JP2012047481A - Detection method of urine antigen with immunoassay - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するための、鳥由来のIgYを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤、及びそれを用いた免疫測定法に関する。
また、本発明は、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法における非特異反応を抑制するために鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることができる、クロマトグラフ媒体、及びそのための展開液に関する。
The present invention relates to a nonspecific reaction inhibitor in an immunoassay using urine as a subject, comprising IgY derived from a bird for suppressing a nonspecific reaction in an immunoassay using urine as a subject, and The present invention relates to an immunoassay using the same.
In addition, the present invention can cause an immune reaction in the presence of a non-specific reaction inhibitor containing bird-derived IgY in order to suppress non-specific reaction in an immunochromatographic method using urine as a subject. , A chromatographic medium, and a developing solution therefor.
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く利用されている。特に、容易にかつ高感度で検出できる標識物質を用いた免疫測定法として、凝集法(血球やラテックスを担体として用いた方法)、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法等が知られている。
不溶性担体、放射性物質、酵素、螢光物質等を抗体に結合した標識抗体を用いるこれらの免疫測定法では、標識抗体は、一般に、抗体を固相に結合した固相化抗体と組み合わせて固相法に使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法等がある。固相には、ポリスチレンマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、磁性粒子、ガラスビーズ等を用いることができるが、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質を固相に用いたイムノクロマトグラフ法も知られている。
Immunoassays using antigen-antibody reactions are widely used in clinical tests because they can specifically detect or accurately measure trace components. In particular, as an immunoassay using a labeling substance that can be detected easily and with high sensitivity, an agglutination method (a method using blood cells or latex as a carrier), a radioimmunoassay, an enzyme immunoassay, a fluorescent immunoassay, etc. It has been known.
In these immunoassays using a labeled antibody in which an insoluble carrier, radioactive substance, enzyme, fluorescent substance, etc. are bound to the antibody, the labeled antibody is generally combined with a solid-phased antibody in which the antibody is bound to a solid phase. Used in law. The solid phase method includes a sandwich method in which a “solid phase antibody-antigen-labeled antibody” complex is prepared and measured, or a fixed amount of labeled antibody in which the solid phase antigen and the free antigen in the sample are added to the reaction system. There are competition methods based on the principle of reacting competitively. For the solid phase, polystyrene microplates, polystyrene beads, magnetic particles, glass beads, and the like can be used, but immunochromatography using a porous material such as a nitrocellulose membrane or cellulose filter paper is also known. .
抗原抗体反応は、ある抗原決定基に対して誘導された抗体の抗原結合部位が、その抗原決定基と高い相補性をもつことにより生ずる、特異性の高い結合反応である。ところが、抗原抗体反応を利用した免疫測定においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応が生じ、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。このような現象が起こる原因の1つには、被検出物質(抗原)以外の成分であるにもかかわらず、免疫測定に用いる抗体に結合する成分が、試料中に存在するという事実がある。例えば、試料中に存在する非特異因子が、標識抗体及び固相化抗体と反応して「固相化抗体−非特異因子−標識抗体」複合物を生じ、試料中に被検出物質が存在しないにもかかわらず、被検出物質が存在することを示す測定結果が得られることとなる(偽陽性、疑陽性)。
このような非特異因子は、被検出物質と特異的に反応する抗体のみならず、被検出物質と反応しない抗体とも結合する物質である。具体的な非特異因子としては、試料がヒトから採取されたものであり、被検出物質に対する標識抗体又は固相化抗体がマウスで作製された場合には、ヒト抗マウスIgG抗体、ヒト抗マウスIgM抗体等が挙げられる。非特異因子の例としては、異好性抗体(異種動物の抗原と反応する抗体)、リウマトイド因子(抗IgG抗体)等が知られているが、成分が明らかとなっていない非特異因子も多く存在する。
The antigen-antibody reaction is a highly specific binding reaction that occurs when an antigen-binding site of an antibody induced to a certain antigenic determinant has high complementarity with the antigenic determinant. However, in immunoassays using antigen-antibody reactions, it is often recognized that non-specific reactions other than the original target specific antigen-antibody reactions occur and the reliability of measured values is impaired. One of the causes of such a phenomenon is the fact that a component that binds to an antibody used for immunoassay is present in the sample even though it is a component other than the substance to be detected (antigen). For example, a non-specific factor present in a sample reacts with a labeled antibody and a solid-phased antibody to produce a “solid-phased antibody-non-specific factor-labeled antibody” complex, and there is no substance to be detected in the sample. Nevertheless, a measurement result indicating the presence of the substance to be detected is obtained (false positive, false positive).
Such a non-specific factor is a substance that binds not only to an antibody that specifically reacts with a substance to be detected, but also to an antibody that does not react with the substance to be detected. As specific non-specific factors, when a sample is collected from a human and a labeled antibody or a solid-phased antibody against a substance to be detected is produced in a mouse, a human anti-mouse IgG antibody, a human anti-mouse IgM antibody etc. are mentioned. Examples of non-specific factors include heterophilic antibodies (antibodies that react with antigens from different animals), rheumatoid factors (anti-IgG antibodies), etc., but there are many non-specific factors whose components have not been clarified. Exists.
試料中の非特異因子の存在は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できるという免疫測定法の利点を損なうため、従来、非特異因子による非特異反応を抑制し正しい測定値を得るための様々な試みが行われてきた。
例えば、特許文献1には、マウスモノクローナル抗体を用いた免疫測定法において、非特異反応吸収剤としてマウス血清、マウス腹水等を用いる方法が記載されている。特許文献2では、免疫測定法に使用される標識抗体と同一の抗体を、抗体本来の特異的な結合活性を失活させて非特異反応吸収剤として用いる方法が記載されている。特許文献3では、例えばウサギ由来の抗体を用いた免疫測定法における非特異因子(例えば、ヒト抗ウサギIgG抗体)の吸収剤として、ウサギで作製した非特異因子に対する抗体を用いる方法が記載されている。特許文献4では、免疫測定法に用いる抗体の産生動物種とは異なるウシ科動物種の血液成分を非特異反応抑制剤として用いることが記載されており、特許文献5では、γ−グロブリンを折衝させる方法が記載されている。
The presence of non-specific factors in the sample impairs the advantages of immunoassay methods that can measure trace components specifically and with high sensitivity. Various attempts have been made.
For example, Patent Document 1 describes a method of using mouse serum, mouse ascites, etc. as a nonspecific reaction absorbent in an immunoassay using a mouse monoclonal antibody. Patent Document 2 describes a method in which an antibody identical to a labeled antibody used in an immunoassay is used as a non-specific reaction absorbent by deactivating the antibody-specific specific binding activity. Patent Document 3 describes a method of using an antibody against a non-specific factor produced in a rabbit as an absorbent for a non-specific factor (for example, a human anti-rabbit IgG antibody) in an immunoassay using an antibody derived from a rabbit, for example. Yes. In Patent Document 4, it is described that a blood component of a bovine species different from the antibody-producing animal species used in the immunoassay is used as a nonspecific reaction inhibitor. In Patent Document 5, γ-globulin is negotiated. Is described.
また、特許文献6では、捕捉物質として断片化された抗体を用いる免疫反応測定において未重合のIgGを存在させることで非特異反応を抑制する方法が開示されている。特許文献7では、免疫反応測定において捕捉物質として用いられる抗体のFc部位に特異的結合能を有する抗体あるいはその断片をブロッキング剤として用い、捕捉物質として用いられる抗体のFc部位をブロックし非特異反応が抑制された免疫反応測定用抗体が開示されており、またそのブロック抗体としてリウマチ因子との干渉能を有さないIgGが断片化せずに効果を発揮することが記載されている。特許文献8では、捕捉物質としてIgMモノクローナル抗体を用いるヘテロジーニアス酵素免疫測定において免疫反応用緩衝液中に非特異的IgM抗体を共存させることで非特異反応を抑制するヘテロジーニアス酵素免疫測定法が開示されている。特許文献9では、非ヒト種の体液を含むサンプルを用いる免疫反応測定系においてマウスIgG、ロバIgGあるいはウサギIgGを含有するブロッキングバッファーを用いることで非特異反応を抑制できることが開示されている。
さらに、特許文献10では、ウサギに由来し被検出物質に特異的に結合しない免疫グロブリンを含んでなる、免疫測定法における非特異反応を抑制する方法が開示されている。
Patent Document 6 discloses a method for suppressing nonspecific reaction by allowing unpolymerized IgG to exist in an immune reaction measurement using a fragmented antibody as a capture substance. In Patent Document 7, an antibody having a specific binding ability to an Fc site of an antibody used as a capture substance in an immune reaction measurement or a fragment thereof is used as a blocking agent, and the Fc site of an antibody used as a capture substance is blocked to perform a nonspecific reaction. Have been disclosed, and IgG that does not have the ability to interfere with rheumatoid factor as a blocking antibody exhibits an effect without fragmentation. Patent Document 8 discloses a heterogeneous enzyme immunoassay method that suppresses nonspecific reactions by allowing nonspecific IgM antibodies to coexist in a buffer for immune reactions in heterogeneous enzyme immunoassays using IgM monoclonal antibodies as capture substances. Has been. Patent Document 9 discloses that nonspecific reactions can be suppressed by using a blocking buffer containing mouse IgG, donkey IgG, or rabbit IgG in an immune reaction measurement system using a sample containing a body fluid of a non-human species.
Furthermore, Patent Document 10 discloses a method for suppressing a nonspecific reaction in an immunoassay method, which comprises an immunoglobulin derived from a rabbit and not specifically bound to a substance to be detected.
さらに、特許文献11では、免疫学的方法において、非特異反応を抑制する方法として試薬中に低分子のペプチドを導入することによって非特異反応を抑制することが報告されており、特許文献12では、非特異反応を抑制する為に、塩化ナトリウム及びエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを導入することが報告され、さらに、特許文献13では、ホスホリルコリン基を有する重合体をある一定濃度抗体抗原反応中に存在させることにより非特異反応を抑制することが報告されている。
これらの従来技術での非特異抑制技術では、ペプチドなどを導入することにより感作粒子上の表面電荷を変化させることにより粒子の分散性を高め非特異反応を抑制することを目的としているものであり、また、塩化ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸、ホスホリルコリン基を有する重合体を抗体抗原反応中に存在する方法も感作粒子の分散性を高め非特異反応を抑制するが抜本的に非特異反応を抑制する問題を解決するものではないと考えられる。
Furthermore, Patent Document 11 reports that in immunological methods, as a method for suppressing non-specific reactions, it is reported that non-specific reactions are suppressed by introducing a low molecular weight peptide into the reagent. In order to suppress non-specific reactions, it has been reported that sodium chloride and sodium ethylenediaminetetraacetate are introduced. Further, in Patent Document 13, a polymer having a phosphorylcholine group is present in a certain concentration of antibody antigen reaction. Has been reported to suppress non-specific reactions.
These non-specific suppression techniques in the prior art are aimed at increasing the dispersibility of the particles and suppressing non-specific reactions by changing the surface charge on the sensitized particles by introducing peptides and the like. There is also a method in which a polymer having sodium chloride, ethylenediaminetetraacetic acid, or a phosphorylcholine group is present in the antibody-antigen reaction, which increases the dispersibility of sensitized particles and suppresses nonspecific reactions, but drastically suppresses nonspecific reactions. It is not considered to solve the problem.
