KR100680845B1

KR100680845B1 - 신이화로부터 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법 및 이를 이용한 화장품 조성물

Info

Publication number: KR100680845B1
Application number: KR1020060072181A
Authority: KR
Inventors: 배강규; 김은혜; 장선희
Original assignee: 배강규
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2007-02-09

Abstract

본 발명은 신이화로부터 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 피부 보습효과를 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법 및 이를 이용한 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 주요구성은 신이화를 건조시키는 단계와; 상기 건조된 신이화를 에탄올로 추출하여 유기성 저분자화합물들을 제거한 후 유기성 저분자들이 제거된 잔사를 물로 추출하고 농축시켜 수용성 분획을 수득하는 단계와; 상기 수용성 분획에 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시키는 단계와; 상기 침전으로 수득된 물질을 투석 후 농축시켜 당 함량이 99.0% 이상이며 분자량이 5,000 내지 1,500,000달톤를 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

신이화추출, 다당체, 마그놀란, 피부 세포 증식, 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 보습효과, 화장품 조성물

Description

신이화로부터 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법 및 이를 이용한 화장품 조성물{Magnolan extraction method from the flower of Magnolia species and Cosmetic Compositions using Magnolan}

도 1은 본 발명의 신이화로부터 다당체인 마그놀란의 추출·정제과정을 나타낸 공정도.

도 2는 본 발명에 따른 신이화 다당체 추출물의 겔여과 크로마토그래피한 결과를 도시한 그래프.

도 3은 본 발명에 따른 신이화추출 다당체인 마그놀란의 적외선흡수 스펙트럼.

본 발명은 신이화로부터 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 피부 보습효과를 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 신이화로부터 추출된 다당체인 마그놀란을 함유하여 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 피부 보습효과를 갖는 화장품 조성물에 관한 것이다.
이때, 본 발명에서 사용된 마그놀란은 "신이화로부터 추출된 다당체로서, 당함량이 99.0% 이상이며 분자량이 5,000 내지 1,500,000 달톤인 다당체"로 정의한다.

신이화는 목련과의 갈잎큰키나무 목련(Magnolia kobus A. P. DC.), 자목련(Magnolia liliflora DESR.), 백목련(Magnolia denudata DESR.)의 꽃봉오리로 휘발성 정유, flavonoid, alkaloid등이 함유되어 있다.

한의학적인 효능은 비염에 수렴 작용이 있어서 점막 표면을 보호하는 동시에 모세 혈관을 확장시키고, 국부의 혈액 순환을 개선시켜 분비물이 흡수를 촉진시키므로 염증을 가라앉히고 호흡을 원활하게 하고 증상을 완화시킨다. 정유 성분은 진통. 진정 작용이 있으며, 약물 달인 물은 혈압 강하 작용을 보이고, 피부 진균과 포도상 구균의 억제 작용을 나타낸다.

신이화를 이용한 화장품에 관한 공지된 기술로는 대한민국 공개특허공보 2003-0025975호 '신이화추출물을 함유하는 피부면역조절용 조성물' 등이 개시되어 있으나 이는 단순히 신이화의 에탄올 추출물로 아토피 피부 개선에 대한 효능효과시험과 경피수분 손실(TEWL) 정도의 측정만을 수행한 것으로 본 발명과는 그 내용이 상이하며 신이화추출 다당체를 이용한 화장품조성물은 개발된 바 없다.

이에 본 발명의 발명자들은 종래의 발명과는 상이한 신이화추출 다당체인 마그놀란이 화장료 원료로서 우수한 효과를 지님을 발견하였고, 이러한 신이화추출 다당체인 마그놀란을 유효성분으로 하는 화장품 조성물을 개발한 것이다.

