JP2012217443A - Metal ion supply system - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a metal ion supply system that can supply metal ions by completely separating metal ions from metal nanoparticles in liquid.SOLUTION: Fine particles 2 are solid-phased on a base material 1, and a part of the surface of each fine particle 2 is coated with a nano-metal layer 3. The base material 1 may be a base of a container or a substrate. Metal ions generated based on the nano-metal layers 3 can be supplied by immersing metal-attached fine particles 10 in liquid.

Description

本発明は、金属イオン又は金属ナノ粒子が生物個体群や生物群集に与える影響を試験する場合等に用いられる金属イオン供給システムに関する。   The present invention relates to a metal ion supply system used when testing the influence of metal ions or metal nanoparticles on a biological population or a biological community.

最近、使用・廃棄されるナノ材料によって生じる人健康・環境・生態系へのリスクが懸念されている。化学物質の毒性評価にはＯＥＣＤテストガイドライン等で定められた方法があるが、ナノ材料の毒性評価については、多くが難溶、不溶であることを含めて従来法の盲点を突いた形となっている。   Recently, there are concerns about risks to human health, the environment, and the ecosystem caused by nanomaterials that are used and disposed of. There are methods defined in the OECD test guidelines for the toxicity assessment of chemical substances, but the toxicity assessment of nanomaterials is in the form of blind spots of conventional methods, including the fact that many are hardly soluble or insoluble. ing.

すなわち、主原料が既存化学物質（炭素、金属など）であること、ナノサイズに基づく特異的な酸化活性による毒性を評価する試験法がないことなどである。毒性のスクリーニング及びメカニズムの解明が試験法確立と毒性評価のために必須である。   That is, the main raw material is an existing chemical substance (carbon, metal, etc.), and there is no test method for evaluating toxicity due to specific oxidation activity based on nanosize. Toxicity screening and mechanism elucidation are essential for establishing test methods and evaluating toxicity.

金属ナノ粒子の中でも、特に、酸化活性によるものとされる高い抗菌活性を持つ銀ナノ粒子は、使用・廃棄後に排水に混入した場合、下水処理場の生物処理（活性汚泥）の機能低下を引き起こすことが知られている。さらに、銀ナノ粒子の水環境への流亡と水生生物（水生植物、藻類、ミジンコ、魚類）個体群への毒性による水圏生態系へのリスク及び生物多様性への影響が懸念されており、化学物質の安全性を国際的に評価するＯＥＣＤなどで議論されている。   Among metal nanoparticles, especially silver nanoparticles with high antibacterial activity attributed to oxidation activity cause deterioration of biological treatment (activated sludge) in sewage treatment plants when mixed into wastewater after use and disposal. It is known. Furthermore, there are concerns about the risks to aquatic ecosystems and the impact on biodiversity caused by the erosion of silver nanoparticles to the aquatic environment and toxicity to aquatic organisms (aquatic plants, algae, daphnia, fish) populations. It is discussed in OECD, which internationally evaluates the safety of substances.

銀ナノ粒子の毒性としては、活性汚泥の硝化作用阻害、藻類の光合成阻害、ミジンコへの取り込み、ゼブラフィッシュの胚発達阻害と孵化率低下が報告されている程度である。例えば、非特許文献１に示されるように、銀ナノ粒子によるファットヘッドミノーの胚への影響を実験したものがある。   Toxicity of silver nanoparticles has been reported to inhibit activated sludge nitrification, algae photosynthesis inhibition, incorporation into daphnia, zebrafish embryo development and hatchability reduction. For example, as shown in Non-Patent Document 1, there is an experiment on the effect of silver nanoparticles on fathead minnow embryos.

しかしながら、銀ナノ粒子の毒性作用機能及び生態リスクは未確認である。一方で、銀ナノ粒子の毒性について、銀ナノ粒子そのものは無害だが、ｐＨ依存的に解離する銀イオンによる影響が重要という報告がある。このため、解離銀イオンの影響も注目されているが、銀イオンのみの毒性試験法は確立していない。   However, the toxic function and ecological risk of silver nanoparticles have not been confirmed. On the other hand, regarding the toxicity of silver nanoparticles, there are reports that silver nanoparticles themselves are harmless, but the influence of silver ions that dissociate in a pH-dependent manner is important. For this reason, although the influence of dissociated silver ions has attracted attention, a toxicity test method using only silver ions has not been established.

銀ナノ粒子は、環境生態系への影響が懸念されるため、生物個体群へのリスク評価及び銀毒性が生物群集に与える影響を定量化する手法の確立がＯＥＣＤ等で求められている。   Since silver nanoparticles are concerned about the impact on the environmental ecosystem, OECD and others are required to establish a method for assessing the risk to living organisms and quantifying the impact of silver toxicity on living organisms.