これらの非特異反応を抑制する方法は、血清や粘膜などを検体として使用した場合とするものが多く、尿のような粘性が低く比較的夾雑物が少ないとされるものを検体とする場合には非特異反応は少ないと考えられていた。
しかしながら、尿検体を用いるイムノクロマト法などの免疫測定においても非特異反応が起こる場合があり、尿中における微量の夾雑物が非特異反応を生起させ、検出の信頼性を著しく損なう結果となることがある。また、尿は粘性が低く検体の調製が容易であることから、イムノクロマト法などの免疫測定における検体として優れた特性を有しているが、微量成分の夾雑による非特異反応が有り、必ずしも信頼性の高い方法ではなかった。そこで、尿を被検体とする免疫測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、尿中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するための、非特異反応抑制剤の開発が望まれていた。
There are many methods for suppressing these non-specific reactions when serum or mucous membrane is used as a sample, and when using a sample that has a low viscosity such as urine and relatively few contaminants. Was thought to have few nonspecific reactions.
However, non-specific reactions may occur even in immunoassays such as immunochromatography using urine specimens, and a small amount of contaminants in urine may cause non-specific reactions, resulting in a significant loss of detection reliability. is there. Urine has low viscosity and easy sample preparation, so it has excellent characteristics as a sample for immunoassay such as immunochromatography. However, there is a non-specific reaction due to contamination of trace components, which is not always reliable. It was not expensive. Therefore, it is hoped to develop a non-specific reaction inhibitor that can easily and effectively suppress non-specific reactions associated with immunoassays using urine as a specimen, and realize accurate detection and quantification of trace components in urine. It was rare.
本発明は、尿を被検体とした免疫学的方法を用いたイムノクロマト法などの免疫測定における非特異反応を抑制し、かつ高感度の検出を可能にする高感度で信頼性の高い免疫測定法及びそのための免疫測定媒体を提供するものである。また、本発明は、尿を被検体とした免疫学的方法を用いたイムノクロマト法などの免疫測定における非特異反応抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、尿を被検体とした肺炎球菌の断片を高感度でかつ高信頼性で検出できる免疫測定法及びそのための免疫測定媒体を提供するものである。
The present invention is a highly sensitive and highly reliable immunoassay method that suppresses non-specific reactions in immunoassays such as immunochromatography using an immunological method using urine as a specimen and enables highly sensitive detection. And an immunoassay medium therefor. The present invention also provides a nonspecific reaction inhibitor in immunoassay such as immunochromatography using an immunological method using urine as a subject.
The present invention also provides an immunoassay that can detect pneumococcal fragments of urine as a subject with high sensitivity and high reliability, and an immunoassay medium therefor.
本発明者らは、尿を被検体とした、特に全尿を被検体とした免疫測定法を検討してきたが、尿中には被検出物質の濃度も低く、感度を上げると非特異反応も多くなり、その結果SN比の向上が難しくなっていた。特に、尿を被検体としたときの感度を上げた場合における非特異反応の抑制が大きな問題となっていた。そこで、本発明者らは、鋭意検討してきた結果、意外にも鳥由来のタンパク質であるIgYが、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応の抑制剤として極めて優れていることを見出した。 The present inventors have studied an immunoassay method using urine as a subject, particularly whole urine as a subject, but the concentration of the substance to be detected is low in urine, and non-specific reactions may occur when sensitivity is increased. As a result, it was difficult to improve the SN ratio. In particular, suppression of non-specific reactions has been a major problem when sensitivity is increased when urine is used as a subject. Thus, as a result of intensive studies, the present inventors have surprisingly found that IgY, which is a bird-derived protein, is extremely excellent as an inhibitor of nonspecific reaction in an immunoassay using urine as a subject. It was.
即ち、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するための、鳥由来のIgYを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤に関する。
また、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するために、鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることを特徴とする尿を被検体とした免疫測定法に関する。
さらに、本発明は、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法における非特異反応を抑制するために鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることができる、クロマトグラフ媒体に関する。
また、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤として鳥由来のIgYを含有してなる、尿を被検体とするイムノクロマトグラフ法における展開液を提供するものである。
さらに、本発明は、尿中に***される病原体抗原、例えば、肺炎球菌由来の夾膜(ポリサッカライド)を高感度でかつ高信頼性で検出するための免疫測定法及びそのための免疫測定媒体、例えばクロマトグラフ媒体に関する。
That is, the present invention relates to a nonspecific reaction inhibitor in an immunoassay using urine as a subject, which contains IgY derived from a bird for suppressing a nonspecific reaction in an immunoassay using urine as a subject. About.
In addition, the present invention allows an immune reaction to be carried out in the presence of a non-specific reaction inhibitor containing avian-derived IgY in order to suppress non-specific reaction in an immunoassay using urine as a subject. The present invention relates to an immunoassay using characteristic urine as a subject.
Furthermore, the present invention can cause an immune reaction in the presence of a non-specific reaction inhibitor containing avian-derived IgY in order to suppress non-specific reaction in an immunochromatographic method using urine as a subject. Relates to chromatographic media.
The present invention also provides a developing solution for immunochromatography using urine as a subject, which contains IgY derived from birds as a non-specific reaction inhibitor in an immunoassay using urine as a subject. .
Furthermore, the present invention relates to an immunoassay for detecting a pathogen antigen excreted in urine, for example, a pneumococcal-derived capsule (polysaccharide) with high sensitivity and high reliability, and an immunoassay medium therefor, For example, it relates to a chromatographic medium.
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
(1)鳥由来のIgYを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤。
(2)鳥由来のIgYの濃度が、0.01〜1μg/μLである前記(1)に記載の非特異反応抑制剤。
(3)免疫測定法が、尿中の抗原を検出するための方法である前記(1)又は(2)に記載の非特異反応抑制剤。
(4)抗原が、尿中の病原体抗原である前記(3)に記載の非特異反応抑制剤。
(5)免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記(1)から(4)のいずれかに記載の非特異反応抑制剤。
(6)尿を被検体とし尿中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、非特異反応を抑制するために鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることを特徴とする尿を被検体とした免疫測定法。
(7)免疫測定法が、尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬、並びに尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなる標識試薬を用いて尿中の被検出物質を特異的に検出する免疫測定法である前記(6)に記載の免疫測定法。
(8)免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記(6)又は(7)に記載の免疫測定法。
(9)非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される前記(8)に記載の免疫測定法。
(10)非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている前記(8)に記載の免疫測定法。
(11)免疫反応が、さらに界面活性剤の存在下で行われる前記(6)〜(10)のいずれかに記載の免疫測定法。
(12)尿中の被検出物質が、尿中の抗原である前記(6)〜(11)のいずれかに記載の免疫測定法。
(13)抗原が、尿中の病原体抗原である前記(12)に記載の免疫測定法。
(14)前記(1)〜(5)のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含有してなる、尿を被検体とするイムノクロマトグラフ法における展開液。
(15)尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位を有する尿を被検体としたクロマトグラフ媒体において、移動相を構成する液体が非特異反応抑制剤として鳥由来のIgYを含有できる構成となっていることを特徴とする、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
(16)鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている前記(15)に記載のクロマトグラフ媒体。
(17)鳥由来のIgYを含有してなる非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される前記(15)に記載のクロマトグラフ媒体。
(18)鳥由来のIgYの含有量が、1ストリップ当たり2〜200μgである、前記(15)〜(17)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(19)移動相を構成する液体が、さらに界面活性剤を含有する前記(15)〜(18)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(20)被検出物質と特異的に結合する第一試薬が、被検出物質の抗体である前記(15)〜(19)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(21)被検出物質が、尿中の病原体抗原である前記(15)〜(20)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(22)病原体抗原が、肺炎球菌由来の病原体抗原である前記(21)に記載のクロマトグラフ媒体。
The present invention will be described in detail as follows.
(1) A non-specific reaction inhibitor in an immunoassay using urine as a subject, comprising a bird-derived IgY.
(2) The nonspecific reaction inhibitor according to (1) above, wherein the concentration of bird-derived IgY is 0.01 to 1 μg / μL.
(3) The nonspecific reaction inhibitor according to (1) or (2), wherein the immunoassay is a method for detecting an antigen in urine.
(4) The nonspecific reaction inhibitor according to (3), wherein the antigen is a urinary pathogen antigen.
(5) The nonspecific reaction inhibitor according to any one of (1) to (4), wherein the immunoassay is an immunochromatography method.
(6) In an immunoassay for specifically detecting a substance to be detected in urine using urine as a specimen, a nonspecific reaction inhibitor comprising a bird-derived IgY for suppressing a nonspecific reaction An immunoassay using urine as a subject, characterized by causing an immune reaction in the presence of the subject.
(7) An immunoassay method uses a first reagent that specifically binds to a substance to be detected in urine, and a second reagent that specifically binds to a substance to be detected in urine and a labeling reagent comprising a labeling substance The immunoassay method according to (6), which is an immunoassay method that specifically detects a substance to be detected in urine.
(8) The immunoassay method according to (6) or (7), wherein the immunoassay method is an immunochromatographic method.
(9) The immunoassay method according to (8), wherein the nonspecific reaction inhibitor is supplied as a developing solution in an immunochromatographic method.
(10) The immunoassay method according to (8), wherein the nonspecific reaction inhibitor is fixed to a chromatographic medium.
(11) The immunoassay method according to any one of (6) to (10), wherein the immune reaction is further performed in the presence of a surfactant.
(12) The immunoassay method according to any one of (6) to (11), wherein the substance to be detected in urine is an antigen in urine.
(13) The immunoassay method according to (12), wherein the antigen is a pathogen antigen in urine.
(14) A developing solution in an immunochromatographic method using urine as a subject, comprising the nonspecific reaction inhibitor according to any one of (1) to (5).
(15) In a chromatographic medium using a urine having a determination site on which a first reagent that specifically binds to a substance to be detected in urine is immobilized, the liquid constituting the mobile phase is a nonspecific reaction inhibitor A chromatographic medium for immunochromatography using urine as a specimen, characterized in that the composition can contain a bird-derived IgY.
(16) The chromatographic medium according to (15), wherein the nonspecific reaction inhibitor containing IgY derived from birds is fixed to the chromatographic medium.
(17) The chromatographic medium according to (15), wherein the nonspecific reaction inhibitor containing IgY derived from birds is supplied as a developing solution in an immunochromatographic method.
(18) The chromatographic medium according to any one of (15) to (17), wherein the content of bird-derived IgY is 2 to 200 μg per strip.
(19) The chromatographic medium according to any one of (15) to (18), wherein the liquid constituting the mobile phase further contains a surfactant.
(20) The chromatographic medium according to any one of (15) to (19), wherein the first reagent that specifically binds to the substance to be detected is an antibody of the substance to be detected.
(21) The chromatographic medium according to any one of (15) to (20), wherein the substance to be detected is a pathogen antigen in urine.
(22) The chromatographic medium according to (21), wherein the pathogen antigen is a pneumococcal-derived pathogen antigen.
本発明は、尿を被検体とした免疫測定法において、鳥由来のタンパク質であるIgYを存在させることにより尿中の夾雑物により非特異的反応を顕著に抑制させることを見出したものである。本発明の鳥由来のIgYは、抗原認識部位が異なっているIgYであっても、非特異的反応を顕著に抑制させることができることから、抗原認識部位にかかわらず、IgYのFc部分の存在により、非特異的反応を顕著に抑制させることができると考えられる。 In the immunoassay method using urine as a subject, the present invention has found that non-specific reaction is remarkably suppressed by impurities in urine by the presence of IgY which is a bird-derived protein. Even if the IgY derived from a bird of the present invention is an IgY having a different antigen recognition site, the nonspecific reaction can be remarkably suppressed. Therefore, the presence of the Fc portion of IgY regardless of the antigen recognition site. It is considered that non-specific reactions can be remarkably suppressed.