본 발명의 목적은 건조된 신이화를 에탄올로 추출된 유기성 저분자화합물를 제외한 남은 잔사를 다시 저급지방족알코올로 침전 농축시켜 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과 및 피부 보습효과를 갖으며, 당 함량이 99.0% 이상이고 분자량이 5,000 내지 1,500,000 달톤을 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신이화로부터 추출된 다당체인 마그놀란을 함유하는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 신이화로부터 마그놀란을 추출하는 방법은, 신이화를 건조시키는 단계와; 상기 건조된 신이화를 에탄올로 추출하여 유기성 저분자화합물들을 제거한 후 유기성 저분자들이 제거된 잔사를 물로 추출하고 농축시켜 수용성 분획을 수득하는 단계와; 상기 수용성 분획에 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시키는 단계와; 상기 침전으로 수득된 물질을 투석 후 농축시켜 당 함량이 99.0% 이상이며 분자량이 5,000 내지 1,500,000달톤를 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

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바람직하게, 상기 신이화로부터 추출된 마그놀란은 화장품의 총 중량에 대하여 0.00001∼60 중량%로 함유되는 것을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게, 화장품 조성물은 화장품의 총 중량에 대하여 신이화추출 다당체인 마그놀란 0.01∼30.0 중량%을 함유하며, 크림, 화장수, 로션, 에센스, 마사지 크림 및 팩 등의 화장품 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 실시예를 바탕으로 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 신이화로부터 다당체인 마그놀란를 추출하는 방법을 살펴보면 다음과 같다. 신이화를 건조 후, 에탄올로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한다. 이때, 신이화를 알코올에 침지시키면 잘 용해되는 유기성 저분자들이 용해되어 쉽게 제거된다.

그 후 알코올과 유기성 저분자들을 제거한 후에 남은 잔사를 물로 추출하여 수가용성 분액을 수득한 후 이를 농축시켜 수용성 분획을 수득한다. 이 수용성 분획에 수포화 저급지방족 알코올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석시킨 후 농축하여 제조한다. 이때, 투석의 방법으로는 셀룰로오스 막을 이용하는 방법, 나노필터를 이용하는 방법, 세락믹 필터를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있다.

여기에 사용된 신이화는 종에 따라 효능의 크기의 차이는 있으나 범위는 별 차이가 없으므로 갈잎큰키나무 목련(Magnolia kobus A. P. DC.), 자목련(Magnolia liliflora DESR.), 백목련(Magnolia denudata DESR.) 등의 꽃봉오리를 모두 포함한다.

본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란은 물에 쉽게 혼화되고 유지와 유기성 용매는 혼화되기 어렵지만 현탁상태에서도 화장료에의 배합은 가능하고 효과에 대하여 어떠한 영향도 주지 아니한다. 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란을 화장료에 배합시 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분들 예컨대, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급지방족알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 화장품 중 신이화추출 다당체인 마그놀란의 함량은 0.00001∼60 중량%를 지닌다. 이때, 0.00001 중량% 이하의 신이화 다당체를 함유할 경우 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능, 피부보습효능 등이 충분치 못하며, 60 중량% 이상의 경우 그 이상의 효과 증진이 나타나지 않았다. 한편 화장품의 효과를 충분히 발휘하기 위해서는 신이화 다당체 함량이 0.01∼30.0 중량%인 것이 바람직하다.

본 발명에서 피부 화장료는 피부에 사용하는 것으로서 예를 들면 화장수, 유액, 크림, 팩 등의 화장료의 형태일 수 있으며, 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능 및 피부 보습효능을 지닌 화장료로의 응용이 가능하다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 신이화로부터 다당체인 마그놀란의 제조

건조된 신이화 1kg을 에탄올 8L로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한 후 그 잔사를 물 8L로 추출하여 수가용성 분액을 수득한 후 이를 농축시켜 수용성 분획을 얻은 후 60(v/v)% 에탄올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석 후 농축시켜 신이화추출 다당체인 마그놀란을 제조하였다. 수득된 마그놀란의 양은 68g이였다. 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란은 분자량 약 5,000∼1,500,000 달톤의 고분자 물질이고, 주성분은 다당체들로 구성되어 있다.

