JP2012528147A - ヒノキ多糖体を含有する皮膚外用剤組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物に関し、より詳細には、ヒノキ多糖体を含有することによって、コラーゲンの生成を促進し、皮膚弾力及びしわを改善し、メラニン生成を抑制し、皮膚美白効果に優れているだけでなく、角質形成細胞分化を促進して皮膚保湿力を向上させ、抗炎症及び皮膚再生効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、ヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物に関し、より詳細には、ヒノキ多糖体を含有することによって、コラーゲンの生成を促進し、皮膚弾力及びしわを改善し、メラニン生成を抑制し、皮膚美白効果に優れているだけでなく、角質形成細胞分化を促進し、皮膚保湿力を向上させ、抗炎症及び皮膚再生効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。

人間の皮膚は、年を取るに伴い、様々な内的、外的要因によって変化を経験する。すなわち、内的には、新陳代謝を調節する各種ホルモンの分泌が減少し、免疫細胞の機能と細胞の活性が低下し、生体に必要な免疫タンパク質及び生体構成タンパク質の生合成が減少するようになり、外的には、オゾン層の破壊に起因して太陽光線のうち地表に到逹する紫外線の含量が増加するようになり、環境汚染がさらに激しくなるにつれて、自由ラジカル及び活性有害酸素などが増加することによって、皮膚の厚さが減少し、しわが増加し、弾力が減少するだけでなく、皮膚血色もくすんだ色を呈するようになり、皮膚トラブルがしばしば発生し、染みとそばかす及び斑点も増加するなどさまざまな変化を起こすようになる。

老化が進行されるほど皮膚を構成する物質であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、及び糖蛋白質の含有量並びに配列が変わるかまたは減少する症状が現われ、自由ラジカル及び活性有害酸素による酸化的ストレスを受けるようになる。また老化の進行、または紫外線により、皮膚を構成する大部分の細胞では、炎症を起こすものと知られている炎症性サイトカイン（proinflammatory cytokine）を生成する酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２, cyclooxygenase）の生合成が増加し、これらの炎症性因子により皮膚組職を分解する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ, Matrix metalloproteinase）の生合成が増加し、ｉＮＯＳ（inducible nitric oxide synthase）によるＮＯ（nitric oxide）生成が増加するものと知られている。すなわち自然的に進行される内因性老化による細胞活性の減少及び微細炎症によって基質物質の生合成が減少し、さまざまな有害環境によるストレスの増加及び太陽光線による活性酸素種の増加のような外的要因によって分解及び変性が加速化し、皮膚基質が破壊され、薄くなり、そのため、皮膚老化の諸症状が現われる。したがって、このような老化の現象を防止し、改善させることができる活性成分について多くの研究が行われていることが現実である。

人間の皮膚色を決定するには、さまざまな要因が関与するが、それらのうちメラニン色素を作るメラノサイト（melanocyte）の活動性、血管の分布、皮膚の厚さ及びカロチノイド、ビリルビンなどの人体内外の色素含有有無などの要因が重要である。

これらのうち特に最も重要な要因は、人体内のメラノサイトでチロシナーゼなどの様々な酵素が作用して生成されるメラニンという黒色色素である。このメラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレスなどと関連した生理的要因及び紫外線の照射などのような環境的要因などが影響を及ぼす。

身体皮膚のメラニン細胞で生成されるメラニン色素は、黒い色素とタンパク質の複合体形態を有するフェノール系高分子物質であって、太陽から照射される紫外線を遮断し、真皮以下の皮膚器官を保護すると同時に、皮膚生体内に生じた自由ラジカルなどを制御するなど皮膚内のタンパク質と遺伝子を保護する有用な役目を担当する。

このように皮膚の内部や外部のストレス的刺激によって生じたメラニンは、ストレスが消えても、皮膚角質化を通じて外部に排出される前までは消えない安定的な物質である。しかし、メラニンが必要以上に多く生成されれば、染みやそばかす、斑点などのような過色素沈着症を誘発し、美容上、良くない結果をもたらす。

近年、東洋圏の女性は、白玉のように白くて且つきれいな皮膚を好み、これを美の重要な基準にしているので、過色素沈着に対する改善及び美容上、問題を解決しようとする要求が増えるようになった。

このような要求に応じて、従来からアスコルビン酸、コウジ酸、アルブチン、ヒドロキノン、グルタチオンまたはこれらの誘導体、またはチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して使用して来たが、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性問題、化粧料に配合時に現われる剤形及び安定性の問題などに起因してその使用が制限されている。

皮膚のうち最外郭に位置する表皮（epidermis）の最も重要な機能は、外部からの多様な刺激（化学物質、大気汚染物質、乾燥な環境、紫外線などの物理及び化学的刺激因子）に対する防御と、皮膚を通じた体内水分の過度な発散を防止する保護機能とであり、このような保護機能は、角質形成細胞で構成された角質層が正常に形成されている時にのみ、その機能を維持することができる。表皮のうち、最も外側に存在する角質層（Stratum corneum, horney layer）は、角質形成細胞から形成され、分化が完結された角質細胞とそれを取り囲む脂質層で構成されている。角質細胞は、表皮の最下層で持続的に増殖（proliferation）する基底細胞（basal cell）が段階的に形態及び機能上の変化を経て、皮膚表面まで上昇した特徴的な細胞であり、一定期間が経過すれば、古い角質細胞は皮膚から脱落し、新しい角質細胞がその機能を担当するようになり、このような繰り返し的な一連の変化過程を「表皮細胞の分化」または「角化（keratinization）」と呼ぶ。角化過程中に角質形成細胞は、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factor；ＮＭＦ）と細胞間脂肪質（セラマイド、コレステロール、脂肪酸）を生成しながら角質層を形成し、角質層が堅固性と柔軟性を有するようにして、皮膚障壁（skin barrier）としての機能を保有するようにする。

