CN102308216B - 免疫球蛋白糖基化模式分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及确定IgG1或IgG4亚类的人免疫球蛋白、或IgG2a或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：a)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段；b)通过反相高效液相色谱法分离通过酶消化获得的所述免疫球蛋白的片段；c)对步骤b)中获得的分离的所述免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及d)从步骤c)中获得的质谱数据确定所述免疫球蛋白的糖基化模式。

Description

免疫球蛋白糖基化模式分析
本发明涉及确定免疫球蛋白Fc片段糖基化模式的方法。还展示了确定Fab糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式的方法，以及产生免疫球蛋白Fab2片段的方法。
发明背景
近年来制药工业领域在尤其以酶、抗体和细胞因子例如***、干扰素、纤溶酶原激活物等为基础的产品方面取得巨大成功，并且全世界对蛋白质治疗剂的需求逐年增加。治疗性单克隆抗体(mAbs，monoclonal antibodies)在蛋白质治疗中是重要一类。它们被称为单克隆，因为相对于多克隆抗体，它们是由衍生自单一抗体形成细胞的免疫细胞(细胞克隆)分泌的。单克隆抗体的特征在于它们每个仅针对免疫原性物质的一个表位，并且因此在治疗疾病中可以非常特异地应用。蛋白质治疗的实例是Roche(罗氏)生产的单克隆抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)(商品名：赫赛汀(Herceptin))、达利珠单抗(daclizumab)(商品名：赛尼哌(Zenapax))和利妥昔单抗(商品名：MabThera)，它们已经成功地用于尤其治疗乳腺癌(曲妥珠单抗)、器官排斥反应(达利珠单抗)和治疗非霍奇金淋巴瘤(利妥昔单抗)。
治疗性单克隆抗体是通过复杂的生物技术方法获得的。降解产物可以在它们的生产、配制和贮存过程中产生，这常常是由于例如氧化和脱酰胺反应以及蛋白酶剪切过程引起的(Yan，B.等人，J.Chromatog.A 1164(2007)153-161)。除了它的作用之外，生物制药产品的质量，即纯度、完整性、聚集状态和糖基化模式也是很重要的。
从人病原体化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中获得的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)，其也称为Mac-1或sib-38，是半胱氨酸蛋白酶，其特异性切割G型免疫球蛋白(IgG)抗体的重链。IgG是迄今为止唯一已知的IdeS底物(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS由339个氨基酸组成，包括含29个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen，U.等人，EMBO J.21(2002)1607-1615)。IdeS于包含在识别序列(LL)GGP中的236和237位氨基酸(Gly-Gly)之间切割人IgG亚类IgG1、IgG3和IgG4。人IgG2在识别基序PVAGP中的丙氨酸和甘氨酸间被切割。IgG2a、IgG2b和IgG3型鼠抗体以及兔IgG(LLGGPS)也被切割(例如参见，Vincents，B.，等人，Biochem.43(2004)15540-15549；Wenig，K.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)17371-17376)。
Hess等人(Hess，J.K.等人，J.Microbiol.Meth.70(2007)284-291)报道了质谱方法，其借助SELDI-TOF质谱法测定IdeS的酶活性。在US2007/0237784中报道了从化脓链球菌中分离的并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。在EP 1458861A中报道了形成抗体的Fc或Fab片段的方法。在WO 2006/131347中报道了来自A组链球菌的IdeS蛋白酶。
例如多肽的糖基化谱是许多重组产生的治疗性多肽的重要性质。糖基化的多肽也称为糖蛋白，其介导真核生物(例如人)和一些原核生物中的许多重要功能，包括催化、信号传导、细胞-细胞沟通、免疫***的活性、以及分子识别和关联。在真核生物中，它们占非胞质蛋白的大多数(Lis，H.等人，Eur.J.Biochem.218(1993)1-27)。寡糖的形成/与蛋白质的连接是共翻译和翻译后修饰，并且因此不是基因控制的。寡糖的生物合成是涉及几种酶的多步骤过程，所述酶彼此竞争底物。因此，糖基化多肽包括寡糖的微不均一阵列，导致产生了一组含有相同氨基酸骨架的不同的糖形。
共价结合的寡糖影响相应多肽的物理稳定性、折叠、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫***的相互作用、生物活性以及药物代谢动力学。此外，一些糖形可以是抗原性的，促使管理机构需要分析重组糖基化多肽的寡糖结构(例如，参见Paulson，J.C.，Trends Biochem.Sci.14(1989)272-276；Jenkins，N.，等人，Nature Biotechnol.14(1998)975-981)。例如已报道糖基化多肽的末端唾液酸化增加血清半寿期，以及含有具末端半乳糖残基的寡糖结构的糖基化多肽显示出增加的从循环的清除率(Smith，P.L.，等人，J.Biol.Chem.268(1993)795-802)。
