている配列比較によって、選択工程において濃縮された６つのユニークな配列が同定された。「Ａ」から「Ｆ」とされる６種類の配列比較は、ＵＡＡ配列の存在を示している。さらに、この完全に保存された配列は、配列：（Ｇ／Ａ）ＵＡＡの内部に含まれている。両側がＧＣに隣接する（Ｇ／Ａ）ＵＡＡ配列は、保存されたＧＣ（Ｇ／Ａ）ＵＡＡＧＣ配列を生じさせる。
その後、ユニークなＧＰＶＩリガンドについて、二次構造予測分析を実行した。二次構造は、リガンドの機能的特性に寄与する。当業者によく理解されているように、二次構造を、分子中で５’から３’方向に存在するように、軸部構造及び環構造を単位として記載することができる。以下の実施例２に記載されている二次構造予測に基づけば、ＧＰＶＩ細胞外ドメインに対するリガンドは、３つの軸部と４つの環とを含む二次構造を有する。その５’から３’の立体配置は、第１の軸部（軸部１又はＳ１）と、第１の環（環１又はＬ１）と、第２の環及び第３の環（環３又はＬ３）につながっている第２の軸部（軸部２又はＳ２）と、第３の環と、第３の軸部（軸部３又はＳ３）と、第４の環（環４又はＬ４）とを含む（図８Ａ−図８Ｃ参照）。いくつかの実施形態において、第２の軸部は、第１の環、第２の環及び第３の環を連結し、第３の軸部は、第３の環と第４の環とを連結する。一実施形態において、第３の軸部は、５’−３’方向において第１の軸部に隣接している。配列ＧＣ（Ｇ／Ａ）ＵＡＡＧＣは、軸部３（ＧＣ塩基対）及び環４（（Ｇ／Ａ）ＵＡＡ）を形成する。配列ＧＡＣ形態は環１を形成する。
ＳＥＬＥＸによって同定されたＧＰＶＩリガンドの突然変異分析は、環３のＵＡ、ＵＵ又はＵＧの配列がＧＰＶＩに対するリガンドの高い親和性結合をサポートすることを示している。従って、いくつかの実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドの環３は、配列５’−ＹＤ−３’（ここで、Ｙはピリミジンを表し、ＤはＵ、Ｇ又はＡを表す）を含む。
いくつかの実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドの環２は、当業者に知られている方法を用いてスペーサで置換されていてもよい。このスペーサは、環２がスペーサで置換されたときに、ＧＰＶＩリガンドがその構造及び機能を維持するように、環２に類似した構造を与える非ヌクレオチドスペーサであってもよい。ＧＰＶＩ核酸リガンド中に９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトを組み込むことによって与えられるヘキサエチレングリコールスペーサによる環２の置換は、ＧＰＶＩに対する親和性を損なわない結果となった（図１３Ａ−図１３Ｂ参照）。従って、当業者は、商業的に入手可能な種々の非ヌクレオチドスペーサによって環２を置換することができることを理解するであろう。そのようなスペーサの例は、以下に限定されないが、ＧＰＶＩ核酸リガンドに、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト；１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト；及び、１２−（４，４’−ジメトキシトリチル）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトを組み込むことによって与えられものを含む。
ＧＰＶＩ機能を制御すること、又は、血小板を介してもたらされる疾病を治療することにおけるＧＰＶＩリガンドの有効性は、リガンドがＧＰＶＩタンパクに対して充分な親和性で結合する能力に大部分は依存する。従って、ＳＥＬＥＸプロセスを通じてＧＰＶＩリガンドを得た後に、各リガンドの配列を決定し、次に、そのＧＰＶＩリガンドを、標的分子との結合の観点によって評価することができる。本明細書におけるリガンドの結合親和性は、標的（ＧＰＶＩ）対するＫｄの単位で定義することができる。この解離定数の値は、実施例１に記載されている放射性リガンド結合方法等の周知の方法によって直接的に測定することができる。しかしながら、小さいオリゴヌクレオチドについては、Ｋｄの直接測定が困難であり、誤って高い結果になってしまうことがある。これらの状況においては、標的分子又は他の候補物質に結合することがわかっている物質に関して、その標的又は候補に対する競合結合測定法を実施することができる。５０％の抑制が生じる濃度（Ｋｉ）の値は、理想的な条件において、Ｋｄに等しい。しかしながら、いかなる場合にもＫｉがＫｄより小さくなることはない。したがって、Ｋｉの測定は、別の方法でＫｄの値の最大値を決める。Ｋｄの正確な測定が技術的困難によって妨げられる状況においては、Ｋｄの上限を与えるために、Ｋｉの測定を簡易に代用することができる。Ｋｉ値は、本発明のリガンドが標的に結合することを確認するために使用されてもよい。ＧＰＶＩリガンド結合特性の評価において、コラーゲン、ＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）又はコンブルキシン（Ｃｖｘ）等の既知のＧＰＶＩ結合分子を用いた競技結合分析又は機能分析を使用して、特異性を分析することができる。
いくつかの実施形態において、ＧＰＶＩに対するリガンドの結合のＫｄは、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、又は、約２０ｎＭ〜約０．１ｎＭであり得る。他の実施形態において、ＧＰＶＩに対するリガンドの結合のＫｄは、無関係なタンパク又は環境中の他の付随物質に対するリガンドの結合のＫｄと比較して、少なくとも１／２倍、１／３倍、１／４倍、１／５倍又は１／１０倍小さい。その無関係なタンパクは、他のＩｇスーパーファミリのタンパク、又は、コラーゲン結合領域、若しくは、他の血小板活性化／接着受容体を含む他のタンパク等のような、ＧＰＶＩ中に存在するモチーフに関連したモチーフを有するタンパクであってもよい。
以下により詳しく検討されているように、種々の技術的方法を使用して、ＳＥＬＥＸ法によって得られて同定されるリガンドの結合活性をさらに修飾又は改良することができる。
いくつかの実施形態において、リガンドは、ＧＰＶＩの細胞外ドメインと相互作用する。そのリガンドは、ＧＰＶＩレセプタのコラーゲン結合を阻害することができる。特定の実施形態において、リガンドは、ＧＰＶＩレセプタを介した細胞内シグナルリングを阻害することができる。この細胞内シグナルリングには、イノシトール三リン酸の生成を減少させること、又は、細胞内カルシウム濃度の変動が含まれる。また、リガンドは、レセプタがコラーゲン又はＦｃＲγと相互作用する能力が低くなるように、二量体の立体構造等のレセプタの立体構造を安定させ又は乱すものでもよい。。リガンドは、コラーゲン又は他のＧＰＶＩアゴニストによる血小板活性化に影響を与えることができる。リガンドは、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドに対する血小板付着に影響を与えることができるものでもよい。リガンドは、コラーゲン又は他のＧＰＶＩアゴニストによって誘導される血小板凝集に影響を与えることができるものでもよい。
本明細書に記載されている核酸リガンドは、活性が可逆的な物質として機能し得る。これらは、患者に投与した後に、第２の物質を投与することによって直接的に制御されることが可能な薬剤又は薬学的に活性な分子である。以下にさらに詳細に説明されているように、本明細書において調節因子と呼ばれる第２の物質は、リガンドの薬理学的活性を遮断又は微調節することができる。結果として、例えば薬物クリアランス以外の手段によって、リガンドの薬理学的活性を無効化することができる。
Ｅ．調節因子
いくつかの実施形態においては、ＧＰＶＩに対する核酸リガンドが可逆的である。一態様において、本発明は、核酸リガンドを投与された接種者に対してＧＰＶＩリガンドの調節因子を投与することによって、ＧＰＶＩに対する核酸リガンドの活性を調節する方法を提供する。
本発明の調節因子は、核酸リガンドに結合することができ、かつ、求められる態様でそのリガンドとその標的分子との間の相互作用を（例えば、核酸リガンドの構造を変化させることによって）変化させることができる、又は、その生物学的作用を変化させるように核酸リガンドを分解、代謝、切断、若しくは、化学的に変化させるあらゆる薬学的に許容可能な物質を含む。本発明の調節因子の例には、オリゴヌクレオチド、又は、その類似化合物であって、核酸リガンド配列（リボザイム又はＤＮＡザイムを含む）の少なくとも一部分に対して相補的である類似化合物が含まれる。他の例には：ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、若しくは、ロックド核酸（ＬＮＡ）；核酸結合タンパク又はペプチド；オリゴ糖；小分子；又は、核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子、若しくは、ミクロスフェアをベースとした調節因子が含まれる。
調節因子は、高い程度の特異性と求められる程度の親和性とを有する特定の核酸リガンドに結合するように設計されたものであり得る。また、調節因子は、結合したときに、リガンドの構造がより高活性又はより低活性の形態のいずれかに変化するように設計されたものであってもよい。例えば、調節因子は、標的とされる核酸リガンドに結合する時に、そのリガンドの二次構造及び／又は三次構造が変化し、それによって、そのリガンドが標的分子ともはや結合することができないか又はより小さい親和性でその標的分子と結合するように設計することができる。あるいは、調節因子は、結合時に、リガンドの標的分子に対するリガンドの親和性が強くなるように、リガンドの三次元構造が変化するように設計されたものであってもよい。すなわち、調節因子は、結合時に、リガンドの親和性が強化されるように、構造モチーフを変化させるように設計されたものであってもよい。他の一実施形態においては、リガンドと調節因子とのペアは、対象とする標的分子と結合することができない核酸リガンド分子に対する調節因子の結合が、そのリガンドがその標的分子と結合できるようになる構造モチーフをリガンド中に生じさせることができるように設計されたものである。
調節因子は、複合体を形成するのに充分な親和性で、特定の核酸リガンド又は核酸リガンドの集合に非特異的に結合するように設計されたものであってもよい。そのような調節因子は、一般に、電荷間相互作用によって核酸と結合することができる。そのような調節因子は、同時に複数の核酸リガンドに結合することもできる。調節因子は、１つ以上の核酸リガンドに結合する時に、核酸リガンドの構造をその活性形態から著しく変化させないが、むしろ、その調節因子が標的分子との核酸リガンドとの結合を遮断又は立体的に阻害するように設計されたものであってもよい。
ヌクレオチド調節因子は、リガンド分子に対する効果的な結合を可能にするあらゆる長さであり得る。例えば、オリゴヌクレオチド調節因子は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約３０ｎｔ、約１０ｎｔから約２０ｎｔ、又は、約１５ｎｔ以上の長さであり得る。ヌクレオチド調節因子の長さは、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、又は、３０ｎｔであり得る。当業者は、３０ｎｔ以上の長さを有するヌクレオチド調節因子を構想することもできる。
本明細書に記載されている核酸リガンドは、活性な三次構造を有する。その三次構造は、適切な安定した二次構造の形成によって影響され得る。したがって、本発明の相補的なオリゴヌクレオチド調節因子と核酸リガンドとによる二本鎖の形成のメカニズムは、２つの短い直鎖オリゴリボヌクレオチド間の二本鎖の形成と同様ではあるが、そのような相互作用を設計するための規則、及び、そのような生成物の形成の動態の両方は、リガンドの分子内構造によって影響される可能性がある。
核酸リガンドとオリゴヌクレオチド調節因子との間での最初の塩基対形成の核生成の速度は、最後の安定的な二本鎖の形成において重要な役割を果たす。また、このステップの速度は、オリゴヌクレオチド調節因子を、核酸リガンド中に存在する一本鎖の環及び／又は３’若しくは５’の一本鎖の尾部にターゲッティングすることによって非常に向上する。分子内二本鎖の最適な形成を生じさせるためには、標的とする核酸リガンド中に存在する分子内二本鎖の形成に関して、自由エネルギーが、分子内二本鎖の形成に理想的には有利である。
本発明に記載されている調節因子は、一般に、標的とする核酸リガンド配列の少なくとも一部分に対して相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、調節因子オリゴヌクレオチドは、標的とするリガンドの約６ｎｔ〜２５ｎｔ、８ｎｔ〜２０ｎｔ、又は、１０ｎｔ〜１５ｎｔに対して相補的な配列を含むものであってもよい。調節因子オリゴヌクレオチドの長さは、標的とするリガンド及び求められる結果を考慮に入れて、本明細書に記載されている技術及び当業者に知られている技術を使用して容易に最適化することができる。Ｄ型若しくはＬ型の立体構造を有するヌクレオチド又はそれらの混合物を用いて、オリゴヌクレオチドを作ることができる。天然に存在するヌクレオシドはＤ型である。
本発明のオリゴヌクレオチド調節因子は、核酸リガンドの少なくとも一部分に対して相補的な配列を含むが、完全な相補性は必要とされない。「核酸リガンドの少なくとも一部分に対して相補的である」と本明細書で呼ばれる配列は、核酸リガンドとハイブリダイズすることができる充分な相補性を有する配列である。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及び核酸の長さの両方に依存し得る。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが大きくなるほど、そのオリゴヌクレオチドは、標的リガンドとのより多くの塩基の不一致を含んでいても安定な二本鎖を形成することができる（あるいは、三重鎖の場合であっても同様である）。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的方法を使用することによって、不一致の許容可能な程度を確認することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ若しくは一本鎖ＲＮＡ、又は、キメラ混合物、又は、誘導体、又は、これらを変性したものであってもよい。
調節因子は、核酸骨格、及び、各核酸の構造の両方に修飾を含むものであってもよい。特定の実施形態において、調節因子は、リガンド中の少なくとも１つの環部に対して相補的な核酸である。いくつかの実施形態において、調節因子は、生理的条件下で二次構造中の第４の環に対してハイブリダイズする配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチドであり、特に、配列３’−ＡＵＵ−５’を含むオリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、調節因子は、生理的条件下でリガンドの二次構造中の第１の環に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、特に、配列３’−ＣＵＧ−５’を少なくとも含むオリゴヌクレオチドである。調節因子の求められる機能に応じて、核酸リガンドの二次構造及び／又は三次構造を乱し又は安定させるように、調節因子を設計することができる。
いくつかの実施形態において、調節因子は、リガンドの「自己不活性化位置」に結合し、それによってリガンドの配列を崩壊させるように設計されたものである。自己不活性化位置は、酵素によって切断され易い（リガンドの）一本鎖の部分である。例示的一実施形態において、調節因子がリガンドに結合した時に、自己不活性化位置が一本鎖になって不安定になり、血液又は肝臓のエンドヌクレアーゼ等の循環中の酵素によるリガンドの切断を増やすことができる。特定の実施形態において、調節因子がリガンドに結合した後には、そのリガンドがもはや標的と相互作用することができなくなる。
例示的一実施形態において、調節因子は、配列番号７４〜８８から選択される核酸配列を含む（配列番号７４及び８８を含む）。
いくつかの実施形態において、調節因子配列は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロシチジン、又は、２’−フルオロウリジン等のように、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾を含んでいてもよい。
オリゴヌクレオチド調節因子が結合するための核酸リガンド中の最適位置を決定するために、様々な戦略を使用することができる。相補的なオリゴヌクレオチドが核酸リガンドの周囲を「巡る」ような実証的戦略を使用することができる。このアプローチに従って、長さが約１５のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド又は２’−フルオロオリゴヌクレオチド）であって、リガンドの約５個のヌクレオチドずつずらした配列（例えば、リガンドの１−１５、６−２０、１１−２５等に対して相補的なオリゴヌクレオチド）を使用することができる。ハイブリダイゼーションの効率に対する核酸リガンドの三次構造の影響を予測することは困難であり得るので、実証的戦略が特に有効になり得る。
様々なオリゴヌクレオチドが特定の核酸リガンドに対してハイブリダイズする能力を評価するために、核酸リガンドの完全な結合を達成するのに必要とされるモル過剰のオリゴヌクレオチドを特に重点を置いて、以下の実施例に記載されている分析を使用することができる。様々なオリゴヌクレオチド調節因子が、標的分子からの核酸リガンドの解離の速度を速める能力、又は、リガンドとの標的分子の結合の速度を速める能力を、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を使用して、標準的な動態研究を行うことによって決定することができる。リガンドとその標的分子との間の相互作用を所望の態様に変化させるために、５倍〜５０倍の又はそれより少ないモル過剰のオリゴヌクレオチドが必要とされるように、オリゴヌクレオチド調節因子を選択することができる。
あるいは、オリゴヌクレオチド調節因子との結合を促進するために、一本鎖の尾部（３’又は５’）を含むように、標的とする核酸リガンドを修飾することができる。好適な尾部は、１個〜２０個のヌクレオチド、１個〜１０個のヌクレオチド、１個〜５個のヌクレオチド、又は、３個〜５個のヌクレオチドを含むものであってもよい。尾部は修飾されたもの（例えば、２’−Ｏ−メチルシトシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロシチジン、又は、２’−フルオロウリジン等のような、２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−フルオロ修飾）であってもよい。一本鎖の尾部の付加が核酸リガンドの活性構造を崩壊させないことを確認するために、結合分析及び生物学的分析において（例えば、後の実施例に記載されているように）、尾部を有するリガンドを試験することができる。例えば、尾部配列と１個、２個、３個、４個又は５個の塩基対を形成することができる一連の複数のオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を設計し、それらのオリゴヌクレオチドを、尾部を有するリガンドに単独で結合する能力のみならず、標的分子からのリガンドの解離の速度を速める能力、又は、標的分子とリガンドの結合の速度を速める能力について試験することができる。その効果が二本鎖形成によるものであり、非特異的効果ではないことを確認するために、順序を入れ替えたコントロール配列を使用することができる。
他の一実施形態において、調節因子は、リボザイム又はＤＮＡザイムである。酵素的核酸は、標的とするＲＮＡ又はＤＮＡに対して最初に結合することによって作用する。そのような結合は、酵素的核酸の標的結合部位によって生じる。標的結合部位は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部位に隣接して保持されている。したがって、酵素的核酸は、最初に標的とするＲＮＡ又はＤＮＡを認識し、相補的塩基の対合によって結合する。酵素的核酸は、正しい位置に結合すると、標的とするＲＮＡを切断するように酵素的に作用し、それによってＲＮＡ又はＤＮＡ、ＲＮＡリガンドの不活性化を可能にする。それぞれ異なる種類の特異性を示す少なくとも５つのクラスのリボザイムが存在する。例えば、グループＩイントロンは、大きさがおよそ３００〜１０００ヌクレオチドであり、切断部位の５’側にすぐ隣接して標的配列中にＵを必要とし、切断部位の５’側の４個〜６個のヌクレオチドに結合する。もう１つのクラスは、ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ ＲＮＡ）である。これは、大きさがおよそ２９０〜４００ヌクレオチドである。第３のクラスは、ハンマーヘッドリボザイム(Hammerhead Ribozyme)である。これは、サイズがおよそ３０〜４０ヌクレオチドである。これらは、切断部位の５’側にすぐ隣接して標的配列ＵＨ（ここで、ＨはＧではない）を必要とし、切断部位の両側の可変数のヌクレオチドに結合する。第４のクラスは、ヘアピンリボザイムであり、約５０ヌクレオチドの大きさである。これらは、切断部位の３’側にすぐに隣接して標的配列ＧＵＣを必要とし、切断部位の５’側において４個のヌクレオチドを、及び、切断部位の３’側に対して可変数のヌクレオチドを結合させる。第５のグループは、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムであり、て約６０ヌクレオチドの大きさである。ＤＮＡザイムは一本鎖で、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を切断する。ＤＮＡザイムの一般的なモデルが提案されており、そのモデルは「１０−２３」モデルとして知られている。「１０−２３」モデルに従ったＤＮＡザイムは、１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有しており、それぞれ、７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインが隣接している。
他の一実施形態において、調節因子は、それ自体が核酸リガンドである。この実施形態においては、求められる治療的標的に結合する第１リガンドを生成する。第２ステップにおいては、本明細書に記載されているＳＥＬＥＸプロセス又は他のプロセスを使用して第１リガンドに結合する第２リガンドを生成し、治療用リガンドと標的との間の相互作用を調節する。一実施形態において、第２のリガンドは、第１リガンドの効果を不活性化する。
他の例示的一実施形態において、調節因子は、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡ又はＰＣＯをベースとした調節因子である。本発明のオリゴヌクレオチド調節因子の核酸塩基は、例えば、ペプチジル結合(ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合等；Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７及びＵＳ特許第５５３９０８２）、及び、モルホリノ結合（Ｑｉｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０、１１（２０００）；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７、１８７（１９９７）； Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７、６３（１９９７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７１、１７４４５（１９９６）；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６、１６９（１９９６））等の核酸塩基間結合を介して、又は、他の天然の又は修飾された結合によって連結されていてもよい。オリゴヌクレオチドの核酸塩基は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）であってもよい（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ １７、１７５（１９９９）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １３、４４（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １１、２２８（２０００））。
ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドと類似するが、組成が異なる化合物である。ＰＮＡにおいて、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格は、ペプチド骨格で置換されている。ペプチド骨格の各サブユニットは、天然に存在する核酸塩基又は天然に存在しない核酸塩基に付着している。ＰＮＡは、多くの場合、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる光学不活性のポリアミド骨格を有する。プリン塩基又はピリミジン塩基は、相補的な核酸を標的とするように、メチレンカルボニルリンカー（１−３）を介して各単位につながっている。ＰＮＡは、ワトソンクリック型塩基対規則に従って、平行又は逆平行の配置で相補的ＲＮＡ又は相補的ＤＮＡと結合する。天然の同族二本鎖と比較して、ＰＮＡオリゴマの荷電していない性質は、ハイブリッドＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）二本鎖の安定性を高める。
モルホリノ核酸は、モルホリノサブユニットから組み立てられるので、そのように名付けられた。各モルホリノサブユニットは、六員環のモルホリン環につながった４種の遺伝子的塩基（アデニン、シトシン、グアニン及びチミン）の１つを含む。これらの４種のサブユニットからなる１８個〜２５個のサブユニットは、オリゴモルホリノを与えるように、非イオン性のホスホロジアミデートサブユニット間結合によって特定の順で連結されている。