尿は粘性が低く被検体の調製が容易であり、イムノクロマトグラフ法などの免疫測定法における被検体として優れているが、非特異的反応が多く、検出の信頼性において問題があった。しかし、本発明により尿を被検体として用いても非特異的反応を顕著に抑制させることができることから、尿を被検体として用いるイムノクロマトグラフ法などの免疫測定法を高感度で、高信頼性で、そしてより簡便な方法で尿を被検体とした免疫測定法を行うことが可能となる。 Urine is low in viscosity and easy to prepare a sample, and is excellent as a sample in immunoassay methods such as immunochromatography, but there are many non-specific reactions and there is a problem in reliability of detection. However, since non-specific reactions can be remarkably suppressed even when urine is used as a subject according to the present invention, immunoassay methods such as immunochromatography using urine as a subject are highly sensitive and reliable. In addition, an immunoassay method using urine as a subject can be performed by a simpler method.
また、感染症患者の尿中に病原体抗原(例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原(lipopolysaccharide)など)が排出されることは約20年以上前から報告されてきている。例えば、肺炎球菌、レジオネラ、インフルエンザ桿菌、髄膜炎菌などの病原体抗原が排出されることが知られている。呼吸器感染症患者からの痰などの呼吸器系の検体からの検出では口腔内常在菌の混入による感染菌の特定の困難さから、特に呼吸器感染症患者における尿中抗原の検出は重要とされている。また、尿は採取が容易であるだけでなく、比較的大量に採取することもできる。
このようなことから、非特異的反応を顕著に抑制させることができる尿を被検体とした新規な免疫測定法を提供することができる本発明は、尿中の病原体抗原の検出を簡便で高感度で、高信頼性で行うことを可能とするものであり、尿中の病原体抗原を検出する優れた方法を提供するものである。
In addition, it has been reported from about 20 years ago that pathogen antigens (for example, capsular polysaccharide antigens and endotoxin antigens (lipopolysaccharides) of pathogens) are excreted in the urine of infected patients. For example, it is known that pathogen antigens such as Streptococcus pneumoniae, Legionella, Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis are excreted. Detecting urinary antigens in patients with respiratory infections is particularly important for detection of respiratory infections such as sputum from patients with respiratory infections due to the difficulty of identifying infectious bacteria due to contamination with oral resident bacteria. It is said that. In addition, urine can be collected not only easily but also in a relatively large amount.
For this reason, the present invention that can provide a novel immunoassay method using urine that can significantly suppress non-specific reactions as a subject is simple and highly capable of detecting pathogen antigens in urine. It is sensitive and can be performed with high reliability, and provides an excellent method for detecting pathogen antigens in urine.
本発明の鳥由来のIgYとしては、鳥類の免疫グロブリンであるIgYであればよく、鳥類としてはニワトリが好ましい。また、IgYであれば、抗原認識部位はいずれであってもよく、モノクローナルIgYであっても、ポリクローナルIgYであってもよい。即ち、Fc部がIgYとなっていればいずれのIgYであってもよい。したがって、ニワトリのIgYであって、入手のしやすいIgYが好ましい。なお、本発明の鳥由来のIgYは、被検出物質に特異的に結合しないものでなければならないことは当然のことである。好ましい鳥由来のIgYとしては、例えば、ニワトリ抗ヒト血清アルブミンポリクローナルIgYや、ニワトリ抗ポリサッカライドポリクローナルIgYなどが挙げられる。
ニワトリのIgYは、公知の方法(例えば、特許第3597784号公報等)に従って調製することができる。例えば、抗原で免疫したニワトリから卵を採取し、この卵から卵黄を分離して粉末化した卵黄粉末を、エタノール等の溶媒を用いて脱脂して脱脂卵黄粉末とし、この脱脂卵黄粉末に緩衝液(例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等)を加えて撹拌・抽出して上清を回収し、この上清を適宜脱塩、濃縮、粉末化することにより各抗原蛋白質に対するニワトリIgYを調製することができる。
The bird-derived IgY of the present invention may be IgY which is an immunoglobulin of birds, and chickens are preferred as birds. Moreover, as long as it is IgY, the antigen recognition site may be any, and may be monoclonal IgY or polyclonal IgY. That is, any IgY may be used as long as the Fc portion is IgY. Therefore, chicken IgY that is readily available is preferred. It should be noted that the bird-derived IgY of the present invention must be one that does not specifically bind to the substance to be detected. Examples of preferable bird-derived IgY include chicken anti-human serum albumin polyclonal IgY and chicken anti-polysaccharide polyclonal IgY.
Chicken IgY can be prepared according to a known method (for example, Japanese Patent No. 3597784). For example, an egg is collected from a chicken immunized with an antigen, and the yolk powder obtained by separating and pulverizing the yolk from the egg is defatted using a solvent such as ethanol to obtain a defatted egg yolk powder, and the defatted egg yolk powder is buffered. (For example, phosphate buffer, Tris-hydrochloric acid buffer, etc.) are added, stirred and extracted, and the supernatant is recovered. The supernatant is appropriately desalted, concentrated and powdered to obtain chicken IgY for each antigen protein. Can be prepared.
本発明の非特異反応抑制剤は、鳥類の免疫グロブリンであるIgYを含有するものであり、イムノクロマトグラフ法においては、これをニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質に含有させておいてもよい。この場合には、尿自体に展開液としての機能を果たさせることもできるし、別途展開液を調製することもできる。
本発明の非特異反応抑制剤を溶液として使用する場合には、鳥由来のIgYを0.01〜1μg/μL好ましくは0.02〜0.5μg/μL、さらに好ましくは0.02〜0.0.2μg/μLの濃度とするのが好ましい。また、多孔性物質に含有させるには、1検体の測定(1ストリップ)当たり、2〜200μg、好ましくは3〜200μg、より好ましくは3〜100μg、さらに好ましくは3〜50μgである。この場合の1検体の量としては、全尿で10〜300μL、好ましくは30〜200μL、さらに好ましくは40〜200μLが挙げられる。
The non-specific reaction inhibitor of the present invention contains IgY which is an avian immunoglobulin, and in the immunochromatographic method, it may be contained in a porous material such as a nitrocellulose membrane or cellulose filter paper. Good. In this case, the urine itself can function as a developing solution, or a developing solution can be prepared separately.
When the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is used as a solution, the bird-derived IgY is 0.01 to 1 μg / μL, preferably 0.02 to 0.5 μg / μL, and more preferably 0.02 to 0.03. The concentration is preferably 0.2 μg / μL. In addition, for inclusion in the porous material, the amount is 2 to 200 μg, preferably 3 to 200 μg, more preferably 3 to 100 μg, still more preferably 3 to 50 μg per measurement (one strip) of one specimen. In this case, the amount of one sample is 10 to 300 μL, preferably 30 to 200 μL, more preferably 40 to 200 μL in the whole urine.
本発明における被検体としての尿としては、ヒトの尿が好ましいが、これに限定されるものではない。尿は、初尿でも中間尿でもよい。被検出物質が病原体抗原である場合には、病原体抗原が比較的熱に強いことから、熱処理が施された尿であってもよい。また、尿は展開液などで希釈されたものであってもよいが、希釈されないものであってもよい。本明細書においては、希釈されず、加熱処理などで処理がされていない採取した尿を「全尿」ということにする。
本発明における免疫測定法としては、抗原抗体反応を利用する免疫測定法であれば、公知のいずれの免疫測定法でもよく、例えば、凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法等を挙げることができる。これらの測定法においては、固相に結合した固相化抗体又は固相化抗原を用いて、被検出物質及び標識抗体の分離が行われる。固相には、一般に、ポリスチレンマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、磁性粒子、ガラスビーズ、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等を用いることができる。マイクロプレートを固相に用いた場合には個々のウェル内に反応溶液が満たされ、また、ビーズ、粒子等を固相に用いた場合には試験管、チューブ等の容器内に満たされた反応溶液中にそれらが分散されるので、免疫反応は比較的多量の溶液中で進行する。一方、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質を固相に用いたイムノクロマトグラフ法では、わずかな展開液が多孔性物質中を移動していく環境下で免疫反応が進行するので、非特異因子と固相化抗体がより密に接触し、非特異反応が促進する可能性が考えられるが、本発明の非特異反応抑制剤は、このような免疫測定法においても優れた免疫抑制効果を奏するものである。
The urine as the subject in the present invention is preferably human urine, but is not limited thereto. The urine may be primary urine or intermediate urine. When the substance to be detected is a pathogen antigen, since the pathogen antigen is relatively resistant to heat, urine subjected to heat treatment may be used. In addition, urine may be diluted with a developing solution or the like, but may not be diluted. In this specification, the collected urine that has not been diluted and has not been subjected to heat treatment or the like is referred to as “total urine”.
As an immunoassay method in the present invention, any known immunoassay method may be used as long as it uses an antigen-antibody reaction. For example, an agglutination method, a radioimmunoassay method, an enzyme immunoassay method, a fluorescent immunity method, and the like. A measuring method etc. can be mentioned. In these measurement methods, a substance to be detected and a labeled antibody are separated using a solid-phased antibody or a solid-phased antigen bound to a solid phase. In general, polystyrene microplates, polystyrene beads, magnetic particles, glass beads, nitrocellulose membranes, cellulose filter paper and the like can be used for the solid phase. When a microplate is used for the solid phase, the reaction solution is filled in each well, and when beads, particles, etc. are used for the solid phase, the reaction is filled in a container such as a test tube or tube. Since they are dispersed in solution, the immune reaction proceeds in a relatively large amount of solution. On the other hand, in the immunochromatography method using a porous material such as nitrocellulose membrane or cellulose filter paper as the solid phase, the immune reaction proceeds in an environment where a small amount of the developing solution moves through the porous material. There is a possibility that the non-specific reaction may be promoted by contacting the factor and the immobilized antibody more closely, but the non-specific reaction inhibitor of the present invention has an excellent immunosuppressive effect even in such an immunoassay. It is what you play.
本発明において、免疫測定法に用いる抗体とは、被検出物質に特異的に結合する免疫グロブリンであればよく、当該抗体としては、被検出物質上の様々な抗原決定基を認識する、様々なクラスの免疫グロブリン分子が混在した状態のポリクローナル抗体であってもよく、単一の抗原決定基を認識する単一の分子種からなるモノクローナル抗体であってもよい。
本発明において、免疫測定法に用いる抗体が由来する動物種とは、抗体が被検出物質を動物に投与することにより作製されたものである場合には、被検出物質を投与され抗体を産生した動物の種をいう。抗体が、抗体を産生する動物から細胞を採取し、当該細胞により産生されたものである場合には、当該細胞が由来する動物種をいう。複数の細胞を融合した融合細胞により抗体を産生する場合には、融合前の各々の細胞が由来するそれぞれの動物種をいう。さらに、抗体を、分子生物学的手法により、異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげてキメラ抗体として作製する場合には、抗体が由来する動物種とは、免疫グロブリン遺伝子断片を取得したそれぞれの動物種をいう。
免疫測定法に用いる抗体が由来する動物種の具体例としては、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明における好ましい動物種としては抗原の種類によるが、抗原が病原体抗原である場合には、マウスやウサギが挙げられる。
In the present invention, the antibody used in the immunoassay may be an immunoglobulin that specifically binds to the substance to be detected. Examples of the antibody include various antibodies that recognize various antigenic determinants on the substance to be detected. It may be a polyclonal antibody in which a class of immunoglobulin molecules are mixed, or may be a monoclonal antibody consisting of a single molecular species that recognizes a single antigenic determinant.
