JP7153545B2 - Immunochromatographic test strip, test substance measurement method and immunochromatographic test kit using the same - Google Patents
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Description
本発明は、イムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キットに関し、より詳しくは、テストライン及びコントロールラインを備えるイムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キットに関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunochromatographic test strip, a test substance measuring method using the same, and an immunochromatographic test kit, and more specifically, an immunochromatographic test strip comprising a test line and a control line, and a test substance measuring method using the same. and immunochromatographic test kits.
感染症の陽性・陰性判定やその原因を特定するためには、対象より採取した試料中から細菌やウイルス等の病原体を検出することが必要である。また、特定の疾患の陽性・陰性判定のために、当該疾患のマーカーとなる物質を血液等の試料中から検出・定量することも知られている。前記病原体の検出方法としては、試料から該病原体に特徴的な遺伝子を検出する遺伝子検査法、電子顕微鏡観察によって特定する方法、前記病原体が細菌の場合にはこれを分離培養して同定を行う培養法などが知られている。また、前記病原体やマーカーの検出・定量方法としては、抗原抗体反応を利用したＥＬＩＳＡやＩＦＡ等の免疫学的検査法などが知られている。しかしながら、これらの測定方法には、試料の処理が煩雑である、測定のために熟練した技術が必要である、特別な装置が必要である、結果を得るまでに時間がかかる、短時間で多数の検体を検査できないといった問題がある。 In order to make a positive/negative determination of an infectious disease and to identify its cause, it is necessary to detect pathogens such as bacteria and viruses in samples collected from subjects. It is also known to detect and quantify a substance that serves as a marker for a specific disease from a sample such as blood for positive/negative determination of the disease. Examples of the method for detecting the pathogen include a genetic testing method for detecting genes characteristic of the pathogen from a sample, a method for identifying the pathogen by electron microscopic observation, and when the pathogen is a bacterium, culture for identification by isolating and culturing it. laws are known. Immunological test methods such as ELISA and IFA using antigen-antibody reaction are known as methods for detecting and quantifying the above pathogens and markers. However, these measurement methods require cumbersome sample processing, require skilled techniques for measurement, require special equipment, take a long time to obtain results, and require a large number of samples in a short period of time. There is a problem that it is not possible to test the specimen of
他方、簡易かつ迅速な測定方法として、他の免疫学的検査法であるイムノクロマトグラフィー法が知られている。前記イムノクロマトグラフィー法としては、例えば、試料中の被験物質に対して特異的に結合可能な物質（抗原又は抗体等）を固定化した多孔性メンブレンからなるイムノクロマトグラフィー試験片の一端から試料を展開させ、その展開の過程で、前記被験物質に対して特異的に結合可能な標識試薬（被験物質に対して特異的に結合可能、かつ、標識された物質（抗原又は抗体等））と該被験物質との複合体を形成させ、上記の多孔性メンブレンに固定化した抗原や抗体等によって間接的又は直接的に前記複合体を捕捉し、当該被験物質を測定する方法が挙げられる。かかる方法では、血液や尿、糞便等の検体を試料として前記イムノクロマトグラフィー試験片に塗布又は滴下し（必要に応じて前記検体は前処理液で懸濁したり、ろ過フィルターでろ過する）、前記多孔性メンブレン上で該試料や前記複合体等を毛細管現象によって展開させるだけで前記試料中の被験物質を測定することができるため、操作が簡単で、また、目視判定も可能であるといった利点から、広く利用されている。 On the other hand, immunochromatography, which is another immunological testing method, is known as a simple and rapid measurement method. As the immunochromatographic method, for example, a sample is developed from one end of an immunochromatographic test strip consisting of a porous membrane on which a substance (such as an antigen or antibody) that can specifically bind to the test substance in the sample is immobilized. , in the course of its development, a labeling reagent capable of specifically binding to the test substance (a substance that is specifically capable of binding to the test substance and is labeled (such as an antigen or antibody)) and the test substance form a complex with, indirectly or directly capture the complex with the antigen or antibody immobilized on the porous membrane, and measure the test substance. In such a method, a sample such as blood, urine, or feces is applied or dropped onto the immunochromatographic test piece (if necessary, the sample is suspended in a pretreatment liquid or filtered with a filtration filter), and the porous Since the test substance in the sample can be measured simply by spreading the sample, the complex, etc. on the membrane by capillary action, the operation is simple, and visual judgment is also possible. Widely used.
一般的なイムノクロマトグラフィー試験片においては、上記の多孔性メンブレンに固定化した抗原や抗体等によって間接的又は直接的に前記複合体を捕捉してシグナルとして検出するテストラインと、試験成立の可否を判定する指標として、前記標識試薬には特異的に結合するが前記被験物質には結合しない物質（対照試薬）を固定化したコントロールラインとが設けられている。イムノクロマトグラフィー試験片の一端又は一点から試料を展開させた際に前記コントロールラインでシグナルが検出された場合には、測定に必要な量の試料及び標識試薬がテストライン及びコントロールライン上を問題なく展開したこと、ひいてはイムノクロマトグラフィー試験片上において各抗原抗体反応等が正常に実施されたことを意味するが、前記コントロールラインでシグナルが検出されない場合には、測定に必要な量の試料及び／又は標識試薬が展開しておらず、各抗原抗体反応等が正常に実施されていない可能性があるため、その試験は不成立とみなされる。このように、コントロールラインは、その試験の成否に大きく関わるため、常に安定的なシグナル強度を示すことが望まれている。 In general immunochromatographic test strips, a test line in which the complex is indirectly or directly captured by the antigen or antibody immobilized on the porous membrane and detected as a signal, and whether or not the test is established As an indicator for determination, a control line on which a substance (control reagent) that specifically binds to the labeling reagent but does not bind to the test substance is immobilized is provided. When a signal is detected in the control line when the sample is developed from one end or one point of the immunochromatographic test strip, the amount of sample and labeling reagent required for measurement is developed without problems on the test line and control line. It means that each antigen-antibody reaction etc. was performed normally on the immunochromatographic test piece, but if no signal is detected in the control line, the amount of sample and / or labeling reagent required for measurement is not developed, and each antigen-antibody reaction may not be performed normally, so the test is considered unsuccessful. As described above, the control line has a great influence on the success or failure of the test, so it is desired that the control line always shows stable signal intensity.
前記コントロールラインに固定化される対照試薬としては、従来、標識試薬に対する抗体が一般的に用いられている。例えば、前記標識試薬として被験物質に特異的なウサギモノクローナル抗体が用いられる場合、前記対照試薬としては、抗ウサギ抗体が用いられている。 Antibodies against labeling reagents are generally used as control reagents immobilized on the control line. For example, when a rabbit monoclonal antibody specific to a test substance is used as the labeling reagent, an anti-rabbit antibody is used as the control reagent.
