JP2012047836A - Laser microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、レーザ顕微鏡に関する。 The present invention relates to a laser microscope.
走査型共焦点顕微鏡（レーザ顕微鏡の一種）は、レーザ光源からの照明光を、対物レンズを介して標本上に結像し、標本上に照射されたスポット状の光を２次元的に走査して観察を行うものである。標本にレーザ光が照射されると、標本の光学的な特性によって反射、吸収、蛍光、散乱などが照射領域において生じる。照射領域で発生した反射光や蛍光は、対物レンズで集光された後に検出器により検出される。通常、検出器は複数設けられており、フィルタ等を用いて所望の波長の光を検出器で検出するようにしている（特許文献１参照）。 A scanning confocal microscope (a type of laser microscope) forms illumination light from a laser light source on a specimen through an objective lens, and scans spot-shaped light irradiated on the specimen two-dimensionally. Observation. When the sample is irradiated with laser light, reflection, absorption, fluorescence, scattering, and the like occur in the irradiated region due to the optical characteristics of the sample. Reflected light and fluorescence generated in the irradiation region are collected by the objective lens and then detected by the detector. Usually, a plurality of detectors are provided, and light of a desired wavelength is detected by the detector using a filter or the like (see Patent Document 1).
しかしながら、上記従来技術においては、光の回折限界という制限から集光スポットの大きさがレーザ光の波長程度に限られるため、例えば標本の厚さ方向をＺ方向とした場合にＸＹ平面内での解像度に限界があるといった問題があった。 However, in the above prior art, the size of the focused spot is limited to the wavelength of the laser beam due to the limitation of the light diffraction limit. For example, when the thickness direction of the specimen is the Z direction, There was a problem that the resolution was limited.
上記のような事情に鑑み、本発明は、標本のＸＹ平面内での解像度を向上させることができる、レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a laser microscope that can improve the resolution of a specimen in the XY plane.
本発明の第１の態様に従えば、顕微鏡本体と、前記顕微鏡本体に設けられる標本に対してレーザ照明光を射出する光源部と、前記照明光を前記標本上に照射する照明部と、前記標本と共役な位置であり、且つ前記照明部にて照射された前記標本から射出された光の復路上に配置される検出光学系と、前記光源部から射出された前記照明光における前記標本に向かう往路のうち、前記復路と重ならない位置に配置され、前記光源部から出射された前記照明光を光軸に垂直な面内で偏光分布を所定分布に制御する偏光制御素子と、前記偏光制御素子は、前記照明光の光路上における前記照明部よりも前記光源部側に配置される
ことを特徴とするレーザ顕微鏡が提供される。
According to the first aspect of the present invention, a microscope main body, a light source unit that emits laser illumination light to a specimen provided in the microscope main body, an illumination unit that irradiates the specimen with the illumination light, A detection optical system disposed on the return path of the light emitted from the sample irradiated by the illumination unit and a position conjugate with the sample; and the sample in the illumination light emitted from the light source unit A polarization control element that is arranged at a position that does not overlap with the return path in the outgoing path, and that controls the polarization distribution of the illumination light emitted from the light source unit in a plane perpendicular to the optical axis, and the polarization control An element is disposed closer to the light source unit than the illumination unit on the optical path of the illumination light. A laser microscope is provided.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記検出光学系は、ピンホールを有し、前記照明部は、前記照明光を前記標本上で２次元的にスキャンされるように偏向する光走査部を有する走査ユニットからなり、前記光走査部は、少なくとも１つのミラーを有しており、前記偏光制御素子は、前記照明光の光路上における前記少なくとも１つのミラーよりも前記光源部側に配置されることが好ましい。 In the laser microscope, the detection optical system includes a pinhole, and the illumination unit includes a light scanning unit that deflects the illumination light so as to be scanned two-dimensionally on the sample. The optical scanning unit includes at least one mirror, and the polarization control element is disposed closer to the light source unit than the at least one mirror on the optical path of the illumination light. preferable.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記走査ユニットは、反射型あるいは透過型であることが好ましい。 In the laser microscope, the scanning unit is preferably a reflection type or a transmission type.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記偏光制御素子は、前記光源部から出射された前記照明光を透過させることで前記照明光を複数の偏光成分からなるものに制御することが好ましい。 In the laser microscope, it is preferable that the polarization control element controls the illumination light to have a plurality of polarization components by transmitting the illumination light emitted from the light source unit.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記偏光制御素子は、前記光源部から出射された前記照明光を透過させることで前記照明光の光軸の垂直な面内の偏光の位相状態を座標に応じて分布を持つように制御することが好ましい。 Further, in the laser microscope, the polarization control element transmits the illumination light emitted from the light source unit, thereby changing the phase state of the polarization in a plane perpendicular to the optical axis of the illumination light according to the coordinates. It is preferable to control to have a distribution.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記ピンホールは、走査ユニットに設けられており、前記光走査部は、前記標本から射出された光を偏向してデスキャンすることで前記ピンホールへと出射することが好ましい。 Further, in the laser microscope, the pinhole is provided in a scanning unit, and the optical scanning unit emits the light emitted from the specimen by deflecting and descanning the light to the pinhole. Is preferred.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記偏光制御素子は液晶装置から構成されることが好ましい。 In the laser microscope, the polarization control element is preferably composed of a liquid crystal device.