しかし、このような角質層は、過度な洗顔や、お風呂などの生活習慣的要素や、乾燥な大気、汚染物質などの環境的な要因、そしてアトピー性皮膚や老人性皮膚のような内因性疾患などに起因してその機能が損失されやすい。実際に、現代になってさらに増加した様々な要因によって、最近には、乾燥皮膚症状及びこれによる諸障害を訴える人々がますます増加している傾向にある。したがって、適切な皮膚水分を維持するために、外部から水分を供給するか、または体内からの水分損失を防止するための研究が多く進行されて来て、実際に水分保有能力がある様々な種類の保湿剤（moisturizer）が開発され、主に化粧品領域において多く使用されている。

しかし、生活環境の中に人間に対する危害要因がますます増加し、老齢人口が急激に増加するに伴い、角質層の生成−脱落速度（turnover rate）が遅くなり、角質形成細胞の脂質合成能力が低下するか、または、表皮で正常な細胞の***、成熟及び分化が円滑に行われないため、角質層の保湿因子と脂質の量が減少し、正常な角質層の機能を維持しない状態、すなわち皮膚障壁機能が瓦解された状態の皮膚を持っている人々がますます増加する傾向にある。

このような非正常的な表皮細胞の***、分化に起因して、皮膚は、皮膚乾燥症、アトピー、乾癬などの多様な皮膚疾患を誘発するようになり、このような疾患は、水分保有機能のみを有する通常的な保湿剤だけでは、その症状を若干緩和させることはできるが、根本的な治癒を期待することは難しい実情である。

皮膚疾患は、人間を含む動物の皮膚で現われるすべての異常所見を意味する。それらのうち、炎症性皮膚疾患というのは、皮膚上皮内に一連の炎症反応を起こす多様な刺激要因によってかゆみ、むくみ、紅斑、剥脱などのような一連の臨床的兆候と症状が誘発される疾患を意味する。

炎症性皮膚疾患としては、アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）、接触性皮膚炎（contact dermatitis）、脂漏性皮膚炎（seborrhoic dermatitis）、にきびなどが知られている。

現在までは、上記のような炎症性皮膚疾患の治療のために、主に抗ヒスタミン剤、ビタミン軟膏、副腎皮質ホルモン剤が使用されているが、その効果が一時的な場合が大部分であり、副作用が激しい場合も多い。

また、皮膚は、外部から身体を保護する防御膜としての役目をする。皮膚に傷ができれば、生体の自然治癒作用により傷部位を血液が満たすようになり、血小板の顆粒減少とハーゲマン因子（hageman factor）の活性化が始まり、傷治癒過程が進行される。血液の凝固は、臨時防御作用として、露出した傷組職を保護し、治癒過程中に細胞が移動することができる基盤を提供する（Lee SH AS, Jung SG. Skin Barrier. Seoul: Ryo Moon Gak, 2004）。

傷治癒過程は、大きく、炎症期、再上皮化期、増殖期及び成熟期の４段階に区分される。炎症期の間には、傷部位に免疫細胞が出現するが、この細胞は、血管から傷部位に移動したものである。次いで、顆粒組職形成を誘導する成長因子と信号伝逹物質が分泌される。重大な感染がない状態では、炎症期が一般的に短く進行される（Care KRGf. Advances in wound Care. Seoul: Korea Medical Book Publisher, 2002）。炎症期は、傷治療過程に必要な段階である。

増殖期は、再上皮化期と類似に起きるが、傷部位で顆粒組職が形成される特性を示す（Kubo KKY. Spongy matrix of hyaluronic acid and collagen as a cultured dermal substitute: evaluation in an animal test. J Artif Organs 2003;6(1):64-70）。顆粒組職は、線維芽細胞（fibroblasts）及び炎症性細胞（inflammatory cells）とともに、未成熟コラーゲン（immaturity collagen）、フィブロネクチン（fibronectin）及びヒアルロン酸（hyaluronic acid）などの細胞外基質構成要素の組合よりなり、この顆粒組職が傷部分を速く満たし、組織的な構造を備えることが傷治療に重要である。剥けた傷表面が角質形成細胞（keratinocytes）層により覆われ、これにより、新しい表皮が生成され、上皮層が再建される。細胞は、傷の端部または残された皮膚の真皮残余物で傷を通じて浮び上がって、かさぶたの下部と生きている結合組職の上部を通じて移住を始める。

傷の再上皮化が完了すれば、結合組織の増加と再編を通じて傷面積が減少する一連の過程が進行される。その後、成熟期間には、回復期組職の固まった細胞と毛細管が少しずつ消えるようになり、このような組職が過形成されるか、または正常的に分解されない場合、傷あとができる。これが一般的な傷治療過程である。傷治癒過程では、傷を速く治療することだけでなく、副作用や傷あとなしに治療することが重要なので、炎症の抑制と成長因子の発現調節を通じて組職細胞が均衡的に満たされることがさらに重要であり、このような効能を有する物質を捜そうとする努力が続いて進行されている。