ところで、血液等の生体試料には、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗ウサギ抗体（ＨＡＲＡ）等、様々な動物の抗体に対する異好性抗体を含有する検体が存在することがある。そのため、例えば、標識試薬を構成する抗体の作製に用いた動物と同種の動物に対する異好性抗体を含有する検体を試験に供すると、非特異反応が起きてしまう。例えば、上記の標識試薬及び多孔性メンブレンに固定化する抗体として被験物質に特異的なウサギモノクローナル抗体を用い、ＨＡＲＡを含有する検体を試料とした場合には、ＨＡＲＡがこれらのウサギモノクローナル抗体と反応してしまい、被験物質を含まない試料であっても被験物質が存在するかのような偽陽性の結果を与えてしまう場合がある。このような非特異反応は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できるというイムノクロマトグラフィー法の利点を損なうことになる。 Biological samples such as blood sometimes contain specimens containing heterophile antibodies against various animal antibodies, such as human anti-mouse antibody (HAMA) and human anti-rabbit antibody (HARA). Therefore, for example, if a specimen containing a heterophilic antibody against an animal of the same species as the animal used to prepare the antibody constituting the labeling reagent is tested, a non-specific reaction will occur. For example, when a rabbit monoclonal antibody specific to the test substance is used as the labeling reagent and the antibody immobilized on the porous membrane, and a specimen containing HARA is used as a sample, HARA reacts with these rabbit monoclonal antibodies. This can lead to false-positive results as if the test substance was present even in samples that did not contain the test substance. Such non-specific reactions impair the advantage of the immunochromatographic method, which is the ability to measure trace components specifically and with high sensitivity.
前記異好性抗体による非特異反応を抑制し、正しい測定値を得ることを目的として、従来より様々な試みが行われている。例えば、特開昭６１－０６５１６２号公報（特許文献１）には、マウス由来モノクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法において、マウス血清等のマウス由来の物質を非特異反応抑制剤として存在させることが記載されている。しかしながら、イムノクロマトグラフィー法において、例えば、前記標識試薬として被験物質に特異的なマウスモノクローナル抗体を用い、これに対する抗マウス抗体を前記対照試薬として用いた場合に、前記非特異反応抑制剤としてマウス由来の物質を用いると、前記対照試薬に前記非特異反応抑制剤が捕捉されて、前記対照試薬（コントロールライン）への前記標識試薬の捕捉が阻害されるため、コントロールラインのシグナル強度が著しく減弱するという問題があった。 Various attempts have been made to suppress the non-specific reaction caused by the heterophilic antibody and to obtain correct measurement values. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-065162 (Patent Document 1) discloses that a mouse-derived substance such as mouse serum is present as a non-specific reaction inhibitor in an immunoassay method using a mouse-derived monoclonal antibody. is described. However, in the immunochromatographic method, for example, when a mouse monoclonal antibody specific to the test substance is used as the labeling reagent and an anti-mouse antibody against it is used as the control reagent, the nonspecific reaction inhibitor is mouse-derived When the substance is used, the control reagent captures the non-specific reaction inhibitor, inhibiting the capture of the labeling reagent to the control reagent (control line), thereby significantly reducing the signal intensity of the control line. I had a problem.
また、このようなＨＡＭＡやＨＡＲＡ等の異好性抗体を含む干渉物質の影響を低減させることを目的とした試みも行われており、例えば、特開２００１－０３３４５４号公報（特許文献２）には、流体試料中の被検物質（被験物質）の濃度を定量する方法として、被検物質の濃度に対応した検出可能な標識物質からの信号を検出する工程と、これとは別に、被検物質の濃度に依存することなしに検出可能な標識物質からの信号（内部コントロール信号）を検出する工程とを含み、内部コントロール信号を生じさせ検出する工程に被検試料中に共存する物質の影響を実質的に受けないリガンド対の組み合わせを用いる方法が記載されており、前記組み合わせとして、ビオチン若しくはビオチン類縁体とアビジン若しくはストレプトアビジンとの組み合わせ、又はハプテンと抗体との組み合わせが記載されている。また、特開２００９－０８５７５１号公報（特許文献３）には、イムノクロマトグラフィー用試験具として、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と反応可能な物質が、被検出成分に結合可能な結合物質を固定化した判定部よりも試料展開方向上流側に配置された試験片が記載されており、同文献の実施例には、対照用標識物質とこれに結合可能な物質としてストレプトアビジンを感作したラテックス粒子とビオチン化ＢＳＡとの組み合わせが記載されている。しかしながら、これらの方法や試験片においては、コントロールラインでシグナルを検出するために、上記の被検試料中に共存する物質の影響を実質的に受けないリガンド対の組み合わせ（特許文献２）や対照用標識物質（特許文献３）を別途準備する必要があり、試薬や試験片の調製の複雑化やコストアップが問題であった。 Attempts have also been made to reduce the effects of interfering substances including heterophilic antibodies such as HAMA and HARA. is a method for quantifying the concentration of a test substance (test substance) in a fluid sample, comprising a step of detecting a signal from a detectable labeled substance corresponding to the concentration of the test substance; detecting a signal (internal control signal) from a labeled substance that is detectable without dependence on the concentration of the substance; Methods are described that use combinations of ligand pairs that do not substantially undergo , such as biotin or biotin analogues and avidin or streptavidin, or haptens and antibodies. In addition, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-085751 (Patent Document 3) discloses that, as an immunochromatographic test device, a substance capable of reacting with a human anti-mouse antibody (HAMA) is immobilized with a binding substance capable of binding to a component to be detected. The document describes a test piece arranged upstream in the direction of sample development from the judgment part, and in the examples of the document, latex particles sensitized with a labeling substance for control and streptavidin as a substance capable of binding thereto. and biotinylated BSA have been described. However, in these methods and test strips, in order to detect a signal in the control line, a combination of ligand pairs (Patent Document 2) or a control that is substantially unaffected by substances coexisting in the test sample is used. Therefore, it is necessary to separately prepare a labeling substance (Patent Document 3), which complicates the preparation of reagents and test strips and increases the cost.
また、例えば、特開２０１３－２０５３３５号公報（特許文献４）には、イムノクロマトグラフ用試験具として、標識試薬が、アビジン及びビオチンを介して、被検物質に特異的に結合する第一親和性物質と標識物質とが連結されたものであり、対照試薬がビオチンを含むものである試験片が記載されている。しかしながら、かかる試験片も、標識試薬の調製が複雑であるといった問題を有していた。 Further, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-205335 (Patent Document 4) describes, as an immunochromatographic test device, a first affinity labeling reagent that specifically binds to a test substance via avidin and biotin. A test strip is described in which a substance and a labeling substance are linked and the control reagent contains biotin. However, such a test strip also has the problem that the preparation of the labeling reagent is complicated.