ＬＮＡは、本発明の調節因子の主要な候補にせしめるいくつかの特徴を有するＤＮＡ類似化合物のクラスの１つである。ＬＮＡモノマーは、ＲＮＡモノマーに構造的に類似する二環化合物である。ＬＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの化学的性質の大部分を共有しており、水溶性であり、ゲル電気泳動、エタノール沈殿等によって分離可能である（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５４、３６０７−３６３０（１９９８））。しかしながら、ＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴマーのいずれかにＬＮＡモノマーを導入することは、ワトソンクリック型塩基対規則に従うと同時に、相補的ＤＮＡ又は相補的ＲＮＡとの二本鎖の高い熱安定性をもたらす。
偽環オリゴ核酸（ＰＣＯ）を本発明において調節因子として使用することもできる（米国特許第６３８３７５２号参照）。ＰＣＯは、３’−３’端又は５’−５’端を介して接続された２つのオリゴヌクレオチド断片を含んでいる。ＰＣＯの１つの断片（「機能的断片」）は、いくつかの機能性（例えば、標的ＲＮＡに対する相補性）を有する。もう１つの断片（「保護断片」）は、（機能的断片が接続される末端に依存して）機能的断片の３’又は５’端末側終端に対して相補的である。機能的断片と保護断片との間の相補性の結果として、ＰＣＯは、標的核酸（例えば、ＲＮＡ）の非存在下において分子間偽環構造を形成する。ＰＣＯは、３’−３’結合又は５’−５’結合の存在、及び、分子間偽環構造の形成に起因して、従来のオリゴヌクレオチドよりも安定である。マウスにおける薬物動態調査、生体内分布調査、及び、安定性調査によって、ＰＣＯは、インビボにおいてＰＳオリゴヌクレオチド全般よりも高い安定性、並びに、ＰＳオリゴヌクレオチド全般と類似した薬物動態及び生体内分布特性を有するが、特定の組織からは急速に除去されることが示唆されている。蛍光色素分子及び消光分子が本発明のＰＣＯに適切に結合していれば、その分子は、線形構造にある時に発光するが、その発光は環構造中で消光される。この特徴を、潜在的な調節因子としてＰＣＯを選別するために使用することができる。
他の例示的一実施形態において、調節因子は、ペプチドをベースとした調節因子である。核酸リガンドのペプチドベース調節因子は、オリゴヌクレオチド又はその類似化合物に対する調節因子の代替的分子クラスの１つを意味する。標的核酸リガンドとオリゴヌクレオチド調節因子との間の核生成を促進するための充分な一本鎖領域がないことに起因して、標的核酸リガンドの充分に活性なオリゴヌクレオチド調節因子を単離することができない場合には、調節因子のこのクラスが特に有用である。さらに、ペプチド調節因子は、オリゴヌクレオチド調節因子とは異なる生物学的利用可能性及び薬物動態を与える。例示的一実施形態においては、調節因子がプロタミンである（Ｏｎｅｙら、２００９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５：１２２４−１２２８）。プロタミンは、水に可溶であり、熱によって凝固せず、アルギニン、アラニン及びセリンを含む（大部分がプロリン及びバリンをさらに含んでおり、また、多数はグリシン及びイソロイシンを含んでいる）。調節因子には、プロタミン変異体（例えば、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．６３：２８０（１９９６）参照）、及び、米国公開公報第２００４０１２１４４３号に記載されているものを含むプロタミンの修飾された形態が含まれる。他の調節因子には、米国特許第６６２４１４１号及び米国特許公開公報第２００５０１０１５３２号に記載ているもののようなプロタミン断片が含まれる。調節因子には、一般に、ヘパリン、他のグリコサミノグリカン又はプロテオグリカンの活性を調節するペプチドが含まれる（例えば、米国特許第５９１９７６１号参照）。例示的一実施形態において、調節因子は、ポリＬリジン及びポリＬオルニチン等の電荷間相互作用を安定させることができる陽イオン性ＮＨ基を含むペプチドである。
標的核酸リガンドに結合することができ、それによって標的核酸リガンドの活性を調節することができるペプチドを単離するいくつかの戦略が利用可能である。例えば、コードされてビーズに固定されたペプチドコンビナトリアルライブラリが記載されている。このライブラリは、ウィルスＲＮＡ配列に結合することができ、かつ、ＲＮＡに特異的に結合するウイルス制御タンパクとそのウィルスＲＮＡとの間の相互作用を乱すことができるペプチドを含むことが実証されている（Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９９、９６：１２９９７）。標的核酸リガンドにラベルを付し、ライブラリのいくつかのペプチドと核酸との間の結合を促進する条件下で、ラベルを付した標的とビーズに固定されたペプチドライブラリとを一緒にインキュベートすることによって、そのようなライブラリを使用して核酸リガンドの調節因子を単離することができる。所定のビーズ上の特定のペプチドに対する核酸リガンドの結合は、その核酸リガンド上のラベルによってそのビーズを「有色」にし、したがって、ビーズの単純な分離によって、標的に結合できるペプチドの同定が可能になる。そのような選抜方法によって分離されたペプチドと標的核酸リガンドとの間の直接的な相互作用は、核酸リガンドの調節因子を同定するために記載されている任意の数の結合分析を使用して、確認及び定量することができる。前記ペプチドが標的核酸リガンドの活性を調節する能力は、適切な生物学的分析によって確認することができる。
さらなる実施形態において、調節因子は、オリゴ糖をベースとした調節因子である。オリゴ糖は、核酸と相互作用することができる。例えば、抗生剤アミノグリコシドは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の生成物であり、様々なリボザイム、リボソームのＲＮＡ成分、及び、ＨＩＶ−１のＴＡＲ配列及びＲＲＥ配列等のＲＮＡ分子の種々の配列と特異的に相互作用する。したがって、オリゴ糖は、核酸に結合することができ、核酸リガンドの活性を調節するために使用することができる。
他の一実施形態において、調節因子は、小分子をベースとした調節因子である。リガンドと標的との間にインターカレートする、又は、リガンドと標的との間の結合を崩壊若しくは修飾する小分子を、治療的調節因子として使用することができる。小分子を用いて及び小分子を用いずにリガンドと標的との間の結合変化を測定する分析において候補を選別することによって、又は、小分子を用いて及び小分子を用いずにインビボ若しくはインビトロにおいて標的に対するリガンドの生物学的作用における差を測定する分析を使用することによって、そのような小分子を同定することができる。所望の結果を与える小分子が同定されれば、所望の制御効果のために化学構造を最適化するために、組み合わせのアプローチ等の技術を使用することができる。
さらなる例示的一実施形態において、調節因子は、核酸結合ポリマー、脂質、ナノ粒子又はミクロスフェアである。さらなる非限定的な例において、調節因子は：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスフォコリン（ＥＤＯＰＣ）；ジラウロイルエチルホスファチジルコリン（ＥＤＬＰＣ）；ＥＤＬＰＣ／ＥＤＯＰＣ；ピリジニウム界面活性剤；ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）；（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシロキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）に、前述の中性共脂質である、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を加えたもの（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ／ＤＯＰＥ）；（±）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−２，３−ビス（ジオレオイルオキシ−１−プロパニミニウムペタヒドロクロリド（ＤＯＳＰＡ）；ジラウロイルエチルホスファチジルコリン（ＥＤＬＰＣ）；エチルジミリストイルホスファチジルコリン（ＥＤＭＰＣ）；（±）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス（ｚ−オクタデカ−９−エン−オイルオキシ）−１−プロパナミニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；（±）−Ｎ−２−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；（±）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス（ｚ−オクタデカ−９−エニルオキシ）−１−プロパナミニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；５−カルボキシスペルミルグリシン・ジオクタデシル・アミド（ＤＯＧＳ）；ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン・５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；テトラメチル・テトラパルミトイル・スペルミン（ＴＭＴＰＳ）；テトラメチルテトラオレイルスペルミン（ＴＭＴＯＳ）；テトラメチルテトララウリルスペルミン（ＴＭＴＬＳ）；テトラメチルテトラミリスチルスペルミン（ＴＭＴＭＳ）；テトラメチルジオレイルスペルミン（ＴＭＤＯＳ）；ジフィタノイルホスファチジル・エタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）；及び、（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ドデシロキシ）−１−プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）からなる群より選択することができる。
他の実施形態において、調節因子は：キトサン；キトサン誘導体；１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレン・ポリメトブロミド；ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロック共重合体；ポリＬリジン；ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）；β−シクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）；β−シクロデキストリン含有ポリカチオン（イミダゾール含有変異体）（ＣＤＰ−Ｉｍ）；ポリホスホロアミダートポリマー（８ｋＤａ、３０ｋＤａ）（ＰＰＡ−ＤＰＡ ８ｋ、ＰＰＡ−ＤＰＡ ３０ｋ）；ポリブレン；スペルミン；ＰＥＧ−ブロック−ＰＬＬ−デンドリマ；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；マンノース・ＰＥＩ；トランスフェリン・ＰＥＩ；線状・ＰＥＩ（ｌＰＥＩ）；ゼラチン；メタクリレート／メタクリルアミド；ポリ（β−アミノエステル）；高分子電解質複合体（ＰＥＣ）；ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）；コラーゲン；ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）；ポリアリルアミン；ポリビニルピリジン；アミノアセタール化されたポリ（ビニルアルコール）；アクリル酸ポリマー又はメタクリル酸ポリマー；Ｎｅｗｋｏｍｅデンドリマー；ポリフェニレン；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＡＢ）；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；アルブミン；酸処理したゼラチン；ポリリシン；ポリオルニチン；ポリアルギニン；ＤＥＡＥセルロース；ＤＥＡＥデキストラン；ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタクリレート；及び、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）からなる群より選択される。
一実施形態において、調節因子は、キトサン及びキトサン誘導体から選択される。キトサン誘導体は、水溶性キトサンナノ粒子（米国特許第６４７５９９５号；米国特許出願第２００６／００１３８８５号；Ｌｉｍｐｅａｎｃｈｏｂら、（２００６） Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ−Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｎａｒｅｕｓａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｏｕｒｎａｌ１４（２）：２７−３４記載されているもの）を含む。キトサンポリマー（グルコサミンモノマーの繰り返しから実質的に構成される非常に大きいポリアミンポリマー）のポリカチオン的特性を考慮して、接種者への注入に続いて、インビボにおいてリガンドを凝集させ及び／又は高分子電解質複合体中に閉じ込めるために、キトサンを使用することができる。これは、一部分において、キトサン上にみられる第１級アミンとリガンドのリン酸ジエステル骨格との相互作用に基づいている。
特定の実施形態においては、水溶性及び荷電状態を変化させるために、キトサンポリマー上の第１級アミンを実質的に修飾することができる。キトサン誘導体は：様々な程度の四級化度で合成され得るトリメチルキトサンクロリド（ＴＭＣ）；両性ポリマーであるモノカルボキシメチル化キトサン（ＭＣＣ）；グルタルアルデヒドと架橋したキトサン誘導体（ＣＳＧＡ）；チオール化されたキトサン（Ｌｅｅら、（２００７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２４：１５７−６７）；グリコールキトサン（ＧＣ）；エチレングリコールと共役したキトサン誘導体（Ｌｅｅら、（２００７） Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ）；［Ｎ−（２−カルボキシベンジル）キトサン（ＣＢＣＳ）（Ｌｉｎら、（２００７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ．３４２（１）：８７−９５）；β−シクロデキストリンキトサンポリマー（Ｖｅｎｔｅｒら、（２００６） Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．３１３（１−２）：３６−４２）；Ｏ−カルボキシメチルキトサン；Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン；又は、キサンテート基を骨格に導入することによって化学修飾されたキトサンを含む。
一実施形態においては、中空のキトサンナノ粒子を生成し、その粒子を調節因子として使用する。１０，０００ｄａ〜１，０００，０００ｄａの範囲内の分子量のキトサン又はキトサン誘導体を使用することができる。特定の実施形態において、キトサンの分子量は５００，０００ｄａ以下である。特定の実施形態において、キトサンの分子量は１００，０００ｄａ以下である。いくつかの実施形態において、この化合物の分子量は、１００００Ｄａ〜１０００００Ｄａ、１００００Ｄａ〜９００００Ｄａ、１００００Ｄａ〜８００００Ｄａ、２００００Ｄａ〜７０００００、３００００Ｄａ〜７００００Ｄａ、約３００００、約４００００Ｄａ、約５００００Ｄａ、又は、約６００００Ｄａである。
いくつかの実施形態においては、脱アセチルされた第１級アミンを様々な程度で含むキトサンポリマーが使用される。これらの実施形態において、脱アセチルの程度が様々であることによって、ポリマーの荷電状態が変化し、それによってポリマーの結合特性が変化する。接種者の体内でキトサンナノ粒子がリガンドと接触すると、リガンドは、ナノ粒子表面に結合して捕捉されるか、又は、ナノ粒子の中に入ってイオン相互作用によって閉じ込められる。
他の一実施形態において、調節因子は、ポリホスフェートポリマーミクロスフェアである。特定の実施形態において、米国特許第６５４８３０２号に記載されているように、調節因子は、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−エチル−ホスファイト）又はＰ（ＬＡＥＧ−ＥＯＰ）等のミクロスフェア及びその他のものの誘導体である。そのようなポリマーは、重合体の骨格の一部分として様々な官能基を含むように生産されたものであってもよい。一例において、このポリマーは、接触したときに、１つ以上の核酸と複合化するか又はその核酸を閉じ込めることができるように、陽電荷を有する第四級アミンを生理学的ｐＨにおいて含んでいてもよい。特定の実施形態において、ポリマーはプラス電荷を含まない。
本発明は、核酸ＧＰＶＩリガンドの調節因子を同定する方法も提供する。一般に、結合分析、分子モデリング、又は、生物学的機能の変化を測定するインビボ若しくはインビトロにおける分析を通じて、調節因子を同定することができる。一実施形態において、ゲルシフト分析によって、核酸に対する調節因子の結合を測定する。他の一実施形態においては、ＢＩＡＣＯＲＥ分析によって、核酸リガンドに対する調節因子の結合を測定する。
本発明の調節因子を同定及び選抜するために、標準結合分析を使用することができる。非限定的な例は、ゲルシフト分析及びＢＩＡＣＯＲＥ分析である。すなわち、試験条件下又は典型的な生理的条件下において、標的とする核酸リガンドに試験用調節因子を接触させて、実際にその試験用調節因子がリガンドに結合するかどうかを決定することができる。その後、標的分子に対するリガンドによって生じる生物学的作用にその試験用調節因子が影響を与えることができるかどうか判断するために、核酸リガンドに結合することが判明した試験用調節因子を、適切な生物学的分析（この分析は、リガンド及び標的分子に応じて変わり、例えば、凝集試験法が挙げられる）において分析することができる。
ゲルシフト分析は、結合能力を評価するために使用される周知の技術である。例えば、最初に、試験用配列を含むＤＮＡ断片を、試験用タンパク又は推定される結合タンパクを含む混合物と共にインキュベートし、次に、インキュベートしたものを電気泳動によってゲル上に分離する。ＤＮＡ断片がタンパクに結合していれば、サイズがより大きくなり、したがって、その移動は、結合していない断片の速度よりも遅くなる。例えば、電気泳動によるゲル移動シフト分析のための１つの方法は、（ａ）複合体の形成においてタンパクと核酸との間の特異的結合相互作用を促進するのに適した条件下で、分子プローブを含む非放射性又は放射性のラベルを付した核酸分子に核酸結合タンパクを混合物中で接触させるステップであって、前記プローブが二本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ及び１本鎖ＲＮＡからなる群より選択されるステップと、（ｂ）その混合物を電気泳動するステップと、（ｃ）複合体中の非放射性又は放射性のラベルを検出することによって、膜に結合した複合体を検出するステップであってもよい。
ＢＩＡＣＯＲＥ技術は、センサチップ表面における結合現象を測定し、表面に付着した反応体によって分析の特異性が決定される。相互作用の特異性の試験は、固定された反応体に様々な分子が結合することができるかどうかを単純に分析することを含む。結合によって表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）信号が急速に変化し、その結果、相互作用が生じているかどうかが直接明らかになる。表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサは、表面に近い生体分子の質量濃度を測定することによって、相互作用を測定する。その表面を、相互作用のパートナーの１つを付着させることによって特異的にする。別のパートナーを含むサンプルは表面上を流れる。すなわち、サンプルに由来する分子が表面に付着させた反応体と結合するときに、局所的濃度が変化して、ＳＰＲ反応が測定される。その反応は、表面に結合する分子の質量に正比例する。
特定の条件下において、異なる屈折率の２つの媒体間の界面において電導膜から光が反射されるときに、ＳＰＲが生じる。ＢＩＡＣＯＲＥ技術において、媒体はサンプルとセンサチップのガラスであり、電導膜は、チップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角で反射光線の強度の低下を生じさせる。この角度は、反射光線から反対側の表面付近の屈折率に応じて変わる。サンプル中の分子がセンサ表面と結合するときに、濃度、したがって、表面における屈折率が変化して、ＳＰＲ反応が検出される。相互作用中の時間に対して反応をプロットすることによって、相互作用の進行の定量的測度が与えられる。ＢＩＡＣＯＲＥ技術は、最小の反射光強度の角度を測定する。この光はサンプルに吸収されない。すなわち、この光エネルギーは金の膜においてＳＰＲによって消失する。ＳＰＲ反応値は共鳴単位（ＲＵ）で表される。１ＲＵは、最小強度の角度における０．０００１度の変化を表し、ほとんどのタンパクについて、これは、センサ表面における約１ｐｇ／ｍｍ２の濃度変化におおよそ等しい。ＲＵと表面濃度との間の正確な変換係数は、センサ表面の特性、及び、濃度変化の原因となる分子の性質に応じて変わる。
標的との相互作用が変化するように、オリゴヌクレオチド若しくはその類似化合物、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖又は小分子がリガンドに結合することができるかどうか判断できる他の多数の分析方法が存在する。ある物質が核酸リガンドに結合する能力を評価するために、例えば、電気泳動度移動分析（ＥＭＳＡ）、滴定熱量測定、シンチレーション近接アッセイ、分析用超遠心法を使用した沈澱平衡分析（例えば、www.cores.utah.edu/interaction参照）、蛍光偏光分析、蛍光異方性分析、蛍光強度分析、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分析、ニトロセルロースフィルタ結合分析、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＯＮＡ（例えば、米国特許第５７８９１６３号参照）、ＲＩＡ、又は、平衡透析法分析を使用することができる。物質と核酸リガンドとの間の相互作を直接的に測定する直接分析を実行することができる。又は、物質がターゲットからリガンドを置き換える能力を測定する競合分析若しくは置換分析を実行することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ、Ｂｅｌｌ ａｎｄ Ｊａｎｊｉｃ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０（５）、２００１、ｐ１０９４、及び、米国特許第６３０６５９８号参照）。調節因子の候補を同定したら、標的に対する核酸リガンドの活性を調節因子が調節する能力を、生物学的分析において確認することができる。あるいは、リガンドの標的との相互作用を調節することができる物質を同定したら、その物質がリガンドと直接的に相互作用しており、その相互作用の親和性を測定することができることを確認するために、そのような結合分析を使用することができる。
他の一実施形態においては、核酸リガンドに結合する調節因子の同定、調節因子と核酸リガンドとの間の相互作用の部位、及び、リガンドに対する物質の相対的結合親和性のために、質量分光測定を使用することができる（例えば、米国特許第６３２９１４６参照）。選択されたターゲットリガンドに結合する各化合物であって、そのリガンドの調節因子として使用することができるものを目的として、化学混合物又はライブラリ（特に組み合わせライブラリ）を選別するために、そのような質量分光方法を使用することもできる。更に、複数のターゲット核酸リガンドを同時に選別するために、例えば、化合物の組み合わせライブラリに対して、質量分光技術を使用することができる。さらに、複数の分子種間、特に「小さい」分子間における相互作用を同定するために、及び、ターゲットリガンドの分子相互作用部位を同定するために、質量分光技術を使用することができる。
核酸リガンドと標的との間の相互作用を変更することにおける調節因子の有効性を評価するインビボ又はインビトロにおける分析は、治療する病気に対して特異的である。使用可能な周知の生物学的特性についての充分な標準的分析が存在する。生物学的分析の例は、本出願において引用されている特許に提供されている。それらの特許には、特定の用途のための特定の核酸リガンドが記載されている。
いくつかの実施形態において、調節因子は小分子である。例えば、特定の実施形態において、核酸リガンドは、ビオチン分子に連結されている。それらの例においては、リガンドに結合させてリガンドの効果を無効化するために、ストレプトアビジン又はアビジンを投与する（Ｓａｖｉら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、６：１６９７−１７０６参照）。アビジンは、鳥類、爬虫類及び両生類の卵管において生産される四量体のタンパクであり、それらの生物の卵の白身に蓄積される。ストレプトアビジンは、細菌ストレプトミセスアビジニイ（Streptomyces avidinii)から精製された四量体タンパクである。この四量体タンパクは、４つの同一のサブユニット（ホモ四量体）を含んでおり、これらのサブユニットのそれぞれは、高い程度の親和性及び特異性でビオチン（ビタミンＢ７、ビタミンＨ）に結合することができる。
特定の実施形態においてが、調節因子が陽イオン性分子である。特定の実施形態において、リガンドは、グアニン四重鎖（Ｇ−四重鎖又はＧ−四本鎖）構造を形成している。これらの構造は、陽イオン性分子によって結合している。特定の実施形態において、前記分子は、金属キレート化分子である。いくつかの実施形態においては、調節因子がポルフィリンである。いくつかの実施形態においては、前記化合物がＴＭＰｙＰ４である。Ｊｏａｃｈｉｍｉら、ＪＡＣＳ ２００７、１２９、３０３６−３０３７、及び、Ｔｏｒｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８年８月１日、３７９（１）８−１５を参照されたい。