ヒノキに対する研究は、ヒノキ精油に含有されているピトンチド成分の効果に集中している。ピトンチドというのは、植物を意味する「ピトン（phyton）」と殺すという意味を有する「チド（cide）」の合成語であって、植物性殺菌素とも言い、木が有する特有の香で「山林香」その自体であると言える。これは、植物が病源菌、害虫、かびに抵抗するために噴き出すかまたは分泌する物質であって、森林浴を通じてピトンチドを飲めば、ストレスが解消され、腸と心肺機能が強化され、殺菌作用をも行われる。このようなピトンチドは、テルペンを含めたフェノール化合物、アルカロイド成分、グリコシドなどで構成されていて、有機溶媒を利用して抽出が可能な物質である。したがって、ヒノキのピトンチドは、ヒノキから抽出したヒノキ精油に含有される。

一般的なヒノキ抽出物を含有し、皮膚状態を改善する化粧料組成物に利用された事例があるが、ヒノキ多糖体並びにその抗老化、皮膚しわ改善、皮膚弾力改善、皮膚美白、皮膚保湿、皮膚乾燥疾患の予防及び改善、抗炎症、及び皮膚再生などの効能については知られていない状況である。

これより、本発明者は、外部の有害環境や紫外線から皮膚を保護し、皮膚老化を防止し、皮膚状態を改善させることができる成分を捜すために努力した結果、皮膚外用剤組成物に有効成分としてヒノキ多糖体を含む場合、皮膚弾力としわ改善、美白、保湿、炎症反応抑制及び皮膚再生効果に優れていることを知見し、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、ヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明では、ヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物を提供する。

本発明によるヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物は、コラーゲンの生成を促進し、メラニン生成を抑制し、角質形成細胞の分化を促進し、皮膚炎症反応と皮膚刺激を改善することによって、抗老化、皮膚しわ改善、皮膚弾力改善、皮膚美白、皮膚保湿、皮膚乾燥疾患の予防及び改善、抗炎症、皮膚再生などの皮膚トラブル予防または改善効果に非常に優れている。

図１は、試験管内の傷治癒測定法を利用してヒノキ多糖体塗布前後の傷治癒効果を示す写真である。

本発明は、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa）多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物を提供する。

本発明のヒノキは、ヒノキ科常緑高木であって、高さが５０ｍ、直径が２ｍ程度であり、ジュニパーとも言う。枝は水平に広がって、円錐形状の俊冠を形成し、樹皮は、赤褐色であり、縦に割れてはげる。真っ直ぐに成長し、木材の用途が非常に広く、主に建築材、土木材、船または彫刻材などに使用されている。

本発明の有効成分であるヒノキ多糖体は、コラーゲンの生成を促進し、ＭＭＰ−１の発現を抑制し、皮膚老化を防止し、皮膚しわと弾力を改善する。また、メラニン生成を抑制し、皮膚美白効果に優れていて、角質形成細胞の分化を誘導することによって、皮膚保湿力を増加させて、皮膚乾燥疾患を予防及び改善するだけでなく、炎症反応誘発因子によって誘導されたシクロオキシゲナーゼ−２の生合成を抑制し、皮膚炎症と刺激を低減し、皮膚トラブルを緩和する効果に優れている。

したがって、本発明のヒノキ多糖体を含有する皮膚外用剤組成物は、抗老化、皮膚しわ改善、皮膚弾力改善、皮膚美白、皮膚保湿、アトピーなどの皮膚乾燥疾患の予防及び改善、抗炎症、皮膚再生などの皮膚トラブル予防または改善用途に非常に有用である。

一般的なヒノキ抽出物は、水またはエタノール水溶液などでヒノキの多様な成分を抽出した混合抽出物であって、これに含まれた葉緑素などに起因して、皮膚外用剤組成物に使用時に、変色や色素沈着などの問題を惹起させる。しかし、本発明のヒノキ多糖体は、ヒノキ抽出物に特殊な分離工程を適用することによって、主に多糖体だけよりなるので、上記ヒノキ抽出物の問題点を解決することができる。

本発明のヒノキ多糖体は、当業界に公知された方法により製造されることができ、その製造方法は、特に限定されない。具体的な例として、乾燥したヒノキ葉から葉緑素を除去するために、溶媒抽出方法を使用する。抽出溶媒としては、ヘキサン、エタノール及びメタノールよりなる群から選択された１種以上を使用することが好ましく、化粧料への適用時に、残存量によって惹起されることがある毒性問題を防止するためにエタノールを使用することがより好ましい。

乾燥したヒノキ葉に上記溶媒を入れ、常温で充分に撹拌した後、遠心分離を通じて葉緑素が溶解されている溶媒を除去する。得られたヒノキ葉の残渣を乾燥すれば、葉緑素が含有されていないヒノキ葉を得ることができる。