In the present invention, the animal species from which the antibody used in the immunoassay is derived is produced by administering the substance to be detected to the animal and producing the antibody by administering the substance to be detected. An animal species. When an antibody is a cell collected from an animal producing the antibody and produced by the cell, it refers to the animal species from which the cell is derived. When an antibody is produced by a fused cell obtained by fusing a plurality of cells, it refers to each animal species from which each cell before fusion is derived. Furthermore, when an antibody is produced as a chimeric antibody by connecting immunoglobulin gene fragments of different animals using molecular biological techniques, the animal species from which the antibody is derived refers to each of the immunoglobulin gene fragments obtained. An animal species.
Specific examples of animal species from which antibodies used in immunoassays are derived include, but are not limited to, mice, rats, guinea pigs, dogs, goats, sheep, pigs, horses, cows and humans. The preferred animal species in the present invention depends on the type of antigen, but when the antigen is a pathogen antigen, examples thereof include mice and rabbits.
本発明の非特異反応抑制剤は、被検出物質を含む被検体としての尿と接触させることにより、本来の目的とする抗原抗体反応以外の非特異反応を抑制することができる。本発明の非特異反応抑制剤と尿との接触はどのような方法で行われてもよいが、例えば、被検出物質を含む尿と被検出物質に対する抗体とを接触させる前に、あらかじめ尿に本発明の非特異反応抑制剤を添加して、非特異因子と反応させることによって、非特異反応を抑制してもよいし、被検出物質に対する抗体と非特異反応抑制剤を含む反応溶液中に、被検出物質を含む尿を添加して、非特異因子と非特異反応抑制剤を反応させることによって、非特異反応を抑制してもよい。 The nonspecific reaction inhibitor of the present invention can suppress nonspecific reactions other than the intended antigen-antibody reaction by contacting with urine as an analyte containing a substance to be detected. The contact between the nonspecific reaction inhibitor of the present invention and urine may be carried out by any method. For example, before contacting the urine containing the substance to be detected with the antibody against the substance to be detected, the urine is contacted beforehand. By adding the non-specific reaction inhibitor of the present invention and reacting with a non-specific factor, the non-specific reaction may be suppressed, or in a reaction solution containing an antibody against the substance to be detected and the non-specific reaction inhibitor. The nonspecific reaction may be suppressed by adding urine containing the substance to be detected and reacting the nonspecific factor with the nonspecific reaction inhibitor.
本発明の一態様として、例えば、イムノクロマトグラフ法による免疫測定に、本発明の非特異反応抑制剤を適用する場合には、多孔性物質からなるクロマトグラフ媒体上で移動相を構成する展開液に、予め本発明の非特異反応抑制剤を添加しておくことができる。展開液による展開は、被検出物質を含む尿と同時に行ってもよいし、尿をクロマトグラフ媒体に先行して滴下した後、被検出物質が固相化抗体の結合した反応部位に到達可能となるように、適量の展開液を後から展開してもよい。本発明の他の態様としては、クロマトグラフ媒体における移動相の展開経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の展開液が適用される端部又は当該端部と反応部位との間の領域に、本発明の非特異反応抑制剤を乾燥・保持しておき、移動相を構成する尿及び/又は展開液により溶解して、尿と接触させることもできる。 As one aspect of the present invention, for example, when the nonspecific reaction inhibitor of the present invention is applied to immunoassay by immunochromatography, a developing solution constituting a mobile phase on a chromatographic medium made of a porous substance is used. The nonspecific reaction inhibitor of the present invention can be added in advance. The development with the developing solution may be performed simultaneously with the urine containing the substance to be detected, or after the urine is dripped in advance on the chromatographic medium, the substance to be detected can reach the reaction site to which the immobilized antibody is bound. Thus, an appropriate amount of the developing solution may be developed later. As another aspect of the present invention, the development phase of the mobile phase in the chromatographic medium, that is, the end portion to which the developing solution of the chromatographic medium is applied or the region between the end portion and the reaction site is used. The nonspecific reaction inhibitor can be dried and retained, dissolved in urine and / or developing solution constituting the mobile phase, and brought into contact with urine.
この接触時における、本発明の非特異反応抑制剤の濃度としては、非特異反応抑制剤と被検体としての尿との混合比率や接触時間等の条件、あるいは尿の個体差により異なり一概に言うことはできないが、通常は、鳥由来のIgYとして尿10μL当たり0.1〜100μgの範囲にあることが好ましく、0.5〜20μgの範囲があることが特に好ましい。また、被検出物質に特異的に結合する抗体に対しての混合比は特に制限されるものではないが、通常、40:1〜1:40の範囲にあることが好ましい。 The concentration of the non-specific reaction inhibitor of the present invention at the time of contact varies depending on the mixing ratio of the non-specific reaction inhibitor and urine as the subject, contact time, and other conditions, or individual differences in urine. In general, however, it is preferably in the range of 0.1 to 100 μg, particularly preferably in the range of 0.5 to 20 μg, per 10 μL of urine as IgY derived from birds. The mixing ratio with respect to the antibody that specifically binds to the substance to be detected is not particularly limited, but it is usually preferably in the range of 40: 1 to 1:40.
本発明の非特異反応抑制剤が適用できる免疫測定法において、検出できる被検出物質としては、尿中に存在する抗原となる物質であって、それに特異的に結合する抗体が存在する抗原であれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、多糖類、複合糖質などを例示することができる。尿中に存在し得る病原体抗原(例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原(lipopolysaccharide)など)が好ましい。特に、尿中に微量に含まれる抗原が好適である。なぜなら、抗原の含まれる濃度が微量である程、相対的に非特異的反応の影響が大きくなるので、本発明の非特異反応抑制剤が有用となるからである。
具体的な被検出物質としては、例えば、尿中に存在し得る病原体抗原(例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原(lipopolysaccharide)など)を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
In the immunoassay method to which the non-specific reaction inhibitor of the present invention can be applied, the detectable substance can be a substance that becomes an antigen present in urine and that has an antibody that specifically binds to it. Examples thereof include proteins, peptides, polysaccharides, complex carbohydrates and the like. Pathogen antigens that can be present in urine (eg, capsular polysaccharide antigens or endotoxin antigens (lipopolysaccharides) of pathogens) are preferred. In particular, an antigen contained in a trace amount in urine is preferable. This is because the smaller the concentration of the antigen, the greater the influence of the non-specific reaction, and the non-specific reaction inhibitor of the present invention is useful.
Specific examples of the substance to be detected include, but are not limited to, pathogen antigens that can be present in urine (for example, capsular polysaccharide antigens and endotoxin antigens (lipopolysaccharides) of pathogens). It is not a thing.
本発明は、尿を被検体とするものであり、被検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。したがって、以下では、特にイムノクロマトグラフ法について詳細に説明する。
クロマトグラフ媒体
本発明のイムノクロマトグラフ法において用いるクロマトグラフ媒体は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される検出試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないものであり、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。
本発明において、クロマトグラフ媒体としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じクロマトグラフ媒体として機能する。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル(ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物)膜、ナイロン膜、濾紙である。
The present invention uses urine as a specimen, and is particularly useful in an immunochromatographic method that is easy to handle because of the ease of collection of the specimen. Therefore, in the following, the immunochromatography method will be described in detail.
Chromatographic medium The chromatographic medium used in the immunochromatographic method of the present invention is an inert medium composed of a microporous material exhibiting capillary action, and reacts with the detection reagent, the immobilization reagent, the substance to be detected, etc. However, the material is not particularly limited as long as it has a development speed at which a sufficient sensitivity can be obtained by a determination in a short time.
In the present invention, the chromatographic medium includes ceramic fine particles such as silica, titania, zirconia, ceria and alumina, or fine particles of organic polymer, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, nylon, nitrocellulose or acetic acid. Examples thereof include fibrous or non-woven fibrous matrices composed of cellulose derivatives such as cellulose, membranes, filter paper, glass fiber filter paper, cloth, and cotton. Even if the microparticles are not porous per se, voids are generated between the microparticles in the packed state and function as a chromatographic medium. Preferred are cellulose derivatives and nylon membranes, filter papers, glass fiber filter papers, and more preferred are nitrocellulose membranes, mixed nitrocellulose ester (mixtures of nitrocellulose and cellulose acetate) membranes, nylon membranes, and filter papers.
本発明の実施に供されるクロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。 The form and size of the chromatographic medium used in the practice of the present invention are not particularly limited, and may be appropriate in terms of actual operation and observation of reaction results. In order to make the operation easier, it is preferable to provide a support made of plastic or the like on the back surface of the chromatographic medium having the reaction sites formed on the surface. The properties of the support are not particularly limited, but when the measurement result is observed by visual judgment, the support preferably has a color that is not similar to the color caused by the labeling substance. Usually, it is preferably colorless or white.
判定部位
本発明において用いるクロマトグラフ媒体上には、尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬、例えば抗体が任意の位置に固定化された判定部位が形成される。抗体などの第一試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、第一試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法と、第一試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的又は化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体に捕捉して固定化する間接固定化方法がある。
直接的に固定化する方法としては、物理吸着を利用しても良いし、共有結合によってもよい。一般にクロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜又は混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。共有結合ではクロマトグラフ媒体の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。間接的に固定化する方法としては、不溶性微粒子に第一試薬を結合した後に、クロマトグラフ媒体に固定化する方法がある。不溶性微粒子の粒径はクロマトグラフ媒体に捕捉されるが移動することのできないサイズのものを選択することができ、好ましくは平均粒径10μm程度以下の微粒子である。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。また、クロマトグラフ媒体への第一試薬の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、インキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。判定部位の形態としては特に限定されないが、円形のスポット、クロマトグラフ媒体の展開方向に垂直にのびるライン、数字、文字や+、−などの記号等として固定化することもできる。
Determination site On the chromatographic medium used in the present invention, a determination site is formed in which a first reagent that specifically binds to a substance to be detected in urine, for example, an antibody is immobilized at an arbitrary position. The first reagent such as an antibody can be immobilized on a chromatographic medium by directly immobilizing the first reagent on the chromatographic medium by physical or chemical means, and the first reagent on fine particles such as latex particles. There is an indirect immobilization method that binds physically or chemically and captures and immobilizes the fine particles in a chromatographic medium.
As a method of directly immobilizing, physical adsorption may be used, or covalent bonding may be used. Generally, when the chromatographic medium is a nitrocellulose membrane or a mixed nitrocellulose ester membrane, physical adsorption can be performed. In the covalent bond, cyanogen bromide, glutaraldehyde, carbodiimide and the like are generally used for activating the chromatographic medium, but any method can be used. As a method for immobilizing indirectly, there is a method in which a first reagent is bound to insoluble fine particles and then immobilized on a chromatographic medium. The particle size of the insoluble fine particles can be selected such that it is captured by the chromatographic medium but cannot move, and is preferably fine particles having an average particle size of about 10 μm or less. Various particles used for antigen-antibody reaction are known as these particles, for example, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer. Organic polymer fine particles such as organic polymer latex particles obtained by emulsion polymerization methods such as polymers, fine particles such as gelatin, bentonite, agarose, and crosslinked dextran, inorganic oxides such as silica, silica-alumina, alumina, and inorganic Examples thereof include inorganic particles in which a functional group is introduced into the oxide by a silane coupling treatment or the like.