一実施形態において、調節因子は、１０（１０．０）マイクロモル（μＭ）未満、１（１．０）マイクロモル（μＭ）未満、好ましくは０．１μＭ未満、及び、より好ましくは０．０１μＭ未満の調節因子濃度の溶液中において核酸リガンドに実質的に結合する能力を有する。「実質的に」は、標的の存在下において、調節によって標的の生物活性の少なくとも５０パーセントが低下することが観察されることを意味する。また、本明細書において５０％の低下をＩＣ５０値と称する。
Ｆ．リガンド及び調節因子の最適化
リガンドを治療的用途に適するものとするために、そのリガンドは、安価に合成され、接種者における使用が安全であり、インビボにおいて安定であることが好ましい。野生型ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び野生型ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、一般に、インビボにおいて安定ではない。２’位に修飾基を組み込むことによって、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を大幅に向上させることができる。
後でリガンドを選抜するオリゴヌクレオチドプールに２’−フルオロ基又は２’−アミノ基を組み込むことができる。リガンド選抜のための最初のオリゴヌクレオチドプールを生成するために、本開示においては、インビトロの転写反応において２’−フルオロピリミジンを使用した（実施例１参照）。しかしながら、各プリン位に２’−ヒドロキシル糖を含むそのようなライブラリから選択されて得られるリガンドは、したがって、インビボにおいて相当するＲＮＡ又はＤＮＡのリガンドより安定ではあるものの、さらなる最適化を必要とする。従って、本明細書に記載されている方法を使用して同定されたリガンドは、機能性及び安定性を高めたのみならず、大規模製造プロセスの実現可能性を高めたリガンドを得るための様々な方法で、その後に修飾される。
リガンド（例えば、ＳＥＬＥＸによるもの）及び調節因子（例えば、配列相補性に基づいた設計）の最初の同定の後に、所望の構造、機能及び／又は安定性を改良するために、様々な手段によってリガンド及び調節因子を修飾又は改変することができる。これらは、以下に限定されないが、特定の糖残基を置換すること、リガンド中の特定の領域及び／又は構造の組成と大きさを変更すること、並びに、調節因子によってより効果的に制御され得るリガンドを設計することを含む。
核酸リガンドの設計及び最適化は、リガンドの二次構造の認識のみならず、二次構造と調節因子制御との関係を含む。核酸を修飾するための従来の方法式とは異なり、ＧＰＶＩタンパクに対するリガンドの設計は、リガンドの変更が、潜在的な調節因子の設計に対して与える影響を考慮することを含んでいてもよい。リガンドを切断によって修飾する場合には、例えば、対応する調節因子は、その切断されたリガンドを制御するように設計されるべきである。
ＳＥＬＥＸプロセスを通じて同定されたリガンドの二次構造は、当業者に知られている様々な方法によって予測可能である。例えば、各配列をＭｆｏｌｄ等のソフトウェアプログラムを使用して分析することができる（mfold.bioinfo.rpi.edu；また、Ｚｕｋｅｒ、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３４０６−３４１５、及び、Ｍａｔｈｅｗｓら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８：９１１−９４０を参照されたい）。次に、保存された共通する二次構造エレメントに基づいて、予測されるＧＰＶＩリガンドの二次構造に達するようにその配列を整列させるために、選択された様々な配列の比較配列分析を使用することができる（実施例２参照）。上述されているような分析によって、向上した機能性及び安定性を有するリガンドを生成するように、ＳＥＬＥＸによって得られる配列の変異体を設計及び試験することが可能になる。
リガンド全体の長さだけでなく、軸構造及び環構造の長さを変更することによって、本発明のＧＰＶＩ核酸リガンドを修飾することができる。例えば、ＳＥＬＥＸプロセスで選択したリガンドの５’末端及び／又は３’末端の一部分を削除するように、リガンド切断を生じさせることができる。リガンドが耐えられる切断の範囲を決定するために、そのリガンドの５’又は３’末端部位に対して相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド）を加熱してそのリガンドにアニーリングし、その後、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを有するリガンドの結合と、オリゴヌクレオチドを有しないリガンドの結合とを比較する方法を使用することができる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドを有するリガンドの結合と、オリゴヌクレオチドを有しないリガンドの結合との間に顕著な差がみられなければ、このことは、リガンドのアニーリングされた部分が標的タンパクに対するそのリガンドの結合にとって重要ではないことを示唆する。完全に機能するリガンドを与える５’及び３’の境界を決定するために、リガンドの５’末端又は３’末端の様々な長さに対してアニーリングするオリゴヌクレオチドを使用して、この方法を実行することができる。
他の一実施形態において、設計は、リガンドの大きさを小さくすることを含む。他の一実施形態において、調節因子の大きさは、リガンドの大きさに関連させて変更される。さらに別の一実施形態において、グアニン鎖は、４個未満のグアニン、３個未満のグアニン、若しくは、２個未満のグアニンとなるように、又は、グアニンを全く含まないように減らされる。しかしながら、適切な活性を与え、かつ、調節因子によって容易に無効化されるリガンドを生成するという課題を、これらの変更の複合効果が満たさなければならない。
調節因子のターゲッティングのために、オリゴヌクレオチド調節因子との結合を促進するために、一本鎖の尻部（３’又は５’）を含むように、その改良されたリガンドを修飾することができる。適切な尻部は、１ｎｔ〜２０ｎｔ、好ましくは１ｎｔ〜１０ｎｔ、１ｎｔ〜５ｎｔ、又は、３ｎｔ〜５ｎｔを含んでいてもよい。以下にさらに詳細に説明されているように、修飾されたヌクレオチドが、そのような尾部に含まれていてもよいことは、容易に理解されるであろう。
一本鎖の尾部を付加することによってリガンドの活性構造が崩壊しないことを確認するために、結合分析及び生物学的分析において（例えば、以下に説明されているように）、尾部を有するリガンドを試験することができる。例えば、尾部配列と１個、３個、又は、５個の塩基対を形成することができる一連の複数のオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を設計し、それらのオリゴヌクレオチドを、尾部を有するリガンドに単独で結合する能力のみならず、標的分子からのリガンドの解離の速度を速める能力、又は、標的分子とリガンドの結合の速度を速める能力について試験することができる。その効果が二本鎖形成によるものであり、非特異的効果ではないことを確認するために、順序を入れ替えたコントロール配列を使用することができる。
共通構造の決定は、リガンド構造及び機能を向上又は低下させることができる１つ以上のヌクレオチドを同定するためのリガンドの改変を容易にする。例えば、特定の軸構造及び環構造に対するヌクレオチドの付加、削除及び置換を、より効率的に同定及び試験することができる（実施例３参照）。
共通の二次構造についての知識によって、リガンド構造及び機能に対して有害となり得る修飾を回避することができる。例えば、軸部又は環内部のそのような２’−フルオロ等のように、共通の二次構造の内部に特定の修飾が保存されていてもよい。これらの例において、リガンドの軸部又は環からの２’−フルオロの除去は、活性の喪失を生じさせることができる。
特定の実施形態において、リガンドは、表１〜表７から選択される核酸分子であり、それらの切断された配列及び実質的に相同な配列も含む。本明細書で用いられているように、相同部位の文脈において、「実質的に相同な」配列は、特定の分子内のワトソンクリック型塩基対によって同じ二次構造を形成する配列である。特定の実施形態において、複数の配列が特定のリガンドに対して、少なくとも８０％、８５％、又は、より高い配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性）を共に有する場合には、それらの複数の配列が「実質的に相同」である。５０個以下のヌクレオチド等のような特定の長さの核酸リガンドの文脈において、相同な配列は、特定の領域中の配列同一性にかかわらず、ワトソンクリック型結合が同じ二次構造を形成できるあらゆる部位にみられる。
リガンドは、自己不活性化部位を有するように設計されたものであってもよい。それによって、ペアにした調節因子によるさらに効果的な制御が可能になる。調節因子がリガンドに結合するときに、自己不活性化位置が一本鎖になって不安定になり、それによって、血液エンドヌクレアーゼ又は肝臓エンドヌクレアーゼ等のような血液中に天然に存在する酵素によるリガンドの切断が容易になる。これは、循環からの活性リガンドの有効かつ実質的に急速な除去のための手段となる。
化学的修飾
核酸の治療的使用において生じる問題の１つは、求められる効果が現れる前に、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ等のような細胞内酵素及び細胞外酵素によって、リン酸ジエステル形態のオリゴヌクレオチドが体液中で急速に分解されてしまうということである。核酸リガンドの特定の化学的修飾は、インビボにおける核酸リガンドの安定性を高めることができ、又は、核酸リガンドの送達を向上若しくは媒介することができる。さらに、特定の化学的修飾は、核酸リガンド内で所望の構造エレメントの形成を安定化若しくは促進することによって、又は、標的分子にさらなる分子相互作用を与えることによって、標的に対する核酸リガンドの親和性を高めることができる。
リガンドの修飾は、以下に限定されないが、さらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用、及び、機能性を、核酸リガンドの塩基又はリガンド全体に組み込む化学基を与えるものを含んでいてもよい。そのような修飾は、以下に限定されないが、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシル又は５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエート修飾又はアルキルホスフェート修飾、メチル化、及び、イソ塩基であるイソシチジンとイソグアニジン等のような異常な塩基対合の組み合わせを含む。修飾は、キャッピング等のような３’修飾及び５’修飾を含んでいてもよい。
ＳＥＬＥＸ法は、インビボにおける向上した安定性又は向上した送達特性等のように、向上した特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性の核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボース及び／又はホスフェート及び／又は塩基の位置における化学的な置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドは、米国特許第５６６０９８５号に記載されている。その米国特許には、ピリミジンの５位及び２’位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５５８０７３７号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む特殊な核酸リガンドが記載されている。米国特許第５７５６７０３号には、２’位が修飾された様々なピリミジンを含むオリゴヌクレオチドが記載されている。
ＳＥＬＥＸ法は、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチド、並びに、米国特許第５６３７４５９号及び第５６８３８６７号に記載されているような非オリゴヌクレオチド機能単位に組み合わせることを包含する。米国特許第５６３７４５９号には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／又は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む非常に特殊な核酸リガンドが記載されている。ＳＥＬＥＸ法は、選択された核酸リガンドを、米国特許第６０１１０２０に記載されている診断用又は治療用の複合体中の脂肪親和性又は非免疫原性の高分子化合物に組み合わせることをさらに包含する。
ＳＥＬＥＸ法によって核酸リガンドが得られる場合には、修飾が、ＳＥＬＥＸ前又は後の修飾であってもよい。ＳＥＬＥＸ前修飾によって、標的に対する特異性及び向上したインビボ安定性の両方を有するリガンドを作成することができる。核酸リガンドの２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）に対するＳＥＬＥＸ後修飾によって、核酸リガンドの結合能力を損なうことなく、インビボ安定性を向上させることができる。一実施形態において、リガンドの修飾は、分子の３’末端の３’−３’反転ホスホジエステル結合、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’デオキシ、及び／又は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）の修飾を含む。この修飾は、ヌクレオチドのすべて又はいくつかにおける修飾である。
Ｃ残基及びＵ残基を２’−フルオロで置換し、Ａ残基及びＧ残基が２’−ＯＨで置換した転写物のライブラリを使用して、本明細書に記載されているリガンドを、ＳＥＬＥＸによって最初に生成した。そのような修飾は、選抜に適したリガンド分子を生じさせるものの、２’位のヒドロキシル含有が高いものは、これらの位置がインビボにおいてヌクレアーゼによる分解を非常に受けやすく、非経口適用後に達成される最高濃度が限定されるのみならず、循環半減期が限定されるという事実に起因して薬剤候補に適さない。従って、ＳＥＬＥＸ法等によって機能的配列を同定したら、リガンド構造、機能、及び、安定性に対するこれらの置換の影響を評価することによって、個々の残基を、置換に対する耐性について試験することができる。
特定の実施形態において、リガンドを構成する核酸は、修飾された糖及び／又は修飾された塩基を含む。特定の実施形態において、修飾は、２’安定化修飾等のような安定化修飾を含む。一実施形態において、２’安定化修飾は、糖環における２’−フルオロ修飾、２’デオキシ修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾を含んでいてもよい。
一実施形態において、設計には、リガンド若しくは調節因子又は両方の２’−ヒドロキシル含有量を減少させることが含まれる。他の一実施形態において、設計には、リガンド若しくは調節因子又は両方の２’−フルオロ含有量を減少させることが含まれる。他の一実施形態において、設計には、リガンド若しくは調節因子又は両方の２’−Ｏ−メチル含有量を増加させることが含まれる。
オリゴヌクレオチドは、以下に限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル、ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル、チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２α−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）及び２，６−ジアミノプリンを含む基から選択される少なくとも１つの修飾塩基部位を含んでいてもよい。
以下に記載されているリガンド及び調節因子のオリゴヌクレオチドは、修飾された糖基を含んでいてもよく、例えば、１つ以上の水酸基が、ハロゲン、脂肪族基で置換されているか、又は、エーテル若しくはアミンとして官能化されている。一実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル、又は、ハロ基の任意のものによって置換されている。他の一実施形態において、本発明の核酸リガンド又は調節因子は、以下に限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、２’−フルオロリボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロピルリボース、２’−Ｏ−メチルチオエチルリボース、２’−Ｏ−ジエチルアミノオキシエチルリボース、２’−Ｏ−（３−アミノプロピル）リボース、２’−Ｏ−（ジメチルアミノプロピル）リボース、２’−Ｏ−（メチルアセトアミド）リボース、及び、２’−Ｏ−（ジメチルアミノエチルオキシエチル）リボースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部位を含んでいてもよい。
リガンド又は調節因子は、以下に限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル、及び、ホルムアセタール、又は、これらの類似物を含む群から選択される少なくとも１つの修飾されたホスフェート骨格を含んでいてもよい。
治療的用途のために、１つ以上の核酸環構造をより安定した環構造で置換することによって、軸構造と環構造とを含むリガンド分子をさらに安定化することができる。例えば、本明細書に記載されているＧＰＶＩリガンドについて、ヘキサエチレングリコールスペーサによる環２の置換は、同等の親和性を有するＧＰＶＩリガンド、及び、ヌクレオチジル環を有する抗ＧＰＶＩリガンドを生じさせることがわかった。図１３Ａは、合成において使用されるヘキサエチレングリコールリンカーのための出発物であるホスホラミダイトを示している。図１３Ｂは、核酸リガンドの２個のヌクレオチドの間に組み込まれた時のヘキサエチレングリコールスペーサを示している。
医薬品組成物中において、リガンドは、溶解度又は生物学的利用性を向上させる塩形態等のような形態で提供されていてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドのあらゆるものは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムズから購入できるものなど）を使用することによって、当業界で知られている標準分析法によって合成できる。
本明細書において、リガンド及び修飾剤は、当業者によって容易に理解される略語を使用して記載されており、以下のように記載されている。「ｒＡ」は、２’ＯＨ Ａ又はアデノシンである。「Ａ」は、２’−デオキシＡ又は２’−デオキシアデノシンである。「ｍＡ」は、２’−Ｏ−メチルＡ又は２’−メトキシ−２’−デオキシアデノシンである。「ｒＧ」は２’−ＯＨ Ｇ又はグアノシンである。「Ｇ」は、２’−デオキシＧ又は２’−デオキシグアノシンである。「ｍG」は、２’−Ｏ−メチルＧ又は２’−メトキシ−２’デオキシグアノシンである。「ｆＣ」は、２’−フルオロＣ又は２’−フルオロ−２’デオキシシチジンである。「ｍＣ」は、２’−Ｏ−メチルＣ又はメトキシ−２’−デオキシシチジンである。「ｆＵ」は、２’−フルオロＵ又は２’−フルオロウリジンである。「ｍＵ」は、２’−Ｏ−メチルＵ又は２’−メトキシウリジンである。「ｉＴ」は、反転した２’ＨＴであり、（Ｃ６Ｌ）は、ヘキシルアミノリンカーである。（６ＧＬＹ）は、ヘキサエチレングリコールスペーサである。（ＰＥＧ４０ＫＧＬ２−ＮＯＦ）は、約４０ｋＤａ分岐したＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（商標）製品番号ＧＬ２−４００ＧＳ２）である。（６ＦＡＭ）は、６−カルボキシフルオレスセインである。（ｓ）は、２個のヌクレオチド間のホスホロチオエート結合である。
担体への結合
ＧＰＶＩリガンドは、生物学的利用性又は安定性を向上させる修飾を含んでいてもよい。そのような修飾は、担体分子に対する接合を含んでいてもよい。担体分子は、限定されないが、親水性又は疎水性の部位を含んでいてもよい。一例は、核酸配列に結合したポリエチレングリコール分子である。例えば、後述されているようなポリマーへの接合は、リガンドの細胞質部分への分散を限定することができ、循環半減期を長くすることができる。
糖修飾は、上述されているように、安定性を保証することができるが、核酸リガンドが治療的に活性であるための適切な薬物動態を保証しない。健康な個体において、リガンドは、おそらく、腎***を通じて静脈注射の数分以内に血漿から除去される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の大きい高分子にリガンドを接合させることによって、注射から数時間乃至数日間にわたって血液中で完全なリガンドを維持することが達成された。リガンドの血漿クリアランスは、リガンドをリポソーム中に埋め込むことによって低下した。
したがって、一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンド又はＧＰＶＩリガンドの調節因子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非免疫原性高分子化合物、又は、ポリアミノアミン（ＰＡＭＡＭ）、デキストラン等のような多糖類、若しくは、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）を含む（これらに限定されない）その他の水溶性の薬学的に許容可能なポリマーに共有結合によって結合していてもよいし、又は、他の態様で付着していてもよい。ＧＰＶＩ核酸リガンド又はＧＰＶＩリガンドの調節因子は、共有結合を介して高分子化合物に結合していてもよい。共有結合による連結を使用する場合には、リガンド又は調節因子の様々な位置に共有結合によって高分子化合物を結合させることができる。いくつかの実施形態においては、必要がある接種者に投与するために、リポソーム中にリガンド又は調節因子を閉じ込めることができる。
一実施形態においては、リガンド又は調節因子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に付着している。潜在的に（１）循環中の化合物の半減期を延ばし、（２）化合物の分布パターンを変化させ、及び／又は、（３）化合物を覆い隠すことによって、潜在的な免疫原性を低減し、また、酵素による分解から化合物を保護するための生物学的に「不活性」な担体として機能ように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を活性化合物に接合させることができる。
リガンド又は調節因子は、共有結合を介してＰＥＧ分子に結合していてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドリガンド又は調節因子は、マレイミド又はビニルスルホンの官能基を介して５’−チオールに接合されていてもよい。
一般的に、活性化されるＰＥＧ及び他の活性化される水溶性高分子は、治療用薬剤の所望の位置に結合させるのに適した適切な活性基を用いて活性化される。これらのポリマーを活性物質に接合させるための代表的な高分子試薬及び方法は、当業界で知られており、例えば、Zalipsky, S.ら、「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides」、Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992);及び、Zalipsky, Advanced Drug Reviews, 1995, 16:157-182においてさらに記載されている。そのような試薬は市販されて購入することができる。
例えば、アミド結合による接合体を調製するための１つのアプローチにおいては、ＮＨＳエステル等のような活性化されたエステルを有する水溶性ポリマー（例えば、ｍＰＥＧ−スクシンイミジル−α−メチルブタノアート）を、活性物質のアミン基に反応させて、それによって活性物質と水溶性高分子との間のアミド結合を生じさせる。反応性アミノ基と反応できるさらなる官能基は、特に、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、スクシンイミジルカーボネート、アルデヒド、アセタール、Ｎ−ケト−ピペリドン、マレイミド、カルボニルイミダゾール、アザラクトン、環式イミドチオン、イソシアネート、イソチオシアナート、トレシルクロリド、及び、ギ酸ハロゲンを含む。
一実施形態において、複数のＧＰＶＩリガンド又はＧＰＶＩリガンド調節因子は、１個のＰＥＧ分子に結合していてもよい。結合する複数のリガンド及び調節因子は、同一又は異なる配列及び修飾であってもよい。さらに別の一実施形態において、複数のＰＥＧ分子は、互いに付着していてもよい。この実施形態において、同一のＧＰＶＩタンパク標的配列又は異なるＧＰＶＩタンパク標的配列に対する１つ以上のＧＰＶＩリガンド又はＧＰＶＩリガンド調節因子は、各ＰＥＧ分子に結合していてもよい。同一の標的に対して特異的な複数のリガンド又は複数の調節因子がＰＥＧに付着している実施形態においては、それらの同一の標的間の特異的な相互作用を生じさせるために、同一の標的を互いの近くに移動させる可能性がある。異なる標的に対して特異的な複数のリガンド又は複数の調節因子がＰＥＧに付着している場合には、それらの標的間の特異的な相互作用を生じさせるために、別々の標的を互いの近くに移動させる可能性がある。
ＰＥＧ分子等のような親水性部位を接合するための様々なリンカー及び様々な方法が、当業者に周知であるが、以下にいくつかの実施形態を提供する。一実施形態においては、合成されたオリゴヌクレオチドの５’末端にヘキシルアミノリンカーを付加するために、図１４に示されているＣ６ヘキシルアミノリンカー、６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト等のようなアミノリンカーを使用することができる。合成されたオリゴヌクレオチドにリンカーを付加するために使用することができる他のリンカーホスホラミダイトを以下に記載する。
下記構造：
Figure 2012528597
を有するＴＦＡアミノＣ４ ＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓから入手可能、カタログ番号ＣＬＰ−１４５３）