上記で製造されたヒノキ葉の残渣から水溶性活性成分を抽出するために熱水抽出させる。熱水抽出は、３０〜４０℃の温度で行うことが好ましい。これは、４０℃超過時には、高温に起因して熱変性が生ずることがあり、３０℃未満の場合は、多糖体が充分に抽出されないからである。また、熱水抽出時間は、６〜８時間であることが好ましい。これは、８時間超過時には、微生物による汚染が発生することがあり、６時間未満なら、多糖体が充分に抽出されないからである。熱水抽出して得られた抽出液は、濾過機器を利用して濾過した後、減圧濃縮する。

上記熱水抽出物で多糖体のみを分離するために、限外濾過及びエタノール沈殿反応を行う。多糖体は、１０万ダルトン（dalton）以上の分子量を有していて、これは、遊離タンパク質の分子量よりさらに大きい値である。このような分子量の差異を利用して限外濾過を行うことによって、ヒノキ多糖体の含量を増加させることができる。また、限外濾過は、連続式工程として、低分子量物質の分離及び濾過液の濃縮を同時に進行することができると共に、工程が常温で行われるため、熱変性の問題が発生しないという長所を有する。

次いで、上記限外濾過濃縮液にエタノールを徐々に加え、エタノール沈殿反応を進行する。この際、エタノールの添加速度は、１００〜２００ ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、２００ ｍＬ／ｍｉｎを超過すれば、最終生成粒子の大きさが非常に大きくなるか、または、かたまることがある。エタノール沈殿反応が完了すれば、エタノールを除去し、得られたヒノキ多糖体を４０〜５０℃で真空乾燥すれば、パウダー形態のヒノキ多糖体を得ることができる。

本発明のヒノキ多糖体は、皮膚外用剤組成物全体重量に対して０．００１〜１０重量％に含有されることが好ましい。その含量が０．００１重量％未満なら、効果が非常に弱く、活性成分としての作用を期待しにくいし、１０重量％を超過すれば、剤形安定性に問題が起こることがあるからである。

本発明による化粧品の外形は、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含む。これは、局所適用に適したすべての剤形であって、例えば、溶液、ゲル、固体、混練無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球または、イオン型（リポソーム）及び非イオン型の小胞分散剤の形態で、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシルステッキの形態で提供されることができる。これらの組成物は、当該分野の通常的な方法により製造されることができる。また、本発明による組成物は、泡沫（foam）の形態で、または圧縮された推進剤をさらに含有するエアロゾル組成物の形態でも使用されることができる。

本発明の化粧品は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発布剤（foaming agent）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型もしくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性もしくは親油性活性剤、脂質小胞、または化粧品に通常的に使用される任意の他の成分のような化粧品学または皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤を含むことができる。上記補助剤は、化粧品学または皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入する。

本発明のヒノキ多糖体を含む皮膚外用剤は、その剤形において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル及びボディーエッセンスなどの化粧料に剤形化されることができる。

本発明による皮膚外用剤組成物は、薬剤学的組成物であることができる。上記薬剤学的組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／または緩衝剤などの薬剤学的補助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含むことができる。上記薬剤学的組成物は、ローション、クリーム、軟膏、またはジェルなどに剤形化されることができる。

上記薬剤学的組成物は、経皮投与されることが好ましい。上記薬剤学的組成物の有効成分であるヒノキ多糖体の投与量は、治療される対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断とによって変わる。このような因子に基礎した投与量の決定は、当業者の水準内にある。一般的に、投与量は、略０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０００ｇ／ｋｇ／日の範囲である。

以下、実施例及び試験例により本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、これらの実施例及び試験例は、本発明に対する理解を助けるために例示の目的だけで提供されるものに過ぎず、本発明の範疇及び範囲が下記例によって制限されるものではない。

［製造例１］ヒノキ多糖体の製造
乾燥したヒノキ葉１ｋｇにエタノール１０Ｌを添加し、常温で２４時間撹拌した後、遠心分離を通じて溶媒を除去した。製造されたヒノキ葉の残渣を３０℃で７時間熱水抽出し、得られた熱水抽出液は、フィルタープレス機器を利用して濾過（珪藻土濾過）及び回収した後、初期体積の１／１０となるように５０℃で減圧濃縮した。次いで、上記濃縮液を限外濾過（分子量ＣＵＴ ＯＦＦ：１，０００ダルトン）し、低分子量の遊離タンパク質を除去し、最終限外濾過濃縮液の５倍体積のエタノールを１００ｍＬ／ｍｉｎの速度で徐々に加えて、エタノール沈殿反応を進行した。沈殿されたヒノキ多糖体を４５℃で真空乾燥し、パウダー形態のヒノキ多糖体（５３ｇ）を得た。

［試験例１］Ｉ型プロコラーゲン生成分析（Type I Procollagen assay）
ヒト正常線維芽細胞を１０⁵個の濃度で、１２孔平板培養器で培養した後、製造例１で得たヒノキ多糖体を１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍの濃度で含む培地に交替した。陽性対照群としてＴＧＦ−β（Human Transforming Growth Factor-β1, Roche Co.）を使用した。培養３日目、細胞を収穫し、ＥＬＩＳＡ方法で生成されたＩ型プロコラーゲン（type I procollagen）の量を定量した。上記ヒノキ多糖体を含まない対照群のプロコラーゲンの量を０、陽性対照群を１００に設定し、各測定値との比較値を算出した。その結果は、下記表１に示した。