免疫球蛋白与其他重组多肽在它们的糖基化模式方面不同。免疫球蛋白G(IgG)例如是分子量为约150kDa的对称、多功能糖基化多肽，其由两个相同的负责抗原结合的Fab片段和负责效应子功能的Fc片段组成。在IgG分子中糖基化倾向于在Asn-297处高度保守，所述Asn-297包埋在Fc重链的CH2结构域之间，形成与CH2中氨基酸残基的广泛接触(Sutton和Phillips，Biochem.Soc.Trans.11(1983)130-132)。Asn-297连接的寡糖结构被不均一地加工，使得IgG以多种糖形存在。变化存在于Asn-297残基占据的位点(大不均一性)，或由糖基化位点处的寡糖结构变化(微不均一性)，例如参见Jenkins，N.，等人，Nature Biotechnol.14(1996)975-981。
具有脉冲电流测定的高性能阴离子交换色谱(HPAEC)和基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)已用于分析糖基化多肽的碳水化合物部分(例如参见，Fukuda，M.，(编辑)Glycobiology：APractical Approach，IRL Press，Oxford；Morelle，W.和Michalsky，J.C.，Curr.Pharmaceut.Design 11(2005)2615-2645)。Hoffstetter-Kuhn等(Electrophoresis 17(1996)418-422)使用毛细管电泳和MALDI-TOF MS分析，从而在用N-糖苷酶F(PNG酶F)去糖基化后剖析寡糖介导的单克隆抗体的不均一性。
由于糖基化对重组糖基化多肽功能特性的重要性，以及充分定义的且一致的产物生产方法的必要性，在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化模式的在线或离线(ad-line)分析是高度期望的。Papac等人(Glycobiol.8(1998)445-454)报道了包括将糖基化多肽固定在聚偏(二)氟乙烯膜上、酶消化和MALDI-TOF MS分析糖基化谱的方法。Bailey，M.等人，J.Chromat.826(2005)177-187中报道了重组产生的mAb的分析和分子表征，其包括多个色谱步骤。
由哺乳动物细胞产生的免疫球蛋白含有2-3％质量的碳水化合物(Taniguchi，T.，等人，Biochem.24(1985)5551-5557)。例如在G类免疫球蛋白(IgG)中，这等价于在小鼠源的IgG中2.3个糖残基(Mizuochi，T.，等人，Arch.Biochem.Biophys.257(1987)387-394)以及在人源IgG中2.8个糖残基(Parekh，R.B.，等人，Nature 316(1985)452-457)，其中一般两个位于Fc-区Asn-297处，以及其他的位于可变区(Saba，J.A.，等人，Anal.Biochem.305(2002)16-31)。
例如对于G类免疫球蛋白(IgG)，结合或可结合寡糖至氨基酸骨架上的不同的N糖基化位点是已知的。在IgG的Fc-区中，可将寡糖残基在氨基酸残基297(其为天冬氨酸，表示为Asn-297)处通过N糖基化引入。Youings等人显示，15-20％的多克隆IgG分子中，其他的N糖基化位点位于Fab-区(Youings，A.，等人，Biochem.J.，314(1996)621-630；还参见，例如Endo，T.，等人，Mol.Immunol.32(1995)931-940)
由于不同质的(即不对称)的寡糖加工，存在免疫球蛋白的多种糖结构同等型(Patel，T.P.，等人，Biochem.J.285(1992)839-845；Yu-Ip，C.C.，等人，Arch.Biochem.Biophys.308(1994)387-399；Lund，J.，等人，Immunol.30(1993)741-748)。同时，寡糖的结构和分布均是高度可重复的(即，非随机的)且位点特异性的(Dwek，R.A.，等人，J.Anat.187(1995)279-292)
免疫球蛋白的一些特征与Fc-区的糖基化直接相关(例如参见，Dwek，R.A.，等人，J.Anat.187(1995)279-292；Lund，J.，等人，J Immunol.157(1996)4963-4969和FASEB J.9(1995)115-119；Wright，A.，和Morrison，S.L.，J.Immunol.160(1998)3393-3402)，例如诸如热稳定性和溶解性(West，C.M.，Mol.Cell.Biochem.72(1986)3-20)、抗原性(Turco，S.J.，Arch.Biochem.Biophys.205(1980)330-339)、免疫原性(Bradshaw，J.P.，等人，Biochim.Biophys.Acta 847(1985)344-351；Feizi，T.，和Childs，R.A.，Biochem.J.245(1987)1-11；Schauer，R.，Adv.Exp.Med.Biol.228(1988)47-72)、清除率/循环半寿期(Ashwell，G.，和Harford，J.，Ann.Rev.Biochem.51(1982)531-554；McFarlane，I.G.，Clin.Sci.64(1983)127-135；Baenziger，J.U.，Am.J.Path.121(1985)382-391；Chan，V.T.，和Wolf，G.，Biochem.J.247(1987)53-62；Wright，A.，等人，Glycobiology 10(2000)1347-1355；Rifai，A.，等人，J.Exp.Med.191(2000)2171-2182；Zukier，L.S.，等人，Cancer Res.58(1998)3905-3908)以及生物比活性(Jefferis，R.，和Lund，J.，在Antibody Engineering中，由Capra，J.D.编辑，Chem.Immunol.Basel，Karger，65(1997)111-128)。
Lim，A.，等Anal.Biochem.375(2008)163-172中报道了具有两个N连接的糖基化位点的治疗性重组单克隆抗体的糖基化分析，其应用与杂合四极飞行时间质谱仪连用的液相色谱法。Nandakumar，K.S.和Holmdahl，R.，Trends.Immunol.29(2008)173-178报道了通过注射酶从而在体内切割或修饰IgG的可能性。链球菌蛋白酶Ides调节细菌IgGFc结合，并且产生具有启动多形核白细胞能力的1/2Fc片段，这在J.J.和vonPawel-Rammingen，U.，Mol.Immunol.45(2008)3347-3353中得以报道。Bennet，K.L.，等人，Anal.Biochem.245(1997)17-27报道了通过电喷雾电离质谱法监测单克隆抗体的木瓜蛋白酶消化。