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記液晶装置は、放射状に分割された複数の分割領域を有し、各々の分割領域における光学軸が異なっていることが好ましい。 In the laser microscope, it is preferable that the liquid crystal device has a plurality of radially divided areas, and the optical axes in the divided areas are different.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記液晶装置は放射状に分割された複数の分割領域を有しており、各々の分割領域ごとに、偏光の旋光性を独立制御可能であることが好ましい。 In the laser microscope, it is preferable that the liquid crystal device has a plurality of radially divided areas, and the polarization optical rotation can be independently controlled for each of the divided areas.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記液晶装置は一対の基板間に挟持された液晶を有し、前記液晶に電圧を印加することで偏光制御を行う状態と、前記液晶に電圧を印加しないことで偏光制御を行わない状態とを切り替え可能とされていることが好ましい。 In the laser microscope, the liquid crystal device includes a liquid crystal sandwiched between a pair of substrates, and a state in which polarization control is performed by applying a voltage to the liquid crystal, and a voltage is not applied to the liquid crystal. It is preferable that the state in which the polarization control is not performed can be switched.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記液晶装置は、前記光源部から射出される前記照明光の波長に応じて前記液晶への印加電圧を可変とされていることが好ましい。 In the laser microscope, it is preferable that the liquid crystal device has a variable voltage applied to the liquid crystal according to the wavelength of the illumination light emitted from the light source unit.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記偏光制御素子は入射した前記照明光の位相をずらして射出する波長板としての機能を含むことが好ましい。 In the laser microscope, it is preferable that the polarization control element includes a function as a wave plate that emits the incident illumination light with a phase shifted.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記偏光制御素子は、放射状に分割され、且つ前記波長板が配置された複数の分割領域を有し、前記分割領域に配置された前記波長板の光学軸がそれぞれ異なっていることが好ましい。 Further, in the laser microscope, the polarization control element has a plurality of divided regions in which the wavelength plate is radially divided and the wavelength plate is arranged, and the optical axes of the wave plates arranged in the divided regions are respectively Preferably they are different.
また、上記レーザ顕微鏡においては、前記光走査部は２つのミラーを有しており、前記偏光制御素子は、該２つのミラーの間に配置されることが好ましい。 In the laser microscope, the optical scanning unit preferably includes two mirrors, and the polarization control element is disposed between the two mirrors.
本発明によれば、走査型共焦点顕微鏡において、標本のＸＹ平面内での解像度を向上させることができる。 According to the present invention, in the scanning confocal microscope, the resolution of the specimen in the XY plane can be improved.
以下、図面を参照しながら、本発明の走査型共焦点顕微鏡に係る一実施例について説明する。図１は本実施形態に係る走査型共焦点顕微鏡の構成を示す図である。なお、図１、３，４においてはＸＹＺ座標系を用い、標本２４が配置されるステージ面をＸＹ平面とし、該標本２４の厚さ方向をＺ方向としている。走査型共焦点顕微鏡は、顕微鏡本体１０と光源部１と検出ユニット２６とからなり、顕微鏡本体１０の鏡筒部１１には走査ユニット１２が着脱可能な状態で装着されている。光源部１および検出ユニット２６と走査ユニット１２とはシングルモード光ファイバ９およびマルチモード光ファイバ２５により接続されており、光源部１で発生したレーザ光は光ファイバ９により走査ユニット１２に入力される。標本２４からの光は、後述するように対物レンズ２３，第２対物レンズ２２，走査ユニット１２および光ファイバ２５を介して検出ユニット２６に伝達される。
Hereinafter, an embodiment according to a scanning confocal microscope of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a diagram illustrating a configuration of a scanning confocal microscope according to the present embodiment. 1, 3, and 4, the XYZ coordinate system is used, the stage surface on which the
光ファイバ９，２５と光源部１，検出ユニット２６および走査ユニット１２との接続は、コネクタＣ１〜Ｃ４を用いて行われており、この部分は容易に着脱可能とされている。検出ユニット２６には信号線７７を介して処理ユニット３７が接続されており、検出ユニット２６で検出された画像信号に基づく標本２４の観察画像が処理ユニット３７において形成される。
The
図２は光源部１、検出ユニット２６及び処理ユニット３７の概略構成を示す図である。図２に示すように、信号線７７はコネクタＣ５を介して処理ユニット３７に着脱可能に接続されている。処理ユニット３７にはモニタ３６が接続されており、画像処理により得られた観察像が表示される。３５は画像データを保存記憶するための記憶装置である。検出ユニット２６および処理ユニット３７の詳細については後述する。
FIG. 2 is a diagram illustrating a schematic configuration of the
光源部１には出力波長の異なる複数のレーザ発生装置２，３，４が設けられている。レーザ発生装置２，３，４から出射された各レーザ光は全反射ミラー５およびダイクロイックミラー６，７を用いて同一光軸に合わせられた後に、集光レンズ８により集光されて光ファイバ９に入射される。図１に示すように、光ファイバ９により走査ユニット１２に伝送されたレーザ光はファイバ端面から所定のＮＡ（開口数）で出射され、走査ユニット１２内のコリメータレンズ１５により平行光に変換される。
The
コリメータレンズ１５からの平行光はダイクロイックミラー１８により反射され、光走査部１９に入射するようになっている。図１に示したように、走査ユニット１２は、コリメータレンズ１５とダイクロイックミラー１８との間における光路の途中に設けられた偏光制御素子１００を備えている。偏光制御素子１００は、詳細について後述するように（図４参照）、光源部１から射出されたビーム（照明光）を透過させることで該ビームの偏光状態を単一の偏光成分を含むものから複数の偏光成分を含むものへと制御可能な素子を意味する。
The parallel light from the
ここで、単一偏光成分とは、ビームの進行方向と垂直な断面を規定し、その面内のいずれの座標でも一様な偏光状態（直線偏光、楕円偏光、円偏光など）であり、かつその面内の偏光の位相状態がほぼ一定とみなせるものである。一方、複数の偏光状態とは、上記断面内の座標位置に依存して、偏光状態が一様でない分布を持つ、あるいは面内の偏光の位相状態を座標に応じて分布を持つ、の少なくとも一方を満たすものである。 Here, the single polarization component defines a cross section perpendicular to the traveling direction of the beam, is a uniform polarization state (linearly polarized light, elliptically polarized light, circularly polarized light, etc.) at any coordinate in the plane, and The phase state of the polarized light in the plane can be regarded as almost constant. On the other hand, depending on the coordinate position in the cross section, the plurality of polarization states are at least one of having a non-uniform distribution of the polarization state or having a distribution of the in-plane polarization state according to the coordinates. It satisfies.