In the present invention, direct immobilization is preferred from the standpoint of ease of sensitivity adjustment. Various methods can be used for immobilizing the first reagent on the chromatographic medium. For example, various techniques such as a microsyringe, a pen with a control pump, and ink jet printing can be used. Although the form of the determination site is not particularly limited, it can be fixed as a circular spot, a line extending perpendicularly to the developing direction of the chromatographic medium, a numeral, a letter, a symbol such as +, −, or the like.
第一試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、ツイーン20、トリトンX−100、SDS等の界面活性剤を1つ又は2つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
その他、クロマトグラフ媒体には、必要に応じて、被検出物質を含む尿を添加するための尿添加部位(サンプルパッド等)、尿中の不溶物質を除去する部位、展開液を添加するための展開液添加部位、判定部位に捕獲されなかった被検出物質や展開液を吸い取る吸収部位(吸収パッド等)、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料液や展開液が移動できれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、第一試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。
After the first reagent is immobilized, the chromatographic medium can be subjected to a blocking treatment by a known method, if necessary, in order to prevent the accuracy of analysis from being lowered due to nonspecific adsorption. Generally, proteins such as bovine serum albumin, skim milk, casein, and gelatin are preferably used for the blocking treatment. After such blocking treatment, a surfactant such as Tween 20, Triton X-100, or SDS may be washed in combination with one or more if necessary.
In addition to the chromatographic medium, a urine addition site (sample pad, etc.) for adding urine containing the substance to be detected, a site for removing insoluble substances in urine, and a developing solution as necessary. A developing solution addition site, an absorption site (absorbing pad or the like) that absorbs a substance to be detected or a developing solution that has not been captured by the determination site, a control site indicating that the measurement has been performed normally, and the like may be incorporated. The members of these parts are not particularly limited as long as the sample solution and the developing solution can move by capillary action, and generally, a plurality of porous substances such as a nitrocellulose membrane, filter paper, and glass fiber filter paper are used according to the purpose. A thing can be selected and used, and it can arrange | position so that it may connect with the chromatographic medium to which the 1st reagent was fix | immobilized by the capillary.
標識試薬
本発明における標識試薬は、尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなっており、一般的には第二試薬が吸着や化学結合などにより標識物質に結合している。
標識物質
本発明で用いられる検出試薬は、尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬、例えば抗体であり、標識物質により標識化される。イムノクロマトグラフ法における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、尿中の被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、本発明の標識物質としては不溶性担体を用いるのが好ましい。本発明においては、第二試薬を不溶性担体に感作することにより標識化した第二試薬を標識試薬として調製する。
本発明で用いられる標識物質としての不溶性担体としては、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、その他を用いることができる。
Labeling reagent The labeling reagent in the present invention is composed of a second reagent and a labeling substance that specifically bind to a substance to be detected in urine, and generally the second reagent binds to the labeling substance by adsorption or chemical bonding is doing.
Labeling substance The detection reagent used in the present invention is a second reagent that specifically binds to the substance to be detected in urine, such as an antibody, and is labeled with the labeling substance. An enzyme or the like is generally used for labeling the detection reagent in the immunochromatography method. However, since it is suitable for visually determining the presence of a substance to be detected in urine, the labeling substance of the present invention is an insoluble carrier. Is preferably used. In the present invention, a second reagent labeled by sensitizing the second reagent to an insoluble carrier is prepared as a labeling reagent.
Examples of the insoluble carrier as a labeling substance used in the present invention include colloidal metal particles such as gold, silver and platinum, colloidal metal oxide particles such as iron oxide, colloidal nonmetal particles such as sulfur, and synthetic materials. Latex particles made of molecules and others can be used.
不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。合成高分子よりなるラテックス粒子は自然の状態で白色であるため、そのままでは標識物質として使用することはできないが、例えば油溶性染料によって、特に水系媒体中のラテックス粒子を、油溶性染料の油性有機溶剤による溶液のエマルジョンによって染色することにより、所望の色彩を所望の濃さで有するものとすることができる。このようなラテックス粒子としては、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えばスチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエンなどの重合性不飽和芳香族類、例えば(メタ)アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸などの重合性不飽和カルボン酸類、例えば(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸−n−ブチル、(メタ)アクリル酸−2−ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−(メタ)アクリル酸エステル、(メタ)アクリル酸トリブロモフェニルなどの重合性不飽和カルボン酸エステル類、(メタ)アクリロニトリル、(メタ)アクロレイン、(メタ)アクリルアミド、N−メチロール−(メタ)アクリルアミド、メチレンビス(メタ)アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、N−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなどの不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類などを挙げることができる。これらのモノマーは、標識物質として要求される表面特性、比重などによって適宜選択され、1種を単独で又は2種以上を混合して使用することができる。 The insoluble carrier is a labeling substance suitable for visually determining the presence of the substance to be detected, and is preferably colored in order to facilitate the visual determination. The colloidal metal particles and the colloidal metal oxide particles themselves exhibit a specific natural color corresponding to the particle diameter, and the color can be used as a label. Latex particles made of a synthetic polymer are naturally white and cannot be used as a labeling substance as they are. However, for example, latex particles in an aqueous medium are treated with oil-soluble dyes, such as oil-soluble organic dyes. By dyeing with an emulsion of a solution with a solvent, it is possible to have a desired color at a desired intensity. Such latex particles can be obtained by polymerizing or copolymerizing various monomers. Examples of monomers include polymerizable unsaturated aromatics such as styrene, chlorostyrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, and vinyltoluene, such as polymerization of (meth) acrylic acid, itaconic acid, maleic acid, and fumaric acid. Unsaturated carboxylic acids such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, (n-butyl) (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, ethylene Polymerizable unsaturated carboxylic acid esters such as glycol-di- (meth) acrylic acid ester, tribromophenyl (meth) acrylic acid, (meth) acrylonitrile, (meth) acrolein, (meth) acrylamide, N-methylol- ( (Meth) acrylamide, methylenebis (meth) acrylamide, Tadiene, isoprene, vinyl acetate, vinyl pyridine, N-vinyl pyrrolidone, vinyl chloride, vinylidene chloride, vinyl bromide and other unsaturated carboxylic acid amides, polymerizable unsaturated nitriles, vinyl halides, conjugated dienes, etc. Can be mentioned. These monomers are appropriately selected depending on the surface characteristics and specific gravity required as a labeling substance, and can be used alone or in combination of two or more.
本発明において、標識物質として特に好ましい標識物質としては、コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子、例えば、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、コロイド状白金粒子、コロイド状酸化鉄粒子、コロイド状水酸化アルミニウム粒子などが挙げられる。特に、コロイド状金粒子とコロイド状銀粒子が適当な粒径において、コロイド状金粒子は赤色、コロイド状銀粒子は黄色を示す点で好ましい。これらのコロイド状金属粒子の平均粒径は1〜500nm、特に強い色調が得られる10nm〜150nm、より好ましくは20〜100nmの範囲内であることがさらに好ましい。
これらの不溶性担体に関しては、ラテックス粒子又はコロイド状金属粒子のいずれにおいても、その表面が負に荷電していることが知られている(例えば、特開平5−133956号公報参照)。例えば、コロイド状金属粒子では、その製造過程で添加される還元剤由来のアニオンがその表面に吸着しており、相互の凝集が妨げられて分散した状態を保っている。そして、この状態のコロイド状金属粒子に、表面電荷を中和しない程度の低濃度の界面活性剤を添加すると、粒子が鎖状に数個程度凝集することが知られている(特開2006−58781号公報)。このように、本発明のイムノクロマトグラフ法においても、移動相を構成する展開液に界面活性剤を添加すると、クロマトグラフ媒体上の判定部位に捕捉された不溶性担体が数個程度凝集することにより、反応部位で観察される陽性シグナルの増幅が見られると推測される。特に、コロイド状金属粒子においては、凝集によって反応部位に蓄積する粒子の数が増加することにより、目視判定されるシグナル量が増加するのみならず、粒子の光吸収スペクトル特性が変化することにより、判定部位においてより明瞭な陽性シグナルを得ることが可能となると推測される。このような利点を有することから、コロイド状貴金属粒子、特にコロイド状金粒子は、本発明の標識物質として好ましいものである。
コロイド状金属粒子として、例えばコロイド状金粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法によりコロイド状金粒子を調製することができる。
In the present invention, particularly preferable labeling substances as labeling substances include colloidal metal particles and colloidal metal oxide particles such as colloidal gold particles, colloidal silver particles, colloidal platinum particles, colloidal iron oxide particles, colloids. And aluminum hydroxide particles. In particular, the colloidal gold particles and the colloidal silver particles are preferable in that the colloidal gold particles are red and the colloidal silver particles are yellow in an appropriate particle size. These colloidal metal particles have an average particle diameter of 1 to 500 nm, more preferably within a range of 10 nm to 150 nm, more preferably 20 to 100 nm at which a particularly strong color tone is obtained.
Regarding these insoluble carriers, it is known that the surface of either latex particles or colloidal metal particles is negatively charged (see, for example, JP-A-5-133958). For example, in a colloidal metal particle, an anion derived from a reducing agent added in the production process is adsorbed on the surface, and mutual aggregation is prevented to maintain a dispersed state. Then, it is known that when a low-concentration surfactant that does not neutralize the surface charge is added to the colloidal metal particles in this state, several particles are aggregated in a chain shape (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-2006). No. 58781). Thus, even in the immunochromatography method of the present invention, when a surfactant is added to the developing solution constituting the mobile phase, about several insoluble carriers captured at the determination site on the chromatographic medium are aggregated, It is presumed that positive signal amplification observed at the reaction site is observed. In particular, in colloidal metal particles, by increasing the number of particles accumulated in the reaction site due to aggregation, not only the amount of signal visually determined increases, but also the light absorption spectrum characteristics of the particles change, It is presumed that a clearer positive signal can be obtained at the determination site. Because of such advantages, colloidal noble metal particles, particularly colloidal gold particles, are preferable as the labeling substance of the present invention.
For example, when colloidal gold particles are used as the colloidal metal particles, commercially available ones may be used. Alternatively, colloidal gold particles can be prepared by a conventional method, for example, a method of reducing chloroauric acid with sodium citrate.
本発明で用いられる第二試薬をコロイド状金属粒子に感作する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、コロイド状金粒子に第二試薬として抗体を感作した標識試薬は、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製することができる。 As a method for sensitizing the colloidal metal particles with the second reagent used in the present invention, known methods such as physical adsorption and chemical bonding can be used. For example, a labeling reagent sensitized with an antibody as a second reagent on colloidal gold particles is added with bovine serum albumin solution after adding the antibody to a solution in which gold particles are colloidally dispersed and then physically adsorbed. It can be prepared by blocking the surface of unbound particles.