发明概述
本发明一个方面是确定人IgG1(huIgG1)或IgG2(huIgG2)或IgG4(huIgG4)亚类免疫球蛋白或鼠IgG2a(muIgG2a)或IgG2b(muIgG2b)或IgG3(muIgG3)亚类免疫球蛋白的糖基化模式或位点特异性糖基化模式的方法，其包括以下步骤：
a)用酶IdeS消化免疫球蛋白；
b)通过反相高效液相色谱法分离a)中获得的免疫球蛋白片段；
c)对b)中获得的分离的免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及
d)从c)中获得的质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化模式。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤b)和c)：
b)通过尺寸排阻色谱法对免疫球蛋白片段脱盐；
c)将脱盐的片段直接用于质谱分析。
在一个其他实施方案中，根据本发明的方法包括步骤a)：
a)通过用酶IdeS进行酶消化将免疫球蛋白切割为片段，并用羧肽酶B处理免疫球蛋白片段。
在另一实施方案中，根据本发明的方法在步骤a)之后及步骤b)之前包括步骤ab)，其为：
ab)用甲酸和还原剂处理步骤a)的经消化的免疫球蛋白。
发明详述
本发明涉及通过应用酶IdeS和质谱分析，确定人IgG1(huIgG1)或IgG2(huIgG2)或IgG4(huIgG4)亚类免疫球蛋白或鼠IgG2a(muIgG2a)或IgG2b(muIgG2b)或IgG3(muIgG3)亚类免疫球蛋白的糖基化模式的方法。
已发现使用IdeS提供了高度可重复的切割，甚至在非还原条件下也如此。此外，可在质谱分析中省略添加TFA(三氟乙酸)，即可在不存在三氟乙酸的情况下进行质谱分析。而且，IdeS的使用是不受限的，例如，其可用于在溶液中消化免疫球蛋白。
ESI-MS技术通常在完整免疫球蛋白或免疫球蛋白重链的水平上进行，并且对大蛋白质提供较低的质谱解析。木瓜蛋白酶消化的免疫球蛋白的ESI-MS分析是受限的，这是因为该酶的低特异性以及其活化需要半胱氨酸，这导致形成副产物，即干扰数据分析的人工产物，例如通过还原反应产生。在肽作图技术中，不得不进行相对复杂的样本制备，并且定量分析很困难，这尤其是因为盐加合物的形成。
一般地，所有的色谱方法需要物质标记，某些聚糖的共洗脱难以避免。此外，区分在Fc片段以及在Fb片段中糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式是不可能的。
“多肽”是由氨基酸组成的聚合物，所述氨基酸由肽键连接在一起。其可以是通过酶解或合成产生的。含有小于20个氨基酸的多肽也称为“肽”。“蛋白质”是大分子，其含有两个或多个多肽，或者它是包含超过100个氨基酸的多肽。多肽也可以含有非肽组分，例如诸如碳水化合物。非肽修饰物是通过表达该多肽的细胞引入的，并且因此取决于细胞类型。在本申请中，多肽是通过它们的氨基酸序列来定义的。修饰物(诸如碳水化合物)没有明确描述，但可能总是存在。
本申请中同义应用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”表示含有至少两条轻多肽链(轻链，LC)和两条重多肽链(重链，HC)的分子。每条轻链和重链包含可变区(通常是链的氨基端)，其含有结合抗原的结合结构域。每条重链和轻链包含恒定区(通常是链的羧基端)，其介导抗体与不同受体结合。轻链通常包含可变结构域VL和恒定结构域CL。重链通常包含可变结构域VH和恒定区，恒定区又包含结构域CH1、铰链区、CH2、CH3和任选的CH4。抗体可以以多种形式存在，例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)(例如Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird，R.E.等人，Science 242(1988)423-426；和Hood，L.E.等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第2版(1984)以及Hunkapiller，T.和Hood，L.，Nature 323(1986)15-16)。取决于重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白分为多个类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类中的一些进一步细分为亚类(同种型)，例如IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；或者IgA分为IgA1和IgA2。取决于抗体所属的类，将重链恒定区称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。
通用色谱方法是本领域技术人员已知的，例如Chromatography(色谱)，第5版，A部：Fundamentals and Techniques(原理与技术)，Heftmann，E.(编辑)，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences(生物科学中的高等色谱和电迁移方法)，Deyl，Z.(编辑)，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands，(1998)；Chromatography Today(今日色谱)，Poole，D.F.和Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1991)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(蛋白质纯化：原理与实践)(1982)；Sambrook，J.等人(编辑)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；或Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学最新方法)，Ausubel，F.M.等人(编辑)，JohnWiley & Sons，Inc.，New York。