さらに、例えば、国際公開第２０１７／０６５２１３号（特許文献５）には、イムノクロマト試験片として、検出対象物質（被験物質）と特異的に結合する検出試薬及びコントロールライン検出試薬が含浸されたコンジュゲーションパット（コンジュゲートパット）、及び前記コントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体が固定化されている多孔性メンブレンパッドを有する試験片が記載されており、前記コントロールライン検出試薬としてビオチン標識タンパク質が結合した検出粒子を用い、前記コントロールライン検出試薬を特異的に捕捉するための抗体として抗ビオチン抗体を用いることが記載されている。しかしながら、かかる試験片でも、特許文献２や特許文献３に記載の方法や試験片と同様に、別途の検出試薬（コントロールライン検出試薬）を準備する必要があり、試薬や試験片の調製の複雑化やコストアップが問題であった。 Furthermore, for example, International Publication No. WO 2017/065213 (Patent Document 5) discloses, as an immunochromatographic test strip, a detection reagent that specifically binds to a substance to be detected (test substance) and a conjugation impregnated with a control line detection reagent. A test strip having a pad (conjugate pad) and a porous membrane pad on which an antibody for specifically capturing the control line detection reagent is immobilized is described, and the control line detection reagent is biotin-labeled. The use of protein-bound detection particles and the use of an anti-biotin antibody as an antibody to specifically capture the control line detection reagent is described. However, even with such a test strip, it is necessary to prepare a separate detection reagent (control line detection reagent) in the same manner as the methods and test strips described in Patent Document 2 and Patent Document 3, and the preparation of reagents and test strips is complicated. However, the problem was the increase in cost.
本発明者らがイムノクロマトグラフィー試験片についてさらなる検討を行ったところ、従来のイムノクロマトグラフィー試験片では、上記問題に加えて、例えば、特許文献２、３、５に記載されているような別途の検出試薬を用いる場合、これらは粒子であるため、このような別粒子の存在によって多孔性メンブレンが目詰まりを起こしたり、バックグラウンドが上昇したり、被験物質の検出精度が低下したりする問題や、コントロールラインにおけるシグナルが該別粒子による間接評価となるために試験成立の可否の判定精度が低下する可能性があるといった問題を有することを見い出した。 When the present inventors conducted further studies on immunochromatographic test strips, in addition to the above problems, in conventional immunochromatographic test strips, for example, separate detection as described in Patent Documents 2, 3, and 5 When using reagents, since these are particles, the presence of such separate particles may cause clogging of the porous membrane, increase the background, reduce the detection accuracy of the test substance, and It has been found that the signal in the control line is an indirect evaluation by the other particles, so there is a problem that the accuracy of determining whether the test is successful or not may be lowered.
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、イムノクロマトグラフィー法において、コントロールラインでシグナルを検出するために標識試薬及び対照試薬以外の試薬を別途準備する必要がなく、かつ、試料中に異好性抗体に対する非特異反応抑制剤が存在していてもコントロールラインにおけるシグナル強度が影響を受けないコントロールラインシグナル形成機構を備える、イムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キットを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above problems of the prior art, and in the immunochromatographic method, there is no need to separately prepare reagents other than labeling reagents and control reagents in order to detect signals in the control line, and , an immunochromatographic test strip with a control line signal formation mechanism that does not affect the signal intensity in the control line even if a non-specific reaction inhibitor against heterophilic antibodies is present in the sample, and a test substance using the same An object of the present invention is to provide a measurement method and an immunochromatography test kit.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、前記標識試薬として、標識体と、前記標識体に結合している、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質とを備え、かつ、ブロッキング剤でブロッキングされている標識試薬を用い、さらに、従来から前記標識体が前記第一の物質以外の物質に非特異的に結合することを抑制するために用いられていたに過ぎない前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質を、前記対照試薬として新たに採用してコントロールラインに固定することにより、前記標識試薬及び対照試薬以外の試薬を別途準備しなくとも、コントロールラインにおいて十分な強度のシグナルを検出できることを見い出した。さらに、各生物種由来の非特異反応抑制剤を用いた場合にも、前記第三の物質がこれを捕捉することはなく、コントロールラインにおけるシグナル強度が影響を受けることもないため、前記非特異反応抑制剤を適切量用いて異好性抗体による偽陽性判定を防ぐことができることを見い出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have made intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that, as the labeling reagent, a labeled substance and a first compound that is bound to the labeled substance and is capable of specifically binding to the test substance In order to suppress non-specific binding of the label to substances other than the first substance, using a labeling reagent that is provided with one substance and blocked with a blocking agent, and conventionally By newly adopting a third substance that can specifically bind to the blocking agent that has been used as the control reagent and immobilizing it on the control line, It was found that a sufficiently strong signal could be detected in the control line without separately preparing a reagent. Furthermore, even when a non-specific reaction inhibitor derived from each species is used, the third substance does not capture it, and the signal intensity in the control line is not affected. The inventors have found that the use of an appropriate amount of a reaction inhibitor can prevent false positive determination by heterophilic antibodies, and have completed the present invention.
かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］試料中の被験物質を測定するためのイムノクロマトグラフィー試験片であって、
コンジュゲートパッド、テストライン、及びコントロールラインを備えており、
前記コンジュゲートパッドには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質、ブロッキング剤、及び標識体を含む標識試薬が溶出可能に保持されており、
前記標識体は、前記第一の物質と結合しており、かつ、前記ブロッキング剤でブロッキングされており、
前記テストラインには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第二の物質が固定化されており、
前記コントロールラインには、前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質が固定化されている、
ことを特徴とする、イムノクロマトグラフィー試験片。
［２］前記ブロッキング剤が、カゼイン、大腸菌由来熱ショックタンパク質、牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、及びスキムミルクからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であることを特徴とする、［１］に記載のイムノクロマトグラフィー試験片。
［３］前記試料が非特異反応抑制剤を含有するか、又は、前記コンジュゲートパッドに前記非特異反応抑制剤がさらに溶出可能に保持されていることを特徴とする、［１］又は［２］に記載のイムノクロマトグラフィー試験片。
［４］前記非特異反応抑制剤が、ノーマルマウスグロブリン、ノーマルウサギグロブリン、ノーマルウシグロブリン、ノーマルヤギグロブリン、ノーマルヒツジグロブリン、ノーマルラットグロブリン、ノーマルアルパカグロブリン、及びノーマルニワトリグロブリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、［３］に記載のイムノクロマトグラフィー試験片。
［５］前記第三の物質が、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラット、アルパカ、及びニワトリからなる群から選択される少なくとも１種の生物由来の抗ブロッキング剤抗体であることを特徴とする、［１］～［４］のうちのいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー試験片。
［６］［１］～［５］のうちのいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー試験片を用いて試料中の被験物質を測定する方法であり、
前記コンジュゲートパッドに前記試料を接触させ、前記試料中の前記被験物質と前記標識試薬との複合体を形成させる工程、
前記テストラインにおいて、前記第二の物質で前記被験物質を介して前記複合体を捕捉して検出する工程、
前記コントロールラインにおいて、前記第三の物質で前記ブロッキング剤を介して前記標識試薬を捕捉する工程、
を含むことを特徴とする、被験物質測定方法。
［７］前記試料若しくは前記コンジュゲートパッドに非特異反応抑制剤を添加する工程をさらに含むか、又は、前記コンジュゲートパッドに前記非特異反応抑制剤がさらに溶出可能に保持されていることを特徴とする、［６］に記載の被験物質測定方法。
［８］［１］～［５］のうちのいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー試験片を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフィー試験キット。
［９］非特異反応抑制剤をさらに含むことを特徴とする、［８］に記載のイムノクロマトグラフィー試験キット。
［１０］前記非特異反応抑制剤が、ノーマルマウスグロブリン、ノーマルウサギグロブリン、ノーマルウシグロブリン、ノーマルヤギグロブリン、ノーマルヒツジグロブリン、ノーマルラットグロブリン、ノーマルアルパカグロブリン、及びノーマルニワトリグロブリンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、［９］に記載のイムノクロマトグラフィー試験キット。
The aspects of the present invention obtained from such findings are as follows.