上記表１から分かるように、ヒト正常線維芽細胞単層培養システム（Normal human fibroblast monolayer culture system）で、ヒノキ多糖体は、陰性対照群に比べてＩ型プロコラーゲン生成を濃度依存的に促進させた。したがって、本発明のヒノキ多糖体は、コラーゲン生成を促進することによって、人体皮膚の老化によって発生するコラーゲンの減少現象を緩和させて、抗老化効果に優れていることが分かる。

［試験例２］ＭＭＰ−１生合成抑制分析
ヒト正常線維芽細胞を１０⁵個の濃度で、１２孔平板培養器で培養し、紫外線Ｂを４０ｍＪ／ｃｍ²で照射した後、製造例１で得たヒノキ多糖体を１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、または５０ｐｐｍで含む培地に交替した。培養２日目、細胞を収穫し、ＥＬＩＳＡ方法で生成されたＭＭＰ−１（matrix metalloproteinase Ｉ）の量を定量した。陽性対照群としては、レチノイン酸（Retinoic acid；ＲＡ、Ｓｉｇｍａ．米国）を使用した。試験物質を含まず、紫外線を照射しない対照群を１００にして測定した値との比較値を算出し、その結果を下記表２に示した。

上記表２から分かるように、ヒト正常線維芽細胞単層培養システムで、ヒノキ多糖体は、紫外線Ｂによって誘導されるＭＭＰ−１の生合成を有意的に抑制した。また、上記ヒノキ多糖体を５０ｐｐｍの濃度で処理した場合には、ＵＶを照射しない対照群と類似の水準までＭＭＰ−１生合成を抑制した。

したがって、本発明によるヒノキ多糖体は、内的老化または外的環境要因によって発生する皮膚組職分解酵素であるＭＭＰ−１の生合成を阻害することによって、皮膚基質が破壊され、薄くなる皮膚老化の諸症状を予防し、皮膚内のコラーゲン減少を抑制し、皮膚しわを改善することが分かる。

［試験例３］人体皮膚を対象にした皮膚しわ改善効果
３０〜５０才の顔面にしわがある試験対象者４０名に対して下記表３に記載した組成のヒノキ多糖体を含有する栄養クリーム（実施例１）及びヒノキ多糖体を含有しない栄養クリーム（比較例１）を利用して皮膚しわ改善効果を比較評価した。

実験は、被検者の顔面の左部には、実施例１、顔面の右部には、比較例１を３ヶ月間塗布するようにした。栄養クリーム使用前の顔面両方部の皮膚状態を測定した後、使用３ヶ月後、同一部位での皮膚状態を再測定し、皮膚しわの変化を測定した。より具体的には、２４℃、相対湿度４０％の恒温恒湿室で目尻部位のしわをレプリカ（replica）で採取し、ビジオメーターシステム（Visiometer system、Ｃ＋Ｋ社）で皮膚しわを測定した。皮膚しわの変化量は、下記数式１によって計算した。

上記数式１によって皮膚しわの変化量を計算した結果、ヒノキ多糖体を含有しない比較例１を使用した部位の皮膚しわは、５．３±７％（平均±標準偏差）の減少値を示すが、ヒノキ多糖体を含有する実施例１を使用した部位の皮膚しわは、３０±８％の減少値を示した。

上記結果から分かるように、本発明のヒノキ抽出物を含有する実施例１は、これを含有しない比較例１より約６倍の皮膚しわを減少させることが分かった。したがって、本発明のヒノキ抽出物を含有する組成物は、優れた皮膚しわ改善効果を示した。

［試験例４］人体での皮膚弾力改善効果実験
上記実施例１及び比較例１の皮膚弾力改善効果を測定した。３０〜５０才の女性４０名を対象にして２個グループに分けて、各グループに上記実施例１及び比較例１の栄養クリームを毎日２回ずつ１２週間顔面に塗布した後、皮膚弾力測定器（Cutometer SEM 575, C+Kエレクトロニック社, ドイツ）を利用して皮膚弾力を測定した。

上記比較例１を使用した部位の皮膚弾力数値は、０．２１±０．１４（平均±標準偏差）を示すが、実施例１を使用した部位の弾力数値は、０．３０±０．１０を示した。

上記結果から分かるように、本発明のヒノキ多糖体を含有する実施例１は、ヒノキ多糖体を含有しない比較例１より約３０％向上した皮膚弾力増進効果を示した。

［試験例５］ねずみの色素細胞を利用したメラニン生成抑制効果
本発明のヒノキ多糖体のメラニン生成抑制効果を調べるために、ねずみの色素細胞を利用した。先に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス来由のねずみ色素細胞（Ｍｅｌ−Ａｂ ｃｅｌｌ）（Dooley, T. P. et al, Skin pharmacol, 7, pp188-200）を、ＤＭＥＭ（Dulbeccos modified Eagles media）に、１０％牛胎盤血清、１００ｎＭの２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール（tetradecanoylphorbol）−１３−アセテート、及び１ｎＭのコレラ毒素を添加した培地で、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で培養した。培養したＭｅｌ−Ａｂ細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで取り外し、２４−孔プレートに１０⁵細胞／孔（cells/well）の濃度で細胞を培養した後、二日間から３日連続で１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、または１００ｐｐｍのヒノキ多糖体を加えて培養した。この際、アルブチン（Sigma, 米国）を陽性対照群として使用した。次に、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を溶かし、４００ｎｍで吸光度を測定した。測定した吸光度を利用して下記数式２によってメラニン生成抑制率（％）を計算し、その結果を下記表４に示した（Dooleyの方法）。