免疫球蛋白降解酶IdeS是在GP(S)基序高特异性切割IgG的半胱氨酸蛋白酶，已发现其可与LC-MS(与质谱联用的液相色谱法)联用，用于免疫球蛋白的详细的位点特异性糖基化模式表征。
已发现在2小时消化过程中，IdeS切割抗体，产生两个HC-Fc片段，也称为HC-Fc片段(包含免疫球蛋白重链的C-端部分)，以及Fab2片段，也称为Fab2片段(包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的N-端部分)。这一方法尤其适用于分析在Fc片段中糖基化的或在Fc片段及Fab2片段中糖基化的免疫球蛋白的糖基化模式。对于次级糖基化位点的分析，可还原IdeS消化产物。还可能用这一方法分析降解产物。酶处理后，使该样品进行LC-MS分析，所述分析包括反相高效液相色谱(RP-HPLC)和在QTOF仪器(四极飞行时间质谱仪)上的在线MS分析。根据本发明的方法例如可用于产品批次表征、监测下游加工步骤以及监测发酵过程，甚至无需样本提纯(clean-up)。
免疫球蛋白的CH2结构域N-端区域的GP(S)基序对用IdeS的消化是必需的。本文所使用的术语HC-Fc片段是指通过IdeS消化得到的免疫球蛋白重链的C-端片段，以及术语Fab2片段是指通过IdeS消化得到的免疫球蛋白的N-端片段，其包括完整的轻链。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法是用于表征嵌合或人源化IgG，即IgG1、IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白或其变体，以及用于鼠IgG的某些亚类，即IgG2a、IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白或其变体。在一个实施方案中，在稍碱性pH进行消化2小时。为分析Fab2片段的糖基化模式，在一个实施方案中应用TCEP在酸性条件下进行额外的还原步骤，进行半小时。随后如下文以及实施例中所述使样本进行LC-MS分析。
已发现，与在完整的免疫球蛋白重链或甚至完整的免疫球蛋白水平的糖基化模式分析相反，该方法具有更高的质量精确度、分辨率和敏感度的优点。与其他酶例如木瓜蛋白酶或受限的LysC消化相比较，IdeS显示出具有独特的切割位点的优点，并且因此是高度特异的以及以类似的效率切割不同的亚类。不存在过度切割的风险，并且酶的活化不需要半胱氨酸。为分析降解产物，还原IdeS消化产物以产生三种抗体片段：全长免疫球蛋白轻链、两个重链Fab片段(HC Fab片段)和重链Fc片段(HC Fc片段)。可通过色谱层析分离该三个种类，并逐个分析。这一方法是确定免疫球蛋白的Fc片段或Fab片段中是否存在/发生了降解(诸如氧化、脱酰胺作用或片段化)的简单快速方法。某些降解反应，例如诸如氧化，导致保留时间的轻微移动，并且因此可用于快速监测来自制剂的样本，以及通过应用UV吸收检测进行稳定性研究，这也是本发明的一个方面。在一个实施方案中，根据本发明的方法包括用尺寸排阻色谱法脱盐的步骤，以及直接质谱法分析脱盐分子混合物。
免疫球蛋白的特异性切割
单克隆免疫球蛋白是非常大的蛋白质，并且由于它们重链的糖结构，它们是非常不均一的(微不均一性)。对于降解产物的形成和/或修饰物，为了检查免疫球蛋白的糖基化模式，在糖结构分析前将它们切割成更小的片段，这是有利的。
二硫键的切割
免疫球蛋白分子中存在的所有二硫键均可通过还原来切割。在还原过程中获得免疫球蛋白的游离的重链和轻链。三(2-羧基乙基)-膦(TCEP)是常用的还原剂，因为免疫球蛋白所有的二硫键在短时间内完全被切割，并且还原在整个pH范围内均可发生(参见例如Hau，J.C.和Hau，C.Y.，Anal.Biochem.220(1994)5-10)。在一个实施方案中，pH范围从1.5至8.5。二硫苏糖醇(DTT)也具有快速切割二硫键的特征。但是，DTT还原在酸性环境中进行很差。为了完全分离重链和轻链，变性步骤通常是必要的。变性还使得二硫基更易受影响。在一个实施方案中，变性可以例如借助胍/盐酸或甲酸来进行。
酶切割
木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，其相对非特异地切割精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后的肽键。如果温育期间足够或太长，木瓜蛋白酶消化导致免疫球蛋白的完全水解。但是，免疫球蛋白可以通过受限的蛋白水解相对选择性地在它们的铰链区被切割(Lottspeich，F.和Engels，J.W.，Bioanalytik SpektrumAkademischer Verlag，Munich，第二版(2006)201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N-端侧。二硫键在该过程中是得到保留的，从而获得三个片段(2个Fab片段、1个Fc片段)。两个N-端片段称为抗原结合片段(Fab片段，Fab，抗原结合片段)，C-端片段称为结晶片段(Fc片段，Fc，结晶片段)。每个Fab片段包含完整的轻链和氨基端的半个重链。Fc片段包含两个仍然通过二硫键连接在一起的羧基端的半个重链。
IdeS(化脓链球菌的免疫球蛋白G-降解酶)是细胞半胱氨酸蛋白酶，其可以从致病细菌化脓链球菌中分离。该酶直接在序列GP(SVFLFP)(即GP(S)基序)前高特异性切割人IgG。该序列位于将两条重链(HC)连接在一起的二硫键的C-端侧。切割产生两条重链的C-末端(2个HC-Fc片段)和一个Fab2片段，所述Fab2片段包含通过二硫键连接的轻链和重链的Fab片段(图1)(von Pavel-Rammingen，U.等人，EMBO Journal 21(2002)1607-1615)。如果将免疫球蛋白通过IdeS切割获得的片段在消化之后用DTT或TCEP还原，那么获得抗体的两条轻链(2LC)和两条重链的N-端片段(2HC Fab片段)，而不是Fab2片段。重链的C-末端(HC-Fc)不受还原的影响。