(실시예 2) 신이화추출 다당체인 마그놀란의 구조 분석

1) 신이화 다당체인 마그놀란의 당 함량 측정

신이화로부터 분리된 신이화 다당체인 마그놀란의 당 함량을 페놀-황산법으로 측정하였다. 0.1㎎/㎖의 농도로 신이화 다당체인 마그놀란을 증류수에 용해시킨 용액 20㎕에 5% 페놀용액 30㎕와 진한 황산 0.2㎖를 가하고 진탕한 후, 60℃에서 20분간 반응시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준품으로는 글루코오스를 사용하여 표준용량곡선을 작성하였다. 측정결과 신이화 다당체인 마그놀란의 당 함량은 99.0%이상이었다.

2) 신이화 다당체인 마그놀란의 단백질 함량 측정

신이화로부터 분리된 신이화 다당체인 마그놀란의 단백질 함량을 브래드포드법을 기본으로 제품화된 단백질 함량측정 키트(Protein Assay Kit, Bio-Rad사)를 사용하여 측정하였다. 소의 혈청 알부민을 표준품으로 하여 표준용량곡선을 작성하였으며, 측정결과 신이화 다당체인 마그놀란의 단백질 함량은 각각 1.0%미만이었다.

3) 신이화 다당체의 분자량 확인

신이화 다당체의 분자량확인은 세파크릴 S-500겔을 2×100cm컬럼에 충진한 겔여과크로마토그래피를 사용하였으며 이동상으로 0.1몰-인산나트륨 완충용액(pH 7.4)을 사용하였고, 유속은 5㎖/분, 검출기는 215nm의 자외선검출기를 사용하였다. 60%에탄올 침전물을 셀룰로오스 투석막으로 투석하여 제조한 신이화 다당체 추출물 의 겔 여과 액체크로마토그래피한 결과를 도 2 및 표 1에 각각 나타내었으며, 각 분자량 크기별 조성비는 12.4 : 3.9 : 4.8 : 0.8 : 44.1 : 34.0 이었다.

분획	시험관번호	평균분자량(달톤)	면적비(%)
1	2-8	1,500,000	21
2	9-13	700,000	16
3	14-16	300,000	5
4	17-22	120,000	49
5	23-27	20,000	6
6	28-34	5,000	3

4) 신이화 다당체의 적외선흡수 스펙트럼 분석

신이화 다당체를 브롬화칼륨(KBr)을 사용하여 적외선 흡수 스펙트럼 분석용 박편을 만든 다음 푸리에-변환 적외선 분광기(Fourier Transform-Infra Red spectroscopy, Bomem DA8.12, Hartman and Braun사, Canada)를 사용하여 분석하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 분석결과 3400 cm^-1부근의 히드록시기(-OH), 1000∼1100 cm^-1 부근의 에스테르기(C-O), 2800∼2900 cm^-1의 탄화수소의 흡수스펙트럼이 확인되어 전형적인 다당체의 흡수 스펙트럼임을 확인할 수 있었다.

(제조예 1)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	5.0
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
소디움 히알루로네이트	2.0
글리세린	4.0
피이지 4000	1.0
폴리 솔베이트 20	0.5
에탄올	10.0
방부제	적량
벤조페논-9	0.05
향	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 2)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 밀크 로션을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	2.0
스테아린산	0.4
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
세토스테아릴 알콜	1.2
글리세린	4.0
글리세릴 스테아레이트	1.0
트리에탄올 아민	0.25
토코페릴 아세테이트	3.0
유동 파라핀	5.0
스쿠아렌	3.0
마카다미아 너트 오일	2.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.6
카르복시비닐 폴리머	0.15
방부제	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 3)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	2.0
바셀린	7.0
세토스테아릴 알콜	2.5
글리세릴 스테아레이트	2.0
스테아린산	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올 아민	0.5
토코페릴 아세테이트	0.1
방부제	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 4)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 에센스를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	5.0
글리세린	10.0
피이지 1500	2.0
알란토인	0.1
판테놀	0.3
이.디.티이.에이(EDTA)	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시 에틸 셀룰로오스	0.1
소디움 히알루로네이트	8.0
카르복시비닐 폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-25	0.6
에탄올	6.0
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 5)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 마사지 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	3.0
글리세릴 스테아레이트	2.0
세토스테아릴 알콜	2.5
스테아린산	1.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테아레이트	5.0
스쿠알렌	5.0
광물유	35.0
디메치콘	1.0
산탄검	0.1
히드록시에틸 셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올 아민	0.5
방부제, 향, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 6)

