JP2012517585A - 免疫グロブリングリコシル化パターン分析 - Google Patents
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Abstract
Description
医薬産業は、近年、とりわけ、酵素、抗体、及びサイトカイン(例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、プラスミノーゲンアクチベーターなど)に基づく産物を用いて非常に成功しており、世界でのタンパク質治療用薬剤の需用は毎年増加している。治療用モノクローナル抗体(mAb、モノクローナル抗体)は、タンパク質治療法内で重要な群である。それらはモノクローナルと呼ばれる。なぜなら、ポリクローナル抗体とは対照的に、それらは単一の抗体形成細胞に由来する免疫細胞(細胞クローン)により分泌されるからである。モノクローナル抗体の特徴は、それらの各々が、免疫原性物質の1つのエピトープに対して向けられるだけであり、従って、疾患の処置において非常に特異的に使用することができることである。タンパク質治療法の例は、モノクローナル抗体トラスツズマブ(商品名:ハーセプチン)、ダクリズマブ(商品名:ゼナパックス)、及びリツキシマブ(商品名:マブセラ)であり、Rocheにより製造され、とりわけ乳癌の処置のために(トラスツズマブ)、臓器拒絶反応のために(ダクリズマブ)、及び非ホジキンリンパ腫のために(リツキシマブ)成功裏に使用されてきた。
本発明の一局面は、サブクラスIgG1(huIgG1)又はIgG2(huIgG2)又はIgG4(huIgG4)のヒト免疫グロブリンあるいはサブクラスIgG2a(muIgG2a)又はIgG2b(muIgG2b)又はIgG3(muIgG3)のマウス免疫グロブリンのグリコシル化パターン又は部位特異的グリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程:
a)免疫グロブリンを、酵素IdeSを用いて消化すること、
b)a)において得られる免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
c)b)において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントをマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
d)免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、c)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
b)免疫グロブリンのフラグメントを、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
c)脱塩されたフラグメントをマススペクトロメトリー分析に直接的に適用すること
を含む。
a)酵素IdeSを用いた酵素消化により免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、及び、免疫グロブリンフラグメントを、カルボキシペプチダーゼBを用いて処理すること
を含む。
ab)工程a)の消化された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
である。
本発明は、サブクラスIgG1(huIgG1)又はIgG2(huIgG2)又はIgG4(huIgG4)のヒト免疫グロブリンあるいはサブクラスIgG2a(muIgG2a)又はIgG2b(muIgG2b)又はIgG3(muIgG3)のマウス免疫グロブリンのグリコシル化パターンの決定のための方法に関する。
モノクローナル免疫グロブリンは非常に大きなタンパク質であり、さらに、それらの重鎖の糖構造のため極めて不均一(ミクロ不均一性)である。分解産物の形成について及び/又は修飾について免疫グロブリンのグリコシル化パターンを検討するために、糖構造分析の前にそれらをより小さなフラグメントに切断することが好都合である。
免疫グロブリン分子において生じる全てのジスルフィド架橋を、還元により切断することができる。免疫グロブリンの遊離の重鎖及び軽鎖が、還元の間に得られる。トリス(2−カルボキシエチル)−ホスフィン(TCEP)が、しばしば使用される還元剤である。なぜなら、免疫グロブリンの全てのジスルフィド架橋が短時間内に完全に切断され、その還元は全pH範囲において生じるからである(例、Hau, J. C. and Hau, C. Y., Anal. Biochem. 220 (1994) 5-10を参照のこと)。一実施態様において、pH範囲はpH1.5〜pH8.5である。ジチオトレイトール(DTT)は、また、ジスルフィド架橋の迅速な切断により特徴付けられる。しかし、酸性環境におけるDTT還元は、非常に不十分に進行するだけである。変性工程が、通常、重鎖と軽鎖の解離を完了するために必要である。変性によって、加えて、ジスルフィド基がより接近可能になる。一実施態様における変性は、例えば、グアニジン/HCl又はギ酸の助けで行うことができる。
パパイン(システインプロテアーゼ)は、アルギニン(R)、リジン(K)、グルタミン酸(E)、ヒスチジン(H)、グリシン(G)、及びチロシン(Y)の後で比較的、非特異的にペプチド結合を切断する。インキュベーション期間が十分に長い又は長過ぎる場合、パパイン消化は免疫グロブリンの全体の加水分解に導く。しかし、免疫グロブリンを、それらのヒンジ領域において、限定的なタンパク質分解により比較的、選択的に切断することができる(Lottspeich, F. and Engels, J. W., Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag, Munich, 2nd Edition (2006) 201-214)。切断は、2つの重鎖を連結するジスルフィド架橋のN末端側で生じる。ジスルフィド架橋はこのプロセスにおいて保持され、3つのフラグメント(2つのFabフラグメント、1つのFcフラグメント)が得られる。2つのN末端フラグメントは抗原結合フラグメント(Fabフラグメント、Fab、抗原結合フラグメント)と呼ばれ、C末端フラグメントはクリスタリンフラグメント(Fcフラグメント、Fc、結晶化フラグメント)と呼ばれる。各Fabフラグメントは、完全な軽鎖及び重鎖のアミノ末端半分で構成される。Fcフラグメントは、重鎖の2つのカルボキシ末端半分で構成され、それらは依然としてジスルフィド架橋により一緒に連結されている。
a)酵素IdeSを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
b)酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
c)工程b)において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメトリー分析に供すること、及び