Geoff Laban et al., Ecotoxicology (2010) 19:185-195 “The effects of silver nanoparticles on fathead minnow embryos”Geoff Laban et al., Ecotoxicology (2010) 19: 185-195 “The effects of silver nanoparticles on fathead minnow embryos”

生態リスクのガイドラインを策定するにあたり、標準物質としての銀ナノ粒子の作製方法を確立する必要がある。同じ貴金属である金ナノ粒子の場合には、様々なサイズ及び形状のコロイド粒子を作製するプロトコールが確立されているが、銀コロイドに関しては、入手可能なサイズ及び形状は極めて限定されている。   In developing ecological risk guidelines, it is necessary to establish a method for producing silver nanoparticles as reference materials. In the case of gold nanoparticles that are the same noble metal, protocols have been established for making colloidal particles of various sizes and shapes, but for silver colloids, the available sizes and shapes are very limited.

銀ナノ粒子の毒性メカニズムとして、銀ナノ粒子が細胞内に取り込まれることによる影響と、ｐＨ依存的に解離する銀イオンの２つの影響が考えられるが、液中に浮遊する銀ナノ粒子を用いる限り、区別することは困難である。   The toxicity mechanism of silver nanoparticles can be considered to be influenced by the incorporation of silver nanoparticles into cells and silver ions that dissociate in a pH-dependent manner, but as long as silver nanoparticles floating in the liquid are used. , Difficult to distinguish.

その他にも、ＴｉやＣｄ等による金属イオンの生体への影響等が議論されているが、同様に、液体中に浮遊する金属ナノ粒子を用いる限り、イオンと粒子を区別することは困難である。このように、イオン化可能な金属については、粒子とイオンとを定量的に分離できないという問題があった。   In addition, the influence of metal ions on living bodies caused by Ti, Cd, and the like has been discussed. Similarly, as long as metal nanoparticles floating in a liquid are used, it is difficult to distinguish ions from particles. . As described above, the ionizable metal has a problem that particles and ions cannot be separated quantitatively.

本発明は、上述した課題を解決するために創案されたものであり、液体中における金属ナノ粒子と金属イオンとを完全に分離して、金属イオンを供給できるようにした金属イオン供給システムを提供することを目的とする。   The present invention has been developed to solve the above-described problems, and provides a metal ion supply system capable of supplying metal ions by completely separating metal nanoparticles and metal ions in a liquid. The purpose is to do.

上記目的を達成するために、本発明の金属イオン供給システムは、微粒子上にナノ金属が形成された金属付着微粒子が吸着された基材を備え、前記金属付着微粒子を液体中に浸漬することで前記ナノ金属に基づいて発生する金属イオンを供給することを主要な特徴とする。   In order to achieve the above object, the metal ion supply system of the present invention comprises a base material on which metal-attached fine particles having nanometals formed on fine particles are adsorbed, and the metal-attached fine particles are immersed in a liquid. The main feature is to supply metal ions generated based on the nanometal.

本発明によれば、液体中に浸漬される金属付着微粒子は、基材上に吸着されているために、通常の状態では液体中で剥離することがなく、浮遊金属ナノ粒子となることがない。一方、液体中に浸漬された金属付着微粒子のナノ金属からは、金属イオンが解離して液体中に拡散する。したがって、液体中には、金属ナノ粒子が存在せずに、解離金属イオンのみとなり、この金属イオンだけを、例えば、細胞や生体組織に供給することができる。   According to the present invention, since the metal-attached fine particles immersed in the liquid are adsorbed on the base material, the metal-attached fine particles are not peeled in the liquid in a normal state and do not become floating metal nanoparticles. . On the other hand, metal ions are dissociated and diffused into the liquid from the nanometal of the metal-attached fine particles immersed in the liquid. Therefore, in the liquid, metal nanoparticles are not present, and only dissociated metal ions are present, and only these metal ions can be supplied to, for example, cells or living tissues.

本発明の金属イオン供給システムに用いられる固相化された金属付着微粒子を示す断面図である。It is sectional drawing which shows the solid-phased metal adhesion fine particle used for the metal ion supply system of this invention. 金属イオン供給システムの一製造工程を示す図である。It is a figure which shows one manufacturing process of a metal ion supply system. 金属イオン供給システムの一製造工程を示す図である。It is a figure which shows one manufacturing process of a metal ion supply system. 金属付着微粒子を容器の底面から剥離する方法を示す図である。It is a figure which shows the method of peeling a metal adhesion fine particle from the bottom face of a container. 細胞培養において細胞が解離金属イオンに晒された状態と、金属付着微粒子を取り込む状態を示す図である。It is a figure which shows the state in which the cell was exposed to the dissociated metal ion in a cell culture, and the state which takes in metal adhesion fine particle. 金属付着微粒子が固相化された基板を細胞培養に適用した構成を示す図である。It is a figure which shows the structure which applied the board | substrate with which the metal adhesion fine particle was solid-phased to cell culture. ｐＨと銀イオンとの関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between pH and a silver ion.