실시예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란을 다음의 첨가제와 혼합하여 팩을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
신이화추출 다당체인 마그놀란	3.0
폴리비닐 알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
피이지 1500	2.0
판테놀	0.4
알란토인	0.1
에탄올	6.0
피이지 40 경화 피마자유	0.3
방부제, 향, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

(비교예 1)

제조예 2에서 신이화추출 다당체인 마그놀란의 함유량만 전분으로 바꾸어 밀크 로션를 제조하였다.

(비교예 2)

제조예 3에서 신이화추출 다당체인 마그놀란의 함유량만 전분으로 바꾸어 영양 크림를 제조하였다.

(시험예 1) 피부노화방지효과 측정 시험

1) 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능 측정

3.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Doubecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 인체 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하고, 시료로서 실시예 1과 2의 신이화추출 다당체인 마그놀란을 1%의 양으로 사용하여, 배양배지로 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가한 후, 37℃ 온도에서 4일간 배양하였다. 배양 후, 0.2% MTT(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 온도에서 4시간 동안 배양한 후, 생성된 포르마잔(formazane)을 DMSO(Dimethylsulfoxide)로 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 이를 신이화추출 다당체인 마그놀란을 처리하지 않은 대조군에 대하여 상기와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

시료농도(%)	섬유아세포증식능(%)
시료농도(%)	마그놀란
1×10^-7	15
1×10^-6	27
1×10^-5	43
1×10^-4	62
1×10^-3	78
1×10^-2	84
1×10^-1	92

표 2에 나타난 바와 같이, 신이화추출 다당체인 마그놀란을 처리한 섬유아세포의 증식 효능이 매우 높음을 알 수 있다.

2) 각질형성세포(Keratinocyte)의 증식효능 측정

각질형성세포를 사용하여 시험예 1에서와 동일한 방법으로 각질형성세포의 증식효능을 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

시료농도(%)	각질형성세포 증식능(%)
시료농도(%)	마그놀란
1×10^-7	9
1×10^-6	21
1×10^-5	28
1×10^-4	36
1×10^-3	47
1×10^-2	51
1×10^-1	58

표 3에 나타난 바와 같이, 신이화추출 다당체인 마그놀란을 처리한 각질형성세포는 약 50% 정도 향상된 증식효능을 나타내었다.

3) 섬유아세포의 콜라겐 합성능 측정

인체 섬유아세포를 24공 평판배양기에 배양한 후, 실시예 1과 동일한 시료를 사용하여, 배양배지로 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가하였다. 배양 3일째에 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 각 well당 0.5㎖씩 첨가한 후, L[2, 3, 4, 5-3H]-프롤린 10Ci를 첨가하였다. 24시간 경과 후, 각 well에 들어있는 배지와 세포들을 모아 5% 삼염화식초산(TCA;Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후, 2개의 시험관에 분주하고, 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고 37℃ 온도에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그 후, 모든 시험관에 50% TCA를 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 다음, 각각 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 디피엠(DPM; decay per minute)값을 얻어, 하기 [수학식 1]에 의거하여, 상기 시험예에서와 동일한 대조군과 실험군에 대해 콜라겐 생합성 값(RCB ; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시료농도(%)	콜라겐 증식능(%)
시료농도(%)	마그놀란
1×10^-7	7
1×10^-6	15
1×10^-5	23
1×10^-4	35
1×10^-3	49
1×10^-2	52
1×10^-1	62

표 4에 나타난 바와 같이, 신이화추출 다당체인 마그놀란을 처리한 섬유아세포는 약 50%정도 향상된 콜라겐 생합성 촉진효능을 나타냄을 알 수 있다.