d)免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程c)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
a)酵素IdeSを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
b)酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
c)工程b)において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメトリー分析に供すること、及び
d)免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程c)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
a)酵素IdeS及び酵素カルボキシペプチダーゼBを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること
を含む。
a1)工程a)の酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、ギ酸を用いて処理すること
である。
a1)工程a)の酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
である。
a)酵素IdeSを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
b)工程a)の酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
c)得られる前記免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること及び/又は得られるフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
d)工程c)において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
e)免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程d)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
a)組換え産生された免疫グロブリンのサンプルを提供すること、
b)酵素IdeSを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
c)工程b)の酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
d)得られる前記免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること及び/又は得られるフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
e)工程d)において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
f)免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程e)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
a)Fab2フラグメント又はFabフラグメントが得られる免疫グロブリンを提供すること、
b)酵素IdeSを用いた消化により前記免疫グロブリンを切断すること、
c)Fabフラグメントが産生される場合、工程b)の酵素切断された前記免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
d)前記Fab2フラグメント又は前記Fabフラグメントを、プロテインAクロマトグラフィー又はサイズ排除樹脂を用いたクロマトグラフィーにより産生すること
を含む。
a)タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質を、酵素IdeSを用いて酵素切断し、それによりタンパク質を産生すること
を含むタンパク質を産生するための方法である。
配列番号1 ストレプトコッカス・ピオゲネスからのIdeSのアミノ酸配列。
配列番号2 CH1で始まり、CH2で終わるマウスIgG2a免疫グロブリン配列。
配列番号3 CH1で始まり、CH2で終わるマウスIgG3免疫グロブリン配列。
配列番号4 ヒトIgG1定常領域。
配列番号5 ヒトIgG4定常領域。
抗体濃度の決定:
抗体濃度を、タイプUVIKON XL(Goebel Company)の分光光度計で、280nmでの吸収測定を用いて決定した。使用された抗体の消衰係数は1.55ml/(mg*cm)であり、Pace, C. N., et al.(Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423)の方法に従って算出した。
一般的な方法A(IgG1、IgG3用)
Fcフラグメントにおけるグリコシル化パターンの分析のためのIdeS消化:
100μg(0.66nmol)の免疫グロブリンを、50mM TRIS/HCl緩衝液(pH8.0)中で最終濃度1mg/mlに希釈し、2μl(c=1mg/ml、0.06nmol)の免疫グロブリン分解酵素(IdeS、MW 345890Da)を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比1:50を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、2〜5時間にわたり37℃でインキュベートする。サイズ排除クロマトグラフィー及びマススペクトロメーター中への直接注入を用いた分析のために、酵素活性を、溶液への等容積の1%ギ酸の添加により停止させる。
還元のために、サンプルの半分を、64μlの100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて希釈し、最終容積115μlを与える。次に、60μlの0.5M TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)−ホスフィン、Pierce)(4M塩酸グアニジンの容積中に溶解)及び50mlの8M塩酸グアニジンを加える。その後、サンプルを30分間にわたり37℃でインキュベートする。反応を、5μlの20%(v/v)ギ酸の添加により停止する。
一般的な方法B(IgG1、IgG3、IgG4用)
組み合わせたIdeS及びCpB消化:
100μg(0.66nmol)の免疫グロブリンを、50mM TRIS/HCl緩衝液(pH8.0)中で最終濃度1mg/mlに希釈し、2μl(c=1mg/ml、0.06nmol)の免疫グロブリン分解酵素(IdeS、MW 345890Da)を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比1:50を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、2〜5時間にわたり37℃でインキュベートする。1μl(1mg/ml)のカルボキシペプチダーゼB(CpB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を、IdeSインキュベーション時間終了の30分前に溶液に加え、酵素と免疫グロブリンの重量比1:25を与える。
一般的な方法C(複雑なグリコシル化パターンを伴うIgG用)
組み合わせたIdeS及びEndoH消化:
25μg(0.17nmol)の免疫グロブリンを、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で最終濃度0.5mg/mlに希釈し、2.5μl(c=2.5U/500μl)のエンドペプチダーゼH(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を加えて、18時間にわたり37℃でインキュベートし、オリゴ糖構造を切断する。続いて、pHを、25μlの0.1M TRIS/HCl緩衝液(pH8.0)を加えることにより8.0に調整する。切断は、0.5μl(c=1mg/ml、0.02nmol)の免疫グロブリン分解酵素(IdeS、MW 345890Da)の添加及び2時間にわたる37℃でのインキュベーションにより達成する。
一般的な方法D(培養上清用)
組み合わせたIdeS及びCpB消化:
50μg(0.33nmol)の免疫グロブリン発現真核細胞の培養での培養上清を、3分間にわたり10,800rcf(相対遠心力)で遠心し、50mM TRIS/HCl緩衝液(pH8.0)中で最終濃度0.7mg/mlに希釈する。1μl(c=1mg/ml、0.06nmol)の免疫グロブリン分解酵素(IdeS、MW 345890Da)を加えて、酵素と免疫グロブリンの重量比1:50を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、2〜5時間にわたり37℃でインキュベートする。1μl(1mg/ml)のカルボキシペプチダーゼB(CpB、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を、IdeSインキュベーション時間終了の30分前に溶液に加え、酵素と免疫グロブリンの重量比1:25を与える。
RP−HPLC−MS方法
LC−MSを、QTOF II(Micromass/Waters)に連結したAgilent Cap LC1100で実施する。クロマトグラフィー分離を、Phenomenex Jupiter C18カラム(5μm粒径、300A口径、1×250mmカラム)で実施する。溶出液Aは0.5%ギ酸である。溶出液Bは、70%イソプロパノール、20%アセトニトリル、9.5%水、及び0.5%ギ酸である。流速は40μl/分である。分離を75℃で実施する。実施例2〜5の1つの方法を用いて得られる2μg(10μl)の免疫グロブリンを、カラム上に注射する。以下の勾配を適用する:
直接注入によるIdeS切断抗体の糖分析
サイズ排除クロマトグラフィー:
実施例2〜5の1つの方法を用いて得られる45μg(90μl)のIdeS切断免疫グロブリンを、2%ギ酸、40%アセトニトリルを用いて平衡化したSephadex G25セルフパックECO SRカラム(5×250mm)(KronLab)上に流速0.5ml/分で30分間にわたり注射する。タンパク質を、2%ギ酸、40%アセトニトリルを用いた流速1ml/分での8分間のイソクラティック溶出を使用して脱塩する。脱塩タンパク質の溶出をUV(280nm)により記録する。サンプルを、分画コレクターを介して、マイクロタイタープレート中に回収する。マイクロタイタープレートをTriversaNanoMate(Advion)システム中に挿入することができる。MSスペクトルを自動的に記録する。又は、サンプルを金属コートガラスニードル(Proxeon Biosystems Nano ESI-needles, cat# ES387)中に手動でピペッティングし、マススペクトロメーター中にスプレーすることができる。
MSスペクトルが、キャピラリー電圧800V、コーン電圧33Vを使用して、質量範囲600〜2000m/z(グリコシル化Fcフラグメント)において、陽イオンモード中で、脱溶媒和温度120℃及びソース温度80℃を使用して得られる。MSデータが約2分にわたり得られる。
マウスIgG3免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例に例示されており、マウスIgG3免疫グロブリンを伴う。この免疫グロブリンは2つのグリコシル化部位(1つがFabフラグメント中及び1つがFcフラグメント中)を有する。
ヒト化IgG4免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトIgG4免疫グロブリン定常領域を含む。この免疫グロブリンは、Fcフラグメント中に1つのNグリコシル化部位を有する。
ヒト化IgG1免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトIgG1免疫グロブリン定常領域を含む。この免疫グロブリンは、Fcフラグメント中に1つのNグリコシル化部位を有する。
培養上清からのヒト化IgG1免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトIgG1免疫グロブリン定常領域を含み、それにより分析のためのサンプルが、さらなる精製なしに培養の培養上清から直接的に得られた。この免疫グロブリンは、Fcフラグメント中に1つのNグリコシル化部位を有する。この実施例は、真核細胞の培養の間にグリコシル化をモニタリングするためのオンラインツールとして本発明の方法を使用することが可能であることを示す。
ヒト化IgG1のFab2フラグメントの産生
10mgの免疫グロブリンを、50mM TRIS/HCl緩衝液(pH8.0)中で最終濃度1mg/mlに希釈し、18μl(c=11.3mg/ml)の免疫グロブリン分解酵素(IdeS、MW 345890Da)を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比1:50を与える。溶液を、0.5〜2時間にわたり37℃で撹拌しながらインキュベートする。IdeSを用いたインキュベーションの直後、プロテインAカラムクロマトグラフィーを、プロテインAHPハイトラップカラムを使用して実施した。緩衝液Aはリン酸緩衝食塩水(pH7.4)であった。緩衝液Bは、流速1ml/分を伴う100mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH2.8)であった。Fab2フラグメントがカラムのフロースルーから得られるのに対し、Fcフラグメントは緩衝液Bを用いた溶出により得られる。得られる分画は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された場合、純度84%〜95%を有する。Superdex75HighLoad16/60カラム(容積120ml)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用したさらなる精製工程を実施することができる。緩衝液として、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(140mMの塩化ナトリウムを伴う)(pH6.0)を流速1ml/分で使用した。図15から見られる通り、本来の完全抗体が、そのFab2フラグメントに変換されている。