以下、図面を参照して本発明の一実施形態を説明する。構造に関する図面は模式的なものであり、現実のものとは異なる。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれている。   Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings. The drawings relating to the structure are schematic and different from the actual ones. Moreover, the part from which the relationship and ratio of a mutual dimension differ also in between drawings is contained.

図１は、本発明の金属イオン供給システムに用いられる基本的構造を示す。ガラス、プラスティックやシリコン等の基材１の上に、微小球形状の金属付着微粒子１０が形成されている。金属付着微粒子１０は、例えば、粒径３０ｎｍから１０μｍの微小球形状の微粒子２と微粒子２に付着したナノ金属層３とで構成されている。基板１上に微粒子２が固相化されており、微粒子２の表面の上半分程度がナノ金属層３で帽子状に被覆されている。微粒子２はポリマー又はシリカ粒子等で構成される。ナノ金属層３は、銀、アルミ、チタン、カドミウム等のイオン化可能な金属で構成されている。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％程度に形成される。   FIG. 1 shows the basic structure used in the metal ion supply system of the present invention. On a base material 1 such as glass, plastic or silicon, fine spherical metal-attached fine particles 10 are formed. The metal-attached fine particles 10 are composed of, for example, microsphere-shaped fine particles 2 having a particle diameter of 30 nm to 10 μm and a nanometal layer 3 attached to the fine particles 2. The fine particles 2 are solid-phased on the substrate 1, and the upper half of the surface of the fine particles 2 is covered with a nano metal layer 3 in a hat shape. The fine particles 2 are composed of polymer or silica particles. The nano metal layer 3 is made of an ionizable metal such as silver, aluminum, titanium, or cadmium. The nano metal layer 3 is formed with a thickness of about 1% to 200% with respect to the diameter of the fine particles 2.

本発明では、特性の評価を行いたい金属ナノ粒子の量と同じ量の基材上に固相化された金属付着微粒子１０を用意する。浮遊した金属ナノ粒子は、生体組織内に取り込まれる可能性があるのに対して、固相化された金属付着微粒子１０は取り込まれない。また、同じ個数の金属付着微粒子を集めさえすれば、その総面積は変わらずに一定であることから、金属付着微粒子に形成されたナノ金属から液体中に解離される金属イオンの濃度は、一定になる。したがって、金属付着微粒子の数を制御することにより、金属イオンの濃度を制御することができるとともに、金属イオンを安定的に供給できる。   In the present invention, the metal-attached fine particles 10 solid-phased on the base material in the same amount as the amount of the metal nanoparticles whose characteristics are to be evaluated are prepared. The suspended metal nanoparticles may be taken into the living tissue, whereas the solid-phased metal-attached fine particles 10 are not taken up. In addition, as long as the same number of metal-attached fine particles are collected, the total area remains constant and the concentration of metal ions dissociated into the liquid from the nanometal formed in the metal-attached fine particles is constant. become. Therefore, by controlling the number of metal-attached fine particles, the concentration of metal ions can be controlled and the metal ions can be supplied stably.

そこで、まず、容器を使ったシステムについて説明する。容器の基底（底面）に微粒子を吸着させるものである。すなわち、図１の基材１が容器の基底に相当する。培養用プレートなどの容器の基底表面上に粒径３０ｎｍから１０μｍの樹脂若しくはシリカの微粒子を単層として吸着させる。吸着の方法としては、基底表面と微粒子表面に官能基を導入し共有結合により微粒子を吸着させる方法がある。あるいは、イオン濃度を上昇させることにより、微粒子間の斥力を抑制することにより物理的に微粒子を吸着する方法がある。以下の実施例では、イオン濃度を上昇させることにより、微粒子間の斥力を抑制することにより物理的に微粒子を吸着する方法を用いた。   First, a system using containers will be described. Fine particles are adsorbed on the base (bottom surface) of the container. That is, the base material 1 in FIG. 1 corresponds to the base of the container. A fine particle of resin or silica having a particle diameter of 30 nm to 10 μm is adsorbed as a single layer on the base surface of a container such as a culture plate. As an adsorption method, there is a method in which fine particles are adsorbed by covalent bonding by introducing functional groups to the base surface and the fine particle surface. Alternatively, there is a method of physically adsorbing the fine particles by suppressing the repulsive force between the fine particles by increasing the ion concentration. In the following examples, a method of physically adsorbing fine particles by increasing repulsive force between the fine particles by increasing the ion concentration was used.