図３は偏光制御素子１００の構成を模式的に示す図であり、図３（ａ）は偏光制御素子１００の平面図であり、図３（ｂ）は偏光制御素子１００の要部断面構成を示す図である。図３（ａ）に示すように、偏光制御素子１００は、放射状に分割された８つの領域を有している（以下、本説明において、この８つの領域を分割領域１５１〜分割領域１５８と称す）。すなわち、偏光制御素子１００は、８つの分割領域１５１〜１５８を備えている。
3 is a diagram schematically illustrating the configuration of the
分割領域１５１〜１５８は、中心点に対して対称に分割されている。したがって、分割領域１５１〜１５８は、放射状に配置されている。このように、放射状に分割された８つの領域が分割領域１５１〜１５８となっている。それぞれの分割領域の大きさは等しくなっており、各分割領域１５１〜１５８は周方向の全体にわたって設けられている。したがって、分割領域１５１〜１５８のそれぞれは、中心点近傍の点に対応する内角が４５°の二等辺三角形となっている。そして、分割領域１５１〜１５８を合わせた形状は、円板形状となっている。換言すると、円形を放射状に８等分したものが、分割領域１５１〜１５８となる。なお、分割領域の中心点は、偏光制御素子１００の中心でなくてもよい。すなわち、偏光制御素子１００の中心と、分割領域１５１〜１５８の中心とは、一致していなくてもよい。
The divided
分割領域１５１〜分割領域１５８はそれぞれ液晶装置１５１ａ〜１５８ａから構成されている。液晶装置１５１ａ〜１５８ａの各々は、図３（ｂ）に示すように、一対のガラス基板１６０，１６１間に液晶１６２を挟持することで構成されている。ガラス基板１６０，１６１の内面側には、一対の電極（不図示）が設けられており、これら電極間に電圧を印加することで液晶１６２を駆動し、各々の分割領域を透過する光の偏光状態を変化させるようになっている。液晶装置１５１ａ〜１５８ａの各々は液晶１６２の駆動時に入射光に対して１／２波長の位相差を与えて出射するように構成されている。すなわち、液晶装置１５１ａ〜１５８ａは、液晶１６２の駆動時に１／２波長板として機能する一方、液晶１６２の非駆動時には入射光の偏光状態を変化させない状態を切り替え可能となっている。
The divided
ところで、光源部１から射出されるレーザ光の波長が変化すると、各液晶装置１５１ａ〜１５８ａを１／２波長として機能させるための位相量が変化する。そこで、光源部１から射出されるレーザ光の波長を測定し、該測定結果に基づき、各液晶装置１５１ａ〜１５８ａにおける電極間に印加する電圧を可変とすることができる。これにより、異なる波長の入射光が各液晶装置１５１ａ〜１５８ａを通過した場合においても、常に１／２波長の位相差を与えることができる。
By the way, when the wavelength of the laser light emitted from the
図３（ａ）においては、説明を分かり易くするため、液晶装置１５１ａ〜１５８ａの駆動に基づき、各分割領域１５１〜１５８に発現される光学軸を矢印で示している。ここで、それぞれの分割領域１５１〜１５８の光学軸は、隣の分割領域の光学軸から２２．５°ずれている。すなわち、Ｙ軸の方向を基準とすると、分割領域１５１における波長板の光学軸の角度は０°となり、分割領域１５２の光学軸は−２２．５°となり、分割領域１５２の光学軸は−４５°となり、分割領域１５４の光学軸は−６７．５°となっている。また、分割領域１５８の光学軸は２２．５°であり、分割領域１５７の光学軸は４５°となり、分割領域１５６の光学軸は６７．５°となり、分割領域１５５の光学軸は、９０°となっている。
In FIG. 3A, for easy understanding, the optical axes expressed in the divided
したがって、中心点に対して互いに対向する分割領域は、各々の光学軸が直交している。例えば、分割領域１５１の光学軸は０°であり、分割領域１５１に対向する分割領域１５５の光学軸は９０°となっている。また、分割領域１５２の光学軸と、分割領域１５６の光学軸は、互いに直交している。同様に、分割領域１５３と分割領域１５７とでは、光学軸が直交しており、分割領域１５４と分割領域１５８とでは、光学軸が直交している。換言すると、互いに対向する分割領域の光学軸の角度の差が９０°となっている。
Therefore, the optical axes of the divided areas facing each other with respect to the center point are orthogonal to each other. For example, the optical axis of the divided
本実施形態においては、偏光軸がＺ方向に沿った方向である直線偏光からなる単一偏光成分からなるビームを偏光制御素子１００に入射させるようにしている。ここで、直線偏光の方位が各分割領域１５１〜１５８における光学軸に対して成す角度をθとすると、各分割領域１５１〜１５８を通過した光は、元の直線偏光から２θだけ回転した直線偏光の光となる。例えば、分割領域１５１〜１５８の光学軸と、直線偏光の偏光軸とが４５°ずれている場合、分割領域１５１〜１５８は、偏光軸が９０°ずれた直線偏光を出射する。
In the present embodiment, a beam composed of a single polarization component composed of linearly polarized light whose polarization axis is along the Z direction is made incident on the