上記表４に示されたように、本発明によるヒノキ多糖体は、濃度依存的にメラニン生成を抑制し、１００ｐｐｍでは、同一濃度のアルブチンと類似の水準のメラニン生成抑制率を示すことを確認することができた。したがって、本発明のヒノキ多糖体は、メラニン生成を効果的に抑制し、優れた皮膚美白効果を示すことが分かる。

［試験例６］人体皮膚に対する美白効果
本発明のヒノキ多糖体の人体皮膚に対する美白効果を調べるために、下記のような実験を行った。まず、元気な１２名の男性を対象にして被検者の上膊部位に直径１．５ｃｍの孔が穿設された不透明テープを付着した後、各被検者の最小紅斑量（Minimal Erythema Dose）の１．５〜２倍程度の紫外線（ＵＶＢ）を照射し、皮膚の黒化を誘導した。

上記紫外線の照射後、試験物質であるヒノキ多糖体とヒドロキノンをそれぞれ塗布し、１ヶ所は、対照群として溶媒だけを塗布し、１０週間状態変化を観察した。皮膚色は、色差計ＣＲ２００２（日本国、ミノルタ社）で測定した。次に、上記各試験物質の塗布開始時点と塗布完了時点（１０週後）での皮膚色の差異（△Ｌ＊）を下記数式３によって計算し、その結果を下記表５に示した。

皮膚美白効果は、試料塗布部位と対照群部位の△Ｌ＊の比較で判定するが、△Ｌ＊値が２程度の場合は、沈着された色素の美白化が明らかな場合であり、１．５程度以上なら美白効果があると判定することができる。

上記表５に示したように、本発明によるヒノキ多糖体は、ヒドロキノンと類似の程度に皮膚色を明るくすることを確認した。したがって、本発明のヒノキ多糖体は、紫外線によって生成された色素沈着を改善し、皮膚美白効果に優れていることが分かる。

［試験例７］ヒト角質形成細胞の分化誘導
角質形成細胞及びヒト皮膚細胞株（ＨａＣａＴ）の分化時に生成されるＣＥ（Cornified Envelop）の量を測定し、本発明によるヒノキ多糖体の細胞分化促進効果を調べた。

一次培養したヒト角質形成細胞を培養用フラスコに入れ、底に付着させた後、カルシウムとヒノキ多糖体を濃度別に培養液に添加し、細胞が底面積の７０〜８０％程度成長するまで５日間培養した。この細胞を収穫し、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）で洗浄した後、２％ＳＤＳ（Sodium Dodecyl Sulfate）と２０ｍＭ濃度のＤＴＴ（Dithiothreitol）を含有する１０ｍＭ濃度のトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍＬを加えて、ソニケーション（sonication）、ボイリング（boiling）、遠心分離した沈殿物をさらにＰＢＳ １ｍＬに懸濁させて３４０ｎｍでの吸光度を測定した。これとは別に、上記ソニケーション後の溶液の一部を取って、タンパク質含量を測定し、細胞分化程度の評価時に基準にした。低カルシウム（０．０３ｍＭ）処理群と高カルシウム（１．２ｍＭ）処理群をそれぞれ陰性／陽性対照群とし、低カルシウム濃度で得た試験結果を１００とし、測定した値との比較値を計算し、下記表６に示した。

上記表６の結果から分かるように、本発明によるヒノキ多糖体は、角質形成細胞分化を濃度依存的に促進することを確認することができた。したがって、本発明のヒノキ多糖体は、角質形成細胞の分化を促進させ、表皮のターンオーバー周期を正常化させて、皮膚保湿を強化することが分かる。

［試験例８］ヒト角質形成細胞のトランスグルタミナーゼ（transglutaminase）の発現効果
ヒト角質形成細胞を９６孔細胞培養プレートの各孔に５ｘ１０⁴個を入れ、２４時間付着させた。付着させた皮膚細胞株に試験物質を処理した後、２日が経過してから培地を除去し、−２０℃冷蔵庫に保管した。凍結−解凍（Freeze-thawing）を２回繰り返して、物質処理した細胞を破壊させた後、−２０℃に保管したアセトン：エタノール（１：１、ｖ／ｖ）を処理し、４℃で３０分間放置し、細胞を固定させた。その後、室温に放置し、有機溶媒が蒸発されるようにし、ブロッキング（１％牛血清アルブミン）、トランスグルタミナーゼ抗体（primary）、ＨＲＰアンチ−マウス抗体（secondary）を処理し、発色は、ＯＰＤ（σ−phenyldiamine）を添加して行った。発現量は、４９０ｎｍで吸光度を測定し、補正は、６３０ｎｍでバックグラウンド（background）を測定して行った。低カルシウム（０．０３ｍＭ）処理群と高カルシウム（１．２ｍＭ）処理群をそれぞれ陰性／陽性対照群とし、低カルシウム濃度に試験物質を添加して実施した結果を１００とし、測定した値との比較値を計算し、下記表７に示した。