[1] An immunochromatographic test strip for measuring a test substance in a sample,
Equipped with conjugate pads, test lines, and control lines,
The conjugate pad retains an elutable labeling reagent containing a first substance capable of specifically binding to the test substance, a blocking agent, and a label,
the label is bound to the first substance and blocked with the blocking agent;
A second substance that can specifically bind to the test substance is immobilized on the test line,
A third substance that can specifically bind to the blocking agent is immobilized on the control line,
An immunochromatographic test strip characterized by:
[2] In [1], wherein the blocking agent is at least one protein selected from the group consisting of casein, E. coli-derived heat shock protein, bovine serum albumin, human serum albumin, and skim milk. Immunochromatographic test strip as described.
[3] The sample contains a non-specific reaction inhibitor, or the conjugate pad holds the non-specific reaction inhibitor in a further elutable manner, [1] or [2] ] The immunochromatographic test strip described in .
[4] The non-specific reaction inhibitor is selected from the group consisting of normal mouse globulin, normal rabbit globulin, normal bovine globulin, normal goat globulin, normal sheep globulin, normal rat globulin, normal alpaca globulin, and normal chicken globulin. The immunochromatographic test strip according to [3], which is at least one.
[5] The third substance is at least one organism-derived anti-blocking agent antibody selected from the group consisting of mouse, rabbit, cow, goat, sheep, rat, alpaca, and chicken. The immunochromatographic test strip according to any one of [1] to [4].
[6] A method for measuring a test substance in a sample using the immunochromatographic test strip according to any one of [1] to [5],
contacting the sample with the conjugate pad to form a complex between the test substance in the sample and the labeling reagent;
Capturing and detecting the complex via the test substance with the second substance in the test line;
Capturing the labeling reagent with the third substance through the blocking agent in the control line;
A method for measuring a test substance, comprising:
[7] Further comprising the step of adding a non-specific reaction inhibitor to the sample or the conjugate pad, or the conjugate pad holds the non-specific reaction inhibitor so that it can be further eluted. The test substance measurement method according to [6].
[8] An immunochromatographic test kit comprising the immunochromatographic test strip according to any one of [1] to [5].
[9] The immunochromatographic test kit of [8], further comprising a non-specific reaction inhibitor.
[10] The non-specific reaction inhibitor is selected from the group consisting of normal mouse globulin, normal rabbit globulin, normal bovine globulin, normal goat globulin, normal sheep globulin, normal rat globulin, normal alpaca globulin, and normal chicken globulin. The immunochromatography test kit according to [9], characterized by comprising at least one.
本発明によれば、イムノクロマトグラフィー法において、コントロールラインでシグナルを検出するために標識試薬及び対照試薬以外の試薬を別途準備する必要がなく、かつ、試料中に異好性抗体に対する非特異反応抑制剤が存在していてもコントロールラインにおけるシグナル強度が影響を受けないコントロールラインシグナル形成機構を備える、イムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キットを提供することが可能となる。 According to the present invention, in the immunochromatographic method, there is no need to separately prepare reagents other than the labeling reagent and the control reagent in order to detect the signal in the control line, and non-specific reaction suppression against heterophile antibodies in the sample It is possible to provide an immunochromatographic test strip with a control line signal formation mechanism that does not affect the signal intensity in the control line even in the presence of an agent, and a method for measuring a test substance and an immunochromatographic test kit using the same. becomes.
本発明によれば、このように標識試薬及び対照試薬以外の試薬を別途準備する必要がないため、簡便かつ低コストで、安定的なシグナル強度を呈するコントロールラインを備えるイムノクロマトグラフィー試験片を製造することが可能となる。また、コントロールラインが非特異反応抑制剤の影響を受けないため、適切量の非特異反応抑制剤を使用することができ、試料中の異好性抗体の影響を回避することが可能となる。そのため、テストライン及びコントロールラインにおける判定の確実性を高めることが可能となる。 According to the present invention, since there is no need to separately prepare reagents other than labeling reagents and control reagents, immunochromatographic test strips equipped with a control line exhibiting stable signal intensity can be produced simply and at low cost. becomes possible. In addition, since the control line is not affected by the non-specific reaction inhibitor, an appropriate amount of the non-specific reaction inhibitor can be used, making it possible to avoid the influence of heterophile antibodies in the sample. Therefore, it is possible to increase the certainty of determination on the test line and the control line.
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will now be described in detail with reference to its preferred embodiments.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片は、試料中の被験物質を測定するためのイムノクロマトグラフィー試験片であって、少なくとも下記のコンジュゲートパッド、テストライン、及びコントロールラインを備える。 The immunochromatographic test strip of the present invention is an immunochromatographic test strip for measuring a test substance in a sample, and comprises at least the following conjugate pad, test line and control line.
また、本発明の被験物質を測定する方法は、前記本発明のイムノクロマトグラフィー試験片を用いて試料中の被験物質を測定する方法であり、本発明のイムノクロマトグラフィー試験キットは、少なくとも前記本発明のイムノクロマトグラフィー試験片を備えるキットである。 Further, the method of measuring a test substance of the present invention is a method of measuring a test substance in a sample using the immunochromatographic test strip of the present invention, and the immunochromatographic test kit of the present invention comprises at least the immunochromatographic test strip of the present invention. A kit comprising an immunochromatographic test strip.