続いて、偏光制御素子１００から出射される光の偏光状態について図４を用いて説明する。図４（ａ）は、偏光軸がＺ方向に沿った方向である直線偏光が入射した場合を示しており、図４（ｂ）は偏光制御素子１００から出射されるビームの偏光状態を示している。したがって、入射偏光方位が０°の直線偏光が入射した時に出射される出射光の偏光方位について説明する。すなわち、分割領域１５１の光学軸と、入射光の偏光軸が一致している場合について説明する。図４には、各分割領域１５１〜１５８から出射される出射光の偏光軸が矢印でそれぞれ示されている。分割領域１５１〜１５８から出射される直線偏光の偏光軸は放射状になっている。
Next, the polarization state of the light emitted from the
具体的には、中心点に対して対向する一対の分割領域から出射される直線偏光の偏光軸が平行になっている。そして、対向する一対の分割領域では振動方向が反対になっている。また、隣接する分割領域から出射される光の偏光軸は４５°ずれている。例えば、分割領域１５１及び分割領域１５５から出射する光の偏光軸は、０°である。また、分割領域１５２及び分割領域１５６から出射される光の偏光軸は、−４５°であり、分割領域１５３及び分割領域１５７から出射される光の偏光軸は９０°であり、分割領域１５４及び分割領域１５８から出射される光の偏光軸は、＋４５°である。したがって、入射位置に応じて偏光軸の角度が変化して、出射される偏光変位が放射状となる。このように、本実施の形態にかかる偏光制御素子１００は、入射位置に応じて入射光の偏光状態を制御し、所望の偏光状態になるように制御することができる。
Specifically, the polarization axes of linearly polarized light emitted from a pair of divided regions facing the center point are parallel. And a vibration direction is opposite in a pair of division area which opposes. Further, the polarization axis of the light emitted from the adjacent divided regions is shifted by 45 °. For example, the polarization axis of the light emitted from the divided
このように、本実施形態においては、上記の偏光制御素子１００に所定方向に沿った直線偏光を入射すると、ラジアル偏光に近い偏光状態となるよう制御することができる。すなわち、直線偏光をラジアル偏光に近似する擬似ラジアル偏光にすることができる。
As described above, in the present embodiment, when linearly polarized light along a predetermined direction is incident on the
なお、偏光制御素子１００の分割領域の数を増加させることによって、偏光制御素子１００を透過後のビームをよりラジアル偏光に近い偏光状態とすることができる。すなわち、分割領域の数を増やすこと偏光軸がよりなめらかに変化する。換言すると、分割数を無限大にすれば、理想的なラジアル偏光状態を生成することができる。分割数は、偶数であることが好ましく、例えば、２あるいは４以上とすることができる。さらに、電場ベクトルのｙ成分を高くするためには、分割数を８以上とすることが好ましく、１６以上とすることがより好ましい。すなわち、分割数を２ｎ（ｎは１以上の整数）とすることが好ましい。また、分割領域の中心点に対して対称に分割し、対向する分割領域の大きさを同じとすることが好ましい。すなわち、分割領域の中心角を等しくして、同じ大きさの分割領域とすることが好ましい。例えば、分割数を２ｎとすると、１つの分割領域に対応する角度は、３６０度／２ｎとなる。
In addition, by increasing the number of divided regions of the
具体的には、例えば、分割数が１６の場合、波長板の光学軸を隣の分割領域から１１．２５°ずらす。これにより、対向する分割領域で、光学軸が直交する。そして、この偏光制御素子に一定角度の偏光軸を入射させると、直線偏光が擬似ラジアル偏光となって出射されることとなる。 Specifically, for example, when the number of divisions is 16, the optical axis of the wave plate is shifted by 11.25 ° from the adjacent division region. As a result, the optical axes are orthogonal to each other in the divided areas facing each other. When a polarization axis having a certain angle is incident on the polarization control element, linearly polarized light is emitted as pseudo radial polarized light.