用于免疫球蛋白切割的通常使用的木瓜蛋白酶切割铰链区的N-端。因此，木瓜蛋白酶消化必须还原，并在质谱的相同的m/z范围内出现所有三个Ab片段(Fc、LC和HC Fab)。
本发明的一个方面是确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白、或其变体的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：
a)通过用酶IdeS处理消化免疫球蛋白；
b)通过反相高效液相色谱法分离通过酶消化获得的免疫球蛋白的酶切割片段；
c)对步骤b)中获得的分离的免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及
d)从步骤c)中获得的质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化模式。
已发现，通过使用特异性切割酶IdeS代替例如使用LysC或木瓜蛋白酶的限制性蛋白水解，可获得确定的免疫球蛋白片段，其非常适于确定免疫球蛋白的糖基化模式。
本申请中使用的术语“糖基化模式”是指与免疫球蛋白中一个或多个特定氨基酸残基连接的作为一个整体的寡糖。由于细胞糖基化的不均一性，重组产生的免疫球蛋白不仅包含在特定氨基酸残基上的单个、确定的N-或O-连接的寡糖，而是多肽的混合物，每一个多肽具有相同的氨基酸序列但在特定的氨基酸位置包含不同组成的寡糖。因此，上述术语表示与重组产生的免疫球蛋白的一个或多个特定氨基酸位置连接的一组寡糖，即连接的寡糖的不均一性。本申请所使用的术语“寡糖”是指包含两个或多个共价连接的单糖单位的聚糖。
在根据本发明的一个方法中，在第一个步骤中用酶IdeS消化/切割待确定其糖基化模式的免疫球蛋白为HC Fc片段和Fab2片段。如果需要确定Fab2片段中糖基化位点的糖基化模式，在根据本发明方法的一个实施方案中，用还原剂还原免疫球蛋白二硫键。在酶切割和任选地还原步骤后，酸化溶液以诱导两个重链Fc片段的解离。在一个实施方案中，在还原免疫球蛋白二硫键相同的步骤中进行酸化。通过反相HPLC(RP-HPLC)分离获得的片段。为确定糖基化模式，使含有免疫球蛋白的解离的重链Fc片段和任选的Fab2-或Fab片段的样本进行质谱(MS)分析。应用MS分析的结果，确定免疫球蛋白的糖基化模式。在一个实施方案中，在除RP-HPLC之外的分开的步骤中进行MS分析(离线)。在另一实施方案中，在RP-HPLC之后直接进行MS分析(在线)，即将RP-HPLC的洗脱液直接引入MS设备中。
在离线方法中，Fc糖基化模式确定包括SEC(尺寸排阻色谱法)脱盐步骤，以及将样本直接输注至质谱仪。这一方法极快，能够高通量，并且得益于在免疫球蛋白HC Fc片段的水平分析寡糖的高解析度、精确度和敏感性。糖基化HC Fc片段在质谱中出现在800至2000的m/z范围内(例如参见图2)，而Fab2片段由于其双倍重量而出现在1900至3000m/z范围内(例如参见图3)。因此免疫球蛋白的这两个片段可通过质谱分离，这是有助于数据解释的效果。
因此，本发明的一个方面是确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白、或其变体的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：
a)通过用酶IdeS处理消化免疫球蛋白；
b)通过尺寸排阻色谱法对通过酶消化获得的免疫球蛋白酶切割片段脱盐；
c)对步骤b)中获得的分离的免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及
d)从步骤c)中获得的质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化模式。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括作为步骤a)的以下步骤：
a)通过用酶IdeS和用羧肽酶B处理，从而消化免疫球蛋白，
在这一实施方案中，通过酶IdeS切割免疫球蛋白，以获得HC Fc片段和Fab2片段，并且在相同的步骤中移除免疫球蛋白重链的C-端赖氨酸，以减少免疫球蛋白的不均一性，即获得更均一的样本，而不影响糖基化模式。
本申请中使用的术语“Fab2片段”是指通过用酶IdeS酶切割获得的免疫球蛋白的N端部分。本申请中使用的术语“HC Fc片段”是指通过用酶IdeS酶切割获得的免疫球蛋白重链的C端部分。这一片段包含两个没有共价连接的多肽，即，每一个重链的C端片段。由于酶IdeS在与木瓜蛋白酶和胃蛋白酶不同的位置上、且仅在免疫球蛋白的单个位点切割免疫球蛋白，因此仅获得两个但明确定义的免疫球蛋白片段。
在另一实施方案中，该方法在步骤a)之后及步骤b)之前包括步骤a1)，其为：
a1)用甲酸处理通过步骤a)的酶消化获得的酶切割的免疫球蛋白片段。
在这一实施方案中，通过酶IdeS切割从免疫球蛋白获得的包含彼此不共价连接的多肽的Fc片段被分离为两个pFc片段。本申请中使用的术语“pFc片段”是指用酶IdeS酶切割后从免疫球蛋白重链获得的单个C端多肽。
在另一实施方案中，根据本发明的方法的步骤a1)是
a1)用甲酸和还原剂处理通过步骤a)的酶消化获得的酶切割的免疫球蛋白片段。
在这一实施方案中，通过还原连接的二硫键，将用酶IdeS酶切割免疫球蛋白后获得的Fab2片段进一步分离为两个Fab片段。在一个实施方案中，在添加还原剂的同时添加甲酸。在另一实施方案中，所述还原剂是TCEP溶液。在这一实施方案中，甲酸和TCEP溶液均在温育之前添加，因此两个成分均在单步骤中存在。