まず、微粒子２を吸着させるためには、次の前処理が必要となる。微粒子２にポリスチレン粒子を用いる場合は、まず、図２（ａ）に示す容器２０の基底２０Ａの表面に厚さ１０ｎｍ以上の金属膜を真空蒸着法等により形成する（図示せず）。次に、微粒子２となるポリスチレン微粒子の懸濁液に同等量の塩化マグネシウム水溶液を加える。濃度は、１ｍＭ（１×１０−３ｍｏｌ／ｍ３）から５００ｍＭとする。 First, the following pretreatment is required to adsorb the fine particles 2. When using polystyrene particles for the fine particles 2, first, a metal film having a thickness of 10 nm or more is formed on the surface of the base 20A of the container 20 shown in FIG. Next, an equivalent amount of magnesium chloride aqueous solution is added to the suspension of polystyrene fine particles to be the fine particles 2. The concentration is from 1 mM (1 × 10 −3 mol / m 3 ) to 500 mM.

図２（ａ）に示すように、この混合液２１を容器２０に加え、１分から１０分間ゆっくり撹拌する。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、１００μＬから１ｍＬとする。次に、多量の純水を加え（図２（ｂ））、過剰量の微粒子２を除去する（図２（ｃ））。図３（ｄ）と図３（ｄ）の点線部分の拡大図である図３（ｅ）に示すように、容器２０の基底２０Ａに吸着された微粒子２を乾燥させる。次に、図３（ｆ）に示すように、真空蒸着装置にて銀等のイオン化可能なナノ金属層３を微粒子２上に蒸着して金属付着微粒子１０を形成する。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％とする。 As shown to Fig.2 (a), this liquid mixture 21 is added to the container 20, and is stirred slowly for 1 to 10 minutes. The addition amount is 100 μL to 1 mL per 1 cm 2 of the area of the container 20. Next, a large amount of pure water is added (FIG. 2B), and an excessive amount of fine particles 2 is removed (FIG. 2C). As shown in FIG. 3E, which is an enlarged view of the dotted line portion of FIGS. 3D and 3D, the fine particles 2 adsorbed on the base 20A of the container 20 are dried. Next, as shown in FIG. 3 (f), an ionizable nano metal layer 3 such as silver is vapor-deposited on the fine particles 2 by a vacuum vapor deposition apparatus to form metal-attached fine particles 10. The thickness of the nano metal layer 3 is 1% to 200% with respect to the diameter of the fine particles 2.

微粒子２にシリカ微粒子を用いる場合は、ガラス表面を用いることが望ましい。したがって、ガラスにより形成されている容器２０を用い、容器２０にアミノプロピルメルトキシシランもしくはアミノプロピルエトキシシラン（０．１％から１０％重量比）を加え、１分から１０分間撹拌する。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、２０μＬから２００μＬとする。次に多量の純水により容器２０を洗浄し乾燥させる。さらにシリカ微粒子懸濁液に同等量の塩化マグネシウム水溶液を加える。濃度は、１ｍＭ（１×１０−３ｍｏｌ／ｍ３）から５００ｍＭとする。 When silica fine particles are used for the fine particles 2, it is desirable to use the glass surface. Therefore, using a container 20 made of glass, aminopropyl meltxysilane or aminopropylethoxysilane (0.1% to 10% by weight) is added to the container 20 and stirred for 1 to 10 minutes. The addition amount is 20 μL to 200 μL per 1 cm 2 of the area of the container 20. Next, the container 20 is washed with a large amount of pure water and dried. Further, an equivalent amount of magnesium chloride aqueous solution is added to the silica fine particle suspension. The concentration is from 1 mM (1 × 10 −3 mol / m 3 ) to 500 mM.