（被験物質）
本発明において、測定される「被験物質」としては、特に制限されず、病原体若しくはこれらに由来する糖鎖等の物質、特定の疾患のマーカーとなる物質が挙げられ、より具体的には、細菌、原生生物や真菌、ウイルス、タンパク質、多糖類、核酸等が挙げられ、例えば、レジオネラ属菌、肺炎球菌、Ａ群β溶血連鎖球菌、ノロウイルス（ＮＶ）、ロタウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(Test substance)
In the present invention, the "test substance" to be measured is not particularly limited, and includes substances such as pathogens or sugar chains derived from them, substances that serve as markers for specific diseases, and more specifically, bacteria , protists and fungi, viruses, proteins, polysaccharides, nucleic acids, etc., such as Legionella, Streptococcus pneumoniae, Group A β-hemolytic streptococcus, Norovirus (NV), Rotavirus, Adenovirus, RS virus (RSV ), influenza virus, etc., but are not limited to these.
（試料）
本発明において、被験物質の測定に用いられる「試料」としては、前記被検物質が存在し得る試料である限り特に制限はない。前記試料としては、対象（好ましくはヒト）から採取された尿、糞便、喀痰、咽頭ぬぐい液、血液、血清、血漿、唾液、耳漏などの検体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書では「検体」も「試料」と同義に使用される。また、例えば、特許文献４～５で用いられているようなビオチンを用いたイムノクロマトグラフィー試験片では、ビオチンを含む血液や尿等の検体を試料として用いるとコントロールラインのシグナル強度が著しく減弱することが推察されるが、本発明においてはビオチンを用いる必要がないため、ビオチンを含む血液や尿等の検体も試料として好適に用いることができる。
(sample)
In the present invention, the "sample" used for measuring the test substance is not particularly limited as long as it is a sample in which the test substance can be present. Examples of the sample include, but are limited to, urine, feces, sputum, throat swab, blood, serum, plasma, saliva, ear discharge, and the like collected from a subject (preferably human). is not. In this specification, "specimen" is also used synonymously with "sample". In addition, for example, in immunochromatographic test strips using biotin as used in Patent Documents 4 and 5, the signal intensity of the control line is significantly attenuated when a biotin-containing specimen such as blood or urine is used as a sample. However, since it is not necessary to use biotin in the present invention, specimens such as blood and urine containing biotin can also be suitably used as samples.
前記試料としては、流体試料であることが好ましく、水溶液又は水分散液であることがより好ましく、必要に応じて、前記検体を前処理液で懸濁したり、ろ過フィルターでろ過したものを用いてもよい。 The sample is preferably a fluid sample, more preferably an aqueous solution or aqueous dispersion. good too.
前記前処理液には、抽出用溶液、希釈用溶液、懸濁用溶液、保存用溶液等、前記試料を前処理又は保存するための溶液を含む。かかる前処理液としては、緩衝剤及び溶媒（好ましくは水）からなる緩衝液を含むことが好ましい。前記緩衝剤としては、目的とする免疫反応に好適なｐＨに調節可能な緩衝剤が用いられる。一般に、緩衝液のｐＨとしては、５～１０が好ましく、この場合には、通常、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が用いられ得る。前記緩衝液のより好適なｐＨとしては、６～８が好ましく、この場合には、例えば、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液が好ましい。 The pretreatment liquid includes a solution for pretreating or preserving the sample, such as an extraction solution, a dilution solution, a suspension solution, a preservation solution, and the like. Such a pretreatment liquid preferably contains a buffer consisting of a buffer and a solvent (preferably water). As the buffering agent, a buffering agent that can be adjusted to a pH suitable for the desired immune reaction is used. In general, the pH of the buffer solution is preferably 5 to 10. In this case, buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer, borate buffer and the like can be used. A more suitable pH of the buffer solution is preferably 6 to 8. In this case, for example, Good's buffer solution such as HEPES or PIPES is preferable.
前記前処理液には、前記緩衝剤以外に塩化ナトリウム等をさらに添加してもよく、また、公知の添加剤をさらに添加してもよい。前記添加剤としては、例えば、抗原－抗体反応の促進又は非特異反応の抑制を主な目的とするタンパク質（例えば、フリー抗体、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン（登録商標）２０、トリトン（登録商標）Ｘ－１００等）、イオン性界面活性剤、ポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）若しくはその塩；抗菌剤としてのアジ化ナトリウム、長鎖アルキル４級アンモニウム塩；検出抗原を抽出するために必要な成分等が挙げられ、これらのうちの１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。 In addition to the buffering agent, sodium chloride or the like may be further added to the pretreatment liquid, or a known additive may be further added. Examples of the additives include proteins whose main purpose is to promote antigen-antibody reactions or suppress non-specific reactions (e.g., free antibodies, bovine serum albumin, casein, gelatin, etc.), polymeric compounds (e.g., polyethylene glycol, dextran, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.), nonionic surfactants (eg, Tween (registered trademark) 20, Triton (registered trademark) X-100, etc.), ionic surfactants, polyanions (eg, dextran sulfate , heparin, polystyrene sulfonic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc.) or salts thereof; sodium azide and long-chain alkyl quaternary ammonium salts as antibacterial agents; One of them may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
また、本発明に係る試料としては、非特異反応抑制剤をさらに添加したものを用いてもよい。本発明によれば、非特異反応抑制剤を反応系に添加しても、その影響を受けることなく、コントロールラインにおけるシグナル強度を十分な強さに維持することができる。本発明において、「非特異反応抑制剤」とは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗ウサギ抗体（ＨＡＲＡ）、ヒト抗ウシ抗体、ヒト抗ヤギ抗体（ＨＡＧＡ）、ヒト抗ヒツジ抗体（ＨＡＳＡ）、ヒト抗ラット抗体、ヒト抗アルパカ抗体、ヒト抗ニワトリ抗体等の、様々な生物由来の抗体を認識するヒト抗体である異好性抗体に対して結合可能な物質を示す。前記異好性抗体に前記非特異反応抑制剤が結合する、すなわち、異好性抗体の反応性を吸収することにより、該異好性抗体が下記の第一の物質及び／又は第二の物質に結合して偽陽性の判定が生ずることを防ぐ。このような非特異反応抑制剤としては、前記異好性抗体が認識して結合可能な生物由来の抗体が挙げられ、これらのうちの１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ＨＡＭＡに対する非特異反応抑制剤としてはマウス抗体（ノーマルマウスグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＭＧ））、ＨＡＭＡ Ｂｌｏｃｋｅｒ等）が、ＨＡＲＡに対する非特異反応抑制剤としてはウサギ抗体（ノーマルウサギグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＲＧ））等）が、ヒト抗ウシ抗体に対する非特異反応抑制剤としてはウシ抗体（ノーマルウシグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＢＧ）等）が、ＨＡＧＡに対する非特異反応抑制剤としてはヤギ抗体（ノーマルヤギグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＧＧ））等）が、ＨＡＳＡに対する非特異反応抑制剤としてはヒツジ抗体（ノーマルヒツジグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｓｈｅｅｐ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＳＧ））等）が、ヒト抗ラット抗体に対する非特異反応抑制剤としてはラット抗体（ノーマルラットグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｒａｔ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＲＧ））等）が、ヒト抗アルパカ抗体に対する非特異反応抑制剤としてはアルパカ抗体（ノーマルアルパカグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ａｌｐａｃａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＡＧ））等）が、ヒト抗ニワトリ抗体に対する非特異反応抑制剤としてはニワトリ抗体（ノーマルニワトリグロブリン（Ｎｏｒｍａｌ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＮＣＧ））等）が、それぞれ挙げられ、これらのうちの少なくとも１種を含有する血清であってもよい。