本発明のイムノクロマトグラフ法の実施において、標識物質により標識化した第二試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することもできるし、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部又は当該端部と判定部位との間の領域に固定化して存在させて適用することもできる。クロマトグラフ媒体上に存在させる場合、標識試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、標識試薬を支持させるのが好ましい。支持させる部位には、標識試薬の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。標識試薬を塗布・乾燥等によりクロマトグラフ媒体上に存在させる場合には、クロマトグラフ媒体に直接、塗布・乾燥等することもできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に塗布・乾燥等して標識試薬の保持部材(コンジュゲートパッド)を形成した後、クロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置させることもできる。 In the implementation of the immunochromatography method of the present invention, the second reagent labeled with a labeling substance can be applied by being dispersed in a developing solution constituting the mobile phase, or the mobile phase in the chromatographic medium constituting the stationary phase. It is also possible to apply it by immobilizing it on the development movement path, that is, the end to which the mobile phase of the chromatographic medium is applied or the region between the end and the determination site. When present on the chromatographic medium, it is preferable to support the labeling reagent so that the labeling reagent dissolves quickly in the developing solution and can be freely moved by capillary action. In order to improve the re-solubility of the labeling reagent on the site to be supported, saccharides such as saccharose, maltose and lactose, sugar alcohols such as mannitol are added and applied, or these substances are coated beforehand. It can also be left. When the labeling reagent is present on the chromatographic medium by coating / drying, it can be directly coated / dried on the chromatographic medium, or another porous substance such as cellulose filter paper, glass fiber filter paper, nylon, etc. After the labeling reagent holding member (conjugate pad) is formed by applying and drying the nonwoven fabric, it can be arranged so as to be connected to the chromatographic medium by a capillary.
第一試薬及び第二試薬
第一試薬及び第二試薬は同じであっても、異なっていてもよいが、同じ有る方が簡便で好ましい。これらの第一試薬及び第二試薬としては、尿中の被検出物質と特異的に結合することができる試薬であれば特に制限はされないが、被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、特別な場合を除きポリクローナル抗体が簡便性の点からも好ましい。このような抗体は、被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。
尿中の被検出物質として、尿中の病原体抗原、特に病原体の夾膜多糖体抗原とする場合には、ウサギ由来のポリクローナル抗体が好ましい。
First Reagent and Second Reagent The first reagent and the second reagent may be the same or different, but the same is preferable because it is the same. These first reagent and second reagent are not particularly limited as long as they can specifically bind to a substance to be detected in urine, but when the substance to be detected is an antigen, it is specific to it. Antibodies that are capable of binding conjugated are preferred. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but a polyclonal antibody is preferable from the viewpoint of convenience except in special cases. Such an antibody can be produced by a known method by sensitizing an animal with an antigen as a substance to be detected.
When a urinary substance to be detected is a pathogen antigen in urine, particularly a capsular polysaccharide antigen of a pathogen, a rabbit-derived polyclonal antibody is preferable.
展開液
本発明で用いられる展開液は、イムノクロマトグラフ法において移動相を構成する液体であり、固定相であるクロマトグラフ媒体上を、尿中の被検出物質を含む尿及び標識試薬と共に移動する。
本発明で用いられる展開液は、通常、水を溶媒とし、上記の酸素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマー及び非イオン性界面活性剤に加え、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等を挙げることができる。また、さらに他の成分として、ウシ血清アルブミン(BSA)等のタンパク質成分(含有量は通常0.01重量%〜10重量%)を任意で含んでいてもよい。
また、本発明は被検体として粘性の低い尿を使用することから、被検体の尿を展開液として使用することもできる。
Developing solution The developing solution used in the present invention is a liquid constituting a mobile phase in the immunochromatography method, and moves on a chromatographic medium, which is a stationary phase, together with urine containing a substance to be detected in urine and a labeling reagent.
In general, the developing solution used in the present invention preferably contains a buffer in addition to the above-described vinyl-based water-soluble polymer having an oxygen atom-containing polar group and a nonionic surfactant, using water as a solvent. Preferable examples of the buffer include phosphate, trishydroxymethylaminomethane, Good's buffer, and the like. Further, as other components, protein components such as bovine serum albumin (BSA) (content is usually 0.01% by weight to 10% by weight) may optionally be included.
In addition, since the present invention uses urine with low viscosity as the subject, the urine of the subject can also be used as the developing solution.
界面活性剤
本発明の方法においては、界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、特にHLB値が10〜18、好ましくはHLB値が13〜18のポリオキシエチレン系界面活性剤がより好ましい。ポリオキシエチレン系界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(商品名「Tween」シリーズ)、ポリオキシエチレンp−t−オクチルフェニルエーテル(商品名「Triton」シリーズ)、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル(商品名「Brij」シリーズ)、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル(商品名「ノニオンMN」)等を挙げることができ、より具体的には、「Tween」シリーズでは、特にTween20(商品名)、Tween40(商品名)、Tween60(商品名)、Tween80(商品名);「Triton」シリーズでは、特にTriton X−100(商品名)、Nonidet P−40(商品名)、TritonX−114(商品名)、NP−40(商品名);「Brij」シリーズでは、Brij58(商品名)、Brij35(商品名);「ノニオンMN」では、アルキル基の炭素数=14、オキシプロピレンのモル比/オキシエチレンのモル比=1.1のMN−811等を挙げることができる。これらのなかでは、Brij35、Brij58、MN−811、Tween80などが好ましい。
界面活性剤は、単独でも2種以上を混合して用いることもできる。上記した界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、組成物全体の質量に対し0.01〜10質量%の範囲であり、好ましくは0.05〜5質量%、より好ましくは0.1〜2質量%の範囲が挙げられる。
Surfactant In the method of the present invention, it is preferable to add a surfactant. The surfactant is preferably a nonionic surfactant, and more preferably a polyoxyethylene surfactant having an HLB value of 10 to 18, preferably an HLB value of 13 to 18. Preferred examples of the polyoxyethylene surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (trade name “Tween” series), polyoxyethylene pt-octylphenyl ether (trade name “Triton”). Series), polyoxyethylene aliphatic ether (trade name “Brij” series), polyoxyethylene / polyoxypropylene-alkyl ether (trade name “Nonion MN”), and the like. In the “Tween” series, in particular, Tween 20 (product name), Tween 40 (product name), Tween 60 (product name), Tween 80 (product name); in the “Triton” series, in particular, Triton X-100 (product name), Nonidet P-40 ( Product name), Triton X-114 (product name), NP-40 (product name); in the “Brij” series, Brij58 (product name), Brij35 (product name); in “nonion MN”, the carbon number of the alkyl group = 14 And MN-811 having a molar ratio of oxypropylene / a molar ratio of oxyethylene = 1.1. Of these, Brij35, Brij58, MN-811, Tween80 and the like are preferable.
Surfactants can be used alone or in admixture of two or more. Although content of above-mentioned surfactant is not specifically limited, It is the range of 0.01-10 mass% with respect to the mass of the whole composition, Preferably it is 0.05-5 mass%, More preferably, it is 0.1. The range of -2 mass% is mentioned.
本発明の一態様としては、展開液に予め界面活性剤を添加した後、クロマトグラフ媒体上で移動層を構成する液体として展開液をクロマトグラフ媒体上で展開させることができる。本発明の他の態様としては、界面活性剤を、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部又は当該端部と判定部位との間の領域に存在させておき、尿などの展開液により移動層が形成された際に溶解させて混合させることもできる。さらに、本発明の他の態様としては、被検出物質を含む尿中に界面活性剤を添加し、これを展開させて、移動層を構成する液体として展開液をクロマトグラフ媒体上で展開させることもできる。 As one aspect of the present invention, after adding a surfactant to the developing solution in advance, the developing solution can be developed on the chromatographic medium as a liquid constituting the moving layer on the chromatographic medium. As another aspect of the present invention, the surfactant is determined to be the end of the mobile phase in the chromatographic medium constituting the stationary phase, that is, the end to which the mobile phase of the chromatographic medium is applied or the end. It can also exist in the area | region between parts, and when a moving layer is formed with developing liquids, such as urine, it can also dissolve and mix. Furthermore, as another aspect of the present invention, a surfactant is added to urine containing a substance to be detected, and this is developed to develop a developing solution on the chromatographic medium as a liquid constituting the moving bed. You can also.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
イムノクロマト試薬の作製
(1)判定部位の作製
ニトロセルロースからなる膜の判定ライン領域に、抗体塗布機(BioDot社)を用いて抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体(Polyclonal Rabbit anti Streptcoccus pneumoniae antibody)を塗布した。抗体は、予め10mM炭酸ナトリウム水溶液(pH7.5)に希釈し、4mg/mLとした。本試験では、4mg/mLの抗体溶液95μL、20%シュクロース溶液75μL、イソプロパノール(Wako)15μL、10mM炭酸ナトリウム水溶液(pH7.5)115μLをそれぞれ混合し、合計300μLの抗体溶液を作製した。作製した抗体溶液中の抗体濃度はおよそ1.3mg/mLとし、これを1cmあたりおよそ1.116μLの割合で塗布し、42℃で1時間乾燥した。
なお、コントロール用ライン領域にはマウスIgGに対するヤギ由来の抗血清を用いた。抗体は、予め10mM炭酸ナトリウム水溶液(pH7.5)に希釈し、2.25mg/mLとした。2.25mg/mLの抗体溶液60μL、イソプロパノール(Wako)15μL、10mM炭酸ナトリウム水溶液(pH7.5)225μLをそれぞれ混合し、合計300μLの抗体溶液を作製した。作製した抗体濃度は0.45mg/mLとし、これを1cmあたり0.744μLの割合で塗布した。
Preparation of immunochromatographic reagent (1) Preparation of determination site An anti-pneumococcal rabbit polyclonal antibody (Polyclonal Rabbit anti-Streptcoccus pneumoniae antibody) was applied to the determination line region of the membrane made of nitrocellulose using an antibody coating machine (BioDot). The antibody was previously diluted in 10 mM aqueous sodium carbonate (pH 7.5) to give 4 mg / mL. In this test, 95 μL of 4 mg / mL antibody solution, 75 μL of 20% sucrose solution, 15 μL of isopropanol (Wako), and 115 μL of 10 mM aqueous sodium carbonate solution (pH 7.5) were mixed to prepare a total 300 μL antibody solution. The antibody concentration in the prepared antibody solution was approximately 1.3 mg / mL, and this was applied at a rate of approximately 1.116 μL per cm and dried at 42 ° C. for 1 hour.
In the control line region, goat-derived antiserum against mouse IgG was used. The antibody was previously diluted in a 10 mM aqueous sodium carbonate solution (pH 7.5) to give 2.25 mg / mL. 2. A 25 mg / mL antibody solution (60 μL), isopropanol (Wako) 15 μL, and a 10 mM sodium carbonate aqueous solution (pH 7.5) 225 μL were mixed to prepare a total 300 μL antibody solution. The prepared antibody concentration was 0.45 mg / mL, and this was applied at a rate of 0.744 μL per cm.