この混合液２１を容器２０に加え、１分から１０分間ゆっくり撹拌する（図２（ａ））。添加量は、容器２０の面積１ｃｍ２当たり、１００μＬから１ｍＬとする。次に、多量の純水を加え（図２（ｂ））、過剰量の微粒子を除去する（図２（ｃ））。図３（ｄ）と図３（ｄ）の点線部分の拡大図である図３（ｅ）に示すように容器２０の基底２０Ａに吸着された微粒子２を乾燥させる。図３（ｆ）に示すように、真空蒸着装置にて銀等のイオン化可能なナノ金属層３を蒸着して金属付着微粒子１０を形成する。ナノ金属層３の厚さは、微粒子２の直径に対して、１％から２００％とする。 This mixed solution 21 is added to the container 20 and slowly stirred for 1 to 10 minutes (FIG. 2 (a)). The addition amount is 100 μL to 1 mL per 1 cm 2 of the area of the container 20. Next, a large amount of pure water is added (FIG. 2B), and an excessive amount of fine particles is removed (FIG. 2C). The fine particles 2 adsorbed on the base 20A of the container 20 are dried as shown in FIG. 3 (e), which is an enlarged view of the dotted line portion of FIG. 3 (d) and FIG. 3 (d). As shown in FIG. 3 (f), an ionizable nano metal layer 3 such as silver is vapor-deposited by a vacuum vapor deposition apparatus to form metal-adhered fine particles 10. The thickness of the nano metal layer 3 is 1% to 200% with respect to the diameter of the fine particles 2.

上記のように、基材１に相当する基底２０Ａ上に、高密度に吸着された微粒子２を真空蒸着法又はスパッタリング法により金属コーティングすることにより、微粒子の表面に帽子状の金属ナノ粒子となるナノ金属層３が形成される。   As described above, hat-shaped metal nanoparticles are formed on the surface of the fine particles by coating the fine particles 2 adsorbed at a high density on the base 20A corresponding to the substrate 1 by a vacuum deposition method or a sputtering method. A nano metal layer 3 is formed.

上記の方法で調製された金属付着微粒子１０は、超音波に晒すことにより、容易に剥離できる。金属付着微粒子１０を剥離するためには、厚さ３ｍｍから２０ｍｍ程度の平坦なガラス基板もしくは金属基板からなる剥離用基板を用いる。形状は容器の形状とほぼ同じとする。すなわち、容器が円形であれば円形とし、長方形であれば長方形とする。大きさとしては、容器のサイズに対して３０％〜９５％とすることが望ましい。   The metal-attached fine particles 10 prepared by the above method can be easily peeled off by being exposed to ultrasonic waves. In order to peel off the metal-attached fine particles 10, a peeling substrate made of a flat glass substrate having a thickness of about 3 mm to 20 mm or a metal substrate is used. The shape is almost the same as the shape of the container. That is, if the container is circular, it is circular, and if it is rectangular, it is rectangular. The size is desirably 30% to 95% with respect to the size of the container.

図４（ａ）に示すように、ガラス基板もしくは金属基板からなる剥離用基板２５を容器２０の中に設置する。次に、容器２０と剥離用基板２５の間の領域が完全に浸漬される程度の純水又はエタノール、メタノール等のアルコールによる液体２６を加える。次に容器２０を超音波洗浄装置内部の容器３０に浮かせ、剥離用基板２５や容器２０等が矢印の方向に振動するように超音波を加える（図４（ｂ））。剥離用基板２５を金属付着微粒子１０の方へ若干押し付けることにより、より効率良く微粒子を剥離することができる（図４（ｃ））。吸着された金属ナノ粒子と同じ数の浮遊金属ナノ粒子を調製するには、吸着された金属付着微粒子１０をすべて剥離することにより可能となる。   As shown in FIG. 4A, a peeling substrate 25 made of a glass substrate or a metal substrate is placed in the container 20. Next, a liquid 26 of pure water or an alcohol such as ethanol or methanol is added to such an extent that the region between the container 20 and the peeling substrate 25 is completely immersed. Next, the container 20 is floated on the container 30 inside the ultrasonic cleaning apparatus, and ultrasonic waves are applied so that the peeling substrate 25, the container 20 and the like vibrate in the direction of the arrow (FIG. 4B). By slightly pressing the peeling substrate 25 toward the metal-attached fine particles 10, the fine particles can be peeled more efficiently (FIG. 4C). In order to prepare the same number of floating metal nanoparticles as the adsorbed metal nanoparticles, it is possible to peel off all the adhering metal adhering fine particles 10.

上記のように、容器２０を簡易超音波洗浄装置中に置き超音波を発生させると、容器２０の基底と剥離用基板２５との間に振動が発生し、金属付着微粒子１０は数分以内に完全に剥離する。   As described above, when the container 20 is placed in a simple ultrasonic cleaning apparatus and ultrasonic waves are generated, vibration occurs between the base of the container 20 and the peeling substrate 25, and the metal-adhered fine particles 10 are within a few minutes. Peel completely.