前記非特異反応抑制剤を前記試料に添加する場合、その種類及び量は、測定対象とする試料の種類及び濃度等によって適宜調整することができる。 Moreover, as the sample according to the present invention, a sample to which a non-specific reaction inhibitor is further added may be used. According to the present invention, even if a non-specific reaction inhibitor is added to the reaction system, the signal intensity in the control line can be maintained at a sufficient level without being affected by it. In the present invention, "non-specific reaction inhibitor" means human anti-mouse antibody (HAMA), human anti-rabbit antibody (HARA), human anti-bovine antibody, human anti-goat antibody (HAGA), human anti-sheep antibody (HASA). , human anti-rat antibodies, human anti-alpaca antibodies, human anti-chicken antibodies, etc., which are human antibodies that recognize antibodies derived from various organisms. The non-specific reaction inhibitor binds to the heterophilic antibody, that is, by absorbing the reactivity of the heterophilic antibody, the heterophilic antibody is the following first substance and / or second substance to prevent false positive determinations from occurring. Examples of such a non-specific reaction inhibitor include biological antibodies that can be recognized and bound by the heterophilic antibody. One of these may be used alone or two or more may be used in combination. may For example, non-specific reaction inhibitors against HAMA include mouse antibodies (Normal Mouse Globulin (NMG), HAMA Blocker, etc.), and non-specific reaction inhibitors against HARA include rabbit antibodies (Normal Rabbit Globulin (NMG), HAMA Blocker, etc.). Globulin (NRG)), etc.), bovine antibodies (normal bovine globulin (NBG), etc.) as non-specific reaction inhibitors against human anti-bovine antibodies, goat antibodies (Normal Bovine Globulin (NBG), etc.) as non-specific reaction inhibitors against HAGA Normal goat globulin (NGG), etc.), sheep antibody (Normal Sheep Globulin (NSG), etc.) as a non-specific reaction inhibitor against HASA, non-specific reaction against human anti-rat antibody Rat antibodies (Normal Rat Globulin (NRG), etc.) as inhibitors, and alpaca antibodies (Normal Alpaca Globulin (NAG), etc.) as non-specific reaction inhibitors for human anti-alpaca antibodies. However, non-specific reaction inhibitors against human anti-chicken antibodies include chicken antibodies (Normal Chicken Globulin (NCG)), etc., and serum containing at least one of these When the non-specific reaction inhibitor is added to the sample, the type and amount thereof can be appropriately adjusted depending on the type and concentration of the sample to be measured.
（測定）
本発明において、「被験物質の測定」には、被験物質の存在の有無を確認する検出、及び被験物質の量の定量又は半定量が含まれる。本発明において、被験物質の測定は、テストラインにおけるシグナルを検出し、必要に応じてこれを定量することによって行われ、また、その測定の成否は、コントロールラインのシグナルを検出し、必要に応じてこれを定量することによって判定するが、前記「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた検出方法・装置によって確認できるものも含まれる。
(measurement)
In the present invention, "measurement of the test substance" includes detection to confirm the presence or absence of the test substance, and quantification or semi-quantification of the amount of the test substance. In the present invention, the measurement of the test substance is performed by detecting the signal in the test line and optionally quantifying it, and the success or failure of the measurement is determined by detecting the signal in the control line and optionally The above-mentioned "signal" includes coloration (color development), reflected light, luminescence, fluorescence, radiation from radioactive isotopes, etc., and in addition to those that can be confirmed with the naked eye, signals It also includes those that can be confirmed by detection methods and devices according to the type.
＜イムノクロマトグラフィー試験片＞
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片は、
試料中の被験物質を測定するためのイムノクロマトグラフィー試験片であって、
コンジュゲートパッド、テストライン、及びコントロールラインを備えており、
前記コンジュゲートパッドには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質、ブロッキング剤、及び標識体を含む標識試薬が溶出可能に保持されており、
前記標識体は、前記第一の物質と結合しており、かつ、前記ブロッキング剤でブロッキングされており、
前記テストラインには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第二の物質が固定化されており、
前記コントロールラインには、前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質が固定化されている、
ことを特徴とする。
<Immunochromatographic test piece>
The immunochromatographic test strip of the present invention is
An immunochromatographic test strip for measuring a test substance in a sample,
Equipped with conjugate pads, test lines, and control lines,
The conjugate pad retains an elutable labeling reagent containing a first substance capable of specifically binding to the test substance, a blocking agent, and a label,
the label is bound to the first substance and blocked with the blocking agent;
A second substance that can specifically bind to the test substance is immobilized on the test line,
A third substance that can specifically bind to the blocking agent is immobilized on the control line,
It is characterized by
また、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片としては、
前記コンジュゲートパッドに接しているサンプルパッド、及び
前記コンジュゲートパッドに接しており、かつ、前記テストライン及び前記コントロールラインを有する多孔性メンブレン、
をさらに備えることが好ましい。
In addition, as the immunochromatographic test strip of the present invention,
a sample pad in contact with the conjugate pad; and a porous membrane in contact with the conjugate pad and having the test line and the control line;
is preferably further provided.
以下、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の好ましい形態について、図面を参照しながら本発明の一実施形態を例に挙げて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。 Preferred embodiments of the immunochromatographic test strip of the present invention will be described below in detail by taking one embodiment of the present invention as an example with reference to the drawings, but the present invention is not limited thereto. In the following description and drawings, the same or corresponding elements are denoted by the same reference numerals, and overlapping descriptions are omitted.