下記構造：
Figure 2012528597
を有する５’−アミノモディファイアＣ３ ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能、カタログ番号１０−１９２３−９０）：

下記構造：
Figure 2012528597
を有する ５’−アミノモディファイア５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能、カタログ番号１０−１９０５−９０）

下記構造：
Figure 2012528597
を有する５’−アミノモディファイアＣ１２（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能、カタログ番号１０−１９１２−９０）

下記構造：
Figure 2012528597
を有する５’チオールモディファイアＣ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能、カタログ番号１０−１９２６−９０）

例えば、５’−チオールモディファイアリンカーは、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、及び、ＰＥＧ−オルソピリジル−ジスルフィドと共に使用される。
ＰＥＧの分子量は５ＫＤ〜２００ＫＤであってもよく、典型的なＰＥＧは、医薬製剤として１０ＫＤ〜６０ＫＤの範囲内で使用される。最大約３０ＫＤの直鎖ＰＥＧを生産することができる。３０ＫＤを超えるＰＥＧについては、求められる大きさのＰＥＧを生産するために、複数のＰＥＧを付着させることができる（マルチアーム又は「分岐した」ＰＥＧ）。分岐した「ｍＰＥＧ２」連結体（アミノ酸を介して連結された２個のｍＰＥＧ）を含む化合物の一般的な合成は、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９５、６：６２−６９に記載されている。「分岐した」ＰＥＧ、すなわち、共通の反応性基に連結された１つより多いＰＥＧ又はｍＰＥＧを含む化合物を目的として、複数のＰＥＧ又は複数のｍＰＥＧＳを、リジン等のようなアミノ酸を介して連結させることもできるし、又は、例えばグリセリン等を介して連結させることもできる。それぞれのｍＰＥＧが約１０ＫＤ、約２０ＫＤ、又は、約３０ＫＤである分岐したＰＥＧについては、全質量が約２０ＫＤ、約４０ＫＤ、又は、約６０ＫＤであり、その全質量によって命名される（すなわち、４０ｋＤのｍＰＥＧ２は、２０ｋＤのｍＰＥＧが２個連結されたものである）。ペグ化された化合物を生産するための試薬として使用することができる総分子量が４０ＫＤのＰＥＧには、例えば、下記構造：
Figure 2012528597
を有する［Ｎ２−（モノメトキシ・２０Ｋポリエチレングリコール・カルバモイル）−Ｎ６−（モノメトキシ・２０Ｋポリエチレングリコール・カルバモイル）］リジン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが含まれる。
本発明の安定化された化合物を調製するために使用することができるさらなるＰＥＧ試薬には、下記一般式：
Figure 2012528597
Figure 2012528597
を有し、４０ＫＤ又は６０ＫＤの総分子量を有する（ここで、それぞれのｍＰＥＧは約２０ＫＤ又は約３０ＫＤである）他の分岐したＰＥＧ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）が含まれる。上述されているように、アミノ酸等のようなあらゆる適切な試薬を介して、複数の分岐したＰＥＧを連結させることができる。特定の実施形態においては、リシン残基又はグリセリン残基を介して分岐した複数のＰＥＧを連結させる。分岐したＰＥＧには、一般式：
Figure 2012528597
（ｍＰＥＧは約２０ＫＤ又は約３０ＫＤである）を有する分岐していないｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）を含まれ得る。特定の実施形態において、反応性エステルは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳである。
この試薬には、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（商標）シリーズ（ＮＯＦ株式会社、日本）等のようなグリセロールを介して連結された分岐ＰＥＧも含まれ得る。これらの試薬の特別な非限定的な例は、
Figure 2012528597
である。これらの試薬には、一般式：
Figure 2012528597
を有し、ｍＰＥＧが１０ＫＤ〜３０ＫＤの分岐していないスクシンイミジルα−メチルブタノアート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）が含まれ得る。ある下位実施形態において、反応性エステルは、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ２−ＮＨＳである。この構造の化合物は、カタログ番号２Ｍ４Ｋ０Ｒ０１として、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから販売されている。
ＰＥＧ試薬には、以下の構造：
Figure 2012528597
等を有するニトロフェニルカーボネートを介して連結された複数のＰＥＧが含まれ得る。この構造の化合物は、例えば、Ｓｕｎｂｉｏ社から購入できる。ニトロフェニルカーボネートを含む化合物は、第１級アミンを含むリンカーに接合させることができる。この反応において、Ｏ−ニトロフェニルは、構造［ｍＰＥＧ］ｎ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−リンカー−リガンドを残す脱離基として機能する。
上述されているような、チオール反応性基を有するＰＥＧであって、チオール修飾されたリンカーと共に使用することができるＰＥＧは、下記一般構造：
Figure 2012528597
を有する（ｍＰＥＧが、約１０ＫＤ、約２０ＫＤ又は約３０ＫＤである）化合物を含む。さらに、この構造は、例えば、
Figure 2012528597
（それぞれのｍＰＥＧは、約１０ＫＤ、約２０ＫＤ又は約３０ＫＤであり、かつ、全質量が約２０ＫＤ、約４０ＫＤ又は約６０ＫＤである）のように分岐していてもよい。上述されているような、チオール反応性基を有する分岐したＰＥＧであって、チオール修飾されたリンカーと共に使用することができるＰＥＧには、約４０ＫＤ又は６０ＫＤの総分子量を有する分岐したＰＥＧであって、それぞれのｍＰＥＧが２０ＫＤ又は３０ＫＤの分子量を有するＰＥＧが含まれる。ＰＥＧ試薬は、以下の構造：
Figure 2012528597
を有するものであってもよい。ＰＥＧマレイミドは、目標化合物のチオール化物をペグ化する。このとき、マレイミド環の二重結合が裂けてチオールと結合する。反応速度はｐＨ依存性であり、一実施形態において、反応は、ｐＨ６〜１０の間で、ｐＨ７〜９の間で、又は、ｐＨ約８で実行される。
一実施形態においては、複数のＧＰＶＩリガンド調節因子が、１個のＰＥＧ分子に結合していてもよい。この調節因子は、同一の又は異なるＧＰＶＩ核酸リガンドに対するものであり得る。同一のリガンドに対して複数の調節因子が存在する実施形態においては、リガンドとの多重結合相互作用によって結合力が高まる。さらに別の一実施形態においては、複数のＰＥＧ分子が互いに付着していてもよい。この実施形態においては、同一の核酸リガンド又は異なる複数のリガンドに対する１個以上の調節因子が、各ＰＥＧ分子に結合していてもよい。これは、標的に対するそれぞれの調節因子の結合力を高める結果にもなる。
一実施形態において、コレステロール、ジアルキルグリセロール、又は、ジアシルグリセロール等のような脂肪親和性化合物に、核酸リガンド又はその調節因子を共有結合で連結することができる。リガンド又は調節因子との非共有結合性の相互作用を経由して、脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物を共有結合的に結合又は連結することができる。脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物に対するリガンド又はオリゴヌクレオチド調節因子の連結は、直接的に、又は、リンカー若しくはスペーサを用いて行うことができる。
直接的な共有結合による連結を使用する実施形態においては、塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸エステルの水酸基、又は、５’末端若しくは３’末端の水酸基若しくは他の基等のように、リガンド又は調節因子の様々な位置に、脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物を共有結合で結合させることができる。
リガンド又は調節因子がリンカー又はスペーサを介して脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物に付着している実施形態においては、例えば、６炭素アミノリンカーを使用して、脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物を、リガンド又は調節因子に付着させることができる。
他の一実施形態において、１つ以上のリン酸基がリンカーと核酸配列との間に含まれていてもよい。
脂肪親和性化合物又は非免疫原性高分子化合物に対してリガンド又は調節因子を付着させるための適切なさらなるリンカー及びスペーサは、米国特許第７５３１５２４号に記載されている。この特許はここで言及することによって組み込まれている。
例えば、分子の安定性及び意図した標的に対する親和性等のような特性を向上させるために、本発明のオリゴヌクレオチドの塩基部位、糖部位、又は、ホスフェート骨格を修飾することができる。
Ｇ．血小板を介してもたらされる病気を治療する方法
血小板は、２つの生理学的に重要なコラーゲン受容体であるＧＰＶＩ及びインテグリンα２β１を含んでいる。これらのうち、コラーゲンに対する血小板の活性化は、ＧＰＶＩを介して媒介される。ＧＰＶＩとのコラーゲンの相互作用による血小板活性化によって、血小板から高密度のα顆粒内容物が放出される。顆粒成分は、多数の血小板アゴニストのみならず、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ポリホスフェート、ＣＤ６３、ＬＡＭＰ２、セロトニン、血小板第４因子、β−トロンボグロブリン、ＭＩＰ−１α、ランテス、ＭＣＰ−３、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＩＬ−８、ＢＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、インスリン様増殖因子−１、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ、Ｐ−セレクチン、フォン−ウィルブランド因子、トロンボスポンジン、フィブリノゲン、インテグリンαＩＩβ３及びαｖβ３、フィブロネクチン、アルブミン、α１−トリプシン、Ｇａｓ６、ヒスチジンリッチグリコプロテイン、高分子量キニノーゲン、及び、アミロイドβ−タンパク前駆体を含む、炎症性サイトカイン、成長因子、接着分子、及び、他のタンパクを含む。したがって、コラーゲンとのＧＰＶＩの相互作用による血小板活性化は、近傍にある広範な細胞種を刺激し得る炎症性の環境を局所的に生じさせる。
コラーゲンとのＧＰＶＩの相互作用は、病的な又は損傷された血管壁に対する血小板の付着に必要とされる。最終的に、コラーゲンによるＧＰＶＩの活性化は血小板凝集を生じさせる。コラーゲンによるＧＰＶＩ活性化は、血管損傷によって血管のコラーゲンが露出し、それによって血小板血栓が形成される止血において重要な役割を果たす。血栓形成における血小板の役割は、よく理解されており、通常は、内皮細胞下のマトリクス中に存在し、かつ、アテローム斑に多く存在するコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型とのＧＰＶＩの相互作用によって媒介されるが、活性化に対する血小板の炎症性反応が、アテローム性動脈硬化、糖尿病性血管疾患、慢性関節リウマチ、及び、強皮症を含む血栓症性疾病に加えた多数の病的状態の根底にあることが、より最近のデータによって示唆されている。例えば、コラーゲンとのＧＰＶＩの相互作用は、ＧＰＶＩの発現が異常に多いときや、血小板が病態生理学的濃度のコラーゲンに暴露されるときや、血小板が異常分布したコラーゲンに暴露されるときに、病的状態を生じさせることがある。従って、本明細書において、治療的有効量のＧＰＶＩリガンドを使用して、血小板を介してもたらされる疾病又は病気を治療するための方法を提供する。これらのＧＰＶＩリガンドは、血小板に結合して、血小板活性化を阻害することによって機能することができる。
コラーゲンによる血小板の活性化には、そのコラーゲンがＧＰＶＩと相互作用できることが必要であるので、抗ＧＰＶＩ療法によって治療効果を与えることができる疾病を理解するためには、体内にみられる様々なコラーゲン種に関するＧＰＶＩの特異性を理解することだけは必要である。異なる２９種類のコラーゲンが存在する。これらのうち、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩＩ型、ＸＩＩ型、ＸＩＩＩ型及びＸＩＶ型を含む９個は、脈管構造中で発現されることが判明している。さらに、これらのうち、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＸＩ型、ＸＸＩＶ型及びＸＸＶＩＩ型を含む７個は、繊維状であり、かつ、安定な三重螺旋構造及び高次繊維構造に集合することができる（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔら、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０２：４４９−４６１、及び、Ｈｅｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００９、２８４：１９７８１−１９７８５）。非線維状コラーゲンであるＶＩ型、ＶＩＩ型及びＶＩＩＩ型は、血小板凝集を伴わない弱い付着のみを生じさせるが、繊維形成コラーゲンであるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型は、血小板の活性化、凝集及び付着をサポートすることが示されている。したがって、コラーゲンＩ型〜ＩＶ型は、ＧＰＶＩと相互作用することができ、血小板を特異的に活性化することができる。さらに、ＧＰＶＩは、コラーゲンＩ型〜ＩＶ型に対して特異的に結合することが示されている（Ｊｕｎｇら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２００８、１９：３２−４２）。したがって、コラーゲンＩ型〜ＩＶ型の多量の発現が生じる疾病、又は、これらのコラーゲン種の血小板に対する異常な局在又は存在が生じる疾病を、ＧＰＶＩリガンドで治療することができる。
コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによるＧＰＶＩ結合のための構造的要件は、よく理解されている(実施例６；Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００７、２８２：１２９６−１３０４；Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔら、Ｂｌｏｏｄ、２００４、１０３：９０３−９１１；Ｈｏｒｉｉら、Ｂｌｏｏｄ、２００８：９３６−９４２を参照されたい）。コラーゲン繊維中のＧＰＶＩの第１認識部位の１つは、トリペプチド配列ＧＰＯである。さらに、ＧＰＶＩ中のコラーゲン結合溝は、約５．５ｎｍの間隔で分離している。したがって、ＧＰＯ反復配列を含み、かつ、ＧＰＶＩ二量体に結合することができるように約５．５ｎｍの単位距離のＧＰＯ反復配列を展開することができる繊維構造を形成する他のコラーゲン種は、ＧＰＶＩを介して血小板を活性化させ、それによってＧＰＶＩリガンドを用いて治療可能な疾病を生じさせることが予想される。
通常、ＧＰＶＩは、血小板１個当たり通常レセプタの数が約１２００個となるように、血小板表面において低から中の濃度で発現される。しかしながら、ＧＰＶＩ発現量の増加は、血小板がコラーゲンに対して過剰に反応するようにし、したがって、個体を病気にし易くするか、又は、血小板とコラーゲンと相互作用によって媒介される病的状態を直接生じさせる可能性がある。ＧＰＶＩの過剰発現は、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）及び急性冠動脈症候群を含む血栓性血管疾患の発症に結びつけて考えられている（Ｂｉｇａｌｋｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ、２０１０：１２５：ｅ１８４−１８９；Ｂｉｇａｌｋｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ、２００９年１月１１日、ｅｐｕｂ；Ｂｉｇａｌｋｅら、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ、２０１０、９９：２２７−２３３）。したがって、ＧＰＶＩリガンドを用いた、ＴＩＡ及び卒中等のような脳血管事象の治療又は急性冠動脈症候群の治療は、治療効果を与えることができる。
止血反応及び炎症反応における血小板の役割の根底には共通の分子機構が存在する。例えば、糖尿病及びアテローム性血管疾患等における損傷のような血管内皮損傷が存在する状況では、高い程度のＧＰＶＩ血小板活性化が存在する。これは、結果的に、サイトカインの放出と、白血球細胞の活性化、局在化及び成熟とを生じさせる。アテローム性動脈硬化による血管疾患が存在する状況におけるこのプロセスの発生及び永続は、内皮表面に対する血小板の付着を生じさせ、それによって、血小板が不安定になり、さらなる血管損傷が生じる。これらの現象の併発は、血管内で虚血を生じさせる可能性がある。したがって、例えば、血小板の表面におけるＧＰＶＩ発現のアップレギュレーション、又は、コラーゲンに対する暴露の増加による血小板の活性化の増加に関係することがわかっている様々な疾病を治療するために、血小板の望ましくない活性化を防止又は低減するＧＰＶＩリガンド等のような治療薬を使用することができる。
糖尿病は、コラーゲンによって媒介される血小板活性化の上昇に関連しており、また、ＧＰＶＩ発現は、非糖尿病患者と比較して糖尿病患者において有意に高い（Ｃａｂｅｚａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００４、５３：２１１７−２１２１）。糖尿病患者における高いＧＰＶＩ発現は、糖尿病に伴う血栓性合併症の著しい原因となる。したがって、抗ＧＰＶＩ療法は、糖尿病性に伴う血栓性疾病の治療において治療効果を与えることができる。ＧＰＶＩの活性化は、ＣＤ４０Ｌの表面発現を著しく増大させる。ＣＤ４０Ｌは、血栓症及びアテローム性動脈硬化に関与する強力な血小板由来のサイトカインである。さらに、ＧＰＶＩによって活性化された血小板におけるＣＤ４０Ｌ過剰発現は、ＣＤ６２Ｐ、αｖβ３、及び、細胞間接着分子１の内皮表面発現を増加させ、また、単球遊走因子１の分泌を増加させる。これらの結果は、コラーゲン受容体ＧＰＶＩの機能が、２型糖尿病患者において変化しており、また、糖尿病性のアテローム血栓性合併症及び局所的血管疾患において重要な役割を果たし得ることを示唆している。
従って、糖尿病に一般的に伴う様々な病気であって、血小板を介してもたらされる病気を治療するために、ＧＰＶＩリガンドを使用することができる。一実施形態においては、糖尿病に罹患した患者を治療する方法であって、ＧＰＶＩリガンドを投与するステップを含む方法を提供する。ハイリスクの糖尿病患者をＧＰＶＩリガンドで治療することによって、これらの患者における糖尿病に伴う疾患を低減又は予防することができる。以下に限定されるものではないが、これらの疾患には、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管障害、アテローム性動脈硬化、虚血性脳血管障害、及び、慢性腎不全が含まれる。ＧＰＶＩリガンドを用いて糖尿病患者を治療することによって、これらの患者における微小血栓形成を低減又は防止することができる。
さらに、慢性関節リウマチ（ＲＡ）又は他の炎症性の関節炎病気等のような、血小板を介してもたらされる炎症性障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。慢性関節リウマチや他の形態の炎症性関節炎に罹患した患者は、関節液中の血小板微粒子の濃度が増加していることが、最近の研究によって示されている（Ｂｏｉｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、３２７：５８０−５８３）。血小板微粒子は、炎症反応促進性であり、周辺細胞（例えば、滑膜線維芽細胞）からの炎症反応を誘発する。例えば、ＧＰＶＩに対するコラーゲンＩＶ型の結合は、結果的にＩＬ−１及びＩＬ−８の放出を生じさせる。
マウスにおけるメカニズム研究によって、血小板の炎症反応促進状態とＧＰＶＩ活性化とは関連づけられる。ノックアウトマウスモデルにおけるＧＰＶＩの不存在は、炎症誘発性細胞の動員を阻害し、したがって、関節滑膜及び細胞間マトリックスにおける白血球の動員及び成熟を阻害する。
関節の炎症は、関節の細胞外マトリクスにおいて血小板とコラーゲンとの相互作用を生じさせ、ＧＰＶＩによって媒介される血小板活性化を介して近隣細胞の炎症を拡大させ、ＧＰＶＩリガンドによって治療可能な慢性関節リウマチ／炎症性関節炎を発症させる。従って、ＧＰＶＩリガンドは、以下に限定されないが、痛風、乾癬性関節炎、反応性関節炎、ウイルス性若しくはウイルス感染後の関節炎、並びに、脊椎関節炎を含む慢性関節リウマチ又は他の炎症性関節炎等のような炎症性疾患の改善、回復又は予防における治療的使用を提供することができる。
強皮症又は全身性硬化症に罹患した患者を治療するためにＧＰＶＩリガンドを使用することもできる。強皮症は、コラーゲンの生成過剰を伴った、筋肉及び関節における腫れ（炎症）を生じさせる自己免疫反応として発症すると考えられている。微小血管の損傷は、全身性硬化症又は強皮症に付随する主な発病プロセスの１つである。血小板のＩ型及びＩＩＩ型コラーゲン受容体（ＧＰＶＩ）と、全身性硬化症患者における継続的な微小血管損傷の結果として露出した内皮下ストロマ中の各リガンドとの相互作用は、炎症性伝達物質の放出を伴って、血小板の活性化及び凝集を生じさせ、これらが血管損傷及び炎症の原因となる（Ｃｈｉａｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、２００６、１１７：２９９−３０６）。全身性硬化症において、血管病変は、単核細胞浸潤を伴った小動脈毛細血管における血管周囲炎を特徴とし、内皮細胞及び基底膜の減少を伴って、動脈内膜増殖と小動脈及び毛細血管の閉塞とを生じさせる。内皮細胞若しくは基底膜又は両方への損傷の再発パターンは、全身性硬化症の特徴である。さらに、これらの現象は、体内組織におけるコラーゲンの生成過剰及び蓄積によって促進され、体全体の組織の広範囲な硬化及び損傷を生じさせる。従って、ＧＰＶＩリガンドを使用することによって、コラーゲン濃度の上昇及び血小板を介してもたらされる微小血管損傷に関連した強皮症又は全身性硬化症等のような疾病からの治療的緩和を与えることができる。強皮症に罹患した患者を治療的有効量のＧＰＶＩリガンドを投与することによって治療する方法を提供する。
癌と診察された患者を治療するために本明細書に開示されているＧＰＶＩリガンドを使用することもできる。最近の研究によって、ＧＰＶＩが腫瘍転移を媒介することが示唆されている（例えば、Ｊａｉｎら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００９、７：１７１３−１７１７を参照されたい）。Ｊａｉｎらは、インビボの実験転移分析を使用して、ワイルドタイプコントロールマウスと比較して、ＧＰＶＩノックアウトマウスにおける腫瘍転移が著しく減少したことを示した。従って、一実施形態において、原発性の癌性腫瘍を有すると診断された患者における転移を阻害、低減又は防止する方法であって、前記患者に治療的有効量のＧＰＶＩリガンドを投与する方法を提供する。
抗血小板治療を必要とする病気の治療に使用するための調節可能な抗血小板薬剤として、本明細書に記載されている方法、医薬品組成物、及び、ＧＰＶＩ核酸リガンドの使用を提供する。特定の実施形態において、治療は外科的処置である。この方法は、必要性がある接種者にＧＰＶＩ核酸リガンドを投与するステップであって、前記接種者が、冠状動脈、大脳若しくは末梢血管系の閉塞性血栓症の疾病又は疾患に罹患した又は罹患する危険がある接種者であるステップを含んでいてもよい。
一実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、血小板活性化の開始を阻害する。他の実施形態においては、ＧＰＶＩリガンドは、血小板活性化を阻害し、結果的に、血小板の炎症促進性反応を阻害する。他の実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、血小板付着を阻害する。他の実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、血小板凝集を阻害する。さらに別の実施形態において、ＧＰＶＩリガンドは、トロンビン生成を阻害する。
一実施形態において、前記接種者は、冠状動脈、大脳及び末梢血管系の閉塞性血栓症に罹患しているか又は罹患する危険がある者である。特定の他の実施形態において、前記接種者は、外科的処置を受ける準備をしているか若しくは外科的処置を受けている者であるか、又は、閉塞性血栓症発症の危険がある外科的処置を受けた者である。他の実施形態において、前記接種者は、血液透析を可能にするために管移植を受けており、前記管と血小板との間の相互作用に起因した閉塞の危険がある者である。
特定の実施形態においては、血管事象の形成、特に、血栓症又は血栓塞栓的事象を治療又は予防する方法であって、必要性のある接種者に本発明のＧＰＶＩ核酸リガンドを投与するステップを含む方法を提供する。