(2)コンジュゲートパッドの作製
コンジュゲートパッドは、以下のように作製した。およそ60ppmの金コロイド溶液500μLに対して、50mM HEPES(pH9.0)100μLを加えた後、混和し、5mM HEPESで15mg/mLに調製しておいた前記(1)に記載した判定部位の作製に用いられる抗体と同じ抗体(抗肺炎球菌ウサギポリクローナル)の溶液100μLを添加し、すぐに混和した。室温で10分間放置した後、CE510(JSR社)を100μL、及び50mM KH2PO4(pH7.5)に溶解した1%(w/v)PEG(分子量20,000)溶液を100μLずつそれぞれ添加し、混和した。室温で10分間放置したのち、遠心分離機(クボタ)を用いて8,000×g、4℃の条件で10分間遠心分離した。上澄み液を除去し、1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)、0.05%(w/v)PEG(分子量20,000)、0.1%(w/v)NaN3、150mM NaCl、20mM Tris−HCl、pH8.2からなる金コロイド保存液を加えた。超音波破砕機を用いて金コロイド粒子をよく分散させた後、8,000×g、4℃の条件で10分間遠心分離した。上澄み液を除去し、金コロイド保存液を加えて超音波破砕機にてよく分散させた。UV測定器(島津)を用いて溶液のOD値を測定し、OD値がほぼ9になるように調製した。これを抗体感作金コロイド溶液(標識試薬溶液)とした。この抗体感作金コロイド溶液321μLに対して純水あるいは超純水を426μL、及び25%(w/v)トレハロース溶液を106.6μLそれぞれ加えて、よく混和した。本試験では、この溶液853.6μLを、縦16mm、横10cmのガラス繊維パッド(ミリポア社)に添加し、均一に馴染ませた。真空乾燥機を用いて十分に乾燥させ、コンジュゲートパッドを得た。
(2) Preparation of conjugate pad A conjugate pad was prepared as follows. Preparation of the determination site described in (1) above, wherein 100 μL of 50 mM HEPES (pH 9.0) was added to 500 μL of a gold colloid solution of about 60 ppm, and then mixed to 15 mg / mL with 5 mM HEPES. 100 μL of a solution of the same antibody (anti-pneumococcal rabbit polyclonal) as that used in the above was added and mixed immediately. After leaving at room temperature for 10 minutes, 100 μL of CE510 (JSR) and 100 μL each of 1% (w / v) PEG (molecular weight 20,000) solution dissolved in 50 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) were added. And mixed. After standing at room temperature for 10 minutes, the mixture was centrifuged for 10 minutes at 8,000 × g and 4 ° C. using a centrifuge (KUBOTA). The supernatant was removed and 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA), 0.05% (w / v) PEG (molecular weight 20,000), 0.1% (w / v) NaN 3 , 150 mM A colloidal gold stock solution consisting of NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.2 was added. The gold colloid particles were well dispersed using an ultrasonic crusher, and then centrifuged at 8,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes. The supernatant was removed, and a gold colloid preservation solution was added and well dispersed with an ultrasonic crusher. The OD value of the solution was measured using a UV measuring device (Shimadzu), and the OD value was adjusted to about 9. This was used as an antibody-sensitized gold colloid solution (labeling reagent solution). To this antibody-sensitized gold colloid solution 321 μL, 426 μL of pure water or ultrapure water and 106.6 μL of 25% (w / v) trehalose solution were added and mixed well. In this test, 853.6 μL of this solution was added to a glass fiber pad (Millipore) having a length of 16 mm and a width of 10 cm, and was uniformly blended. It was sufficiently dried using a vacuum dryer to obtain a conjugate pad.
(3)サンプルパッドの作製
サンプルパッドは、以下のように作成した。1M Tris−HCl150μL、10%Brij35 150μL、0.5M EDTA 10μL、及び純水あるいは超純水690μLをそれぞれ加えて、よく混和した。この溶液1000μLを、縦20mm、横10cmのガラス繊維パッド(ミリポア社)に添加し、均一に馴染ませた。真空乾燥機を用いて十分に乾燥させ、サンプルパッドを得た。
(4)クロマトグラフ媒体の作製
前記(1)で作製した判定部位及びコントロール用ライン領域を有するクロマトグラフ媒体上に、前記(2)及び(3)で作製したコンジュゲートパッド及びサンプルパッドを設置し、展開された水溶液を吸収する吸収パッドをコントロールライン下流に設置して、本発明のクロマトグラフ媒体を製造した。
(3) Production of sample pad The sample pad was produced as follows. 1 M Tris-HCl 150 μL, 10% Brij 35 150 μL, 0.5 M EDTA 10 μL, and pure water or ultrapure water 690 μL were added and mixed well. 1000 μL of this solution was added to a glass fiber pad (Millipore) having a length of 20 mm and a width of 10 cm, and uniformly blended. The sample pad was sufficiently dried using a vacuum dryer.
(4) Preparation of chromatographic medium The conjugate pad and sample pad prepared in (2) and (3) above are installed on the chromatographic medium having the determination site and control line area prepared in (1). Then, an absorption pad for absorbing the developed aqueous solution was installed downstream of the control line to produce the chromatographic medium of the present invention.
尿を被検体としたイムノクロマト試薬でのIgYの非特異抑制評価
尿を被検体として鳥由来のIgYの導入濃度を変化させ非特異抑制効果を評価した。
(1)イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の作製
抗体として、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体(Polyclonal Rabbit anti Streptcoccus pneumoniae antibody)を用い、鳥由来のIgYを0、2、3、7、10、及び20μg/1ストリップ(strip)それぞれ導入して、真空乾燥機を用いて十分に乾燥させて、実施例1と同様にしてサンプルパッドを得た。
得られたサンプルパッドを用いて、実施例1と同様にして、鳥由来のIgYを0、2、3、7、10、及び20μg/1ストリップ(strip)それぞれ有する本発明のクロマトグラフ媒体を製造した。
Evaluation of non-specific inhibition of IgY with immunochromatography reagent using urine as a subject The introduction concentration of bird-derived IgY was changed using urine as a subject to evaluate the non-specific inhibitory effect.
(1) Preparation of chromatographic medium for immunochromatography As an antibody, anti-pneumococcal rabbit polyclonal antibody (Polyclonal Rabbit anti Streptcoccus pneumoniae antibody) is used, and IgY derived from birds is 0, 2, 3, 7, 10, and Each 20 μg / 1 strip was introduced and sufficiently dried using a vacuum dryer to obtain a sample pad in the same manner as in Example 1.
Using the obtained sample pad, the chromatographic media of the present invention having IgYs derived from birds of 0, 2, 3, 7, 10, and 20 μg / 1 strip were produced in the same manner as in Example 1. did.
(2)非特異抑制効果の評価
被検体として、尿のみ、及び尿に肺炎球菌(Streptcoccus pneumoniae)の夾膜抗原を精製したものを11.5ng/mLの濃度になるように添加した尿サンプルを用いた。被検体量は150μLとして、これを前記(1)で製造した本発明のクロマトグラフ媒体のサンプルパッドの上に滴下した。被検体150μLを導入後、15分後に判定部位における発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社)で測定した。
結果を図1のグラフに示す。図1の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は鳥由来のIgYの添加量(μg/ストリップ)を示す。各棒グラフの左側は、被検体として尿のみを使用した場合を示し、右側は、尿に肺炎球菌夾膜抗原を添加した尿サンプルの場合を示す。
(2) Evaluation of non-specific inhibitory effect As a subject, a urine sample containing urine alone and purified urine pneumococcal (Streptcoccus pneumoniae) capsular antigen added to a concentration of 11.5 ng / mL. Using. The amount of the analyte was 150 μL, and this was dropped onto the sample pad of the chromatographic medium of the present invention produced in (1) above. After introducing 150 μL of the specimen, the color intensity at the determination site was measured 15 minutes later using an immunochromatographic reader (Hamamatsu Photonics).
The results are shown in the graph of FIG. The vertical axis in FIG. 1 indicates the color intensity at the determination site, and the horizontal axis indicates the amount of added IgY derived from birds (μg / strip). The left side of each bar graph shows the case where only urine is used as a subject, and the right side shows the case of a urine sample obtained by adding pneumococcal capsular antigen to urine.
(3)評価結果
この結果、鳥由来のIgYを存在させることにより非特異的反応が顕著に抑制されることがわかった。即ち、抗原を含有していない尿のみのサンプル(陰性のサンプル)であっても、鳥由来のIgYが存在していない場合には、250程度の発色強度が観察され、これは目視でも十分に確認できる発色強度(発色強度が10以上)であり、強い非特異反応があることがわかる。しかし、鳥由来のIgYの2μg/ストリップの添加により、発色強度は100以下に顕著に減少し、3μg/ストリップの添加により、10程度に極端な減少を示した。3μg/ストリップの添加では、目視可能ラインのギリギリであったが、7μg/ストリップの添加では、完全に目視できない程度にすることができた。
これらの結果、鳥由来のIgYは本イムノクロマト試薬において1ストリップあたりに3μg、好ましくは7μg以上を抗体抗原反応中に導入することにより非特異反応を目視できない程度に抑制することができることがわかった。
また、尿に肺炎球菌夾膜抗原を添加した尿サンプル(陽性のサンプル)においても同様の傾向が見られるが、鳥由来のIgYが3μg/ストリップ以上添加された場合には、発色強度は殆ど変化せず、安定した発色強度が保たれた。そして、発色強度の絶対値は鳥由来のIgYの添加により減少するが、SN比は大幅に改善され、例えば、鳥由来のIgY無添加の場合には、約1.4(340/250)であったものが、鳥由来のIgYが3μg/ストリップの場合には約10(100/10)と大幅な改善が見られることがわかった。このように、鳥由来のIgYの添加により、被検体としての尿における特異性を高め検出感度を飛躍的に向上させる効果が得られることがわかった。
(3) Evaluation result As a result, it was found that non-specific reaction was remarkably suppressed by the presence of bird-derived IgY. That is, even in the case of a urine-only sample that does not contain an antigen (negative sample), when there is no bird-derived IgY, a color development intensity of about 250 is observed, which is sufficient even visually. The color development intensity can be confirmed (color development intensity is 10 or more), indicating that there is a strong non-specific reaction. However, the addition of 2 μg / strip of IgY derived from a bird markedly reduced the color intensity to 100 or less, and the addition of 3 μg / strip showed an extreme decrease of about 10. With the addition of 3 μg / strip, the line was barely visible, but with the addition of 7 μg / strip, it could be completely invisible.
As a result, it was found that the non-specific reaction can be suppressed to an invisible level by introducing 3 μg, preferably 7 μg or more of the bird-derived IgY into the antibody-antigen reaction in the immunochromatography reagent.
In addition, the same tendency is observed in urine samples (positive samples) in which pneumococcal capsular antigen is added to urine. However, when 3 μg / strip or more of bird-derived IgY is added, the color intensity changes almost. No stable color intensity was maintained. The absolute value of the color intensity decreases with the addition of bird-derived IgY, but the SN ratio is greatly improved. For example, when no bird-derived IgY is added, it is about 1.4 (340/250). However, when the IgY derived from birds was 3 μg / strip, it was found that a significant improvement of about 10 (100/10) was observed. Thus, it has been found that the addition of avian-derived IgY has the effect of increasing the specificity in urine as a subject and dramatically improving detection sensitivity.
各種のタンパク質による尿を被検体とした場合の非特異抑制効果1
尿を被検体として各種のタンパク質を添加した場合の非特異的反応の抑制効果を判定部位とコントロール用ライン領域を有するクロマトグラフ媒体に吸収パッドのみを設置したクロマトグラフ媒体(以下「ハーフストリップ」という)で評価した。
被検体として界面活性剤Brij35を0.5%の濃度で添加した尿を用いた。
被検体40μLに対して、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体(Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody)を感作させた金コロイド(標識試薬)を5μL導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるIgY(これをIgY1という)、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるIgG、兎由来のタンパク質であるIgG、牛血清アルブミン(BSA)、及び抗原認識部位の違う鳥由来のIgY(これをIgY2という)を、それぞれ2μg添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、15分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社)で測定した。
Non-specific inhibitory effect when urine from various proteins is used as the subject 1
A chromatographic medium (hereinafter referred to as “half-strip”) in which only an absorption pad is installed on a chromatographic medium having a determination site and a control line area for suppressing the nonspecific reaction when various proteins are added using urine as a specimen. ).