根据本发明的方法包括将含有待确定其糖基化模式的免疫球蛋白的样品与不同的酶和试剂温育。这些化合物和试剂用于将样品中包含的免疫球蛋白转化为确定的片段。在该方法的一个实施方案中，IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS是获自化脓链球菌或齿垢密螺旋体的IdeS。在进一步优选的实施方案中，IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，用IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶的酶切割在pH范围从pH 5.5至8.5之间进行。在一个实施方案中，酶切割在pH范围从pH 7.0至8.0之间。还发现IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶与免疫球蛋白分子的摩尔比应该在1∶25至1∶2500之间，在另一实施方案中，在1∶25至1∶100之间。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，将反相高效液相色谱法或尺寸排阻色谱的洗脱液直接输注至质谱仪。
若在根据本发明的方法中，必须确定免疫球蛋白Fab片段中的糖基化模式，则该方法包括以下步骤：
a)通过用酶IdeS处理消化免疫球蛋白；
b)用甲酸和还原剂处理步骤a)的酶切割的免疫球蛋白；
c)通过反相高效液相色谱法分离获得的所述免疫球蛋白的片段和/或通过尺寸排阻色谱法对获得的片段脱盐；
d)通过直接输注至质谱仪，对步骤c)中获得的分离的免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及
e)从步骤d)中获得的质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化模式。
本发明的另一个方面是确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的重组产生的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：
a)提供重组产生的免疫球蛋白样本；
b)通过用酶IdeS处理消化免疫球蛋白；
c)用甲酸和还原剂处理步骤b)的酶切割的免疫球蛋白；
d)通过反相高效液相色谱法分离获得的所述免疫球蛋白的片段和/或通过尺寸排阻色谱法对获得的片段脱盐；
e)通过直接输注至质谱仪，对步骤d)中获得的分离的免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及
f)从步骤e)中获得的质谱数据确定免疫球蛋白的糖基化模式。
本发明的另一方面是用于产生IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的Fab2片段或Fab片段的方法，其包括以下步骤：
a)提供从其中获得Fab2片段或Fab片段的免疫球蛋白；
b)通过用酶IdeS消化而切割所述免疫球蛋白；
c)若欲产生Fab片段，则用甲酸和还原剂处理步骤b)的所述酶切割的免疫球蛋白；
d)通过使用A蛋白色谱或尺寸排阻树脂的色谱法产生所述Fab2片段或所述Fab片段。
为纯化重组产生的异种免疫球蛋白，通常采用不同柱色谱步骤的组合。在一个实施方案中，在A蛋白亲和色谱之后采用一个或两个其他的色谱分离步骤，例如离子交换色谱步骤。最终的纯化步骤也称为“精制步骤”，用于移除痕量杂质和污染物，例如聚集的免疫球蛋白、残余HCP(宿主细胞蛋白)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒和/或内毒素。对于这一精制步骤，通常在流通模式中使用阴离子交换色谱材料。
已很好地建立了不同的方法并广泛应用于蛋白质回收和纯化，诸如应用微生物蛋白质的亲和色谱(例如，A蛋白或G蛋白亲和色谱)、离子交换色谱(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合模式交换)、嗜硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳香吸附色谱(例如，应用苯基琼脂糖凝胶、亲杂氮芳基树脂(aza-arenophilic resin)、或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如，应用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱法和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
在一个实施方案中，该办法包括在适于表达异源免疫球蛋白的条件下培养包含编码该免疫球蛋白的核酸的真核细胞。术语“在适于表达免疫球蛋白的条件下”是指用于培养表达免疫球蛋白的哺乳动物细胞的条件，并且其对本领域技术人员而言是公知的或可容易地确定。本领域技术人员还公知这些条件可依据所培养的哺乳动物细胞类型以及依据所表达的免疫球蛋白类型而不同。一般地，例如在20℃至40℃之间的温度培养哺乳动物细胞，并且培养足以允许有效产生免疫球蛋白的时间，例如4至28天。
本发明的另一方面是通过应用根据本发明的方法监测重组产生的免疫球蛋白的糖基化模式的方法。
本发明的另一方面是用于产生蛋白质的方法，其包括以下步骤：
a)用酶IdeS酶切割蛋白质-免疫球蛋白融合蛋白，并由此产生该蛋白质。
提供了以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中提出。应当理解，在不背离本发明的精神下可对提出的方法进行改变。
序列表说明
SEQ ID NO：1来自化脓链球菌的IdeS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2CH1处开始且在CH2处结束的鼠IgG2a免疫球蛋白序列。
SEQ ID NO：3CH1处开始且在CH2处结束的鼠IgG3免疫球蛋白序列。
SEQ ID NO：4人IgG1恒定区。
SEQ ID NO：5人IgG4恒定区。
附图描述
图1：IgG1免疫球蛋白的IdeS消化的示意图。
图2：通过SEC和直接输注至质谱仪分析的经IdeS切割的人IgG1的质谱。该质谱仅显示了糖基化的Fc片段。
图3：通过SEC和直接输注至质谱仪分析的经IdeS切割的人IgG1的质谱。该质谱显示了糖基化的Fc片段和Fab2片段。
图4：IdeS消化且经还原的鼠IgG3免疫球蛋白的色谱图。
图5：鼠IgG3免疫球蛋白的在铰链区中具有O糖基化的重链Fab片段的放大质谱。