一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは長期間にわたって与えられる。この例において、例えば、治療が、頭蓋内出血又は胃腸出血を含む出血を発生させるような緊急事態のみに、ＧＰＶＩリガンド調節因子を使用することができる。他の一実施形態においては、ＧＰＶＩ核酸リガンド治療を受けた患者に緊急外科手術が必要なときに、調節因子が投与される。他の一実施形態においては、ＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を制御し、それによって治療の期間及び強度を制御するために、調節因子が投与される。他の一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは、人工心肺処置時の血小板麻酔薬として提供される。他の一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは、経口による抗血小板薬剤からの又は経口による抗血小板薬剤への移行期間を提供するために投与される。調節因子は、治療効果のある濃度の経口の抗血小板薬剤が確立された時点で、ＧＰＶＩ核酸リガンドを無効化するために使用される。
Ｈ．医薬品組成物
本明細書に教示されているＧＰＶＩ核酸リガンド又はＧＰＶＩリガンド調節因子は、以下に限定されないが、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含み得る医薬品組成物中に配合されたものであってもよい。この組成物の詳細な性質は、少なくとも部分的に、あらゆる安定化修飾及び投与経路を含めたリガンド及び／又は調節因子の性質に応じて変わるだろう。調節因子を含む組成物は、リガンドの活性の変化を可能にし、したがって、投与したＧＰＶＩ核酸リガンドの抗血小板活性を制御するように、ＧＰＶＩ核酸リガンドを与えた接種者に対して投与するために設計されたものであってもよい。
医薬品組成物又は薬学的組成物の設計及び調製は、本開示を参照した当業者に既知であろう。通常、そのような組成物は、液溶体又は懸濁液のいずれかとして注射可能なものとして；注射前の液体に溶解又は懸濁させるのに適した固体形態；経口投与用の錠剤又は他の固体として；経口投与用液体としての限時解放カプセルとして；エリキシル剤、シロップ剤、坐薬、ゲル剤として、又は、目薬、クリーム剤、ローション剤、軟膏、吸入剤等を含む当業界で使用される他の形態に調製されたものであってもよい。作業領域中の特定領域を処理するために、外科医内科医又は保健従事者が、生理食塩水をベースとした洗浄剤等のような無菌調合物の使用することも特に有用であり得る。微小デバイス、微粒子又はスポンジによる送達のためにこの組成物を配合することもできる。
本発明のＧＰＶＩ核酸リガンド又はＧＰＶＩリガンド調節因子を含む薬学的に有用な組成物は、薬学的に許容可能な担体の混合剤として、少なくとも部分的に配合されていてもよい。そのような担体の例及び配合方法は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (Lippincott Williams & Wilkins, 2000)、及び、Anselら、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th Ed.(Media, Pa.: Williams & Wilkins, 1995)において見つけることができる。
適切な医薬品賦形剤には、安定剤、酸化防止剤、浸透圧調節剤、バッファ、及び、ｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、生理学的に生体適合性のバッファ（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡビスアミド等）若しくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の追加分、又は、選択的に、カルシウム塩若しくはナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）の追加分が含まれる。本発明の医薬品組成物は、液体形態で使用するためにパッケージされていてもよいし、又は、凍結乾燥されていてもよい。
有効な投与に適した薬学的に許容可能な組成物を作るために、そのような組成物は、有効な量の核酸リガンド又は調節因子を含む。そのような組成物は、１つ以上の化合物の混合剤を含んでいてもよい。この組成物は、通常、約０．１重量パーセント（ｗｔ％）〜約５０重量％、約１重量％〜約２５重量％、又は、約５重量％〜約２０重量％の活性物質（リガンド又は調節因子）を含む。
ここでは、皮下注射、筋肉内注射又は静脈内注射や、点滴剤を含む非経口的注入可能な投与のための医薬品組成物を提供する。非経口適用としては無菌懸濁及び無菌溶液が望ましい。静脈内投与が求められる場合には、適切な保存剤を通常含む等浸透圧製剤を使用する。この医薬品組成物は、殺菌されたものであってもよいし、及び／又は、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、及び／又は、バッファ等のような添加物を含んでいてもよい。液体、特に、注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散させことなどによって調製することができる。活性化合物は、例えば、水、緩衝水、食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、水溶性デキストロース、グリセロール、エタノール等のような薬学的に純粋な溶媒中に溶解又は混合されており、それによって注射液又は懸濁液を構成する。さらに、注射前の液体に溶解させるのに適した固体形態を配合することができる。
水性環境中に物質が溶解するを助けるために、湿潤剤として界面活性剤を加えることができる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及び、スルフォン酸ジオクチルナトリウム等のような陰イオン洗浄剤が含まれ得る。陽イオン性洗剤を使用することもでき、陽イオン性洗浄剤には、塩化ベンザルコニウム又はベンゼトニウムクロリドが含まれ得る。界面活性剤としての配合物中に含まれ得る非イオン系洗剤は、以下に限定されないが、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレイト、ポリオキシエチレン水素化キャスターオイル１０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、並びに、プルロニックＦ６８及び／又はプルロニックＦ１２７等のようなプルロニック洗剤のあらゆるものを含む（例えば、Ｓｔｒａｐｐｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ、２００５、６１：１２６−１３３参照）。界面活性剤は、タンパク又は誘導体の配合物中に単独で又は様々な比率の混合物として存在していてもよい。
錠剤又はカプセルの形態での経口投与のために、エタノール、グリセロール、水等のような経口的に無毒で薬学的に許容可能な不活性の担体に、活性薬剤成分を組み合わせることができる。さらに、求められる場合又は必要とされる場合には、適切なバインダ、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤を混合物中に含ませることもできる。限定されるものではないが、適切なバインダには、デンプン、ゼラチン、グルコース又はβラクトース等のような天然の糖、コーン甘味料、アカシア等のような天然ゴム及び合成ゴム、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、並びに、ワックス等が含まれる。これらの投薬形態において使用される潤滑剤には、限定されるものではないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び、塩化ナトリウム等が含まれる。限定されるものではないが、崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、寒天培地、ベントナイト、キサンタンガム等が含まれる。
経口投与において使用される液体形態のために、例えば、トラガカント、アラビアゴム及びメチルセルロース等のような合成ゴム又は天然ゴム等のような適切に味付けした懸濁化剤又は分散剤に、活性薬剤成分を組み合わせることができる。使用可能な他の分散剤にはグリセリン等が含まれる。
例えば、アルコール溶液、局所用洗浄剤、洗顔クリーム、皮膚ゲル剤、皮膚化粧水、及び、シャンプーをクリーム剤又はゲル剤として作成するために、例えば、アルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡオイル、ビタミンＥオイル、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチリルエーテルプロピオナート等のような当業界で周知の様々な担体材料と、活性薬剤成分を含む局所用製剤を混合することができる。
小さい単層の小胞、大きい単層の小胞、及び、多重層の小胞等のようなリポソーム送達系の形態で本発明の化合物を投与することもできる。コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等のような様々なリン脂質からリポソームを作成することができる。直接的に（例えば、単独で）又はリポソーム製剤として投与される活性物質は、例えば、米国特許第６１４７２０４号に記載されている。
ターゲットにできる薬剤担体として可溶性ポリマーと、本発明の化合物を結合させることができる。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミドフェノール、又は、パルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得る。さらに、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリオキサゾリン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及び、ヒドロゲルの架橋された若しくは両親媒性のブロック共重合体等のような、薬剤の制御された放出を達成するのに有効な生分解性高分子種に、本発明の化合物を（好ましくは共有結合によって）結合させることができる。生体利用性を増大及び延長させるために、核酸リガンドにコレステロール及び類似分子を連結することができる。
現在当業界において知られている又は後で開発される様々な技術のあらゆるものによって、本発明において使用するために本発明の調節因子と共に配合することができる脂肪親和性化合物及び非免疫原性高分子化合物を調製することができる。通常、これらの化合物は、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン等のリン脂質から調製され、例えば、中性脂肪（例えば、コレステロール）等のような他の材料を含んでいてもよく、さらに、正に帯電した化合物（例えば、コレステロールのステリルアミン誘導体やアミノマンノース誘導体やアミノマンニトール誘導体）又は負に帯電した化合物（例えば、ジアセチルホスフェート、フォスファチジルグリセロール）のような表面改質剤を含んでいてもよい。多重膜リポソームは、従来の技術によって（すなわち、適切な溶媒中に脂質を溶解させることによって適切な容器又は管の内壁に選択した脂質を堆積させ、次に、管内部に薄膜を残すように溶媒を蒸発させることによって、又は、噴霧乾燥によって）作成することができる。その後、回転又は攪拌しながら水相をその管に加えると、多重膜小胞が生じる。その後、多重膜小胞をホモジナイズ、超音波処理又は（フィルタを通した）押し出しすることによって、単層小胞を作成することができる。さらに、洗剤除去技術によって単層小胞を作成することができる。本発明の特定の実施形態において、この複合体は、リポソームと、治療薬又は診断薬とを含み、リポソームの表面にターゲティング核酸リガンド結びついている。予め作成されたリポソームは、核酸リガンドと結びつくよう修飾されたものであってもよい。例えば、陽イオン性リポソームは、静電相互作用によって核酸と結びつく。あるいは、コレステロール等のような脂肪親和性化合物に結びついた核酸を、予め作成されたリポソーム中に加えることもできる。それによってコレステロールがリポソーム膜に結びつくようになる。あるいは、リポソームを形成するときに、核酸をリポソームに結びつけることもできる。
他の一実施形態において、当業者に既知の方法によって、ＧＰＶＩリガンド又はＧＰＶＩリガンド調節因子を含む製剤で、ステント又は医療器具をコーティングすることができる。
治療用キットも構想されている。このキットは、試薬、活性物質、及び、上記方法を実行するために必要な材料を含む。このキットは、通常、適切な容器手段の中に、ＧＰＶＩリガンド及び／又はＧＰＶＩリガンド調節因子の薬学的に許容可能な製剤を含む。このキットは、１個の容器手段を有していてもよいし、及び／又は、各化合物又は各反応液若しくは各ステップのための別々の容器手段を有していてもよい。
Ｉ．投与方法
接種者に対する本発明のＧＰＶＩリガンド及び／又はＧＰＶＩリガンド調節因子の投与形態は、以下に限定されないが、非経口投与（注射又はゆっくり時間をかけた注入）、静脈内投与、皮内投与、関節内投与、滑膜内投与、脊髄腔内投与、動脈内投与、心臓内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼窩内投与、嚢内投与、脊髄内投与、胸骨内投与、局所的投与、経皮貼布、直腸坐薬、膣坐薬、尿道坐薬、腹膜投与、経皮投与、鼻内噴霧、外科移植、体内外科塗料、輸液ポンプ、又は、カテーテル等をを含む。一実施形態において、薬剤及び担体は、移植片、巨丸薬、微粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子又はナノスフェア等のような持続放出性製剤として投与される。一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは、皮下注入（浸透圧ポンプ等によって）を含む皮下注射又は皮下沈着によって届けられる。
一実施形態において、ＧＰＶＩ核酸リガンドは皮下投与によって届けられる。また、調節因子は、皮下投与又は静脈内投与によって届けられる。
本発明のリガンド及び調節因子を含む治療用組成物は、単位用量を注射すること等によって静脈内に投与することができる。この「単位用量」という用語は、本発明の治療組成物に関して使用する場合には、接種者用の単位ごとの投薬として適切な物理的に別個の複数の単位であって、各単位が、必要とされる希釈剤（すなわち、担体又は賦形剤）と連携して求められる治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性物質を含む複数の単位を意味する。
さらに、非経口適用のアプローチの１つにおいては、一定レベルの用量を維持することを保証する遅効放出系又は継続放出系の埋め込みが使用される。
例えば、罹患関節の間質に対する局所投与も提供する。シリンジからの注射又は針のような注射装置を含む他の製品からの注射によって、局所投与を実現することができる。求められる時間にわたってシリンジの内容物を供給する圧力を制御することによって、シリンジからの投与速度を制御することができる。他の一例において、注入によって局所的投与を実現することができる。ポンプ又は他の類似した装置を使用することによって注入を容易にすることができる。
さらに、血管組織に対する局所投与のための代表的で非限定なアプローチを提供する。このアプローチは、（１）例えば、インビボにおける送達のための核酸リガンドを含むゲルで血管組織をコーティング又は該ゲルを該血管組織に浸透させることによって、損傷又は疾病して除去され又は迂回された管組織断片に代えて、コーティングした又は浸透させた管を埋め込むステップと、（２）送達が求められる血管にカテーテルを介して送達するステップと、（３）患者に埋め込む管に組成物を注入するステップと、を含む。あるいは、マイクロインジェクション又はリポソームカプセル化によってこの化合物を細胞内に導入することもできる。
さらに、リガンドを含む医薬品組成物でステント等のような医療用具をコーティングすることによる接種者へのＧＰＶＩリガンドの投与も提供する。リガンドの適切な放出及び投与を可能にするためのコーティング方法は、当業者に既知である。
本明細書に記載されている組成物のための最適な投与方式は、当業者によって容易に確立され得るものであり、調節因子、患者、及び、求められる効果に応じて変化し得る。有効量は、患者の状態、体重、性別、年齢、及び、投与した核酸リガンドの量等のような様々な要因によって変化し得る。他の要因には投与形態が含まれる。
本明細書の組成物は、通常、体重に応じて調整された用量（例えば、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量）で投与される。この用量は、より一般的には、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、さらに一般的には約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、若しくは、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約５．０ｍｇ、又は、体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約２．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約３．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約４．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約６．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約７．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約８．０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約９．０ｍｇ、若しくは、約１０．０ｍｇであろう。通常、この用量は、約０．００２μｇ／ｍｌ〜約２０００μｇ／ｍｌ、より一般的には約２．０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、さらに一般的には約１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、若しくは、約２０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、又は、約２０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、若しくは、約２００μｇ／ｍｌの血漿中薬剤濃度を初期に与える。
既にリガンドを投与された接種者に調節因子を投与する場合には、リガンドの阻害の所望のレベルに基づいて、調節因子とリガンドとの比率を調節することができる。調節因子の用量は、リガンドの用量との関係に基づいて算出することができる。一実施形態においては、調節因子とリガンドとの重量比が１：１である。他の実施形態においては、調節因子とリガンドとの比率が１：１より大きく、例えば、２：１若しくは約２：１、３：１若しくは約３：１、４：１若しくは約４：１、５：１若しくは約５：１、６：１若しくは約６：１、７：１若しくは約７：１、８：１若しくは約８：１、９：１若しくは約９：１、１０：１若しくは約１０：１、又は、それ以上である。他の実施形態において、調節因子とリガンドとの用量比は、約１：１より小さく、例えば、０．９：１若しくは約０．９：１、０．８：１若しくは約０．８：１、０．７：１若しくは約０．７：１、０．６：１若しくは約０．６：１、０．５：１若しくは約０．５：１、０．４５：１若しくは約０．４５：１、０．４：１若しくは約０．４：１、０．３５：１若しくは約０．３５：１、０．３：１若しくは約０．３：１、０．２５：１若しくは約０．２５：１、０．２：１若しくは約０．２：１、０．１５：１若しくは約０．１５：１、０．１：１若しくは約０．１：１であり、又は、０．１：１より小さく、例えば、約０．００５：１である。いくつかの実施形態において、この比率は、０．５：１〜０．１：１の間、０．５：１〜０．２：１の間、又は、０．５：１〜０．３：１の間である。他の実施形態において、この比率は、１：１〜５：１の間、１：１〜１０：１の間、又は、１：１〜２０：１の間である。
本発明のＧＰＶＩ核酸リガンドは、１日１回の投与で又は１日おきの投与で静脈内に投与することができる。あるいは、１日の全用量をいくつかの量に分けて投与することもできる。リガンド及び／又は調節因子の投与は、１日１回（ｑ．ｄ．）、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）、１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）、又は、必要に応じてそれより多く行うことができる。その後に、調節因子の投与によって核酸リガンドの効果を変化させるために、あらゆる適切な手段によって調節因子を与える。本発明の核酸リガンドは、週２回、週１回、２週間に１回、又は、月１回、皮下投与することができる。ある実施形態においては、１日１回よりも少ない回数でリガンド又は調節因子を投与することができる。例えば、２日に１回、３日に１回、４日に１回、週１回、又は、月１回でリガンド投与を実行することができる。
一実施形態においては、他の薬剤との同時投与又は連続的投与が望ましい場合もある。複数の活性物質を用いた複合療法であって、その複数の活性物質が別個の投薬調合物に存在する場合には、それらの複数の活性物質を同時に投与してもよいし、又は、それらの活性物質を時間をずらしてに別々に投与することもできる。
この組成物は、投与製剤形態と矛盾しない態様で、かつ、治療に有効な量で投与される。投与量は、治療される接種者、接種者の身体が有効成分を生かす能力、及び、求められる治療効果の程度に応じて変化する。投与する必要がある有効成分の正確な量は、実施者の判断に応じて変わり、各患者ごとに異なる。しかしながら、全身的な使用に適した用量範囲は、本明細書に開示されており、また、投与経路に応じて変化する。投与の適切な方式も一定ではないが、初回投与の後に、続発的注射又はその他の投与による１時間又はそれ以上の間隔での繰り返し投与を続けることが典型的である。あるいは、インビボ治療用に規定された範囲内に血液中濃度を維持するのに充分な持続点滴を提供する。
実施例
実施例１：ＧＰＶＩに対する核酸リガンドの同定
図１に記載及び図示されているＧＰＶＩの細胞外ドメインに結合するリガンドを得るためにＳＥＬＥＸ法を使用した。
１ナノモルのテンプレートＤＮＡオリゴ及び１．５ナノモルの５’ＤＮＡプライマーオリゴをヒートアニーリング及び急速冷却することによって開始候補ＤＮＡライブラリを作成した。候補混合物を設計するためのＤＮＡテンプレートオリゴの配列は以下の通り：5’-TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG(N40)CCGCA TCGTCCTCCC TA-3’(配列番号：４)（N40は、等モル量のＡ、Ｔ、Ｇ及びＣを用いて合成された４０個の隣接したヌクレオチドを表す）、5’-GGGGGAATTC TAATACGACT CACTATAGGG AGGACGATGC GG-3’ (配列番号：５)（Ｔ７プロモータ配列は下線で表されている）、及び、5'-TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG-3'（配列番号：６）である。この反応は、エキソクレノー（Ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ）で満たされており、最終濃度が２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加えることによって停止させ、ＰＣＩ（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて抽出し、その後、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出した。この抽出物を脱塩及び濃縮し、組み込まれていないヌクレオチドをアミコン１０スピンカラムを用いて除去した。２’フルオロピリミジン開始ライブラリを生成するために、転写反応においてＤＮＡテンプレートを使用した。インビトロ転写条件は、４０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４％ＰＥＧ−８００、１２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ スペルミジン、０．００２％トリトン、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｒＧＴＰ、１ｍＭ ｒＡＴＰ、３ｍＭ ２’Ｆ−ＣＴＰ、３ｍＭ ２’Ｆ−ＵＴＰ、８μｇ／ｍＬ無機ピロホスファターゼ、０．５μＭ ＤＮＡライブラリ、及び、Ｙ６３９Ｆ変異Ｔ７ポリメラーゼであった。転写物を、３７℃で一晩インキュベートし、ＤＮＡ分解酵素で処理し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて２回抽出し、アミコン１０スピンカラムを用いて濃縮し、１２％変性ＰＡＧＥゲル上でゲル精製した。ＲＮＡをゲルから溶出させ、バッファを交換し、アミコン１０スピンカラムにおいてＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）洗浄剤で濃縮した。
約１０１４個の異なる２’フルオロピリミジン（ＲＮＡ配列）の複合ライブラリを用いてＧＰＶＩ選択を開始した。この複合ＲＮＡプールを、磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定されたビオチン−ＰＥＧ６−Ｈｉｓ６ペプチドに接触させて予備精製（ｐｒｅｃｌｅａｒ）した。予備精製されたＲＮＡを、Ｃ末端にＨｉｓ６タグを付したＧＰＶＩタンパク（配列番号：３）の精製された組換細胞外ドメインに結合させた。ヒスチジンタグを付したＧＰＶＩ細胞外ドメインタンパクの精製物を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ(ミネアポリス、ミネソタ州、カタログ番号３６２７−ＧＰ）から得て、残基Ｇｌｎ２１−Ｌｙｓ２６７を網羅した。