本実施形態では、偏光制御素子１００から出射された擬似ラジアル偏光に対し、液晶制御による透過率制御アポダイゼーションで光軸近傍を遮光する、あるいは、レーザ光量のロスを防止すべく、アキシコンレンズを介して光軸近傍を遮光することにより、図４（ｂ）に示すように略ドーナツ形状からなるラジアル偏光の軸対称偏光ドーナツビーム（以下、軸対称偏光ドーナツビームと称す。）を生成することができる。
In the present embodiment, the pseudo-radially polarized light emitted from the
ここで、本実施形態における軸対称偏光ドーナツビームとは、Maxwell方程式を円筒座標上で解いて得られる通常のラジアル偏光の軸対称偏光ビームよりもビーム断面強度分布における中心付近の強度が減衰した、もしくは強度の弱い面積が広いビームを意味している。
したがって、偏光制御素子１００を通過した光は、軸対称偏光ドーナツビームとして走査部１９へと入射する。このようなラジアル偏光ドーナツビームをレンズで集光させると、偏光制御素子１００を通過させないビーム（ガウスビーム）を集光させた場合に比べて、格段に小さな集光スポット径が得られることが報告されている（S.Quabis,R.Dron,M.Eberier,O.Glocki,G.Leuchs：Optics Communications 179 (2000)）。この報告によると、ラジアル偏光ドーナツビームをＮＡの大きな集光レンズで集光させた場合、ガウスビームを同じ対物レンズで集光させた場合と比較して、強度分布の半値全幅で半分以下にすることが可能であることが分かっている。
Here, the axially symmetric polarized donut beam in the present embodiment is attenuated in the intensity near the center in the beam cross-sectional intensity distribution than the axially symmetric polarized beam of normal radial polarization obtained by solving the Maxwell equation on cylindrical coordinates. Or it means a beam with a small area of weak intensity.
Therefore, the light that has passed through the
図５は走査ユニット１２の拡大図であり、光走査部１９の詳細を示したものである。光走査部１９には一対の可動式全反射ミラー１９１，１９２が設けられており、全反射ミラー１９１，１９２を連動して傾けることにより、ダイクロイックミラー１８から光走査部１９に入射したレーザ光を、レーザ光と直交する２方向に２次元的に走査することができる。本実施形態では、上述のようにダイクロイックミラー１８により偏向されたレーザ光が光走査部１９に入射する前の光路上に偏光制御素子１００を配置しているので、該偏光制御素子１００を瞳面上に配置する必要が無い。よって、偏光制御素子１００を配置する際の設計自由度が高いものとなる。また、光走査部１９による走査によりレーザ光の照射範囲が拡大する前の光路上に偏光制御素子１００を配置するため、偏光制御素子１００として小型なものを用いることができる。
FIG. 5 is an enlarged view of the
光走査部１９から出射されたレーザ光は、走査レンズ２０を介して一次像面２１に結像された後に、第２対物レンズ２２および対物レンズ２３によって標本２４上に結像される。図６（ａ）は標本２４を対物レンズ２３側から見た平面図であり、２４１は標本２４の観察領域を示している。レーザ光を図５の光走査部１９により走査すると、標本２４上に結像されたスポット状のレーザ光Ｌ（点像）は、観察領域２４１を経路Ｒ１のようにラスタ走査される。
The laser light emitted from the
図６（ｂ）は任意の時刻におけるレーザ光Ｌの照射状態を示したものであり、標本２４の光学的な特性によって反射、吸収、蛍光、散乱などがレーザ光Ｌの照射領域において生じる。生物組織を蛍光観察する場合には、標本２４の組織を複数の蛍光試薬で染色して観察する。標本２４にレーザ光Ｌが照射されると、蛍光試薬で染色された各組織から試薬に応じた蛍光が発せられる。
FIG. 6B shows the irradiation state of the laser light L at an arbitrary time, and reflection, absorption, fluorescence, scattering, and the like occur in the irradiation region of the laser light L due to the optical characteristics of the
本実施形態では、レーザ光Ｌが上述のように偏光制御素子１００を通過することで軸対称偏光ドーナツビームとなっているので、レーザ光Ｌの集光スポット径が偏光制御素子１００を通過させない従来の構成に比べ、格段に小さくすることが可能となる。なお、これらの蛍光はほとんどレーザ光Ｌが照射された領域から発せられるが、その領域の周辺領域Ａからも蛍光が若干発生する。
In the present embodiment, since the laser light L passes through the
図１に示した標本２４から発せられた蛍光は、対物レンズ２３および第２対物レンズ２２により一次像面２１の位置に結像された後に、走査レンズ２０で平行光とされて光走査部１９に入射する。標本２４からの蛍光はレーザ光Ｌが照射された領域から出射されるので、光走査部１９によって再び走査されることにより、すなわちデスキャンされることにより、ダイクロイックミラー１８から光走査部１９の反射ミラー１９１（図５参照）に入射したレーザ光と同一の光路に常に戻されることになる。光走査部１９からダイクロイックミラー１８に出射された蛍光はダイクロイックミラー１８を透過し、全反射ミラー１７により反射された後に集光レンズ１６に入射する。
Fluorescence emitted from the
蛍光は集光レンズ１６により遮光板１４上に結像される。すなわち、遮光板１４と標本２４とは共役な位置関係にあり、遮光板１４に形成された開口（ピンホール）１３の位置にスポット状レーザ光Ｌ（図６参照）の像が形成される。そして、開口１３を通過した蛍光のみが光ファイバ２５を介して検出ユニット２６に伝達される。前述したように、図６（ｂ）に示した周辺領域Ａからも蛍光が出射されるが、これらの蛍光は遮光板１４上の開口１３より外側に結像される。そのため、蛍光観察に悪影響を与える周辺領域Ａからの蛍光は、遮光板１４に遮られて検出ユニット２６に伝達されない。
The fluorescence is imaged on the