4) 인체 피부를 대상으로 한 피부 주름개선 효과

35~45세의 안면주름이 있는 시험대상자 30명에 대하여, 상기 제조예 3의 영양크림을 주고, 피부주름 개선효과를 비교 평가하게 하였다. 피검자의 안면 좌부에는 신이화추출 다당체인 마그놀란을 2% 함유한 영양크림을, 우부에는 비교예1의 전분을 1% 함유한 영양크림을 3개월간 사용하게 하였으며, 영양크림 사용 이전에 안면 양쪽부의 피부 상태를 측정해 놓고, 3개월 후 동일부위를 재측정하는 방법으로 피부주름의 변화를 측정하였다. 피부측정은 온도 24℃, 상대습도 40%의 항온실습실에서 하였으며, 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서, 비시오메타 시스템 (Visiometer system;C+K사)으로 피부주름을 측정하였다. 피부주름의 변화량은 하기 [수학식 2]에 따라 계산하였다.

(상기 식에서, Tdi는 영양크림을 바른 후 90일째 되는 날의 측정부위 값이며, Tdo는 영양크림을 바르기전의 측정부위 값이다.)

상기 식에 따라, 계산한 결과, 비교예 1을 사용한 부위의 피부주름은 24 ±11%(평균 ±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 제조예 3을 사용한 부위의 피부주름은 68 ±13% 의 감소치를 보여, 본 발명의 화장료가 우수한 피부주름 개선효과가 있음을 알 수 있었다.

상기한 시험 결과들로부터, 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란은 피부의 각질형성세포(Keratinocyte) 및 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능이 우수하며, 이로 인한 콜라겐의 생합성 촉진작용을 통해 피부노화를 방지하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

(시험예 2) 피부면역증강효능 시험

8∼10주령의 C57BL/6 생쥐를 대상으로 복부를 면도한 다음 FS-20 sun lamp를 이용하여 자외선 B파장을 (UVB) 2.4KJ/m² 로 조사하면 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity)이 정상군에 비해 44.3% 억제되는 면역억제현상을 초래하게 된다. 따라서 본 발명의 제조예 3을 UV 조사후 도포하고 3일이 경과한 다음 UV조사 영역에 3% 삼질소염화벤젠(trinitrochloro benzene)으로 감작시킨다. 6일 후 1%의 삼질소염화벤젠을 생쥐의 귀에 도포하고 부종 상태를 측정하였다. 피부면역증강효과는 하기의 [수학식 3]에 의해 계산하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

자외선 B 조사	처치군	TNCB감작	귀 부종 두께 (x 0.01mm)	피부면역 증강효과(%)
-	-	-	4.9	-
-	-	+	30.5	-
2.4	-	+	13.2	-
2.4	비교예1	+	14.0	4.6
2.4	제조예3 (0.1mg/ml)	+	16.4	18.5
2.4	제조예3 (0.5mg/ml)	+	24.1	63.0
2.4	제조예3 (2.5mg/ml)	+	28.0	85.5

표 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란로 제작된 화장품의 피부면역증강 효능이 비교예에 비하여 크게 증가함을 알 수 있다.

(시험예 3) 항산화효과 측정 시험

1) 크산틴옥시다아제 법

제조예 1에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란 1%용액을 이용하여 항산화효과를 측정하였다. 본 발명에서는 항산화효과를 측정하기 위하여 크산틴과 크산티옥시다제에 의하여 생성하는 활성산소가 본 발명에 의한 추출물에 의하여 제거되는 효과, 즉 활성산소효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitrobluetetrazolium: NBT)과 반응하여 이것에 의하여 생성하는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소량을 측정한다.