第１周目のＧＰＶＩリガンド選択を結合バッファ「Ｅ」の中で実行し、より後の周回の選択では結合バッファ「Ｆ」にして厳格性を高めた。結合バッファＥは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．０１％ＢＳＡからなる。結合バッファＦは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．０１％ＢＳＡからなる。タンパクＲＮＡ複合体を２５ｍｍのニトロセルロースディスク上で洗浄すると共に解離させた。ＰＣＩ（２５：２４：１）中でインキュベートし、結合したＲＮＡをニトロセルロースディスクから抽出した。トリスＥＤＴＡバッファを加え、水相を抽出し、その後、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出した。結合したＲＮＡをエタノール沈殿させた。沈殿させたＲＮＡの４分の１を、３’プライマーに対してヒートアニーリングし、ＡＭＶ ＲＴを用いて逆転写した。５’プライマー及び３’プライマーと、次の周回のＲＮＡ生成のためのＤＮＡテンプレートを生成するための標準的ＰＣＲ条件とを用いたＰＣＲにおいて全逆転写反応を用いた。選択の各周回における詳細な条件は図２に示されている。第６周目の後に、選択を、「Ｅ２」及び「ＥＦ」と命名される２つの経路に分けた。Ｅ２選択は、結合バッファＦにおいて実行した第１周回〜第８周回と、結合バッファＥにおいて実行した第９周回〜第１０周回を含む。ＥＦ選択は、結合バッファＦにおいて実行した第１周回〜第６周回と、結合バッファＥにおいて実行した第７周回−第１０周回とを含む。
ＳＥＬＥＸの各周回から得た放射性標識リガンドＲＮＡ及び可溶性ＧＰＶＩを利用した直接結合試験において、ＧＰＶＩに対するリガンドライブラリの濃縮を監視した。結合バッファＦによるＧＰＶＩの段階的希釈物に加えたトレースＰ３２末端標識ＲＮＡを用いて結合試験を実行した。結合試験用の放射性同位体で識別されたＲＮＡを調製するために、１００ピコモルのＲＮＡを、細菌性アルカリホスファターゼを用いて５０℃において１時間にわたって脱リンした。この反応物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、その後、エタノール沈殿した。３ピコモルの脱リン酸化したＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、供給したバッファ及び２０μＣｉのγ−Ｐ３２−ＡＴＰを用いて末端標識し、その後、バイオラッド・マイクロバイオ・スピン（Biorad MicroBio Spin）Ｐ−３０スピンカラムを用いて洗浄した。末端にラベルを付したＲＮＡを、２０００ｃｐｍ／μＬの最終濃度に希釈し、６５℃で５分間熱変性した。ＲＮＡ及びＧＰＶＩ希釈物を使用前に３７℃において平衡化した。ＲＮＡ（５μＬ）を３７℃の様々な濃度のＧＰＶＩ（１５μＬ）に加え、それを一緒に５分間〜１５分間インキュベートした。その後、複合化したＲＮＡ／ＧＰＶＩタンパク混合物を、プロトランＢＡ８５ニトロセルロース膜の上に載せ、ジェネスクリーン・プラス・ナイロン膜（Genescreen Plus Nylon membrane）で覆い、９６ウェルの真空マニホールドシステムの中で洗浄した。モレキュラダイナミクス（Molecular Dynamics）社のストーム（Storm）840 ホスフォイメージャ（Phosphorimager）装置を用いて、その膜を、ホスフォイメージャスクリーンに露出させ、スキャンし、定量した。全カウントによってニトロセルロース上のカウントを割り、バックグラウンドに合わせて調整することによって、結合割合を算出した。ＳＥＬＥＸの第１０周回Ｅ２及び第１０周回ＥＦから得た濃縮リガンドライブラリの結合についての結果を、開始時の未処理のＧＰＶＩリガンドライブラリと比較して、図３に示す。
実施例２：ＧＰＶＩ核酸リガンドの構造ファミリの配列決定及び同定
実施例１に記載されているＳＥＬＥＸ試験の第１０周から得た抗ＧＰＶＩ濃縮リガンドライブラリに相当する最終ＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で消化し、精製キットを用いて浄化し、線形化したｐＵＣ１９ベクターに直接クローンした。それぞれ１個のクローンについて細菌コロニーを作成し、それぞれ１個のコロニーから５ｍＬの一昼夜培養液に植菌した。キアゲン・プラスミド・ミニ・プレップ・キット（Qiagen Plasmid Mini Prep kit）を使用して、それぞれ１個のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。ベクタープライマーを用いて、各ＳＥＬＥＸ試験から得た４０個のプラスミドを配列決定した。ランダム領域に由来するＤＮＡ配列を図４に示す。これらの配列の分析によって６個のユニークな配列が同定された。それらの配列は、図４において「Ａ」乃至「Ｆ」として表示されている。完全長リガンドクローンの類似するユニークＤＮＡ配列を表１に示す。また、ランダム領域を表す配列を表２に提供する。
Figure 2012528597
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これらのユニークなリガンドの代表例を完全長のＲＮＡとして表３に示す。また、ＲＮＡ配列として、ＳＥＬＥＸ試験において使用した２’−フルオロピリミジンヌクレオチドの組み込み位置を表４に示す（ｆは２−フルオロピリミジン修飾を示し、ｒは修飾されていないリボヌクレオチドを示す。）。完全長は、ＳＥＬＥＸプロセスから得た配列であって、ＳＥＬＥＸプロセスにおいて使用したリガンドライブラリのランダム領域と、そのランダム領域に隣接した固定配列の部分との両方に由来する配列を含む配列を表す。
Figure 2012528597
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 配列番号は、「修飾された配列」と題された列に記載されているリガンドの修飾されていない型を表す。
ｒＧ＝２’リボＧ；ｒＡ＝２’リボＡ；ｆＣ＝２’−フルオロＣ；ｆＵ＝２’−フルオロＵ
これらの６個の配列をさらに検討することによって、配列ＧＣ（例えば、ＧＣ（Ａ／Ｇ）ＵＡＡＧＣ）が両側に隣接する（Ａ／Ｇ）ＵＡＡからなる各クローンによって共有されている保存一次配列が同定され、これらの６個のユニーク配列が関連するファミリのメンバであることが示唆された。
ｍｆｏｌｄサーバー(mfold.bioinfo.rpi.edu)を用いて、潜在的二次構造を求めるように配列の選抜を実行した。これらの方法は、そのサーバーのサイトに加えて、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ （２００３）「Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３）、３４０６−１５、及び、Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓら、（１９９９）「Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８、９１１−９４０に記載されている。次に、保存されている共通二次構造エレメントに基づいてこれらの配列を整列するためにユニーク配列の比較配列分析を使用し、抗ＧＰＶＩリガンドの予測される二次構造に到達した（図５及び図８参照）。
抗ＧＰＶＩリガンドは、３個の軸部（Ｓ１−Ｓ３）及び４個の環（Ｌ１−Ｌ４）からなる共通の二次構造を共有しており、環４の中に保存された（Ａ／Ｇ）ＵＡＡ配列を含み、隣接する２つのＧＣ配列が対合領域を形成することによって軸部３を構成していた。図５に示されているように、抗ＧＰＶＩリガンドファミリの共通した二次構造の決定によって、さらなる保存された構造エレメントが同定された。環１の大きさ及び配列は保存されており、環１は、配列ＧＡＣの３個のヌクレオチドからなっていた。環３の大きさ及び配列も保存されており、環３は、２個のヌクレオチドからなり、ＣＡがファミリのメンバ１つのに存在していたものの、最も多くの場合に配列ＵＵ又は配列ＵＧからなっていた。軸部１は、４個〜５個の塩基対からなっていた。軸部２の長さは、軸部１より長く、典型的には７個〜８個の塩基対からなっていた。環２の長さは、より可変的であり、４個〜７個のヌクレオチドである。
実施例１に上述されている結合方法に従って、放射性同位体で標識したトレースリガンドＲＮＡ及び可溶性ＧＰＶＩを使用した直接結合試験によって、ＧＰＶＩに対するそれぞれの抗ＧＰＶＩリガンドの親和性を決定した。ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩリガンドの親和性は高く、Ｋｄは〜１１ｎＭから〜５０ｎＭに及び、親和性の能力の順位は、ＥＦ−２≒ＥＦ−３≒Ｅ２−６≒ＥＦ−２２≒ＥＦ−３１＞＞Ｆ−１であった。興味深いことに、環３に配列ＣＡを含むリガンドＥＦ−１は、ＧＰＶＩに対して最も低い親和性を示した。これは、高親和性のＧＰＶＩ結合には環３配列のＵＵ又はＵＧが重要であることと一致する。
実施例３：抗ＧＰＶＩリガンド構造の短縮及び変異の試験
図５に示されている抗ＧＰＶＩリガンドの保存二次構造は、この構造を形成し、かつ、ＧＰＶＩに高親和性で結合するのに必要な最低限の配列に関する信頼できる予測を可能にする。最初試験は、所望の構造及び機能を有するリガンドを維持するために必要な５’及び３’の限界配列の要件を決定することを目的としていた。
図５に示されている共通の二次構造は、リガンドライブラリの３’固定領域に由来する（リガンドの）領域がＧＰＶＩ結合にとっておそらく重要はないことを示している。上において同定されたＰ３２末端標識ＲＮＡに対して相補的ＤＮＡ３’プライマをヒートアニーリングし、平衡化し、結合試験を（実施例１に上述されているように）実行することによって、ＧＰＶＩとの相互作用における３’固定領域由来配列の重要性を試験した。その結果を図６に示す。アニーリングプライマを用いた場合と用いない場合とでは、リガンドの結合は同等であった。このことは、図５に示されている共通構造によって予想されたように、この領域がＧＰＶＩタンパクに結合するのには重要でないことを示唆している。
図５に示されている共通構造によって予測されるような、軸部１に必要とされる５’及び３’の限界配列を含む抗ＧＰＶＩリガンドのいくつかの短縮された化合物を調製した（表５）。また、ＧＰＶＩに対するそれらの配列の親和性を測定した。「ＲＢ ＩＤ」は、「修飾された配列」と題された列に記載されている特定の修飾を有する配列のリガンドを表すユニークな名称である。「配列番号」は、修飾を含まない対応核酸配列（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を表す。
Figure 2012528597
Figure 2012528597
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ＰＣＲによって生成したテンプレート又はクレノーによって生成したテンプレートからインビトロにおいてすべてのＲＮＡを転写した。
配列番号は、「修飾された配列」と題された列に記載されているリガンドの修飾されていない型を表す。
ｒＧ＝２’リボＧ；ｒＡ＝２’リボＡ；ｆＣ＝２’−フルオロＣ；ｆＵ＝２’−フルオロＵ
下線されているヌクレオチドは導入した変更を表している。
＋＋＋＋ １０ｎＭより小さいＫｄ
＋＋＋ １０ｎＭ〜２４ｎＭのＫｄ
＋＋ ２５ｎＭ〜４０ｎＭのＫｄ
＋ Ｋｄ＞４０ｎＭ
結合非検出 結合が検出されなかった
割当なし ＲＢ ＩＤが割り当てられていない
いくつかの代表的な短縮体の結合データを図７に示す。図５に定義されている二次構造によって予測される共通の５’及び３’限界と一致して、ＥＦ−１ Ｔ１、ＥＦ２ Ｔ２、ＥＦ−３ Ｔ２、Ｅ２−６ Ｔ１、ＥＦ−２２ Ｔ１及びＥＦ−３１ Ｔ２は、それぞれの完全長の親リガンドと同等のＫｄでＧＰＶＩに結合した。このことによって、５’及び３’末端の予想限界が、軸部１及び機能的な抗ＧＰＶＩリガンドを形成するのに充分であることが確かめられた（表５参照）。
図５に示されている共通構造は、軸部２が安定な軸構造を形成するために必要とされる塩基対よりも多くの塩基対を含んでいてもよいことを示唆している。更に、開始リガンドライブラリの５’固定領域に由来する環１の大きさ及び配列が保存されていることは、軸部２の大きさ及び環２の長さ又は配列の保存の欠落と組み合わされて、軸部２及び環２は、環１を適切に与えるためのスペーシング機能をある程度有していてもよいことを示唆している。これらの見識に基づいて、ＧＰＶＩに対する高親和性結合を保持しながら、軸部２の大きさをより小さくすることできる。したがって、ＧＰＶＩに対する高親和性結合に必要な軸部２の最小の大きさを決定するために、さらなる短縮物を調製した（二次構造表示については図８Ａ、Ｂ、Ｃを参照されたい。配列名称については表５を参照されたい。）。ＥＦ−３ Ｔ４及びＴ５、並びに、ＥＦ−３１ Ｔ５、Ｔ６及びＴ７は、それぞれの完全長の親リガンドと同等のＫｄでＧＰＶＩに結合した。これによって、４塩基対の長さの軸部２がＧＰＶＩに対する高親和性結合に充分であることが確認された。これらの結果は、環１のＧＡＣ配列を適切に与えることにおける軸部２及び環２の役割と完全に一致している。さらに、軸部２の底から２番目の位置でＡ−Ｕ塩基対を削除した短縮物である、ＥＦ−３ Ｔ３及びＥＦ−３１ Ｔ４の両方は、それぞれの完全長親リガンドと比較して結合が低下した。親配列中に存在するＧ−Ｃ塩基対又はＡ−Ｕ塩基対とは対照的に、これらの短縮物に関する軸部２の構成試験によって、上に一覧されているＧＰＶＩ親和性が低下しなかった短縮物に関する軸部２の構成と比較したときに、ＥＦ−３ Ｔ３及びＥＦ−３１ Ｔ４の軸部２はこの位置にＵ−Ｇがユニークに配置されていたことが明らかになった。このことは、高親和性ＧＰＶＩ結合のためには、軸部２の底から２番目の塩基対にプリンとピリミジンとのペアが必要であることを示唆している。このペアは、図５に示されているいくつかの抗ＧＰＶＩリガンドの共通二次構造において保存された特徴である。
図５に示されている抗ＧＰＶＩリガンドの共通の二次構造は、環１、環３及び環４における一次配列が保存されていることと、環２の大きさ又は配列が保存されていないことを示している。これらの環においてみられた保存された又は保存されなかった配列の機能的重要性を評価するために、これらの環配列中に変異及び置換を作成した（表５上部参照。変異させた残基は下線で示されている。）。
ＥＦ−２ Ｔ２又はＥＦ−３ Ｔ２の環３にみられた保存されたＵＵ配列をＡＡに変異させる（ＥＦ−２ Ｔ２ｍｕｔ３及びＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ３、二次構造表示については図９参照）と、ＧＰＶＩに対する測定可能な結合性が完全に失われる結果となった。このことは、図５に示されている共通の二次構造によって予測される環３のＵＵ配列又はＵＧ配列の重要性と一致している。ＥＦ−３ Ｔ２の環３に存在する保存されたＵＵ配列を、ＵＡに（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ６）また、ＡＵに（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ７）変異させた。抗ＧＰＶＩリガンドの共通構造と一致して、環３の最初のＵをＡに変異させることは、ＧＰＶＩに対する測定可能な結合性を失わせる結果となったが、環３の第２のＵをＡに変異させることは、ＧＰＶＩに対する親和性をわずかに低下させる結果となった。したがって、ＵＵ又はＵＧ等のようなＵＡの環３配列は、ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩリガンドの高親和性結合をサポートし、５’−ＹＤ−３’（ここで、Ｙはピリミジンを表し、Ｕは環３のそのピリミジンとして高度に望ましく、ＤはＵ又はＧ又はＡを表す（Ｃではない））のような環３の観察された保存と一致している。
ＥＦ−３ Ｔ２の環４の保存されたＧＵＡＡ及びＥＦ−２ Ｔ２の環４の保存されたＡＵＡＡを、それぞれ、ＧＵＵＵ（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ４）及びＡＵＵＵ（ＥＦ−２ Ｔ２ｍｕｔ４）に変異させ、また、ＧＵＧＧ（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ５）及びＡＵＧＧ（ＥＦ−２ Ｔ２ｍｕｔ５）にも変異させた（二次構造表示については図９参照）。置換の両方の組み合わせは、測定可能なＧＰＶＩ結合性を完全に失わせる結果となった。これは、図５に示されている共通の二次構造によって予測されるような、ＧＰＶＩ結合に対するＡＵＡＡ又はＧＵＡＡの環４配列の重要性に一致している。環３及び環４における保存配列の重要性をさらに確認するために、ＥＦ−３ Ｔ２の環３を、ＥＦ−２２、Ｅ２−６及びＥＦ−３１配列においてみられるように、ＵＧに変更した（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ８）。その結果、ＧＰＶＩに対する親和性に顕著な変化は生じなかった。これは、図５に示されている抗ＧＰＶＩリガンドの保存された構造と一致している。さらに、ＥＦ−３ Ｔ２の環４を、ＥＦ−２、ＥＦ−２２、Ｅ２−６及びＥＦ−３１にみられるように、ＡＵＡＡに変更した（ＥＦ−３ Ｔ２ ｍｕｔ９）。その結果、ＧＰＶＩに対する親和性に顕著な変化は生じなかった。これは、図５に示されている抗ＧＰＶＩリガンドの保存された構造と一致している。最後に、ＥＦ−３ Ｔ２の環３を、ＥＦ−２２、Ｅ２−６及びＥＦ−３１にみられるように、ＵＧに変更し、同時に環４をＡＵＡＡに変更すること（ＥＦ−３ Ｔ２ｍｕｔ１０）は、ＧＰＶＩに対する親和性に顕著な変化を生じさせなかった。これは、図５に示されており抗ＧＰＶＩリガンドの保存された構造と一致している。
環１配列をそれぞれＣＡＣ、ＧＵＣ及びＧＡＧに変更して、環１に単一位置変異を有する合成抗ＧＰＶＩリガンドを生産した（ＲＢ４７０−ＲＢ４７２、下記表６参照）。各置換は、測定可能なＧＰＶＩ結合を完全に失わせる結果となった。これは、図５に示されている共通の二次構造によって予測されるような、ＧＰＶＩ結合に対するＧＡＣの環１配列の重要性と一致している。
環２の長さ又は配列構成に明らかな保存性はみられなかったが、むしろ、環２は、ＳＥＬＥＸにおいて使用されるリガンドライブラリの５’固定配列に由来するＧＡＣ配列が環１に存在できるようにするための、単離されたリガンドにおけるスペーサとして機能することができた。これによって、環２のヌクレオチド構成はＧＰＶＩに対する高親和性結合には必須ではないことが予想される。この予想と一致して、ヘキサエチレン・グリコール・スペーサ（図１３Ａ−Ｂ参照）を有するＥＦ−３１ Ｔ７（ＲＢ４６６）の環２の置換によって、親リガンド（ＲＢ４４８）と比較しても、ＧＰＶＩに対する親和性は失われなかった。ＲＢ４６６に関する結合するデータは図１０に示されている。
実施例４：２’糖修飾及び抗ＧＰＶＩリガンドのリン酸ジエステル骨格のさらなる短縮及び最適化
２’−フルオロピリミジン／２’−ヒドロキシプリンライブラリから単離されるリガンドは、インビトロ選抜のために充分なヌクレアーゼ安定性を示す。しかしながら、多量の２’−ヒドロキシルは、これらの位置がインビボにおいてヌクレアーゼによる分解を非常に受けやすいという事実によって、非経口投与後に達成される最高濃度のみならず、循環半減期を限定することになり、そのライブラリを薬剤開発候補に適さないものにする。したがって、我々は、ヌクレアーゼ安定性を高めながらＧＰＶＩに対する親和性を保持するのに必要とされるようなホスホロチオエート置換によるリガンド骨格の修飾を用いて、２’−ヒドロキシルヌクレオチドによる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの置換による、又は、２’−ヒドロキシルヌクレオチドの２’−デオキシヌクレオチドの置換による骨格のさらなる安定化によって、抗ＧＰＶＩリガンドを最適化を目指した。安定性をさらに向上させ、製造コストを下げ、製造プロセス中の２’−フルオロウリジン含有オリゴヌクレオチドの加熱中に生じ得る潜在的不純物のレベルを下げるために、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる２’−フルオロヌクレオチドのさらなる置換を行った。インビボにおける安定性を高めるために、最後に、オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼによる分解を防ぐ５’末端及び３’末端の「キャッピング」を試みた。抗ＧＰＶＩリガンドにおいて必要とされる最小限配列の保存性は完全に高かった。また、一般にＧＰＶＩに対する親和性は類似していた。リガンドＥＦ−３１ Ｔ７は、高いＧＰＶＩ親和性と短い環２とを有する最小限の抗ＧＰＶＩリガンドに相当した。したがって、リガンドＥＦ−３１ Ｔ７は、ヌクレアーゼ安定性及びＧＰＶＩ結合のための抗ＧＰＶＩリガンドのさらなる最適化のための親分子として選択された。
そのリガンドの３’末端に３’−３’結合を作成するために、反転したデオキシチミジンを乗せたＣＰＧ支持物からのリガンドの合成によって、ＥＦ−３１ Ｔ７の３’末端のキャッピングを実行した（ＲＢ４４８）。この修飾は耐性が高く、したがって、このリガンドに対して合成的に生成したすべての修飾においてこの修飾を使用した。ＲＢ４４８（配列番号：６２）は以下の配列：rGrGrGrArGrGrAfCrGrGfCrGfCfUrArAfCrGfCfCfUrGrGfCrAfUrArArGfCfCfUfCfCfCiTを有する。ここで、「ｒ」はリボ核酸を表し、「ｆ」は２’−フルオロヌクレオチドを表し、「ｉＴ」は反転したデオキシチミジンを表す。
２’ヒドロキシルヌクレオチド及び２’フルオロヌクレオチドに対する２’Ｏメチルヌクレオチドによる最初の置換を、軸部１、軸部２及び軸部３の中に合成し、それらの置換体を、実施例１に記載されているような直接結合分析においてＧＰＶＩに対する結合について試験した。この結合分析の結果を表６下部に示す。軸部１における２’−Ｏ−メチルによる大部分の２’ヒドロキシルの置換（ＲＢ４５２）又は２’−Ｏ−メチルによるすべての２’ヒドロキシルの置換（ＲＢ４５３）は非常に耐久性が高く、軸部１のすべてが２’−Ｏ−メチル構成であるものは、親化合物（ＲＢ４４８）と比較してＧＰＶＩに対する親和性が高かった。これは、抗ＧＰＶＩリガンドの保存された二次構造と一致している。軸部２の上方の２つの塩基対における２’−Ｏ−メチルによる２’−ヒドロキシルの置換（ＲＢ４５５）もまた耐久性が高く、保存された二次構造及び短縮体のデータと一致していた。これは、軸部２の上部の塩基対修飾のいくつかの組み合わせが抗ＧＰＶＩリガンドの中に存在していてもよく、その組み合わせがＧＰＶＩに対する高親和性結合をサポートすることを示唆している。最後に、軸部３（ＲＢ４６２）における２’−Ｏ−メチルＧ−Ｃ塩基対による２’ヒドロキシル−２’フルオロＧ−Ｃ塩基対の置換は、ＧＰＶＩに対する親和性を顕著に増加させる結果となった。この置換は、軸部３の安定性を高めると予想される。また、この置換は、抗ＧＰＶＩリガンドの共通の二次構造（この共通構造において、軸部３は２塩基対の短い軸であると予想される）と一致している。
次に、ＲＢ４５３、ＲＢ４５５、ＲＢ４６２及びＲＢ４６６の置換を含む複合分子を合成し（ＲＢ４９０）、その分子をＧＰＶＩに対する結合について直接結合分析において試験した（図１０参照）。それぞれの置換の組を含む複合物の親和性と矛盾せず、ＲＢ４９０は、開始時の親化合物よりも著しく強い親和性でＧＰＶＩに結合した。ＲＢ４４８のＫｄが〜１４−１５ｎＭであるのに対して、ＲＢ４９０のＧＰＶＩに対するＫｄは、〜４−５ｎＭであった。次に、抗ＧＰＶＩリガンドのさらなる最適化のための親化合物としてＲＢ４９０を使用した。この分子の第１残基（位置１のＧ）における２’−Ｏ−メチル置換は耐久性が高かったが、この修飾はＰ３２によるこれらの複合物の５’末端標識の効率を大幅に低下させることに留意すべきである。したがって、試験される多くの残存する修飾の評価のために、直接結合試験を容易にするために、この残基を２’−ヒドロキシルとして残した。ここで検討されている重要な複合物の糖修飾を示す二次構造表示は、図１１Ａ〜図１１Ｄに示されている。
軸部２の５’側の半分は、ＳＥＬＥＸ試験に使用したリガンドライブラリの５’固定領域に由来したものであるので、リガンドライブラリのランダム領域に由来する配列と比較すると、この軸部配列の配列構成は、この軸部の下部の２塩基対における２’−ヒドロキシルヌクレオチド又は２’−フルオロヌクレオチドの置換の耐久性に関する指標としては信頼性が低い可能性がある。したがって、軸部２の底部の２個のＧ−Ｃ塩基対において、２’−Ｏ−メチルによって２’−ヒドロキシル及び２’−フルオロを置換した（ＲＢ４９７、ＲＢ４９８、ＲＢ４９９及びＲＢ５００）。軸部２の端末位置のＧ−Ｃ塩基対のＧにおいて２’−ヒドロキシルを２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ４９７）は、耐久性が高い結果となったが、この塩基対のＣにおいて２’−フルオロを２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ４９８）は、耐久性が低い結果となった。軸部２の２番目の位置のＧ−Ｃ塩基対のＧにおいて２’−ヒドロキシルを２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ４９９）、及び、Ｃにおいて２’−フルオロ糖を２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ５００）は、いずれも耐久性が高い結果となったが、Ｇにおける２’−Ｏ−メチル置換（ＲＢ４９９）はわずかに親和性が低下した。
抗ＧＰＶＩリガンドの共通の二次構造予測のいくつかは、軸部１が４塩基対程度の短さであってもよいことを示唆している。共通の二次構造と一致して、軸部１のＧ−Ｃ塩基対を１個欠失させた場合には、親合成物ＲＢ４９０と比較して親和性の損失がなく、耐久力も良好であった（ＲＢ５０７）。