図２に示したように、光ファイバ２５により検出ユニット２６に伝達された蛍光は、コリメータレンズ２７を介してダイクロイックミラー２８に入射する。ダイクロイックミラー２８およびバリアフィルタ２９、３０は蛍光分離用の光学素子であり、これらの光学素子により走査ユニット１２から伝達された蛍光から所望の波長を有する２種類の蛍光が分離され、それぞれ異なる検出器３１、３２により検出される。検出器３１、３２から出力されたアナログ信号は処理ユニット３７に設けられたＡ／Ｄ変換器３３でデジタル信号に変換され、ＣＰＵ３４に送られて画像処理される。画像処理により得られた観察像はモニタ３６に表示される。
As shown in FIG. 2, the fluorescence transmitted to the
本実施形態によれば、偏光制御素子１００の作用により、標本２４の表面に集光スポット径の小さいレーザ光Ｌが入射させることができ、且つ、標本２４から出射される蛍光が偏光制御素子１００を通過することで減衰することが防止されるので、モニタ３６にＸＹ平面内における解像度が高く、明瞭な標本２４の観察像を表示させることができる。
According to the present embodiment, the
検出ユニット２６はコネクタＣ２、Ｃ５を介して光ファイバ２５および処理ユニット３７に接続されており、走査ユニット１２に対して着脱可能となっている。図２に示した検出ユニット２６は、２つの検出器３１、３２を備えていて２種類の蛍光波長を観察できる。なお、バリアフィルタおよび検出器を１つずつ備えるような構成としても良い。また、観察対象によってはより多数の蛍光波長に関する観察が必要なものもあり、そのような場合には、３つ以上の検出器を備えた検出ユニットと検出ユニット２６とを交換すれば容易に対応できる。そのため、従来の顕微鏡のように検出器増設のために走査ユニットを改造する必要がなく、低コストで容易に対応することができる。
The
図７は３種類の蛍光波長を検出することができる検出ユニット５０を示す図であり、検出ユニット２６に設けられていた検出器３１、３２に加えて３つ目の検出器５１を備えている。５２および５３は検出器５１用のバリアフィルタおよびダイクロイックミラーであり、その他の構成は検出ユニット２６と同様であり同様の符号を付した。ダイクロイックミラー２８を透過した蛍光は２番目のダイクロイックミラー５３に入射し、検出器５１で検出すべき波長を含む蛍光が反射分離されてバリアフィルタ５２へと導かれる。バリアフィルタ５２では不要な蛍光波長が除去され、所望の波長の蛍光のみが検出器５１に入射する。また、ダイクロイックミラー５３を透過した蛍光はバリアフィルタ３０を介して検出器３２に入射する。このようにして、波長の異なる３種類の蛍光が３つの検出器３１、３２、５１によってそれぞれ検出される。
FIG. 7 is a diagram showing a
なお、上記実施形態では、光走査部１９が一対の可動式全反射ミラー１９１，１９２を備えた場合について説明したが、レーザ光と直交する１方向に長辺を有する矩形状のミラーを１方向に可動することでレーザ光を走査することができる。
In the above-described embodiment, the case where the
また、上記実施形態においては、偏光制御素子１００が光走査部１９の外部に配置する場合について説明したが、図８に示すように可動式全反射ミラー１９１，１９２間に配置するようにしても構わない。この構成によれば、上記実施形態同様、偏光制御素子１００を瞳面上に配置する必要が無いので、該偏光制御素子１００を含んだ光走査部１９が大型化するのを防止できる。
In the above-described embodiment, the case where the
また、上記実施形態では、偏光制御素子１００として液晶装置から構成された場合について説明したが、偏光制御素子として各分割領域１５１〜１５８に所定の光学軸（偏光制御素子１００の駆動時に各分割領域１５１〜１５８に発現される光学軸を矢印に一致）を有する１／２波長板を設けたものを採用することができる。この構成においても、所定方向に沿った直線偏光を入射させることでレーザ光Ｌの集光スポット径を小さくすることができる。
In the above-described embodiment, the case where the
また、上記実施形態では、偏光制御素子１００の各分割領域１５１〜１５８が１／２波長板として機能させる場合について説明したが、また、各分割領域１５１〜１５８ごとに偏光の旋光性を独立して制御することで上記ラジアル偏光のように複数の偏光状態を含むビームを形成することができる。このような旋光性を有する光学材料としては、液晶の他、水晶（非線形光学結晶）を例示することができる。水晶は光学軸の方向に光が入射すると偏光が回る特性を有している。すなわち、各々の光学軸の方向が異なる複数の水晶を組み合わせることで偏光制御素子を構成しても構わない。
Moreover, although the said embodiment demonstrated the case where each division | segmentation area | region 151-158 of the
また、各分割領域１５１〜１５８を独立して制御することでそれぞれの位相差（旋光性）を異ならせ、偏光制御素子１００を通過したレーザ光を所定のラジアル偏光に変換する構成であっても構わない。
Moreover, even if it is the structure which changes each phase difference (optical rotation) by controlling each division area 151-158 independently, and converts the laser beam which passed the
以上、偏光制御素子１００を共焦点顕微鏡に適用した場合について説明したが、偏光制御素子１００は下記の光学装置について応用可能である。光学装置は、標本２４に対してレーザ光（照明光）を射出する光源部１と、照明光を標本に対して結像させる光学系と、標本２４と非共役の位置に設けられた偏光制御素子１００と、を備えている。偏光制御素子１００は対物レンズの瞳面もしくは該瞳面と共役な面のいずれか一方及びその近傍に配置するのが好ましい。より好ましい形態としては、例えば対物レンズ内に瞳面が設定された構成において、光学部材を介してリレーした瞳面の近傍に偏光制御素子１００を配置することにより、リレー光学系による偏光状態の変化の影響を最小とすることができる。
The case where the
光学装置としては、照射光の持つエネルギを用いて例えば細胞内外に存在する細かな粒子を意図的に掴み移動させる光ピンセット（Ｌａｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｗｅｅｚｅｒｓ：ＬＯＴ）技術を用いた捕捉装置を例示できる。このような光ピンセット技術では、掴む力を大きくすることが好ましく、この為には対物レンズの開口数を大きくする必要がある。しかしながら、一般的には開口数の大きな対物レンズは倍率も大きく、広視野観察の状態で用いる事ができない。これに対し、本発明を採用すれば、上記偏光制御素子１００を用いることで、対物レンズの倍率に関わらず開口数を上げる効果があるので光ピンセット技術において高い開口数の対物レンズを用いた場合と同等の効果を得ることができる。なお、光ピンセット技術においては、ピンセット動作に用いた光を再び対物レンズを通して戻す必要性はない。したがって、偏光制御素子１００は光ピンセットの波長のみを考慮して位相制御等を行えば良い。