Urine to which a surfactant Brij35 was added at a concentration of 0.5% was used as a subject.
5 μL of gold colloid (labeling reagent) sensitized with anti-pneumococcal rabbit polyclonal antibody (Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody) was introduced into 40 μL of the subject, and IgY, which is a bird-derived protein (this) Is referred to as IgY1, IgG as a protein derived from mouse, IgG as a protein derived from rabbit, bovine serum albumin (BSA), and IgY derived from a bird with a different antigen recognition site (referred to as IgY2), respectively. A sample was prepared by adding 2 μg. As a control, urine alone without these proteins was used.
In these samples, the tip of a half strip coated with the same antibody as the sensitizing antibody was immersed in the judgment line, and after 15 minutes, the color intensity of the judgment line was measured with an immunochromato reader (Hamamatsu Photonics).
この結果を図2に示す。図2の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、IgY以外のマウスIgG、ウサギIgG、及びBSAなどのタンパク質では、尿における非特異的反応を抑制することができないことがわかった。さらに、驚くべきことに、鳥由来のIgYはその他のタンパク質と比較して特異的に非特異的反応を抑制できるだけでなく、その抗原認識部位が異なっていてもIgYであれば、同様な非特異的反応の抑制効果が有ることがわかった。
The result is shown in FIG. The vertical axis in FIG. 2 indicates the color intensity at the determination site, and the horizontal axis indicates the case of various proteins. The leftmost bar graph shows the case without the control.
As a result, it was found that proteins other than IgY such as mouse IgG, rabbit IgG, and BSA cannot suppress non-specific reactions in urine. Furthermore, surprisingly, IgY derived from birds can not only specifically suppress non-specific reactions compared to other proteins, but can also be similar non-specific if IgY is different even if its antigen recognition site is different. It was found that there is an inhibitory effect on the physical reaction.
各種のタンパク質による尿を被検体とした場合の非特異抑制効果2
尿を被検体として各種のタンパク質を添加した場合の非特異的反応の抑制効果をハーフストリップで評価した。
被検体として界面活性剤Brij35を0.5%の濃度で添加した尿を用いた。
被検体40μLに対して、抗ブタTタンパクウサギモノクローナル抗体(Polyclonal Rabit anti Pig Troponin antibody)を感作させた金コロイド(標識試薬)を5μL導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるIgY(これをIgY1という)、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるIgG、兎由来のタンパク質であるIgG、牛血清アルブミン(BSA)、及び抗原認識部位の違う鳥由来のIgY(これをIgY2という)を、それぞれ2μg添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、15分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社)で測定した。
Non-specific inhibitory effect when urine from various proteins is used as the subject 2
The half-strip was used to evaluate the inhibitory effect of non-specific reactions when various proteins were added using urine as a specimen.
Urine to which a surfactant Brij35 was added at a concentration of 0.5% was used as a subject.
5 μL of gold colloid (labeling reagent) sensitized with anti-porcine T protein rabbit monoclonal antibody (Polyclonal Rabit anti Pig Troponin antibody) was introduced into 40 μL of a subject, and further, IgY (avian-derived protein IgY ( This is referred to as IgY1), IgG as a protein for comparison, IgG as a spider-derived protein, bovine serum albumin (BSA), and IgY derived from a bird with a different antigen recognition site (this is referred to as IgY2), Samples were prepared by adding 2 μg of each. As a control, urine alone without these proteins was used.
In these samples, the tip of a half strip coated with the same antibody as the sensitizing antibody was immersed in the judgment line, and after 15 minutes, the color intensity of the judgment line was measured with an immunochromato reader (Hamamatsu Photonics).
この結果を図3に示す。図3の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、検出用の抗体が異なっても、前記の実施例3と同様な結果が得られることがわかった。即ち、本発明の鳥由来のIgYの添加により、被検体が尿であれば、非特異的反応を特異的に抑制できる効果が得られることがわかった。
The result is shown in FIG. The vertical axis in FIG. 3 shows the color intensity at the determination site, and the horizontal axis shows the case of various proteins. The leftmost bar graph shows the case without the control.
As a result, it was found that the same results as in Example 3 were obtained even if the detection antibodies were different. That is, it has been found that the addition of the bird-derived IgY of the present invention has the effect of specifically suppressing non-specific reactions if the subject is urine.
尿を被検体とした夾膜抗原検出系でのSN比評価
尿を被検体として各種タンパク質を導入し、非特異的反応の抑制効果をハーフストリップにおけるSN比で評価した。
被検体として、界面活性剤Brij35を0.5%の濃度で、かつ肺炎球菌(Streptcoccus pneumoniae)の夾膜抗原を精製したものを115ng/mLの濃度となるように添加した尿を用いた。
被検体40μLに対して、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体(Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody)を感作させた金コロイド(標識試薬)を5μL導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるIgY(これをIgY1という)、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるIgG、兎由来のタンパク質であるIgG、牛血清アルブミン(BSA)、及び抗原認識部位の違う鳥由来のIgY(これをIgY2という)を、それぞれ2μg添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、15分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社)で測定し、測定値から以下の計算式でS/N(SN比)を算出した。
S/N=抗原入り被検体での測定値/抗原無し被検体での測定値
SN ratio evaluation in the capsular antigen detection system using urine as a subject Various proteins were introduced using urine as a subject, and the inhibitory effect of non-specific reaction was evaluated by the SN ratio in the half strip.
As a subject, urine was used in which a surfactant Brij35 was added at a concentration of 0.5% and purified from a capsular antigen of Streptococcus pneumoniae to a concentration of 115 ng / mL.
5 μL of gold colloid (labeling reagent) sensitized with anti-pneumococcal rabbit polyclonal antibody (Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody) was introduced into 40 μL of the subject, and IgY, which is a bird-derived protein (this) Is referred to as IgY1, IgG as a protein derived from mouse, IgG as a protein derived from rabbit, bovine serum albumin (BSA), and IgY derived from a bird with a different antigen recognition site (referred to as IgY2), respectively. A sample was prepared by adding 2 μg. As a control, urine alone without these proteins was used.
In these samples, the tip of a half strip coated with the same antibody as the sensitizing antibody was immersed in the determination line, and after 15 minutes, the color intensity of the determination line was measured with an immunochromatographic reader (Hamamatsu Photonics). S / N (S / N ratio) was calculated by the following formula.
S / N = measured value in a specimen with an antigen / measured value in a specimen without an antigen
この結果を図4に示す。図4の縦軸は判定部位における発色強度に基づいたSN比の値を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、IgY以外のマウスIgG、ウサギIgG、及びBSAなどのタンパク質では、尿における非特異的反応を抑制することができず、SN比は極めて低いことがわかった。さらに、驚くべきことに、鳥由来のIgYはその他のタンパク質と比較して特異的に非特異的反応を抑制でき、SN比を20倍〜50倍まで増加させることができるという顕著な効果があることが示されただけでなく、その抗原認識部位が異なっていてもIgYであれば、同様な非特異的反応の抑制効果が有り、SN比が大幅に改善できることがわかった。
The result is shown in FIG. The vertical axis of FIG. 4 shows the value of the SN ratio based on the color intensity at the determination site, and the horizontal axis shows the case of various proteins. The leftmost bar graph shows the case without the control.
As a result, it was found that proteins other than IgY such as mouse IgG, rabbit IgG, and BSA could not suppress non-specific reactions in urine, and the SN ratio was extremely low. Furthermore, surprisingly, bird-derived IgY has a remarkable effect that it can specifically suppress non-specific reactions as compared with other proteins and can increase the SN ratio by 20 to 50 times. In addition, it was found that even if the antigen recognition site is different, IgY has the same effect of suppressing non-specific reaction and can greatly improve the SN ratio.
本発明は、尿を被検体とする免疫測定法、特にイムノクロマトグラフ法における非特異的反応を顕著に抑制させるものであり、採取が容易で、常在菌の少ない尿による簡便で高感度、高信頼性の測定手段を提供するものであり、産業上有用であり、産業上の利用可能性を有している。 The present invention remarkably suppresses nonspecific reactions in immunoassays using urine as a specimen, particularly immunochromatography, and is easy to collect and simple, highly sensitive, and highly sensitive to urine with few resident bacteria. It provides a means for measuring reliability, is industrially useful, and has industrial applicability.
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015222197A (en) * | 2014-05-22 | 2015-12-10 | 日本ハム株式会社 | Nonspecific reaction inhibitor and immunological test method |
JP2016075645A (en) * | 2014-10-09 | 2016-05-12 | デンカ生研株式会社 | Method for analyzing immunity and reagent |
WO2017170824A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 積水メディカル株式会社 | Oncofetal fibronectin detection method using simple immunoassay |
CN109900887A (en) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | A kind of pretreatment liquid of urine specimen |
CN112730839A (en) * | 2021-01-20 | 2021-04-30 | 宁波海壹生物科技有限公司 | Kit for measuring content of cytokeratin 19 fragments by magnetic particle chemiluminescence method |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61942B2 (en) * | 1978-07-13 | 1986-01-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | |
WO2007103538A2 (en) * | 2006-03-08 | 2007-09-13 | University Of Vermont And State Agricultural College | Methods of multiple antibody labeling and uses thereof |
JP2010025866A (en) * | 2008-07-23 | 2010-02-04 | Tanaka Holdings Kk | Nonspecific reaction inhibitor |
JP2010060297A (en) * | 2008-09-01 | 2010-03-18 | Arkray Inc | Immunological analysis method and specimen analysis tool used for the same |
-
2010
- 2010-08-24 JP JP2010187317A patent/JP5580142B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61942B2 (en) * | 1978-07-13 | 1986-01-13 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | |
WO2007103538A2 (en) * | 2006-03-08 | 2007-09-13 | University Of Vermont And State Agricultural College | Methods of multiple antibody labeling and uses thereof |
JP2010025866A (en) * | 2008-07-23 | 2010-02-04 | Tanaka Holdings Kk | Nonspecific reaction inhibitor |
JP2010060297A (en) * | 2008-09-01 | 2010-03-18 | Arkray Inc | Immunological analysis method and specimen analysis tool used for the same |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015222197A (en) * | 2014-05-22 | 2015-12-10 | 日本ハム株式会社 | Nonspecific reaction inhibitor and immunological test method |
JP2016075645A (en) * | 2014-10-09 | 2016-05-12 | デンカ生研株式会社 | Method for analyzing immunity and reagent |
WO2017170824A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 積水メディカル株式会社 | Oncofetal fibronectin detection method using simple immunoassay |
JP6254333B1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-12-27 | 積水メディカル株式会社 | Detection method of oncofetal fibronectin using simple immunoassay |
CN109900887A (en) * | 2019-04-03 | 2019-06-18 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | A kind of pretreatment liquid of urine specimen |
CN112730839A (en) * | 2021-01-20 | 2021-04-30 | 宁波海壹生物科技有限公司 | Kit for measuring content of cytokeratin 19 fragments by magnetic particle chemiluminescence method |
CN112730839B (en) * | 2021-01-20 | 2024-01-30 | 宁波海尔施智造有限公司 | Kit for measuring content of cytokeratin 19 fragments by magnetic particle chemiluminescence method |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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