Claims (11)
- サブクラスIgG1又はIgG2又はIgG4のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスIgG2a又はIgG2b又はIgG3のマウス免疫グロブリンあるいはこれらの変異体のグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程:
a)酵素IdeSを用いた酵素消化により該免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、
b)酵素消化により得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
c)工程b)において得られる該免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメトリー分析に供すること、及び
d)該免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程c)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む、方法。 - サブクラスIgG1又はIgG2又はIgG4のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスIgG2a又はIgG2b又はIgG3のマウス免疫グロブリンのFab2フラグメントのグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程:
a)酵素IdeSを用いた酵素処理により該免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、
b)工程a)の酵素消化された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
c)得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーにより分離すること、
d)工程b)において得られる該免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
e)該Fab2フラグメントのグリコシル化パターンを、工程c)において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む、方法。 - サブクラスIgG1又はIgG2又はIgG4のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスIgG2a又はIgG2b又はIgG3のマウス免疫グロブリンのFab2フラグメント又はFabフラグメントの産生のための方法であって、方法が以下の工程:
a)Fab2フラグメント又はFabフラグメントが得られる免疫グロブリンを提供すること、
b)酵素IdeSを用いた酵素消化により該免疫グロブリンをFab2フラグメント及びHC−FCフラグメントに切断すること、
c)Fabフラグメントが産生される場合、工程b)の酵素切断された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
d)b)又はc)において得られるフラグメントのプロテインAクロマトグラフィー樹脂を用いたクロマトグラフィーにより該Fab2フラグメント又は該Fabフラグメントを産生すること
を含むことを特徴とする、方法。 - 以下の工程:
a)サンプルを期間にわたり保存すること、
b)酵素IdeSを用いた酵素消化により該免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、
c)酵素消化により得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
d)工程c)の酵素切断された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
e)得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーにより分離すること、
f)フラグメントの保持時間のシフトにより、工程b)〜e)を用いて処理された参照サンプルと比較して、分解産物の存在を決定すること
を含む、サンプルをモニタリングするための方法。 - 分離工程が以下:
− 得られる免疫グロブリンのフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること
であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。 - 分離工程が以下:
− 酵素IdeSを用いた酵素消化により免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、及び、該免疫グロブリンフラグメントを、カルボキシペプチダーゼBを用いて処理すること
であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 - 方法が切断工程の後及び精製工程の前に以下:
− 酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
を含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。 - 切断がpH5.5〜pH8.5の間のpH範囲で実施される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 切断が2時間にわたり実施されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 還元剤がトリス(2−カルボキシエチル)−ホスフィンであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- IdeSの免疫グロブリン分子に対するモル比が1:25〜1:2500の間であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
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