Examples of the optical device include a capturing device using an optical tweezers (LOT) technique that intentionally grabs and moves fine particles existing inside and outside the cell using the energy of irradiation light. In such an optical tweezer technology, it is preferable to increase the gripping force. For this purpose, it is necessary to increase the numerical aperture of the objective lens. However, in general, an objective lens having a large numerical aperture has a large magnification and cannot be used in a wide-field observation state. On the other hand, if the present invention is employed, the use of the
また、上述の光学装置を照明光として用いることで、走査型多光子励起レーザ顕微鏡（例えば、走査型２光子励起レーザ顕微鏡）に応用可能である。具体的には、例えば、偏向制御素子が光源部と対物レンズとの間に設置された走査型２光子励起レーザ顕微鏡においても、光を走査する平面の分解能（ＸＹ分解能）を向上させることができる。 Further, by using the above-described optical device as illumination light, the present invention can be applied to a scanning multiphoton excitation laser microscope (for example, a scanning two-photon excitation laser microscope). Specifically, for example, even in a scanning two-photon excitation laser microscope in which a deflection control element is installed between a light source unit and an objective lens, the resolution (XY resolution) of a plane for scanning light can be improved. .
１光子観察時の蛍光強度分布は励起光のＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：点像強度分布）の1乗に比例するのに対し、２光子観察時の蛍光強度分布は励起光のＰＳＦの２乗に比例する。従って、１光子観察時と比べて、２光子観察時では、蛍光強度のピーク強度に対するサイドローブ強度が低下する。そのため、２光子観察時には、サイドローブの強いＰＳＦであっても、サイドローブによる信号雑音比（ＳＮ比）の低下およびＸＹ分解能の低下を防止できるというメリットがある。従って、２光子観察というのは本発明の好ましい適用例であると言える。 The fluorescence intensity distribution during one-photon observation is proportional to the first power of the excitation light PSF (Point Spread Function), whereas the fluorescence intensity distribution during two-photon observation is the square of the excitation light PSF. Proportional. Therefore, the side lobe intensity with respect to the peak intensity of the fluorescence intensity is lower in the two-photon observation than in the one-photon observation. Therefore, at the time of two-photon observation, even if the PSF has a strong side lobe, there is a merit that it is possible to prevent a decrease in signal noise ratio (SN ratio) and a decrease in XY resolution due to the side lobe. Therefore, it can be said that the two-photon observation is a preferable application example of the present invention.
なお、上述の光学装置を照明光として用いる際、ビームが干渉フィルタやレンズ等の光学素子を通過するほど、ビームの偏光状態は崩れて変わってしまう。そこで、上記光学素子の影響を受け難い、結像系との合流の直前に偏光制御素子を配置するのが好ましい。この構成によれば、理想的な状態に近いビームを得ることができる。 When the above-described optical device is used as illumination light, the polarization state of the beam collapses and changes as the beam passes through an optical element such as an interference filter or a lens. Therefore, it is preferable to dispose the polarization control element immediately before joining with the imaging system, which is hardly affected by the optical element. According to this configuration, a beam close to an ideal state can be obtained.