図１は、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の一実施形態（試験片１００）の概略模式図を示す斜視図である。試験片１００は、ラテラルフロー式イムノクロマトグラフィー試験片であり、試料を受容するサンプルパッド１４０と、標識試薬が溶出可能に保持されたコンジュゲートパッド１３０と、テストライン１２２及びコントロールライン１２４を有する多孔性メンブレン１２０と、を備える。また、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片は、必要に応じて、図１に示すように、吸収パッド１５０や、これらを支持するシート１１０（例えば、プラスチック製粘着シート）をさらに備えていてもよい。さらに、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片としては、一連のサンプルパッド、コンジュゲートパッド、多孔性メンブレン、吸収パッド、シート等を収納するケーシング（図示せず）を備えていてもよく、前記ケーシングは、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、テストライン、コントロールライン等を認識するための窓を備えていてもよい。これらの部材の大きさや間隔は、被験物質の種類や測定目的等に応じて、適宜調整することができる。なお、以下の図１を参照する説明においては、多孔性メンブレン１２０のサンプルパッド１４０側を上流（試料の展開方向の上流側）、吸収パッド１５０側を下流（試料の展開方向の下流側）とする。
FIG. 1 is a perspective view showing a schematic diagram of one embodiment (test strip 100) of the immunochromatographic test strip of the present invention. The
図１において、コンジュゲートパッド１３０、テストライン１２２、及びコントロールライン１２４は、上流からこの順で配置されているが、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の配置としてはこれに制限されず、本発明に係るテストラインとコントロールラインとは、互いに前記コンジュゲートパッドから同距離に配置されていてもよく、例えば、前記テストラインと前記コントロールラインとが、前記コンジュゲートパッドを中心とする同心円状に配置されていたり、バー状のテストラインとコントロールラインとが、互いに交わってプラス（＋）の記号等を形成するように配置されていてもよい。また、本発明に係るテストラインは、本発明に係るコントロールラインよりも下流に配置されていてもよい。
In FIG. 1, the
（サンプルパッド）
本発明に係るサンプルパッド（図１ではサンプルパッド１４０）は、滴下又は塗布された試料を受容する試料供給部として機能する。さらに、前記サンプルパッドは、試料中の不溶物粒子などをろ過する機能や試料が溢れることを防ぐ機能をも兼ねることができる。前記サンプルパッドの材料としては、均一な特性を有する材料であることが好ましく、例えば、セルロースろ紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、不織布、及び綿布が挙げられる。前記サンプルパッドの厚さ及び大きさとしては、特に制限されず、適宜調整することができる。
(sample pad)
A sample pad according to the present invention (
（コンジュゲートパッド）
本発明に係るコンジュゲートパッド（図１ではコンジュゲートパッド１３０）は、標識試薬を溶出可能に保持する標識試薬保持部として機能する。前記コンジュゲートパッドの材料としては、多孔性材料であることが好ましく、例えば、セルロースろ紙、ガラス繊維、及び不織布が挙げられ、これらの中でも、ガラス繊維がより好ましい。前記コンジュゲートパッドの厚さとしては、特に制限されず、通常、２６０～９５０μｍとすることができる。前記コンジュゲートパッドの面積としても特に制限されず、通常、１０～１００ｍｍ２とすることができる。
(Conjugate pad)
The conjugate pad according to the present invention (the
〔標識試薬〕
本発明において、前記コンジュゲートパットによって保持される標識試薬は、標識体と、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質と、ブロッキング剤とを含み、前記標識体は前記第一の物質と結合しており、かつ、前記ブロッキング剤でブロッキングされている。
[Labeling reagent]
In the present invention, the labeling reagent held by the conjugate pad includes a label, a first substance capable of specifically binding to the test substance, and a blocking agent, and the label is the first It is bound with one substance and blocked with the blocking agent.
本発明において、「標識体」は、テストライン及びコントロールラインにおいてシグナルとして検出される標識として機能する。本発明に係る標識体としては、粒子であることが好ましく、例えば、金、銀、白金、銅等の金属粒子又は金属コロイド粒子；酸化鉄等の金属酸化物粒子又は金属酸化物コロイド粒子；セレン、テルル、硫黄等の非金属粒子；染料などで着色したものを含む有色ラテックス粒子；蛍光シリカ粒子やユーロピウムなどの蛍光粒子が挙げられ、これらの中でも、前記第一の物質を結合（吸着）させやすい傾向にある観点から、金コロイド粒子が好ましい。また、前記標識体が粒子である場合、その大きさとしては、特に制限されないが、例えば、レーザー回折散乱式粒度分布測定により測定した体積基準の粒度分布における累積体積が５０％となる粒子径Ｄ５０で、通常、１０～１０００ｎｍとすることができる。 In the present invention, the "label" functions as a label detected as a signal in the test line and control line. Labels according to the present invention are preferably particles, for example, metal particles or colloidal particles of gold, silver, platinum, copper, etc.; , tellurium, sulfur and other nonmetallic particles; colored latex particles including those colored with dyes; fluorescent particles such as fluorescent silica particles and europium; Gold colloidal particles are preferred because they tend to be easy to use. When the label is a particle, its size is not particularly limited. and usually 10 to 1000 nm.
本発明において、「被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質（以下、場合により単に「第一の物質」という）」とは、目的とする被験物質を特異的に認識し、結合することができる物質を示す。このような第一の物質としては、典型的には、前記被験物質が抗原の場合は該抗原に特異的に結合可能な抗体；前記被験物質が抗体の場合は該抗体に特異的に結合可能な抗原又は抗体（免疫グロブリン分子に対する抗体）；前記被験物質が核酸の場合は該核酸に特異的に結合可能な核酸、抗体又は結合タンパクである。 In the present invention, the "first substance capable of specifically binding to the test substance (hereinafter, sometimes simply referred to as "first substance")" specifically recognizes the target test substance, Indicates a substance that can bind. As such a first substance, typically, when the test substance is an antigen, an antibody capable of specifically binding to the antigen; when the test substance is an antibody, capable of specifically binding to the antibody antigens or antibodies (antibodies against immunoglobulin molecules); when the test substance is a nucleic acid, it is a nucleic acid, an antibody, or a binding protein capable of specifically binding to the nucleic acid.
なお、本明細書において、「抗体」としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。また、本明細書において、「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体）、及びこれらの抗体断片が含まれ、前記抗体断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、重鎖抗体、ダイアボディーや抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含まれる。 As used herein, the “antibody” may be of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, and IgY. Also, as used herein, the term "antibody" includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (e.g., chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies), and antibody fragments thereof, and the antibody fragments include, for example, Fab , Fab′, F(ab′) 2 , Fv, single-chain antibodies, heavy-chain antibodies, diabodies, and low-molecular-weight antibodies bound to antibody variable regions.