上記表７の結果から、本発明によるヒノキ多糖体は、陰性対照群に比べてトランスグルタミナーゼの発現を濃度依存的に向上させ、ヒノキ多糖体を１００ｐｐｍで使用した処理群は、陽性対照群である高カルシウム処理群より優れたトランスグルタミナーゼの発現量を示した。したがって、本発明のヒノキ多糖体が角質形成細胞のトランスグルタミナーゼ発現を促進させることによって、優れた皮膚保湿効果を示すことが分かった。

［試験例９］人体での皮膚保湿力増加
皮膚乾燥症を示す５０〜６０代の大人男女５０名を２個グループに分けて、各グループに実施例１及び比較例１を毎日２回ずつ４週間顔面に塗布した。塗布開始前と、塗布後１週、２週、４週が経過した時点及び塗布を中止してから２週経過（全体で６週経過）後に、恒温、恒湿条件（２４℃、相対湿度４０％）でコルネオメーターで皮膚水分量を測定し、試験結果は、塗布開始前に測定したコルネオメーター値を基準にして一定期間処理後の測定値の増加分を百分率で表示した。その結果は、下記表８に示した。

上記表８から分かるように、ヒノキ多糖体が含有された実施例１を塗布した群は、すべての測定時点で比較例１を塗布した群に比べて皮膚水分量がさらに増加した。また、実施例１の栄養クリームの塗布を中止した２週後（全体で６週経過）に皮膚水分を測定した数値は、塗布１週経過後の数値と類似に現われたが、比較例１を塗布した群は、塗布を中止する場合は、水分増加率が急速に低下した。したがって、本発明のヒノキ多糖体を含有する組成物は、皮膚水分量を増加させるだけでなく、塗布を中止する場合にも、一定期間の間に皮膚水分を持続的に維持させることが分かった。

［試験例１０］ＬＰＳ（Lipopolysaccharide）で誘導されたシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の生合成抑制効果
ヒト線維芽細胞を１０⁵個の濃度で１２孔平板培養器に培養した後、ＬＰＳ処理をした後、ヒノキ多糖体を１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍを含む培地に交替した。対照群は、ヒノキ多糖体を処理せず、培養した未処理群である。培養２日目、細胞を収穫し、ウェスタンブロット（Westren blot）方法を使用して生成されたシクロオキシゲナーゼ−２（cyclooxygenase−２、ＣＯＸ−２）の量を定量した。対照群を１００にして濃度計（densitometer）で測定した値との比較値を下記表９に示した。

上記表９の結果から分かるように、本発明によるヒノキ多糖体は、炎症反応誘発因子であるＬＰＳで誘導されたシクロオキシゲナーゼ−２の生合成を濃度依存的に減少させることによって、炎症反応を抑制することが分かった。したがって、ヒノキ多糖体は、皮膚炎症反応を効果的に抑制し、これにより、皮膚トラブルを緩和させる効能にも優れている。

［試験例１１］炎症抑制効能試験（マウスモデル）
テトラデカノイルホルボールアセテート（tetradecanoyl phorbol acetate、ＴＰＡ）誘発性マウス耳炎症モデルは、炎症反応の作用機作と抑制物質の効能を試すために広く使用されている実験方法である（De Young LM et al., Agents and Actions, 26;335-341(1989)）。

ヒノキ多糖体の炎症抑制効能を確認するために、８週齢のＩＣＲ雄性マウス（各群当たり８匹）を準備し、試験群は、ＴＰＡを処理し、８０％エタノール水溶液にヒノキ多糖体が分散された溶液を塗布し、非処理群は、ＴＰＡを処理せず、８０％エタノール水溶液のみを塗布した群であって、陰性対照群は、ＴＰＡを処理し、８０％エタノール水溶液のみを塗布した群であって、陽性対照群は、ＴＰＡを処理し、ヒノキ多糖体の代わりにインドメタシン（indomethacine、Ｓｉｇｍａ、米国）を０．５ｍｇずつ塗布した群に設定した。

製造例１で得たヒノキ多糖体を０．５％の濃度で８０％エタノール水溶液に分散させた後、試験群マウスにＴＰＡ塗布前に２日間一日に２回耳部位に前処理をし、ＴＰＡ塗布３０分後にも、再塗布した。アセトンに２．５μｇ／ｍＬ濃度で溶かしたＴＰＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、米国）を左側の耳に２．５μＬずつ塗布し、皮膚刺激を誘導した。非処理群、陰性対照群及び陽性対照群のマウスも上記設定されたように処理した。ＴＰＡ塗布後、２４時間が経過した時点にマウスを頸椎脱骨法で安楽死させ、左側の耳を一定の広さで採取し、重さを測定した。ＴＰＡ単独処理時に、炎症発生で耳重さが増加するが、試験物質を一緒に塗布する場合、耳重さの増加が低下するが、この際、低下する重さの差異が阻害度である。阻害度（％）は、下記数式４によって計算した。その結果は、下記表１０に示した。

上記表１０から分かるように、ＴＰＡ単独処理群と比べてヒノキ多糖体を処理した試験群は、ＴＰＡによって誘発された炎症反応による耳むくみを有意に抑制した。したがって、本発明のヒノキ多糖体は、皮膚塗布時に抗炎症効果に優れていることが分かった。