측정방법은 바이엘병에 0.05M Na₂CO₃ 완충액(분자량 105.99) 2.4ml, 3mM 크산틴 용액 0.1ml, 3mM EDTA 용액 0.1ml, 0.15% BSA 용액 0.1ml, 0.75mM NBT 용액 0.1ml를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한 다음 크산틴옥시다제 용액 0.1ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간 배양을 개시한다. 그 후 6mM 염화구리 용액 0.1ml를 가하여 반응을 중지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공 시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작하여 흡광도 Bt를 측정하고 공 시험용액은 크산틴옥시다제 용액 0.1ml 대신 증류수를 사용하여 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다. 이때, 항산화효과는 하기의 [수학식 4]와 같이 산출하였다.

상기 식에서, St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도, Bt : 공 시험액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도, So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도, Bo : 공 시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도이다

시료농도(%)	항산화능(%)
시료농도(%)	마그놀란	가용성전분
1×10^-7	8	5
1×10^-6	29	9
1×10^-5	42	15
1×10^-4	58	19
1×10^-3	77	25
1×10^-2	83	29
1×10^-1	87	33

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란을 사용한 시료는 강력한 항산화효과가 나타났다.

(시험예 4) 자유라디칼 소거능

상기 실시예 1에서 얻은 신이화추출 다당체인 마그놀란에 대하여 자유라디칼 소거능을 다음과 같이 측정하였다. 블로이스에 의한 네이처 잡지(Blois, M. S. Nature) 181호 1190쪽, 1958년에 기재된 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라진(DPPH)의 방법을 사용하여 수행하였다. 상기 DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼로서, 라디칼 상태로 존재시에는 517㎚에서 최대 흡광을 보이며 소거되면 흡광성을 잃는다.

DPPH는 시그마사의 제품을 사용하였으며, 0.15mM의 농도로 메틸알코올에 녹여 사용하였다. 먼저 상기 실시예 1의 신이화추출 다당체인 마그놀란을 각 농도별(1㎍/㎖ - 100㎍/㎖)로 제조하여 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 100㎕씩 넣었다. 여기에 DPPH용액을 100㎕씩 첨가한 다음 상온에서 30분간 방치한 후 마이크로 플레이트 리이더(Micro plate reader, 바이오텍 EL-340)를 이용하여 517㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 신이화추출 다당체인 마그놀란 대신 같은 농도의 전분용액 100㎕를 넣은 것을 사용하였다.

실시예 1에서 얻은 신이화추출 다당체인 마그놀란을, 다음과 같이 배양된 세포를 이용하여 자외선에 의하여 발생된 자유라디칼에 의한 세포내 지질 과산화 억제작용을 시험하였다. 상기 시험은 헴스터 유래 섬유아세포종세포 V79-4를 사용하여 수행하였다. 배지는 DMEM에 10%의 소혈청을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 60㎜의 세포배양 페트리디쉬에 2 × 10⁵개 세포/디쉬의 농도로 접종하여 3일간 배양하였다. 배양시 상기 신이화추출 다당체인 마그놀란을 배양액에 첨가하여 배양하였다. 3일 후 배지를 따라 버리고, PBS 용액으로 2번 씻은 다음 1㎖의 PBS 용액을 배양용기에 첨가해준 후 일정한 광량(15J/㎠)의 자외선 A를 조사해 주었다. 조사 직후 PBS 용액을 탄닌계 물질을 포함하는 정상적인 배지로 바꾸고 24시간동안 더 배양하였다.

또한, 세포에 생성된 지질 과산화물의 정량은, 티오바르비투르산(TBA)의 반응성을 이용하여 수행하였으며, 시험 방법은 다음과 같다(카리 피이 등, 저널 오브 인베스트먼트 오브 더마톨로지(J. Invest. Dermatol.), 96호, 255-259쪽, 1991년).