容器の基底に、直接金属付着微粒子１０を形成する方法以外にも、図６のように、浮遊金属微粒子がない所定の濃度の金属イオンのみが存在する状態を形成することができる。樹脂、金属又はガラスの薄いシートからなる基板１１上に金属付着微粒子１０を吸着させておき、図６（ａ）に示すように、この基板１１を容器２０に入れ、水溶液中に沈めても良い。また、図６（ｂ）に示すように、フィルター等の多孔質状のシートからなる基板１２の表面の両面に金属付着微粒子１０を形成して、複数枚数の基板１２を容器２０の基底に沈めても良い。図６（ｃ）は、図６（ｂ）の点線部分の拡大図を示す。   In addition to the method in which the metal-attached fine particles 10 are directly formed on the base of the container, a state in which only a predetermined concentration of metal ions without floating metal fine particles exists can be formed as shown in FIG. Metal adhering fine particles 10 may be adsorbed on a substrate 11 made of a thin sheet of resin, metal or glass, and the substrate 11 may be placed in a container 20 and submerged in an aqueous solution as shown in FIG. . Further, as shown in FIG. 6B, metal-attached fine particles 10 are formed on both surfaces of the surface of the substrate 12 made of a porous sheet such as a filter, and a plurality of substrates 12 are submerged in the base of the container 20. May be. FIG. 6C shows an enlarged view of the dotted line portion of FIG.

図６（ｃ）のように、培養液中には、複数の基板１２が存在するが、基板毎に基板表面に吸着している金属付着微粒子のナノ金属層の金属の種類を変えるようにしても良い。このようにすれば、複数の種類の解離金属イオンによる影響を検査することができる。   As shown in FIG. 6 (c), there are a plurality of substrates 12 in the culture solution, but the metal type of the nanometal layer of the metal-attached fine particles adsorbed on the substrate surface is changed for each substrate. Also good. In this way, it is possible to examine the influence of a plurality of types of dissociated metal ions.

また、容器２０については、樹脂又はガラス製のシャーレ、又は４〜９６の穴が形成されているマルチプレートの容器とし、この中に金属付着微粒子１０を形成することが望ましい。このようにすれば、金属付着微粒子１０の形成後に、細胞及び生体組織に直接金属イオン等を供給することができるからである。   The container 20 is preferably a petri dish made of resin or glass, or a multi-plate container in which 4 to 96 holes are formed, in which the metal-adhered fine particles 10 are formed. This is because metal ions and the like can be directly supplied to cells and living tissues after the metal-attached fine particles 10 are formed.

銀のナノ金属層３を持つ金属付着微粒子１０を細胞培養に適用した例を図５に示す。図２〜図３の方法により得られた容器２０の基底に吸着された金属付着微粒子１０を用い、培養液２７を加え、単離細胞２３を播種する（図５（ａ））。すると、細胞が培養されてコロニー２２Ａが形成されるとともに、コロニー２２Ａ内の培養された細胞が解離銀イオン（Ａｇ＋）に晒される。このとき、浮遊した金属微粒子は、細胞内に取り込まれる可能性があるのに対して、基底に吸着された金属付着微粒子１０は取り込まれない。したがって、銀イオンのみの細胞に対する影響を測定することができる。   An example in which the metal-attached fine particles 10 having the silver nanometal layer 3 are applied to cell culture is shown in FIG. Using the metal-attached fine particles 10 adsorbed on the base of the container 20 obtained by the method of FIGS. 2 to 3, the culture solution 27 is added and the isolated cells 23 are seeded (FIG. 5A). Then, the cells are cultured to form a colony 22A, and the cultured cells in the colony 22A are exposed to dissociated silver ions (Ag +). At this time, the suspended fine metal particles may be taken into the cell, whereas the metal-attached fine particles 10 adsorbed on the base are not taken up. Therefore, it is possible to measure the influence of only silver ions on cells.

次に、一旦、容器２０を洗浄し、図４の方法で、容器２０の基底に吸着された金属付着微粒子１０を基底から剥離する。次に、培養液２７を加え、単離細胞２３を播種する（図５（ｂ））。すると、細胞が培養されてコロニー２２Ｂが形成されるとともに、コロニー２２Ｂ内の培養された細胞が銀イオン（Ａｇ＋）に晒される。また、培養液２７中に、金属付着微粒子１０は浮遊しているので、コロニー２２Ｂ内の培養された細胞には、図５（ｂ）の点線部の拡大図である図５（ｃ）に示すように、一部の金属付着微粒子１０が取り込まれる。以上のように、銀ナノ粒子の取り込みによる影響と銀イオンに晒されることによる影響の２つの影響を測定することができる。   Next, the container 20 is once cleaned, and the metal-attached fine particles 10 adsorbed on the base of the container 20 are peeled off from the base by the method of FIG. Next, the culture solution 27 is added and the isolated cells 23 are seeded (FIG. 5 (b)). Then, the cells are cultured to form a colony 22B, and the cultured cells in the colony 22B are exposed to silver ions (Ag +). Further, since the metal-adhered fine particles 10 are suspended in the culture solution 27, the cultured cells in the colony 22B are shown in FIG. 5C, which is an enlarged view of a dotted line portion in FIG. As described above, some of the metal-attached fine particles 10 are taken in. As described above, it is possible to measure two influences, that is, the influence caused by the incorporation of silver nanoparticles and the influence caused by exposure to silver ions.