また、上述の光学装置を照明光とし、光刺激に応用することができる。光刺激とは例えばレーザスキャン顕微鏡やＣＣＤカメラを用いた顕微鏡画像解析システムにおいて、画像化と同じもしくは異なる光路から画像化と同じもしくは異なる波長の光（レーザ光である場合が多い）を用いて、ターゲットとする細胞（標本）の一部に意図的に光照射して、その細胞内で起こっている様々な生物化学的現象を、例えば、光照射による意図的な退色によって退色させた部位を追従調査したり、或いは光照射による蛍光タンパクの光変換を利用して変色した部位を追従調査したりする等の所謂光操作一般を指す。この光操作は、画像化とは異なり操作に用いた光を再び対物レンズを通して戻す必要性はない。すなわち、偏光制御素子１００は光刺激の波長のみを考慮して位相制御等を行えば良い。本発明を適用すれば、照射ビームのＸＹ面内における照射ビーム径を細くする事ができ、より詳細で細かなターゲットの光操作が可能となる。
In addition, the above-described optical device can be used as illumination light and applied to light stimulation. In the microscope image analysis system using, for example, a laser scanning microscope or a CCD camera, light stimulation uses light of the same or different wavelength as that of imaging (often laser light) from the same or different optical path as that of imaging. A part of the target cell (specimen) is intentionally irradiated with light, and various biochemical phenomena occurring in the cell are followed, for example, following a site that has been discolored by intentionally fading due to light irradiation. It refers to general so-called light manipulation such as investigation or follow-up investigation of a discolored site using photoconversion of fluorescent protein by light irradiation. Unlike the imaging, this light operation does not require the light used for the operation to be returned through the objective lens. That is, the
また、上記実施形態に係る顕微鏡は、蛍光相関分光法に用いることが好適である。蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）は、蛍光物質の分子運動を調べるために用いられるものであり、共焦点顕微鏡の照射によって生じた中央がくびれた光の空間的照射領域内を通過する、蛍光色素がラベリングされていたり蛍光タンパクが発現している分子の発する蛍光をフォトンカウンティングする技術がベースとなっている。蛍光相関分光法における精度を向上させる為には、照射領域をより小さくする必要がある。これに対し、本発明を採用すれば、上記偏光制御素子１００を用いることで、光の空間的照射領域の中央のくびれは更に狭くなり、逆に光軸方向はやや延びる傾向にあるが、光軸方向は検出器前に設置したピンホールによってその長さを制御できるので、結果的には光の空間的照射領域（体積）を小さくして、傾向相関分光法の感度を向上することができる。なお、蛍光相関分光法では発生した蛍光は再び対物レンズを通るが必要な信号は、１点からの信号のみであり画像化する必要は無い。
また、本実施形態は、レーザ走査型共顕微鏡として、レーザ光の反射タイプのものを示したが、レーザ透過型共焦点顕微鏡のものでもよく、例えば、ニッポウディスクタイプのものや、液晶マトリクスタイプのものがある。
In addition, the microscope according to the above-described embodiment is preferably used for fluorescence correlation spectroscopy. Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) is used to examine the molecular motion of a fluorescent substance and passes through the spatial illumination area of the constricted light produced by confocal microscope irradiation. The technology is based on photon counting of fluorescence emitted by molecules labeled with fluorescent dyes or expressed with fluorescent proteins. In order to improve the accuracy in fluorescence correlation spectroscopy, it is necessary to make the irradiation region smaller. On the other hand, when the present invention is employed, the use of the
Further, in the present embodiment, a laser beam reflection type is shown as the laser scanning confocal microscope, but it may be a laser transmission confocal microscope, such as a Nippon disk type or a liquid crystal matrix type. There is something.
１…光源部、１０…顕微鏡本体、１２…走査ユニット、１３…開口（ピンホール）、１９…光走査部、２４…標本、１００…偏光制御素子、１５１〜１５８…分割領域、１５１ａ〜１５８ａ…液晶装置
DESCRIPTION OF
Claims (14)
前記顕微鏡本体に設けられる標本に対してレーザ照明光を射出する光源部と、
前記照明光を前記標本上に照射する照明部と、
前記標本と共役な位置であり、且つ前記照明部にて照射された前記標本から射出された光の復路上に配置される検出光学系と、
前記光源部から射出された前記照明光における前記標本に向かう往路のうち、前記復路と重ならない位置に配置され、前記光源部から出射された前記照明光を光軸に垂直な面内で偏光分布を所定分布に制御する偏光制御素子と、
前記偏光制御素子は、前記照明光の光路上における前記照明部よりも前記光源部側に配置される
ことを特徴とするレーザ顕微鏡。 A microscope body,
A light source unit for emitting laser illumination light to a specimen provided in the microscope body;
An illumination unit that irradiates the specimen with the illumination light;
A detection optical system disposed on the return path of the light emitted from the sample irradiated by the illumination unit at a position conjugate with the sample;
The illumination light emitted from the light source unit is arranged at a position that does not overlap the return path in the forward path toward the sample, and the illumination light emitted from the light source unit is polarized in a plane perpendicular to the optical axis. A polarization control element that controls the distribution to a predetermined distribution;
The laser microscope, wherein the polarization control element is disposed closer to the light source unit than the illumination unit on the optical path of the illumination light.
前記照明部は、前記照明光を前記標本上で２次元的にスキャンされるように偏向する光走査部を有する走査ユニットからなり、
前記光走査部は、少なくとも１つのミラーを有しており、
前記偏光制御素子は、前記照明光の光路上における前記少なくとも１つのミラーよりも前記光源部側に配置されることを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。 The detection optical system has a pinhole,
The illumination unit includes a scanning unit having an optical scanning unit that deflects the illumination light so as to be scanned two-dimensionally on the specimen.
The optical scanning unit has at least one mirror,
The laser microscope according to claim 1, wherein the polarization control element is disposed closer to the light source than the at least one mirror on the optical path of the illumination light.
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