먼저 세포를 셀스크랩퍼를 이용하여 페트리디쉬에서 떼어내었다. 떼어난 세포를 1㎖의 균질화된 완충액에 현탁시킨 후 유리 호모게니저를 이용하여 분쇄하였다. 이 세포 분쇄액 0.5㎖에 30% 삼염화식초산(TCA) 용액 0.5㎖와 50㎕의 2% 부틸화 히드록시톨루엔(BHT) 에탄올 용액을 가하였다. 여기에 0.5㎖의 TBA 수용액(375㎎/㎖)을 가한 후 끓는 물에서 중탕으로 15분간 끓였다. 이것을 냉각한 후 535㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 자외선을 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 기준으로 하여 세포 지질 과산화 억제 작용를 표 7에 나타내었다.

시 료	A535(대조군의 %)	저 해 율 (%)
대조군(정상군)	100	-
물질 미첨가(자외선 조사군)	174±2.9	0
마그놀란 (100㎍/㎖) +자외선 조사군	126±3.4	64
마그놀란 (200㎍/㎖) +자외선 조사군	119±5.3	75

표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란은 자외선에 의한 세포막 지질의 과산화를 매우 효과적으로 막아줄 수 있음을 알 수 있다. 즉, 신이화추출 다당체인 마그놀란은 자외선에 의한 자유라디칼 생성 및 지질 과산화를 억제함으로써 노화방지 및 주름방지 등에 사용될 수 있음을 의미한다.

(시험예 5) 피부 보습효과 측정 시험

제조예 1∼6 및 비교예 1∼2 를 10명의 시험자들이 팔안쪽에 도포하고 테이프를 붙였다. 피부수화는 처치전, 처치 30분 후 및 처치 2시간 후 컨덕턴스를 측정하여 [표 8]에 나타내었다.

구 분		실시예						비교예
구 분		1	2	3	4	5	6	1	2
도포전측정값(평균)		19.7	20.6	21.2	21.0	22.4	20.5	21.3	22.5
도포후 측정값 (평균)	30분	33.4	34.6	37.3	35.7	37.2	38.0	33.0	33.5
도포후 측정값 (평균)	120분	23.3	25.6	28.9	27.3	28.1	29.2	23.1	22.9.

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 측정결과는 제조예 1∼6에서 제조된 신이화추출 다당체인 마그놀란 함유 화장료들의 보습효과가 우수함을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 신이화추출 다당체인 마그놀란은 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 피부 보습효과를 갖는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 신이화추출 다당체인 마그놀란을 화장재료로 사용하면 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능 및 피부 보습효능을 지닌 화장수, 유액, 크림, 팩 등을 제조할 수 있는 장점이 있다.

그러나, 신이화추출 다당체인 마그놀란을 함유한 화장료가 이들 제형으로만 한정되는 것은 아니다.

Claims

신이화를 건조시키는 단계;

상기 건조된 신이화를 에탄올로 추출하여 유기성 저분자화합물들을 제거한 후 유기성 저분자들이 제거된 잔사를 물로 추출하고 농축시켜 수용성 분획을 수득하는 단계;

상기 수용성 분획에 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시키는 단계;

상기 침전으로 수득된 물질을 투석 후 농축시켜 당 함량이 99.0% 이상이며 분자량이 5,000 내지 1,500,000달톤를 갖는 다당체인 마그놀란을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 신이화로부터 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 신이화는 갈잎큰키나무 목련(Magnolia kobus A. P. DC.), 자목련(Magnolia liliflora DESR.), 백목련(Magnolia denudata DESR.) 중에서 선택한 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신이화로부터 다당체인 마그놀란을 추출하는 방법.
제1항에 의해 추출된 상기 다당체인 마그놀란을 화장품의 총 중량에 대하여 0.00001∼60 중량%로 함유시킨 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 다당체인 마그놀란의 함량은 화장품 총 중량에 대하여 0.01∼30.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 화장품은 크림, 화장수, 로션, 에센스, 마사지 크림 및 팩 중에서 선택한 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.