图6：鼠IgG3免疫球蛋白的具有N糖基化的重链Fc片段的放大质谱。
图7：从LC-MS获得的O糖基化胰蛋白酶肽(tryptic peptide)(IPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPK(HC＝重链，氨基酸(aa)217-247；S和T：可能的O糖基化位点)的去卷积质谱。
图8：IdeS消化的人源化IgG4免疫球蛋白的色谱图。
图9：人源化IgG4免疫球蛋白的具有N糖基化的重链Fc片段的放大质谱。
图10：IdeS消化的人源化IgG1免疫球蛋白的色谱图。
图11：人源化IgG1免疫球蛋白的具有N糖基化的重链Fc片段的放大质谱。
图12：IdeS消化的人源化IgG1免疫球蛋白的色谱叠加图，所述免疫球蛋白取自培养物上清液和A蛋白纯化的样本。
图13：IdeS消化的人源化IgG1免疫球蛋白的质谱叠加图，所述免疫球蛋白取自培养物上清液和A蛋白纯化的样本(保留时间：16.8分钟)。
图14：IdeS消化的人源化IgG1免疫球蛋白的放大的质谱叠加图，所述免疫球蛋白取自培养物上清液和A蛋白纯化的样本(保留时间：16.8分钟)。
图15：完整免疫球蛋白、Fab2片段和标准品的分析尺寸排阻色谱叠加图。
实施例1
确定抗体浓度
抗体浓度通过在UVIKON XL型分光光度计(Goebel Company)上测量280nm处的吸收来测定。所用的抗体的消光系数是1.55ml/(mg＊cm)并且根据Pace，C.N.等人(Protein Sci.4(1995)2411-2423)的方法来计算。
实施例2
一般方法A(用于IgG1、IgG3)
分析Fc片段糖基化模式的IdeS消化
将100μg(0.66nmol)免疫球蛋白在50mM TRIS/HCl缓冲液pH 8.0中稀释至1mg/ml的终浓度，并添加2μl(c＝1mg/ml，0.06nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，以得到重量比为1∶50的酶与免疫球蛋白之比。取决于所使用的免疫球蛋白，将该溶液在37℃温育2至5小时。为了用尺寸排阻色谱法分析以及直接输注至质谱仪，通过添加等体积的1％甲酸至该溶液终止酶活性。
还原IdeS消化的免疫球蛋白，用于Fab片段的糖基化模式的额外分析
为了还原，将一半样本用64μl 100mM的磷酸钾缓冲液pH 7.0稀释，得到115μl终体积。然后，加入60μl溶解于一体积4M盐酸胍中的0.5MTCEP(三(2-羧基乙基)膦，Pierce)和50ml 8M盐酸胍。随后，在37℃温育该样本30分钟。通过添加5μl 20％(v/v)甲酸终止反应。
实施例3
一般方法B(用于IgG1、IgG3、IgG4)
联合IdeS和CpB消化：
将100μg(0.66nmol)免疫球蛋白在50mM TRIS/HCl缓冲液pH 8.0中稀释至1mg/ml的终浓度，并添加2μl(c＝1mg/ml，0.06hmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，以得到重量比为1∶50的酶与免疫球蛋白之比。取决于所使用的免疫球蛋白，将该溶液在37℃温育2至5小时。在IdeS温育时间结束之前30分钟，添加1μl(1mg/ml)羧肽酶B(CpB，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)至该溶液，得到重量比为1∶25的酶与免疫球蛋白之比。
实施例4
一般方法C(用于具有复杂糖基化模式的IgG)
联合IdeS和EndoH消化：
将25μg(0.17nmol)免疫球蛋白在pH 6.0的磷酸钠缓冲溶液中稀释至0.5mg/ml的终浓度，并添加2.5μl(c＝2.5U/500μl)的内切糖苷酶H(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)，在37℃温育18h，以切割寡糖结构。随后，通过添加25μl 0.1M TRIS/HCl缓冲液pH 8.0将pH调节至8.0。通过添加0.5μl(c＝1mg/ml，0.02nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，并在37℃温育2h，实现免疫球蛋白的切割。
实施例5
一般方法D(用于培养上清液)
联合IdeS和CpB消化：
将50μg(0.33nmol)表达免疫球蛋白的真核细胞的培养上清液在10,800rcf(相对离心力)离心3分钟，并在50mM TRIS/HCl缓冲液pH 8.0中稀释至0.7mg/ml的终浓度。添加1μl(c＝1mg/ml，0.06nmol)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，以得到重量比为1∶50的酶与免疫球蛋白之比。取决于所使用的免疫球蛋白，将该溶液在37℃温育2至5小时。在IdeS温育时间结束之前30分钟，添加1μl(1mg/ml)羧肽酶B(CpB，RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)至该溶液，得到重量比为1∶25的酶与免疫球蛋白之比。
实施例6
RP-HPLC-MS方法
在与QTOF II(Micromass/Waters)偶联的Agilent Cap LC1100上进行LC-MS。在Phenomenex Jupiter C18柱(5μm粒度、孔大小，1x250mm柱)进行色谱分离。洗脱液A是0.5％甲酸，洗脱液B是70％异丙醇、20％乙腈、9.5％水和0.5％甲酸。流速是40μl/分钟，在75℃进行分离，将根据实施例2-5之一的方法获得的2μg(10μl)免疫球蛋白注射至柱上。使用了以下梯度：
  时间(分钟)   ％B
  0   20
  7   20
  9   25
  29   50
  32   100
  37   100
  38   20
  50   20
在首先的7分钟，将洗脱液引入废弃物，以避免质谱离子源受盐污染物影响。记录280nm(参考360nm)处的UV信号。应用120℃的去溶剂化温度和80℃的源温度，在阳离子模式中在600至2000m/z的质量范围应用2,700V的毛细管电压和30V的锥形电压获得MS质谱。从7至50分钟获得MS数据。