軸部３の最初のＧ−Ｃ塩基対を２’−Ｏ−メチル糖含有塩基対に修飾すること（ＲＢ４６２）は、その位置に２’ヒドロキシル−２’フルオロＧ−Ｃ塩基対を有する複合物と比較して、親和性が高める結果となった。対照的に、軸部３のそのＣ−Ｇ塩基対における糖の２’−Ｏ−メチル置換（ＲＢ４６３）は、測定可能なＧＰＶＩ親和性を失わせる結果となった。したがって、軸部３の最適な糖修飾パターンをさらに調査するために、軸部３のＣ−Ｇ塩基対において、それぞれ、２’−フルオロ糖及び２’−ヒドロキシル糖に対する２’−Ｏ−メチルによる単独置換を実施した（ＲＢ５０１及びＲＢ５０２）。このＣ−Ｇ塩基対のＧの２’−ヒドロキシル糖を２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ５０２）は、耐久性が良好であり、ＧＰＶＩに対する親和性に明らかな低下は生じなかった。しかし、このＣ−Ｇ塩基対のＣの２’−フルオロを２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ５０１は、測定可能なＧＰＶＩ親和性を失わせる結果となった。このことは、この合成物でみられたＧＰＶＩ結合の欠損の原因であることを示唆している。全体的に、軸部２の好ましい糖修飾パターンは、抗ＧＰＶＩリガンド共通構造と一致しており、軸部３のこのＣ−Ｇ塩基対におけるＣの存在が糖修飾、軸部形成及び一次配列のレベルで保存されていることを示唆している。
抗ＧＰＶＩリガンドの環４の配列は高度に保存されており、したがって、環４のこれらの位置のそれぞれにおいて糖を２’−Ｏ−メチルで置換置換した（ＲＢ５０３、ＲＢ５０４、ＲＢ５０５及びＲＢ５０６）。これらの各位置において２’−Ｏ−メチルに置換したものは、耐久性が優れていた。また、環４のＡにおいて２’−ヒドロキシル糖を２’−Ｏ−メチルで置換したものは、親組成物ＲＢ４９０（ＲＢ５０３、ＲＢ５０５及びＲＢ５０６）と同等のＧＰＶＩに対する親和性を有する複合物を生じさせた。しかし、環４のＵにおいて２’−フルオロ糖を２’−Ｏ−メチルで置換したもの（ＲＢ５０４）は、ＧＰＶＩ親和性を穏やかに低下させる結果となった。それにもかかわらず、２’−フルオロによる糖修飾が顕著なヌクレアーゼ耐性を与えるので、この環のＵを２’−フルオロヌクレオチドとして維持した。
変異分析（実施例３、ＲＢ４７０、ＲＢ４７１及びＲＢ４７２参照）によって、ＧＰＶＩに対する高親和性結合における環１のＧＡＣ配列の重要性が実証された。したがって、環１ヌクレオチド（ＲＢ４９１、ＲＢ４９２、ＲＢ４９３、ＲＢ４９４、ＲＢ４９５及びＲＢ４９６）の好ましい糖修飾パターンを決定するために、環１のそれぞれの位置で糖を２’−Ｏ−メチル及び２’−デオキシで置換した。環１のＧにおいて２’−ヒドロキシルを２’−Ｏ−メチルに置換したもの（ＲＢ４９１）は、耐久性に優れており、親合成物ＲＢ４９０と同等にＧＰＶＩに対して親和性であった。また、この位置では２’−デオキシ置換の試験を行わなかった（ＲＢ４９４）。環２のＡにおいて２’−ヒドロキシルを２’−デオキシで置換したもの（ＲＢ４９５）は、この位置における２’−Ｏ−メチルの置換（ＲＢ４９２）よりも耐久性が優れており、親合成物ＲＢ４９０とほぼ同等にＧＰＶＩに対して親和性であった。環２のＣの２’−フルオロ糖を２’−Ｏ−メチル糖又は２’−デオキシ糖のいずれかによって置換したものは、ＧＰＶＩに対する親和性を穏やかに低下させる結果となった。したがって、それ以上試験を行わなかった。環１の個々の糖置換と一致して、２’−Ｏ−メチルＧ、２’−デオキシＡ及び２’−フルオロＣからなる環１を有する合成物（ＲＢ５１８）は、２’−Ｏ−メチルＧ、２’−Ｏ−メチルＡ及び２’−フルオロＣからなる環１を有する化合物（ＲＢ５１９）よりも高い親和性でＧＰＶＩに結合した。
これらの置換のすべてを１個の構成に組み込むことによって優れた耐久性が実現されることを確認するために、ＲＢ４９１、ＲＢ５０２、ＲＢ５０３、ＲＢ５０５及びＲＢ５０６の置換からなる複合分子（ＲＢ５２０）、並びに、ＲＢ４９１、ＲＢ５０２、ＲＢ５０３、ＲＢ５０５、ＲＢ５０６及びＲＢ５０７の置換からなる複合分子（ＲＢ５２１）を合成した。個々の置換から予想されるように、ＲＢ５２０及びＲＢ５２１（ＲＢ５２０と同一の糖置換パターンを有するが、４塩基対の軸部１を有するもの）は、ＧＰＶＩに対するＲＢ４９０の結合に類似したＫｄ（約６ｎＭ、ＲＢ４９０は４−５ｎＭ）でＧＰＶＩに結合した。同様に、これらの置換を有する複合物であって、軸部２の２番目のＧ−Ｃ塩基対に２’−フルオロを有する複合物（ＲＢ５２４）は、ＧＰＶＩに高親和性で結合した。
ＲＢ５２４は、この分子の中心コア（軸部１、環１の頂部、軸部２、環３、軸部３、及び、環４の底部によって定義される）の中に４個の残存する２’ヒドロキシル残基を含んでいた。高度に修飾されたＲＢ５２４構成中の残存２’−ヒドロキシル残基に対する最適な糖置換パターンを決定するために、ＲＢ５２４をバックグラウンドとして、前に別々に試験したように１個の、ペアの、及び、複数の糖置換を作成した。２’−Ｏ−メチルＧ、２’−デオキシＡ及び２’−フルオロＣの環１配列と、軸部２の末端のＧ−Ｃ塩基対のＧにおける２’−デオキシ置換とを組み合わせてＲＢ５２４バックグラウンドに組み込んだもの（ＲＢ５２６）は、２個のみの残存２’−ヒドロキシルを有しながら、ＧＰＶＩに対する高親和性結合を保持した構成となった。次に、軸部１の長さの前分析から予想されたように、ＲＢ５２６のＧ−Ｃ塩基対の欠損（ＲＢ５３７）は、ＧＰＶＩに対する高親和結合性を保持する構成となった。また、ＲＢ５３７の環３のＧにおいて２’−ヒドロキシ糖を２’−Ｏ−メチルによって置換したもの（ＲＢ５３８）は、ＧＰＶＩに対する高親和結合性を保持する構成となった。最後に、ＲＢ５３８の軸部２の２番目のＧ−Ｃ塩基対のＧに残存する唯一の２’−ヒドロキシルを２’−デオキシに置換したもの（ＲＢ５４０）は、耐久性が優れていた。これによって、ＧＰＶＩに対するＫｄが約１５ｎＭであり、２’位の糖が完全に置換された構成が与えられた。
ＧＰＶＩに対する親和性と、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集の抑制との間には、かなりの相関があることが機能試験（実施例６参照）によって示唆された。さらに、コラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を抑制する抗ＧＰＶＩリガンドの能力は、該リガンドが、ＧＰＶＩのコラーゲン関連ペプチド結合部位に重なる又は該部位の近くのコラーゲン結合領域のある領域に結合できることを示唆している。ＧＰＶＩのコラーゲン結合部位は、正味の正電荷及び大きい電気陽性表面を有する。したがって、ホスホロチオエート置換はオリゴヌクレオチドの正味の電気陰性度を高め、それによってＧＰＶＩに対するリガンドの親和性を高めるので、ＲＢ５４０において、環１及び軸部２の中の２’−デオキシ置換からなる部位にホスホロチオエート置換を作成した。さらに、２’−デオキシ糖を含む残基の前後のホスホロチオエート置換は、ヌクレアーゼによる分解からのさらなる保護を与えることができる。ＲＢ５４０を元にして、ホスホロチオエート置換を、それぞれ、環１のＡとＣに隣接するように、また、軸部２の末端の２塩基対のＧに隣接するように作成した（ＲＢ５４６、ＲＢ５４７、ＲＢ５４８、ＲＢ５４９、ＲＢ５５０）。軸部２の底部の２個のＧの間の１個のホスホロチオエート置換（ＲＢ５４９）又は軸部２の２番目のＧに対して３’側の１個のホスホロチオエート置換（ＲＢ５５０）は、ＧＰＶＩに対するリガンドの親和性を高めた。これらのホスホロチオエート置換の両方を複合抗ＧＰＶＩリガンドに組み込んだもの（ＲＢ５６６）は、ＧＰＶＩに対するリガンドの親和性をさらに高まり、ＧＰＶＩに対するＫｄがおよそ２−４ｎＭであるＲＢ４９０と比較してＧＰＶＩに対する親和性がわずかに向上し、また、ＲＢ５４０と比較して親和性が非常に向上する結果となった（図１２参照）。
ヌクレアーゼ安定化の程度に加えて、リガンド非経口投与後の分布及び半減期は、そのリガンドの分子量によって非常に影響される。リガンドを高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のような高分子量担体に対して接合させることは、リガンドの分布を主として血漿部分に限定し、単位用量当たりのＣｍａｘをより高くし、リガンドの腎濾過を非常に制限し、したがって、リガンドのインビボにおける能力及び循環半減期を非常に向上させる。抗ＧＰＶＩリガンドの能力及び半減期（実施例８参照）を微調整するために調節因子を投与することができることを前提として、主として分布を血漿部分に限定するとともに、最も長い潜在的半減期に与えるために、抗ＧＰＶＩリガンドを高分子量担体に接合させる。リガンドのＰＥＧ化は、リガンドの合成中に部位特異的リンカーを組み込み、リガンドのユニークな部位に対してＰＥＧを接合させることによって達成することができる。したがって、ＲＢ５４０、ＲＢ５４９及びＲＢ５６６に対するリンカーの付加及びＰＥＧ接合の影響を評価した。これらのそれぞれのリガンド（ＲＢ５４２、ＲＢ５６０及びＲＢ５６７）の５’ヘキシルアミノリンカーを含む構成は、リンカーを含まない親組成物の構成と同等の親和性でＧＰＶＩに結合した。５’リンカーを含む構成、又は、５’リンカーとＰＥＧとを含む構成のいずれかについて、リガンドの位置１のＧの糖が２’−Ｏ−メチルであったことに留意されたい。さらに、リガンドの５’末端へのリンカーの組み込みは、Ｐ３２を用いた５’末端のラベル付けを妨げるので、実施例１に概説されている方法を本質的に使用して、放射性同位体で識別した同種の親リガンドに対する競合結合によって、リンカー及びＰＥＧによって修飾されたリガンドの親和性を測定した。リンカーを含むそれぞれのリガンド（ＲＢ５６９、ＲＢ５７０、ＲＢ５７１）を分岐した４０ＫＤａのＰＥＧに対して接合させることは、リンカーを含まない又はリンカーのみを含む構成（例えば、ＲＢ５７１に対するＲＢ５６６）と比較して、ＧＰＶＩに対する親和性がおよそ１．２倍〜１．７倍低下する結果となった。したがって、ＲＢ５６６の（位置１に２’−Ｏ−メチルＧを有する）構成を含み、かつ、４０ＫＤａのＰＥＧに接合したＲＢ５７１は、ＧＰＶＩに対して約５ｎＭのＫｄを示す。
Figure 2012528597
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Figure 2012528597
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＋＋＋＋ １０ｎＭより低いＫｄ
＋＋＋ １０ｎＭ〜２４ｎＭのＫｄ
＋＋ ２５ｎＭ〜４０ｎＭのＫｄ
＋ Ｋｄ＞４０ｎＭ
結合なし 結合しなかった
未測定 測定を行わなかった
（＊＊） 機能分析した化合物
「修飾された配列」と題された列に記載されているすべてのリガンドは、配列番号：６（ＲＢ４４８）の修飾された型である。
ｒＧ＝２’リボＧ；ｒＡ＝２’リボＡ；ｍＧ＝２’Ｏ−メチルＧ；ｍＡ＝２’Ｏ−メチルＡ；ｍＣ＝２’Ｏ−メチルＣ；ｍＵ＝２’Ｏ−メチルＵ；ｆＣ＝２’フルオロＣ；ｆＵ＝２’フルオロＵ；Ｇ＝２’デオキシＧ；Ａ＝２’デオキシＡ；ｉＴ−反転したデオキシチミジン；（ｓ）−ホスホチオエート結合；（Ｃ６Ｌ）＝ヘキシルアミノリンカー；（６ＧＬＹ）＝ヘキサエチレングリコールリンカー（（９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール，１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトを用いて組み込んだ）；（ＰＥＧ４０ＫＧＬ２−ＮＯＦ）＝４０ｋＤａの分岐したＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ社、ＧＬ２−４００ＧＳ２製品）；（６ＦＡＭ）：６−カルボキシフルオレセイン
「ＲＢ ＩＤ」は、「修飾された配列」と題された列に記載されている特定の修飾を有する配列のリガンドを表すユニークな名称である。
「配列番号」は、修飾を含まない対応核酸配列（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を表す。
実施例５：抗ＧＰＶＩリガンドの抗血小板活性、活性の特異性、及び、活性の調節を評価する方法
Ａ．ヒト血小板濃縮血漿調製物及び洗浄済血小板におけるコラーゲン誘導血小板凝集（ＣＩＰＡ）分析
１．ヒト血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）及び凝集試験
抗凝血剤として、０．３ｍＭ ＰＰＡＣＫを含む食塩水（９：１ 血液：抗凝固性食塩水混合物；Ｂｉｏｍｏｌカタログ番号ＰＩ１１１７）を使用して、６０ｍｌのシリンジに回収した新鮮な全血からヒト血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）を調製した。この血液を、５０ｍｌの円錐形チューブ内で低速（２５０Ｇ）で１６分間遠心分離した。遠心分離によって血液細胞から分離された血小板濃縮血漿を１０ｍｌの血清用ピペットを使用して回収した。また、２２００Ｇで１０分間高速遠心分離することによって、残存血液から血小板乏血漿（ＰＰＰ）を調製した。血小板乏血漿を回収し、光線透過血小板凝集測定（ＬＴＡ）のブランクとして保存した。
４５０μＬのヒト血小板濃縮血漿（２５μＬ食塩水をさらに加えたもの）を使用して、クロノログ社（Chrono-log、Havertown、ペンシルベニア州）のルミ血小板凝集計（lumi-aggregometer）において３７℃で６分間（１２００ｒｐｍで撹拌した）、ヒト血小板濃縮血漿における血小板凝集をモニターした。アゴニストとして２５μＬのコラーゲンを使用して凝集を開始させた。５００μＬの血小板乏血漿（ＰＰＰ）を血小板凝集計におけるベースラインとして使用した。コラーゲンによって誘導される血小板凝集をブロックする能力を求めて抗ＧＰＶＩリガンドを選抜するために、所望の最終濃度を与えるための濃度で抗ＧＰＶＩリガンドを含む２５μＬの溶液と共に、血小板凝集計細胞において３７℃で３分間、アゴニストであるコラーゲンを加える前に１２００ｒｐｍで持続的に攪拌しながら、４５０μＬのヒト血小板濃縮血漿をインキュベートした。７０％〜９０％のパーセント凝集を与えるように、示されている濃度のコラーゲン（ウマの腱コラーゲン繊維タイプ−１、クロノログ社、カタログ番号３８５）を加えることによって血小板凝集を開始させ、光線透過率を４分間〜６分間にわたって連続的に記録した。
２．洗浄済血小板（ＷＰ）の調製及び凝集試験
基本的にはマスタードら（１９７２、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ２２、１９３−２０４）に記載されているように、ヒトの洗浄済血小板を調製した。簡潔に説明すると、酸／クエン酸塩／デキストロース（ＡＣＤ）バッファ（８５ｍＭクエン酸ナトリウム、６５ｍＭクエン酸、及び、１１０ｍＭグルコース）の６分の１の量となるようにヒト血液を回収し、３７℃の水槽に３０分間静置し、室温で１６分間２５０Ｇで遠心分離した。血小板濃縮血漿を、除去し、室温において２２００Ｇで１３分間遠心分離し、次に、１０Ｕ／ｍＬヘパリン及び５μＭ（最終濃度）プロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を含む４０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液（１３６．５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．４３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．５ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．３５％ウシ血清アルブミンｐＨ７．４）中に再懸濁した。血小板懸濁物を３７℃の水槽中で１０分間インキュベートし、それに５μＭ（最終濃度）のＰＧＩ２を加えて、その混合物を１９００Ｇで８分間遠心分離した。得られたペレットを、５μＭ（最終濃度）ＰＧＩ２を含む４０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液中に再懸濁し、次に、３７℃の水槽中で１０分間インキュベートし、１９００Ｇで８分間遠心分離した。このペレットを、０．１Ｕ／ｍＬポテトアピラーゼを含むＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液中に３×１０８個の血小板／ｍＬの濃度で再懸濁し、血小板凝集試験において使用する前に３７℃の水槽中で１時間インキュベートした。
３７℃においてルミ血小板凝集計（クロノログ社、Havertown、ペンシルバニア州）によって、洗浄済血小板の０．５ｍｌの撹拌した（１２００ｒｐｍ）懸濁液（４２５μｌの洗浄済血小板、２５μｌのフィブリノゲン、２５μＬのインヒビター又はコントロール、及び、２５μＬのコラーゲン）を通る光透過率を測定することによって、コラーゲンによって誘導された洗浄済血小板の凝集を測定した。この装置のベースラインは、０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝タイロード溶液を使用して設定した。凝集測定を行う前に、血小板懸濁物に１ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを補給した。７０％〜９０％のパーセント凝集を与えるように、示されている濃度のコラーゲン（ウマの腱コラーゲン繊維タイプ−１、クロノログ社、カタログ番号３８５）を加えることによって血小板凝集を開始させ、光線透過率を少なくとも６分間にわたって連続的に記録した。コラーゲンによって誘導される血小板凝集をブロックする能力を求めて、抗ＧＰＶＩリガンド又はコントロール（リガンドの様々な変異体）を選抜するために、所望の最終濃度を与えるための濃度で抗ＧＰＶＩリガンドを血小板懸濁液に加え、コラーゲンを加える前に３分間インキュベートし、コラーゲンを加えた後に反応を４〜６分間記録した。
４μｇ／ｍｌのコラーゲンを含む食塩水の２倍段階希釈を使用して、用量反応曲線から得た最大の凝集パーセントから、各ドナーごとにコラーゲンの効力を測定し、投与濃度を決定した。上述されている洗浄済血小板（ＷＰ）及び血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）調製物の両方において、広範囲の抗ＧＰＶＩリガンド濃度（２μＭ〜７．８ｎＭ）を使用して、コラーゲン誘導血小板凝集を抗ＧＰＶＩリガンドが阻害する能力を試験した。
Ｂ．洗浄済血小板（ＷＰ）及び血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）におけるコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集（ＣＲＰＩＰＡ）の分析
コラーゲン関連架橋ペプチド、ＣＲＰ−ＸＬ［（ＧＰＯ）１０］は、ＧＰＶＩの選択的で有力なアゴニストであり（Ｆａｒｎｄａｌｅら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００４、２：５６１−５７３、及び、Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔ ＰＡら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００７、２８２：１２９６−１３０４）。また、血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）及び洗浄済血小板（ＷＰ）の凝集分析の両方において、ＧＰＶＩレセプタを介した血小板凝集を特異的に開始させるために、このコラーゲン関連架橋ペプチドを使用することができる。
４００ｎｇ／ｍｌのコラーゲン関連架橋ペプチドを含む食塩水の２倍段階希釈を使用して、用量反応曲線から得た最大の凝集パーセントから、各ドナーごとにコラーゲン関連架橋ペプチドの効力を測定し、投与濃度を決定した。広範囲の抗ＧＰＶＩリガンド濃度（２μＭ〜７．８ｎＭ）を用いて、上述されている洗浄済血小板（ＷＰ）及び血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）調製物の両方において、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を抗ＧＰＶＩリガンドが阻害する能力を試験した。
Ｃ．コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集の低下パーセント及びＩＣ５０決定
所定濃度のコラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドの接種による血小板凝集の最大値を１００パーセントとして、コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を抗ＧＰＶＩリガンドが低下させるパーセンテージを算出し、それをグラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を使用してプロットした。
広範囲の濃度（通常、１μＭから１μＭの濃度）の抗ＧＰＶＩリガンドを試験した場合には、同時にＩＣ５０値も得た。ＩＣ５０値は、所定濃度のコラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドによって誘導される凝集を５０％阻害するのに必要なリガンドの濃度を表す。
Ｄ．バイオフラックス（商標）２００（Bioflux 200、Fluxion Biosciences社）を使用した抗ＧＰＶＩリガンド活性に関する全血におけるインビトロフローベース血小板付着分析
１．コラーゲンコーティングを有する試験プレートの調製
フロー試験のために、バイオフラックス４８ウェルプレート（製品番号０００９−００１３）を規定通りに使用した。このプレートに、０．０２Ｍ酢酸を５ｄｙｎ／ｃｍ２で５分間入れ、次に、０．０２Ｍ酢酸で希釈した２５μｇ／ｍｌの線維コラーゲン（クロノログ社、製品番号３８５）を５ｄｙｎ／ｃｍ２で１０分間にわたって注入ウェルから散布した。この流れを止め、プレートを室温で１時間培養した。５ｄｙｎ／ｃｍ２の１０分間にわたるＰＢＳでコラーゲンを洗浄した。その後、排出ウェル（１ｍｌ）をＰＢＳ＋５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で完全に満たし、さらに、５ｄｙｎ／ｃｍ２で１５分間にわたってこの溶液をチャネルに潅流させることによって、このコラーゲンコーティングプレートを塞いだ。流れを止め、室温でさらに１０分間にわたってプレートを培養した。すべてのウェルから過剰なＰＢＳ＋ＢＳＡを除去し、そのプレートを、同日に使用するために室温で保持するか、又は、ＰＢＳ＋ＢＳＡ（最大で２週間）の中で４℃において保持した。
２．潅流及びフロー試験のための全血調製物
１９３／４標準規格注射針を用いて、健康なボランティアから血液を採取し、ＰＰＡＣＫ（０．３ｍＭ）／ＣＴＩ（６０μｇ／ｍｌ）抗凝血剤を含む６０ｍＬのシリンジの中に入れた。この血液を、直ちに、４μＭカルセインＡＭ（Invitrogen社、製品番号Ｃ３１００ＭＰ）を用いて３７℃において１時間にわたって蛍光標識した（混合するためにチューブを数回反転させることによって、非常に穏やかに血液にカルセインＡＭを加えた。また、採取から３．５時間以内にその血液を使用した。）。２００μＬの標識された血液を排出ウェル上に加えることによって試験を開始し、バイオフラックス（商標）ソフトウェアを使用して、２０ｄｙｎ／ｃｍ２で３７℃における全血フロー設定を使用して潅流を直ちに開始した。経時的蛍光倒立顕微鏡（アキシオカムＣＣＤカメラに取り付けたツァィス２００Ｍアキシオバート顕微鏡及びアキシオビジョンソフトウェア）を用いて、データ（血小板凝集の蛍光画像）を６秒ごとに合計６分間にわたって収集した。被験物質（抗ＧＰＶＩリガンド、コントロールリガンド、又は、コントロール抗体）とする目的で、排出ウェルに加える前に、２００μＬの標識された血液を、指示濃度のリガンド（又は、バッファＦ、１０μＬの体積）と共に室温において４分間インキュベートした。バイオフラックス・モンテージ（Bioflux Montage）（商標）ソフトウェアを用いて蛍光強度を計算するためにタグド・イメージ・ファイル（ＴＩＦＦ）形式の画像を使用し、次に、そのデータをマイクロソフトエクセルにエクスポートし、グラフプリズムを用いてプロットした。蛍光血小板凝集によってコントロールチャンバが閉塞した時（最大の血小板応答として定義される）にコントロールチャンバにおいて観察された蛍光シグナルに対して、データをノーマライズした。この閉塞は、通常、抗ＧＰＶＩリガンドの非存在下において３分〜４分で生じた。
Ｅ．ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩリガンドの特異性を評価するための、ＡＤＰによって誘導される血小板凝集（ＡＩＰＡ）の分析、ＴＲＡＰによって誘導される血小板凝集（ＴＩＰＡ）の分析、アラキドン酸によって誘導される血小板凝集（ＡＡＩＰＡ）の分析、及び、リストセチンによって誘導される血小板凝集（ＲＩＰＡ）の分析
他の非常に特徴的な血小板レセプタを介して機能が媒介されるアゴニストによって誘導される血小板凝集に対する効果を評価することによって、ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩリガンドの特異性を決定した。様々なアゴニストの活性を評価する必要があるので、これらの試験のために、ヒト血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）及び洗浄済血小板（ＷＰ）調製物を使用した。Ｐ２Ｙ１２レセプタ及びＰ２Ｙ１レセプタの特異的なアゴニストとしてＡＤＰを用い、ＰＡＲ−１レセプタのアゴニストとしてＴＲＡＰを用い、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）レセプタのアゴニストとしてアラキドン酸を用い、フォン・ウィルブランド因子ＧＰ１ｂα相互作用のアゴニストとしてリストセチンを用いた。それぞれのアゴニストの用量反応曲線から得た凝集パーセンテージの最大値から、それぞれのアゴニスト（ＡＤＰ、ＴＲＡＰ、アラキドン酸及びリストセチン）の能力を決定した。また、別々のアゴニストのＥＣ７０−９０％をそれぞれ得るために、投与濃度を測定した。
１．洗浄済血小板（ＷＰ）におけるＡＩＰＡ及びＴＩＰＡによる抗ＧＰＶＩ核酸リガンドの特異性決定
抗ＧＰＶＩリガンドとＰ２Ｙ１２及びＰ２Ｙ１との潜在的相互作用を評価することを目的として、主として５μＭの投与濃度のＡＤＰを使用することによって血小板凝集を促進した。また、抗ＧＰＶＩリガンドとＰＡＲ−１との潜在的相互作用を評価することを目的として、主として２．５μＭの投与濃度のＴＦＬＬＲＮ（ＴＲＡＰ）を使用することによって血小板凝集を促進した。各ドナーのアゴニスト用量反応曲線に基づいて、各試験の固有のアゴニスト投与濃度を決定する。上述されているように、洗浄済血小板（ＷＰ）調製物において、ＡＤＰ及びＴＲＡＰによって誘導される血小板凝集を測定した。これらの分析においてターゲットレセプタの阻害を検出できることを実証するために、各レセプタに対する特異的阻害因子をポジティブコントロールとして使用した。ＰＡＲ−１に対するアンタゴニスト作用のポジティブコントロールとしてＳＣＨ７９７９７（Tocris Biosciences社）を使用し、Ｐ２Ｙ１２に対するアンタゴニスト作用のポジティブコントロールとしてＩＮＳ５０５８９（Inspire Pharmaceuticals社）を使用した。