すなわち、図５（ａ）と図５（ｂ）では、同じ数の金属付着微粒子（金属ナノ粒子）が容器２０には存在するので、解離銀イオンの濃度は、図５（ａ）の溶液中と図５（ｂ）の溶液中で同じである。したがって、図５（ｂ）の細胞への影響を測定し、この測定結果から図５（ａ）の細胞への影響を測定した結果を引き算すれば、金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を算出することができる。   That is, in FIG. 5 (a) and FIG. 5 (b), since the same number of metal-attached fine particles (metal nanoparticles) are present in the container 20, the concentration of dissociated silver ions is set in the solution of FIG. 5 (a). And the same in the solution of FIG. Therefore, if the influence on the cell of FIG. 5 (b) is measured, and the measurement result of the influence on the cell of FIG. 5 (a) is subtracted from this measurement result, the metal adhering fine particles (metal nanoparticles) are taken up. The effect on cells can be calculated.

また、図６のように、フィルター等の多孔質状の基板１２表面の両面に金属付着微粒子１０を形成して、複数枚数のシートを容器２０の基底に沈めた場合でも同様に、細胞が銀イオンに晒されることによる影響と金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を別々に検出することができる。   Further, as shown in FIG. 6, even when the metal-adhered fine particles 10 are formed on both surfaces of the surface of the porous substrate 12 such as a filter and a plurality of sheets are submerged in the base of the container 20, the cells are similarly silver. It is possible to separately detect the effect of exposure to ions and the effect on cells due to the uptake of metal-attached fine particles (metal nanoparticles).

図５（ｂ）に示すように、金属付着微粒子１０が吸着された基板１２を培養液２７中に沈めておき、単離細胞２３を播種する。すると、コロニー２２が形成され、コロニー２２の細胞が、培養液中に解離している銀イオンに晒されることなる。また、銀の金属層が形成されている金属付着微粒子１０は、基板１２に固定されているので、培養液中に浮遊することがない。したがって、銀イオンによる影響のみを測定することができる。   As shown in FIG. 5B, the substrate 12 on which the metal-attached fine particles 10 are adsorbed is submerged in the culture solution 27, and the isolated cells 23 are seeded. Then, a colony 22 is formed, and the cells of the colony 22 are exposed to silver ions dissociated in the culture solution. Further, since the metal-attached fine particles 10 on which the silver metal layer is formed are fixed to the substrate 12, they do not float in the culture solution. Therefore, only the influence by silver ions can be measured.

一方、容器２０を洗浄し、図４のように、容器２０内にシート１２を液体２６中に沈め、超音波洗浄装置により振動させて、金属付着微粒子１０を剥離し、その後、培養液２７、単離細胞２３を加えてコロニー２２を成長させる。コロニー２２の細胞は、解離された銀イオンによる影響と浮遊している金属付着微粒子１０を取り込んだ影響との２つの影響を測定することができる。したがって、シート１２を培養液２７中に沈めて測定した結果と金属付着微粒子１０を剥離して培養液中に浮遊させて測定した結果との差を取れば、金属付着微粒子（金属ナノ粒子）の取り込みによる細胞への影響を算出することができる。   On the other hand, the container 20 is washed, and as shown in FIG. 4, the sheet 12 is submerged in the liquid 26 in the container 20 and is vibrated by an ultrasonic washing device to peel off the metal-attached fine particles 10. Isolated cells 23 are added to grow colonies 22. The cells of the colony 22 can measure two effects, that is, the influence of the dissociated silver ions and the influence of taking in the floating metal-attached fine particles 10. Therefore, if the difference between the measurement result obtained by immersing the sheet 12 in the culture solution 27 and the measurement result obtained by peeling the metal-attached fine particles 10 and suspending them in the culture solution is taken, the metal-attached fine particles (metal nanoparticles) The effect on cells due to uptake can be calculated.