实施例7
通过直接输注糖基化分析IdeS切割的抗体
尺寸排阻色谱法
将45μg(90μl)根据实施例2-5之一的方法获得的IdeS切割的免疫球蛋白注入Sephadex G25自填装ECO SR柱(5x250mm)(KronLab)上，所述柱用2％甲酸、40％乙腈以0.5ml/分钟的流速平衡30分钟。用2％甲酸、40％乙腈以1ml/分钟的流速8分钟等度洗脱对蛋白质脱盐。通过Uv(280nm)记录脱盐蛋白的洗脱，并通过级分收集器将样本收集至微量滴定板中。该微量滴定板可***TriversaNanoMate(Advion)***并自动记录MS谱，或可人工地将样本吸入金属包被的玻璃针头(Proxeon BiosystemsNano ESI-needles，cat#ES387)中，并喷射至质谱仪中。
用于在QTOF II仪器上直接输注的MS参数(微质量/水)
应用120℃的去溶剂化温度和80℃的源温度，在阳离子模式中在600至2000m/z的质量范围(糖基化的Fc片段)应用800V的毛细管电压和33V的锥形电压获得MS质谱。在约2分钟获得MS数据。
实施例8
鼠IgG3免疫球蛋白的糖基化分析
在这一实施例中用鼠IgG3免疫球蛋白例证了根据本发明的方法。这一免疫球蛋白具有两个糖基化位点，一个位于Fab片段，一个位于Fc片段。
IdeS消化并还原的鼠IgG3免疫球蛋白的色谱图显示于图4。在铰链区中具有O糖基化的重链Fab片段的放大质谱显示于图5，而具有N糖基化位点的重链Fc片段的放大质谱显示于图6。在图7中，与糖基化模式一起显示了O糖基化胰蛋白酶肽(tryptic peptide)的去卷积质谱。
实施例9
人源化IgG4免疫球蛋白的糖基化分析
在这一实施例中用包含人IgG4免疫球蛋白恒定区的人源化免疫球蛋白例证了根据本发明的方法。这一免疫球蛋白具有一个位于Fc片段的N糖基化位点。
IdeS消化的人源化IgG4免疫球蛋白的质谱图显示于图8。具有N糖基化位点的重链Fc片段的放大质谱显示于图9。
实施例10
人源化IgG1免疫球蛋白的糖基化分析
在这一实施例中用包含人IgG1免疫球蛋白恒定区的人源化免疫球蛋白例证了根据本发明的方法。这一免疫球蛋白具有一个位于Fc片段的N糖基化位点。
IdeS消化的人源化IgG1免疫球蛋白的色谱图显示于图10。具有N糖基化位点的重链Fc片段的放大质谱显示于图11。
实施例11
来自培养上清液的人源化IgG1免疫球蛋白的糖基化分析
在这一实施例中用包含人IgG1免疫球蛋白恒定区的人源化免疫球蛋白例证了根据本发明的方法，其中用于分析的样本从培养物的培养上清直接获得，没有进一步纯化。这一免疫球蛋白具有一个位于Fc片段的N糖基化位点。这一实施例显示了可应用根据本发明的方法作为在培养真核细胞期间监测糖基化的在线工具。
与用A蛋白色谱法纯化的样本相比较，IdeS消化的来自培养上清液的样本的色谱图显示于图12。可看出，在色谱图相同的点洗脱重链Fc片段。A蛋白纯化的样本的色谱图不含有免疫球蛋白轻链，因为在A蛋白色谱法期间移除了轻链。
实施例12
人源化IgG1的Fab2片段的产生
将100μg免疫球蛋白在50mM TRIS/HCl缓冲液pH 8.0中稀释至1mg/ml的终浓度，并添加18μl(c＝11.3mg/ml)免疫球蛋白降解酶(IdeS，MW 345890Da)，以得到重量比为1∶50的酶与免疫球蛋白之比。将该溶液在37℃温育0.5至2小时，同时搅拌。紧接着IdeS温育后，应用A蛋白HP高俘获柱进行A蛋白柱色谱。缓冲液A是pH 7.4的磷酸盐缓冲的盐水，缓冲液B是100mM柠檬酸钠缓冲液pH 2.8，流速为1ml/分钟。从柱的流通获得Fab2片段，而通过用缓冲液B洗脱获得Fc片段。当通过尺寸排阻色谱法确定时，获得的级分具有84％至95％的纯度。可用具有120ml体积的Superdex 75 HighLoad 16/60柱进行尺寸排阻色谱法，从而进行进一步的纯化步骤。作为缓冲液，以1ml/分钟的流速应用具有140mM氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)。如可从图15看出的那样，已将最初完整的抗体转化为其Fab2片段。

Claims (5)

1.确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白、或它们的变体的糖基化模式的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段，并用羧肽酶B处理所述免疫球蛋白；
b)用甲酸和TCEP处理步骤a)的所述酶切割的免疫球蛋白；
c)通过反相高效液相色谱法分离通过步骤b)的酶消化获得的所述免疫球蛋白的片段；
d)对步骤c)中获得的分离的所述免疫球蛋白片段进行质谱分析，其中所述质谱分析在不存在三氟乙酸下实施；以及
e)从步骤d)中获得的质谱数据确定所述免疫球蛋白的糖基化模式。
2.确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的Fab2片段的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：
a)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段，并用羧肽酶B处理所述免疫球蛋白；
b)用甲酸和TCEP处理步骤a)的所述酶消化的免疫球蛋白；
c)通过反相高效液相色谱法分离步骤b)获得的所述免疫球蛋白的片段；
d)通过直接输注至质谱仪，对步骤c)中获得的分离的所述免疫球蛋白片段进行质谱分析，其中所述质谱分析在不存在三氟乙酸下实施；以及
e)从步骤d)中获得的质谱数据确定所述Fab2片段的糖基化模式。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述切割在pH5.5至pH8.5的pH范围内进行。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述切割进行2小时。
5.根据权利要求1或2的方法，其特征在于IdeS与免疫球蛋白分子的摩尔比是1:25至1:2500之间。
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