２．ＰＲＰにおける堤線によるＧＰＶＩ核酸リガンドの特異性決定
抗ＧＰＶＩリガンドとフォン・ウィルブランド因子又はＧＰ１ｂαとの潜在的相互作用を評価することを目的として、１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬの投与濃度のリストセチン（シグマ社、カタログ番号Ｒ７７５２）を使用することによって血小板凝集を促進した（各ドナーのアゴニスト用量反応曲線に基づいて、各試験の固有のアゴニスト投与濃度を決定する）。リストセチンによって誘導される血小板凝集を、上述されているようにＰＲＰ調製物において測定した。ターゲットレセプタＧＰ１ｂαの阻害を分析において検出できることを実証するために、ＧＰ１ｂαに対するＨＩＰ１抗体（又は、アイソタイプＩｇＧコントロール、Axxora Bio社、２５μｇ／ｍｌ最終濃度）をポジティブコントロールとして使用した。
３．血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）におけるＡＡＩＰＡによるＧＰＶＩ核酸リガンドの特異性決定
抗ＧＰＶＩリガンドとＴＸＡ２レセプタとの潜在的相互作用を評価することを目的として、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの投与濃度のアラキドン酸（Helena Biosciences社、カタログ番号５３６４）を使用することによって血小板凝集を促進した（各ドナーのアゴニスト用量反応曲線に基づいて、各試験の固有のアゴニスト投与濃度を決定する）。アラキドン酸によって誘導される血小板凝集を、上述されているようにＰＲＰ調製物において測定した。
Ｆ．ＷＰ及びＰＲＰにおいて抗ＧＰＶＩリガンドの核酸調節因子を試験することを目的とした、コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集の分析
コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を、ＷＰ調製物及びＰＲＰ調製物において上述されているように実行した。核酸調節因子が抗ＧＰＶＩリガンドによる血小板凝集阻害を無効化する能力を評価することを目的として、抗ＧＰＶＩリガンドのＩＣ９５−１００（所定濃度のアゴニスト投与によって誘導される凝集を９５％〜１００％阻害するのに必要とされるリガンド濃度）において試験を行った。抗ＧＰＶＩリガンドと血小板調製物とを最初にインキュベートした後に、調節因子の量を変更するステップを加え、調節因子対リガンドのモル過剰が８：１から０．５：１となるようにし、アゴニストを加える前に１０分間一緒にインキュベートした以外は、上述されているように、血小板凝集試験を実行した。
Ｇ．ＷＰにおける核酸調節因子による抗ＧＰＶＩリガンドの無効化に対する持続性試験
核酸調節因子による抗ＧＰＶＩ活性の無効化に対する持続性を評価することを目的として、３７℃の全容積４ｍｌのＷＰ懸濁液中に、ＲＢ４９０（最終濃度０．２５μＭ）及びＲＢ５１５（最終濃度０．７５μＭ）を（核酸調節因子を評価するために上述されている添加の順序及びタイミングで）加え、指定した時点（０時間、０．１６時間、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間及び３．５時間）にこのＷＰ懸濁混合液から４５０μＬの分割量を回収し、コラーゲンによって血小板凝集を誘導した。ＷＰ懸濁液の活性、ＲＢ４９０の活性、及び、このインキュベート中にＲＢ５１５による干渉がないことを実証することを目的として、個別のインキュベートを３．５時間にわたって実施した。このインキュベートにおいては、バッファのみ、ＲＢ４９０のみ、又は、ＲＢ５１５のみをＷＰ懸濁液に加え、コラーゲンによって誘導された血小板凝集を測定した。
実施例６：コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板機能の抗ＧＰＶＩリガンドによる抑制
血小板で独占的に発現されるＧＰＶＩは、主要な血小板コラーゲン受容体である。ＧＰＶＩは安定した血小板付着に必要であり、また、ＧＰＶＩのコラーゲンとの相互作用は、血小板インテグリンα２β１及び血小板インテグリンαＩＩｂβ３の完全な活性化のみならず、血小板顆粒成分の分泌（これは、次に、近傍の循環する血小板を活性化する）を生じさせる、血小板の最も強力なアクチベータの１つである。ヒトにおいて、ＧＰＶＩの欠損は、コラーゲンに応答した血小板活性化が失われる原因であり、インビトロにおいては、コラーゲンに応答した血小板凝集が失われる原因である。ＧＰＶＩ細胞外ドメインの予想される構造は、コラーゲン結合領域（ＣＢＤ）を含む２個のＩｇ用ドメインと、それに続いた、極度にＯグリコシル化された軸部を含む。ＬＲＣレセプタの中では典型的であるように、ＧＰＶＩは、ＦｃＲγ鎖コレセプターと結びつく。ＧＰＶＩシグナリングは、ＦｃＲのγ鎖を介して間接的に媒介され、また、ＧＰＶＩ細胞質ドメインを介して直接的に媒介される。繊維コラーゲンの四次構造はＧＰＶＩ活性化に必要である。また、コラーゲンによって媒介される活性化は、配列（ＧＰＯ）ｎのトリペプチド繰り返し配列からなり、Ｇがグリシンであり、Ｐがプロリンであり、Ｏがヒドロキシプロリンであるコラーゲン関連架橋ペプチド（ＣＲＰ−ＸＬ）によって再現可能である、
残基Ｑ１−Ｔ１８３からなるＧＰＶＩのコラーゲン結合ドメインの結晶構造が決定されている（Ｈｏｒｉｉら、Ｂｌｏｏｄ １０８、２００６、第９３６−９４２頁）。変異生成データに加えた構造データは、コラーゲンとＧＰＶＩとの分子間相互作用、及び、ＣＲＰ−ＸＬとＧＰＶＩとの分子間相互作用に対する詳細な見識を与える。そのような試験によって、ＧＰＶＩ活性化の機構を理解することが容易になる。そのコラーゲン結合ドメインは、２個のＩｇ様ドメインであるＣ２−１及びＣ２−２（ここで、Ｃ２−１はＮ末端であり、Ｃ２−２はＣ末端である）からなり、これらのドメインは９０度離れて方向を向いている。ＧＰＶＩのコラーゲン結合ドメインは、その結晶構造中に二量体を形成しており、それぞれのコラーゲン結合ドメインのそれぞれのＣ２−２ドメインが相互作用することによって背中合わせの二量体を形成している。コラーゲン関連ペプチド及びコラーゲンは、それぞれ、Ｃ２−１の浅い溝の中に部分的に結合する。この溝は、いくつかのＬＲＣレセプタの中でもＧＰＶＩに特有であり、他のＬＲＣレセプタにはない、ＧＰＶＩにおける１１個の残基欠失に起因するものである。この結合溝の底は、いくつかの疎水性残基（Ｌ５３、Ｆ５４、Ｐ５６、Ｌ６２、及びＹ６６及びＫ４１の脂肪族部分）と、その周囲のいくつかの極性残基（Ｓ４３、Ｓ４４、Ｑ４８、Ｑ５０及びＳ６１）及び塩基性残基（Ｋ４１、Ｒ４６、Ｋ５９及びＲ１６６）によって形成される。コラーゲン又はコラーゲン関連ペプチドの結合に直接的に関与する残基は、２つのクラスタに分類される。第１の領域は、Ｋ４１、Ｋ５９、Ｒ６０及びＲ１６６を含む、Ｃ２−１の表面の塩基性残基で構成されている。コラーゲン関連ペプチド又はコラーゲンの結合に関与する残基の第２のクラスタは、Ｃ２−１の遠位端に位置する。その第２のクラスタには、Ｌ３６（これは、コラーゲン関連ペプチドの結合には関与しないが、コラーゲンの結合に関与する）、並びに、Ｖ３４、及び、Ｎ−グリカンが付着したＮ７２（これらは、コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドの結合の両方に関与する）とが含まれる。突然変異分析と一致して、ＧＰＶＩのコラーゲン結合ドメインに対するコラーゲン関連ペプチドのコンピュータによるドッキングは、コラーゲン関連ペプチドの結合溝が、Ｋ４１及びＲ１６６との直接相互作用によって塩基性残基の第１のクラスタの内部に位置しており、また、Ｋ５９の側鎖及びＲ６０の側鎖の結合距離内にあることを示している。
それぞれのＧＰＶＩ二量体は、２個のコラーゲン結合溝を含んでおり、それぞれのコラーゲン結合ドメインのそれぞれのＣ２−１サブユニットの中にその１つが存在する。未変性コラーゲン線維は、１．３〜１．４ｎｍ離れた並列のコラーゲン関連ペプチド様三重螺旋の擬似六角形配列（可溶性コラーゲン関連ペプチドの結晶構造に保存されている配列）で構成されている。ＧＰＶＩ二量体内のコラーゲン結合溝は、実質的に平行であり、約５．５ｎｍの間隔である。この距離は、コラーゲン線維中のｎ個〜ｎ＋４個の螺旋である。コラーゲン螺旋とＧＰＶＩの２つの結合溝の幾何学的な適合性によって、ＧＰＶＩ二量体が、コラーゲン線維中の２個の螺旋に同時に結合することが可能になると考えられる。コラーゲン関連架橋ペプチドについても同様である。したがって、コラーゲン関連架橋ペプチドの形状は、未変性コラーゲンのそれを模倣するものであり、その形状によってＧＰＶＩのコラーゲン結合ドメインの別個のプローブとしてコラーゲン関連架橋ペプチドを使用することが可能になる。
ＧＰＶＩの機能をブロックする抗ＧＰＶＩリガンドの能力を最初に評価することを目的として、実施例５に記載されているように、洗浄済血小板調製物中でコラーゲンによって誘導される血小板活性化をブロックする能力について、リガンドＥＦ−２ Ｔ２及びリガンドＥＦ−３ Ｔ２（図９参照）を評価した。コラーゲンによって誘導される血小板凝集に対するリガンドによるあらゆる潜在的な非特異的な効果に関するコントロールとして、ＧＰＶＩ非結合性変異体リガンドである、ＥＦ−２ Ｔ２ Ｍ３−Ｍ５及びＥＦ−３ Ｔ２ Ｍ３−Ｍ５（図９参照）を、特異性コントロールとしての最初の選抜に含めた。図１５に示されているように、ＥＦ−２ Ｔ２及びＥＦ−３ Ｔ２の両方は、コラーゲンによって誘導される血小板凝集を有効にブロックしたが、不活性な変異体コントロールリガンドは、何の効力も有していなかった。
次に、洗浄済血小板調製物（ＷＰ）中でコラーゲンによって誘導される血小板凝集において、最適化された抗ＧＰＶＩリガンドであるＲＢ４９０、ＲＢ５４０、ＲＢ５４９及びＲＢ５６６の活性を評価した（図１６）。最適化されたリガンドは、それぞれコラーゲンによって誘導される血小板凝集を有効にブロックした。これらの抗ＧＰＶＩリガンドの相対効力は、ＧＰＶＩに対するそれぞれの親和性と一致しており、ＲＢ５４０（ＧＰＶＩに対するＫｄが〜１５ｎＭ）は１ｎＭのＩＣ５０を示し、ＲＢ５４９（ＧＰＶＩに対するＫｄが〜６−７ｎＭ）は２５ｎＭのＩＣ５０を示し、ＲＢ４９０（ＧＰＶＩに対するＫｄが〜４−５ｎＭ）は２３ｎＭのＩＣ５０を示し、ＲＢ５６６（ＧＰＶＩに対するＫｄが２−３ｎＭ）は２０ｎＭのＩＣ５０を示した。
抗ＧＰＶＩリガンドがＧＰＶＩの機能をブロックする潜在的なメカニズムをさらに調査することを目的として、実施例５に記載されているように、洗浄済血小板調製物においてコラーゲン関連架橋ペプチドによって誘導される血小板凝集をブロックする能力について、リガンドＲＢ４９０、リガンドＲＢ５４９及びリガンドＲＢ５６６を評価した（図１７）。コラーゲンによって誘導される血小板凝集をブロックするこれらのリガンド能力と一致して、ＲＢ４９０、ＲＢ５４９及びＲＢ５６６は、用量依存的態様でコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集をブロックした。コラーゲンと同様に、リガンドの相対効力は、ＧＰＶＩに対するそれぞれの親和性と一致しており、ＲＢ５６６、ＲＢ４９０及びＲＢ５４９のＩＣ５０は、それぞれ、３８ｎＭ、７９ｎＭ、及び、９８ｎＭであった。驚くべきことではないが、これらの分析において使用したコラーゲン関連架橋ペプチドは、コラーゲンより強力な血小板アゴニストであるので、抗ＧＰＶＩリガンドのＩＣ５０は、コラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集においてさらに高い。同時に、抗ＧＰＶＩリガンドがＧＰＶＩに又はＧＰＶＩのコラーゲン結合溝の近くに結合し、それによって、血小板表面のＧＰＶＩとのコラーゲン又はコラーゲン関連架橋ペプチドの会合をブロックする作用のメカニズムと、これらのデータは一致していた。
さらに、ペグ化されたリガンドであるＲＢ５７０、ＲＢ５６９及びＲＢ５７１の抗ＧＰＶＩ活性を、洗浄済血小板（ＷＰ）調製物においてコラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集におけるＲＢ４９０の活性と比較した（図１８−図１９）。上述されているように、ペグ化されたリガンドは、コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を同様に用量依存的に阻害した。リガンドにＰＥＧを付加することは、コラーゲンによって誘導される血小板凝集においてはＲＢ４９０の活性と比べてそれらのリガンドの活性に多少影響が与えたが、コラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集においては影響を与えなかった。ＲＢ５７１は、洗浄済血小板調製物におけるコラーゲン関連ペプチドによって誘導される凝集を阻害することにおいて最も強い能力を示し、ＩＣ５０は〜３３ｎＭであった。同様に、ＲＢ５７１は、血小板濃縮血漿におけるコラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集を強力に阻害した（図２０参照。詳細については実施例５を参照されたい。）。
実施例５に記載されているように、高せん断条件下における全血中でのコラーゲンコーティング面とのＧＰＶＩの相互作用に応答した血小板付着、活性化及び凝集をブロックする能力について、抗ＧＰＶＩリガンドを評価した。この分析の形式は、全血流における表面結合線維コラーゲンとＧＰＶＩの会合、及び、ＧＰＶＩとコラーゲンとの相互作用によって媒介される３つの重要な機能（すなわち、血小板付着、活性化、凝集）の再現を含む、インビボにおけるＧＰＶＩの機能の多数の特徴を反映している。不活性なコントロールリガンドであるＲＢ４７１と比較して、ＲＢ５６６及びＲＢ５７１は、血小板付着、活性化及び凝集を大幅に低下させた（図２１）（この分析における血小板反応は、ＲＢ４７１とバッファコントロールとで同等であった。）。
したがって、抗ＧＰＶＩリガンドは、静的条件下及び全血流において、単離された血小板分析においてＧＰＶＩの機能をブロックし、ＧＰＶＩによって媒介される血小板付着、活性化及び凝集に影響を与える。さらに、ＧＰＶＩの表面のコラーゲン結合部位に又はその結合部位の近くに抗ＧＰＶＩリガンドが結合するメカニズムと一致して、これらのリガンドは、ＧＰＶＩに対する各リガンドの親和性と一致した相対的効力で、コラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板凝集の両方を用量依存的に阻害する。
実施例７：ＧＰＶＩに対する抗ＧＰＶＩリガンドの特異性
ＧＰＶＩは、いくつかの血小板レセプタの１つであり、同族リガンドによる活性化は、該レセプタを介して血小板活性化及び凝集を促進する。他のそのようなレセプタには、トロンボキサンＡ２受容体（ＴＸＡ２）、ＡＤＰレセプタＰ２Ｙ１２及びＰ２Ｙ１、トロンビンレセプタＰＡＲ−１、及び、コラーゲンに結合したフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）のみによって活性化されるＧＰ１ｂαを含む。抗ＧＰＶＩリガンドがＧＰＶＩに結合して血小板機能をブロックする際の特異性を測定することを目的として、実施例５に記載されているように、ＡＤＰ、ＴＲＡＰ（ＰＡＲ−１アゴニスト）、アラキドン酸（ＴＸＡ２アゴニスト）及びリストセチン（フォンウィルブランド因子・ＧＰ１ｂα相互作用のアゴニスト）によって誘導される血小板凝集の分析において、抗ＧＰＶＩリガンドＲＢ５７１の効果を評価した。図２２及び図２３に示されているように、ＲＢ５７１は、洗浄済血小板（ＷＰ）調製物においてＡＤＰ若しくはＴＲＡＰによって誘導される血小板凝集に対して、又は、血小板濃縮血漿（ＰＲＰ）においてリストセチン若しくはアラキドン酸によって誘導される血小板凝集に対して効果がなかった。したがって、ＧＰＶＩに対するそれらリガンドの高い親和性及びＳＥＬＥＸによる単離に基づいて予想されるように、抗ＧＰＶＩリガンドはＧＰＶＩに対して特異的である。
実施例８：抗ＧＰＶＩリガンドの核酸調節因子
リガンドは、相補的なワトソンクリック型の塩基対合規則に基づいてそれらのリガンドに対する核酸調節因子又は制御因子を設計するために必要な情報をコードする。ある制御因子の有効性は、核生成のための（リガンドの）ターゲット領域と制御因子との近接容易性に加えて、リガンドとの完全な二本鎖を形成する前に変性を必要とする（制御因子中の）二次構造が存在しないか又は限定されていることを含むいくつかの要因に応じて変化する。核酸調節因子との会合するための好ましい領域になる（抗ＧＰＶＩリガンドの）領域を決定することを目的として、ＥＦ−２ Ｔ２及びＥＦ−３ Ｔ２に対して、一連の制御因子（表７及び図２４参照）を設計した。
Figure 2012528597
 配列番号１３７−１５１は、「修飾された配列」と題された列に記載されている調節因子の未修飾バージョンに相当する。
血小板凝集分析において、実施例５に記載されているように、ＥＦ−２ Ｔ２に対する制御因子ＲＢ４１６−ＲＢ４１９の無効化活性、及び、ＥＦ−３ Ｔ２に対する制御因子ＲＢ４２０−４２３の無効化活性を評価した。図２５及び図２６に示されているように、制御因子は、ＧＰＶＩリガンドに対する低いモル過剰において、抗ＧＰＶＩリガンドの機能を１０分以内に無効化することができた。抗ＧＰＶＩリガンドに対して相補的な（制御因子の）領域に関連して、ＥＦ−２ Ｔ２のために設計した制御因子とＥＦ−３ Ｔ２との間における一貫した効力が観察された。ＲＢ４１８及びＲＢ４２２は、３’側の軸部２、環３と、５’側の軸部３及び環４からなる（抗ＧＰＶＩリガンドの）類似領域と会合し、最も強い効力を示した。これらの制御因子は、これらの制御因子と共に完全に相補的な二本鎖を形成することができる上記抗ＧＰＶＩリガンドのあらゆるものと同様の効力特性を示すことが予想される。
潜在的制御因子の同様の集合をＲＢ４９０に対して設計した（表７参照）。図２７に示されているように、これらの核酸調節因子がＲＢ４９０の抗ＧＰＶＩ活性を無効化する能力は、ＥＦ−２Ｔ及びＥＦ−３Ｔに対する制御因子について定義されるような好ましい対合領域と一致しており、ＲＢ５１５が最も強い能力を示した。調節因子の重要な特徴は、リガンドと複合化すると、その調節因子とリガンドとの複合体が解離せず、かつ、リガンド活性が持続的に無効化され続けるということである。ＲＢ５１５によるＲＢ４９０の無効化の持続性を評価することを目的として、実施例５に記載されているように、コラーゲンによって誘導される血小板凝集において、ＲＢ４９０の抗ＧＰＶＩ活性の無効化の持続性を測定した。ＲＢ５１５は、ＲＢ４９０活性を３．５時間にわたって持続的に無効化した（図２８）。この時間は、コラーゲンに対して洗浄済血小板（ＷＰ）調製物が完全な凝集活性を維持した持続時間である。ＲＢ５１５の非存在下におけるＲＢ４９０は、明らかに、３．５時間のインキュベート時間にわたってコラーゲンによって誘導される血小板凝集を完全に阻害し続けた。ＲＢ４９０の抗ＧＰＶＩ活性に対するＲＢ５１５の無効化活性の持続時間は、ヒト血漿における制御因子ＲＢ００７による抗ＦＩＸａリガンドＲＢ００６の抗凝固性活性の無効化についてインビトロにおいて測定された持続時間と同等であった。ＲＢ００６とＲＢ００７との組み合わせは、人間及び他の種においてインビボで持続的な無効化を示したリガンド・制御因子ペアである。
ＲＢ５７１及びＲＢ４９０は、ＲＢ５１５に対して相補的な領域中に同一の塩基配列を共有している。したがって、ＲＢ５１５は、ＲＢ５７１に対する潜在的な制御因子である（図２９参照）。したがって、ＷＰ及びＰＲＰの調製物中でコラーゲン及びコラーゲン関連ペプチドによって誘導される血小板活性化において、ＲＢ５７１に対するＲＢ５１５の無効化活性を評価した。ＲＢ５１５は、低いモル過剰において、両方の基質における両方のアゴニストに対するＲＢ５７１の抗ＧＰＶＩ活性を有効に無効化した（図３０及び図３１）。ＲＢ５１５によってＲＢ５７１活性を完全に無効化するために必要なモル過剰は、インビトロにおいてＲＢ００７によってＲＢ００６を完全に無効化するために必要な量より少ない（無効化に必要なＲＢ００７とＲＢ００６との比が４：１であるのに対して、ＲＢ５１５とＲＢ５７１との比は２：１又はそれ以下のモル比である）。このことは、ヒト及び他の種において、インビボでのＲＢ５１５によるＲＢ５７１の無効化が成功する可能性が高いことを示唆している。

Claims (28)

  1. 第１の単離された核酸配列を含むＧＰＶＩリガンドであって、
    前記ＧＰＶＩリガンドは、グリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合するものであり、
    前記ＧＰＶＩリガンドは、５’から３’の方向に、第１の軸部、第１の環、第２の軸部、第２の環、第３の環、第３の軸部、及び、第４の環を含む二次構造を含み、
    前記第４の環がＵＡＡを含むことを特徴とするＧＰＶＩリガンド。
  2. 前記第２の環がスペーサで置換されたことを特徴とする請求項１のＧＰＶＩリガンド。
  3. 前記第１の核酸が少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１又は２のＧＰＶＩリガンド。
  4. 前記ＧＰＶＩリガンドが担体に接合したものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項のＧＰＶＩリガンド。
  5. 前記担体が親水性部位であることを特徴とする請求項４のＧＰＶＩリガンド。
  6. 前記親水性部位がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子であることを特徴とする請求項５のＧＰＶＩリガンド。
  7. 前記ＧＰＶＩリガンドが修飾されたホスフェート骨格を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項のＧＰＶＩリガンド。
  8. 前記ＧＰＶＩリガンドが配列番号６９の配列を含み、
    配列番号６９の位置１１の２’Ｏ−メチルＧと、位置１２の２’Ｏ−メチルＣとの間にスペーサが組み込まれていることを特徴とする請求項１のＧＰＶＩリガンド。
  9. 前記ＧＰＶＩリガンドが修飾されたホスフェート骨格を含むことを特徴とする請求項８のＧＰＶＩリガンド。
  10. 前記ＧＰＶＩリガンドがポリエチレングリコール部位をさらに含むことを特徴とする請求項８又は９のＧＰＶＩリガンド。
  11. 前記ＧＰＶＩリガンドが、ＲＢ５６９、ＲＢ５７０及びＲＢ５７１からなる群より選択されることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項のＧＰＶＩリガンド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか１項の前記ＧＰＶＩリガンドを含むことを特徴とする医薬品組成物。
  13. ＧＰＶＩリガンドに特異的に結合する調節因子であって、
    前記調節因子は第２の核酸配列を含み、
    前記ＧＰＶＩリガンドはグリコプロテインＶＩ（ＧＰＶＩ）に結合するものであり、
    前記ＧＰＶＩリガンドは、５’から３’の方向に、第１の軸部、第１の環、第２軸部、第２の環、第３の環、第３の軸部及び第４の環を含む二次構造を含む第１核酸配列を含み、
    前記第４の環がＵＡＡを含むことを特徴とする調節因子。
  14. 前記第２の核酸配列が約１０個〜約５０個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１３の調節因子。
  15. 請求項１３又は１４の調節因子を含むことを特徴とする医薬品組成物。
  16. 配列番号８４の配列を含むことを特徴とする調節因子。
  17. 前記調節因子がＲＢ５１５であることを特徴とする請求項１６の調節因子。
  18. 請求項１３〜１７のいずれか１項の調節因子を含むことを特徴とする医薬品組成物。
  19. 血小板を介してもたらされる病気を治療するための治療的有効量のＧＰＶＩリガンドの使用であって、必要性のある接種者に治療的有効量のＧＰＶＩリガンドを投与するステップを含むことを特徴とする使用。
  20. 前記血小板を介してもたらされる障害は、血管障害、脳血管障害、血小板を介してもたらされる炎症性障害、糖尿病関連障害、又は、癌からなる群より選択されることを特徴とする請求項１９の使用。
  21. 前記血管障害は、急性冠動脈症候群、血栓症、血栓塞栓症、末梢血管疾患及び一過性脳乏血発作からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０の使用。
  22. 前記脳血管障害は、一過性脳乏血発作、虚血性脳血管障害及び塞栓症からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０の使用。
  23. 前記血小板を介してもたらされる炎症性障害は、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎及び強皮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０の使用。
  24. 前記糖尿病関連障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性の血管症、アテローム性動脈硬化、虚血性脳血管障害、末梢血管疾患、急性腎損傷及び慢性腎不全からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０の使用。
  25. 前記癌が、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌、脳腫瘍、骨癌及び肝臓癌からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０の使用。
  26. 必要性がある接種者における血小板機能を調節するのためのＧＰＶＩリガンドの使用であって、有効量のＧＰＶＩリガンドを接種者に投与するステップを含むことを特徴とする使用。
  27. 前記接種者は心臓治療を受けていることを特徴とする請求項２６の使用。
  28. 接種者に調節因子を投与するステップをさらに含み、
    前記調節因子がＧＰＶＩリガンドに特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１９〜２７のいずれか１項の使用。
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