［試験例１２］皮膚刺激抑制効能試験（兎モデル）
レチノイン酸（retinoic acid）の場合、皮膚角質層の分化促進、にきび治療、しわ改善効果などの様々な優れた皮膚効能によって化粧品と医薬品に広く利用されている（Fisher et al., J. Investig. Dermatol., 3:61-68(1998)）。しかし、レチノイン酸を皮膚に局所的に適用する場合、初期に刺激感を誘発し、ひいては、皮膚紅斑とむくみを誘発する副作用があるものと報告されている（Varani et al., Arch. Dermatol. Res., 295:255-262(2003)）。これより、レチノイン酸のこのような皮膚刺激を低減するための試みが多方面に進行されている（Kim et al., Toxicol.Letters., 146:65-73(2003)）。一方、ニュージーランド白色兎の場合、様々な皮膚刺激物質に対する反応性に優れていて、個体差異が少なく、皮膚刺激実験に広く使用されている。したがって、本試験例では、レチノイン酸でニュージーランド白色兎に皮膚刺激を誘発させた後、試験物質による皮膚刺激減少程度を評価した。

試験一日前に、雄性ニュージーランド白色兎（体重２．０〜２．５ｋｇ、４匹）の背中部位の毛を除去した。除毛した兎の背中（ｂａｃｋ）に匹当たり２個ずつ対称される４個の適用部位（右側上部−左側上部、右側下部−左側下部）を表示した。また、レチノイン酸（０．０２５％）と製造例１で得たヒノキ多糖体（０．５％）をそれぞれＰＥＧ４００とエタノールの混合溶液（体積比：７／３）に溶かし、試験溶液を製造した。

兎の背中の４個の適用部位にいずれも０．０２５％レチノイン酸溶液（Ｓｉｇｍａ、米国）１００μＬを局所に適用した。適用３０分後に、対称される適用部位の一方には、ヒノキ多糖体（１００μＬ／適用部位）溶液を、他方には、上記混合溶液（１００μＬ／適用部位）のみを処理した。試験溶液をそれぞれ４日間毎日２回ずつ局所適用し、５日目適用部位を目視で観察し、皮膚刺激位を観察し、各実験群の皮膚刺激を累積刺激指数で示した。

上記累積刺激指数は、紅斑を基準にし、紅斑がない場合（０）、目で識別が可能な微弱な紅斑（１）、明瞭な紅斑（２）、赤色が濃い紅斑（３）、深紅色の強い紅斑と痂皮形成（４）の５段階に分けて点数を付加した。

また、レチノイン酸溶液だけを処理した対照群の累積刺激指数を基準にしてレチノイン酸と酸性多糖体溶液を共に処理した実験群の累積刺激指数の減少を阻害度（％）で計算し、皮膚刺激抑制効能の指標にした。その結果を下記表１１に示した。

上記表１１から分かるように、ヒノキ多糖体を処理した実験群は、レチノイン酸のみを処理した実験群より約２７．６％の累積刺激指数が減少した。したがって、本発明のヒノキ多糖体が皮膚刺激の抑制効能に優れていることが分かる。

［試験例１３］試験管内の傷治癒測定法（in vitro wound healing assay）を用いた傷治癒活性
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴ細胞は、韓国細胞部銀行（Korean Cell Line Bank; Seoul, Korea）から分譲されて使用した。ＨａＣａＴ細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ培地に注入し、３７℃、５％ＣＯ₂供給条件を備えた動物細胞培養器で培養した。孔（Well）当たり１．５×１０⁶濃度で用意したＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、細胞単一層を形成させた後、ＨａＣａＴ細胞単一層をｐ２００ピペットチップで「スクラッチ損傷」を誘導した。「スクラッチ損傷」された細胞層を製造例１で得たヒノキ多糖体１０ｐｐｍ濃度で処理した培養培地で２４時間培養し、陰性対照群は、上記ヒノキ多糖体をとかすのに使用したＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）で同量処理し、スクラッチ傷が回復する程度をマイクロイメージビデオカメラ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）が装着された顕微鏡で確認した。その結果を図１に示した。

図１の結果から確認することができるように、陰性対照群で処理された細胞の「スクラッチ損傷」は、２４時間後に相対的に治癒されないまま残っていたのに対し、ヒノキ多糖体で処理された細胞では、傷端部の細胞増殖と移動により「スクラッチ損傷」が治癒され、２４時間後にスクラッチ面積がほとんど復旧された。したがって、本発明のヒノキ多糖体が皮膚傷治癒及び皮膚再生効果に優れていることが分かる。

以下では、本発明による組成物の剤形例を説明するが、これに限定されるものではない。
［剤形例１］柔軟化粧水（スキンローション）

［剤形例２］栄養化粧水（ミルクローション）

［剤形例３］マッサージクリーム

［剤形例４］パック

Claims (10)

1. ヒノキ多糖体を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物。
2. 上記ヒノキ多糖体が組成物全体重量に対して０．００１〜１０重量％で含有されることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
3. 上記組成物が抗老化用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
4. 上記組成物が皮膚しわ改善用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
5. 上記組成物が皮膚弾力改善用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
6. 上記組成物が皮膚美白用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
7. 上記組成物が皮膚保湿用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
8. 上記組成物が皮膚乾燥疾患の予防及び改善用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
9. 上記組成物が抗炎症用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
10. 上記組成物が皮膚再生用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。