なお、銀イオン濃度は、図７に示すように、制御することができる。図７の横軸はｐＨを、縦軸は銀イオン（Ａｇ＋）濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。これは、水溶液中に１０ｍｇ／Ｌの銀ナノ粒子を入れて測定した。図７に示すように、銀ナノ粒子が入った溶液のｐＨを小さく（酸性を強くする）すれば、解離する銀イオン濃度を上げることができ、逆にｐＨを大きく（アルカリ性を強く）すれば、解離する銀イオン濃度を下げることができる。銀イオン濃度を高くしたい場合は、例えば、塩酸等を溶液に加えて酸性を強くすれば良い。銀イオン濃度を低くしたい場合は、例えば、水酸化ナトリウム等を溶液に加えてアルカリ性を強くすれば良い。 The silver ion concentration can be controlled as shown in FIG. In FIG. 7, the horizontal axis represents pH, and the vertical axis represents silver ion (Ag + ) concentration (mg / L). This was measured by putting 10 mg / L of silver nanoparticles in an aqueous solution. As shown in FIG. 7, if the pH of the solution containing silver nanoparticles is reduced (increases the acidity), the concentration of dissociated silver ions can be increased, and conversely, if the pH is increased (increases alkalinity). , The concentration of dissociated silver ions can be lowered. In order to increase the silver ion concentration, for example, hydrochloric acid or the like may be added to the solution to increase the acidity. In order to reduce the silver ion concentration, for example, sodium hydroxide or the like may be added to the solution to increase the alkalinity.

図５で、銀イオン濃度を制御する場合は、図５（ａ）の溶液中と図５（ｂ）の溶液中で同じ銀イオン濃度としておくために、両方の培養液のｐＨは同じにしておく必要がある。   In FIG. 5, when controlling the silver ion concentration, the pH of both culture solutions should be the same in order to keep the same silver ion concentration in the solution of FIG. 5 (a) and the solution of FIG. 5 (b). It is necessary to keep.

以上のように、浮遊金属ナノ粒子に細胞もしくは生体組織を晒した場合であっても、浮遊金属ナノ粒子が細胞又は生体組織に金属ナノ粒子が取り込まれることにより発生する効果と、浮遊金属ナノ粒子に基づいて生じる解離金属イオンに晒されることにより発生する効果を区別することができる。   As described above, even when cells or biological tissues are exposed to floating metal nanoparticles, the effects of floating metal nanoparticles generated by incorporation of metal nanoparticles into cells or biological tissues, and floating metal nanoparticles It is possible to distinguish the effects generated by exposure to dissociated metal ions generated based on the above.

これにより、金属毒性のメカニズムが解明されスクリーニング試験法確立と毒性評価が可能となる。   As a result, the mechanism of metal toxicity is elucidated, and screening test methods can be established and toxicity can be evaluated.

本発明の金属イオン供給システムは、金属イオン又は金属ナノ粒子が生物個体群や生物群集に与える影響の試験、リスク評価等に適用することができる。   The metal ion supply system of the present invention can be applied to testing of the influence of metal ions or metal nanoparticles on a biological population or a biological community, risk assessment, and the like.

１ 基板
２ 微粒子
３ ナノ金属層
２０ 容器
２０Ａ 基底
２１ 混合液
１０ 金属付着微粒子 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Substrate 2 Fine particle 3 Nano metal layer 20 Container 20A Base 21 Mixed liquid 10 Metal adhesion fine particle

Claims (5)

微粒子上にナノ金属が形成された金属付着微粒子が吸着された基材を備え、前記金属付着微粒子を液体中に浸漬することで前記ナノ金属に基づいて発生する金属イオンを供給することを特徴とする金属イオン供給システム。   It comprises a substrate on which metal-attached fine particles having nanometals formed thereon are adsorbed, and metal ions generated based on the nanometal are supplied by immersing the metal-attached fine particles in a liquid. Metal ion supply system. 前記金属付着微粒子を前記基材から剥離して液体中に浮遊させ、前記金属イオンとともに金属付着微粒子も供給することを特徴とする請求項１に記載の金属イオン供給システム。   2. The metal ion supply system according to claim 1, wherein the metal-attached fine particles are peeled off from the substrate and suspended in a liquid, and the metal-attached fine particles are also supplied together with the metal ions. 前記基材は、容器の底面であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の金属イオン供給システム。   The metal ion supply system according to claim 1, wherein the base material is a bottom surface of a container. 前記基材は、基板であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の金属イオン供給システム。   The metal ion supply system according to claim 1, wherein the base material is a substrate. 前記基板を複数用い、各基板に吸着された金属付着微粒子のナノ金属は、異なる金属の種類であることを特徴とする請求項４に記載の金属イオン供給システム。   5. The metal ion supply system according to claim 4, wherein a plurality of the substrates are used, and the nanometal of the metal-attached fine particles adsorbed on each substrate is a different metal type.
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