本発明において、前記第一の物質が抗体である場合、かかる抗体（抗被験物質抗体）としては、被験物質への結合能を有する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても前記抗体断片であってもよい。このような抗被験物質抗体としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することによって産生することができ、ポリクローナル抗体である場合には、例えば、前記被験物質を免疫原として免疫化された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等）の血清から調製することができ、モノクローナル抗体である場合には、例えば、抗体産生細胞（前記被験物質を免疫原として免疫化された動物の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等）とミエローマ細胞とを融合した細胞（ハイブリドーマ）による抗体の産生方法（代表的には、ケーラー及びミルスタインによる方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５））によって産生することができる。また、前記抗被験物質抗体としては、当該抗体をコードするＤＮＡが取得できれば、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。さらに、前記抗被験物質抗体としては、一般に流通されているものを適宜用いてもよい。 In the present invention, when the first substance is an antibody, the antibody (anti-test substance antibody) is not particularly limited as long as it has the ability to bind to the test substance, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. or the antibody fragment. Such an anti-test substance antibody can be produced by appropriately adopting a conventionally known method or a method based thereon, and in the case of a polyclonal antibody, for example, immunization with the test substance as an immunogen It can be prepared from the serum of animals (e.g., mice, rats, hamsters, rabbits, etc.) that have been immunized, and in the case of monoclonal antibodies, for example, antibody-producing cells (animals immunized with the test substance as an immunogen spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes, etc.) and myeloma cells fused with cells (hybridoma) to produce antibodies (representatively, methods by Kohler and Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975)). In addition, the anti-test substance antibody can also be produced by a recombinant DNA method if the DNA encoding the antibody can be obtained. Furthermore, as the anti-test substance antibody, those generally distributed may be appropriately used.
本発明において、「ブロッキング剤」は、前記標識体の第一の物質が結合していない表面を被覆し、前記標識体が、前記第一の物質以外の、試料に由来するタンパク質やその他物質等に対して非特異的に結合することを防ぐ機能を有する。例えば、前記標識体として金コロイド粒子を用いた場合、金コロイド粒子の表面は前記第一の物質（抗原、抗体等）にも、前記試料に由来するタンパク質やその多物質にも非特異的に吸着しやすいという性質を有していることから、試料中に被験物質が含まれていない場合であっても、判定結果が陽性となってしまうことがある（偽陽性）。そのため、前記ブロッキング剤によって、第一の物質が結合していない標識体の表面をブロッキングして被覆する。また、本発明において、前記ブロッキング剤は、下記の第三の物質に特異的に認識される。 In the present invention, the "blocking agent" covers the surface of the label to which the first substance is not bound, and the label is a sample-derived protein or other substance other than the first substance. It has a function to prevent non-specific binding to For example, when colloidal gold particles are used as the label, the surfaces of the colloidal gold particles are non-specific to the first substance (antigen, antibody, etc.), proteins derived from the sample, and multiple substances thereof. Since it has the property of being easily adsorbed, even if the test substance is not contained in the sample, the determination result may be positive (false positive). Therefore, the surface of the label to which the first substance is not bound is blocked and covered with the blocking agent. Moreover, in the present invention, the blocking agent is specifically recognized by the following third substance.
前記ブロッキング剤としては、特に制限されず、一般的にブロッキング剤として用いられているものを適宜用いることができ、例えば、カゼイン、大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＢＰＦ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、スキムミルクが挙げられる。また、本発明においては、前記ブロッキング剤として、前記被検物質及び前記第一の物質のいずれにも結合しなければ、抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等を用いることもできる。これらの中でも、本発明に係るブロッキング剤としては、カゼイン及び大腸菌由来熱ショックタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質（ブロッキングタンパク質）であることが好ましく、生物由来のタンパク質であることがより好ましい。 The blocking agent is not particularly limited, and those commonly used as blocking agents can be appropriately used. serum albumin (HSA), skim milk. In the present invention, antibodies, protein G, protein A, etc. can also be used as the blocking agent as long as they do not bind to either the test substance or the first substance. Among these, the blocking agent according to the present invention is preferably at least one protein (blocking protein) selected from the group consisting of casein and Escherichia coli-derived heat shock protein, and is preferably a biological protein. more preferred.
本発明に係る標識試薬において、前記標識体と前記第一の物質とは結合している。前記標識体と前記第一の物質との結合には物理的吸着も含まれる。前記標識体と前記第一の物質とを結合させる方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、物理的吸着法や、前記標識体の表面を修飾基（カルボキシル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシル基等）によって修飾し、同修飾基によって結合させる方法が挙げられる。前記標識体と前記第一の物質との結合において、その配合比（標識体：第一の物質）としては、前記標識体に対する前記第一の物質の結合のし易さや使用する第一の物質の被験物質に対する感度等によって適宜調整することができる。 In the labeling reagent according to the present invention, the label and the first substance are bound. Physical adsorption is also included in the binding between the label and the first substance. As a method for binding the label and the first substance, a conventionally known method or a method based thereon can be appropriately adopted. (a carboxyl group, an epoxy group, a tosyl group, an amino group, a hydroxyl group, etc.) and a method of bonding through the modified group. In the binding of the label and the first substance, the compounding ratio (label: first substance) depends on the ease of binding of the first substance to the label and the first substance to be used. can be adjusted as appropriate depending on the sensitivity to the test substance, etc.
本発明に係る標識試薬において、前記標識体の前記第一の物質が結合していない表面は、前記ブロッキング剤でブロッキングされている。前記標識体の前記第一の物質が結合していない表面を前記ブロッキング剤によりブロッキングする方法としては、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、前記標識体溶液（例えば、コロイド溶液）に前記第一の物質（例えば、抗被験物質抗体）を添加し、標識体表面に抗体を固定化させる。これに前記ブロッキング剤を添加することにより、該標識体の第一の物質が結合していない表面に前記ブロッキング剤を結合させてブロッキングし、本発明に係る標識試薬を得ることができる。本発明に係る標識試薬において、前記第一の物質と前記ブロッキング剤との配合比（第一の物質：ブロッキング剤）としては、特に制限されないが、例えば、液量での質量比で、１：０．１～１：１００とすることが好ましい。 In the labeling reagent according to the present invention, the surface of the label to which the first substance is not bound is blocked with the blocking agent. As a method for blocking the surface of the label to which the first substance is not bound with the blocking agent, a conventionally known method or a method analogous thereto can be employed as appropriate. For example, the first substance (eg, anti-test substance antibody) is added to a colloidal solution) to immobilize the antibody on the surface of the label. By adding the blocking agent to this, the labeling reagent according to the present invention can be obtained by binding the blocking agent to the surface of the label to which the first substance is not bound and blocking it. In the labeling reagent according to the present invention, the compounding ratio of the first substance and the blocking agent (first substance:blocking agent) is not particularly limited. A ratio of 0.1 to 1:100 is preferred.
本発明に係るコンジュゲートパッドに前記標識試薬を保持させる方法としては、試料（好ましくは水溶液若しくは水分散液）又は下記の展開液を展開した際にこれに前記標識試薬が溶出可能となる方法であれば特に制限されず、例えば、前記標識試薬を含有する溶液を上記のコンジュゲートパッドの材料に塗布又は含浸させた後に乾燥させる方法が挙げられる。前記標識試薬を含有させる溶液としては、例えば緩衝液が挙げられ、前記緩衝液としては、上記の前処理液で挙げたものと同様のものが挙げられる。本発明に係るコンジュゲートパッドに保持させる前記標識試薬の量としては、試料の形態、使用する第一の物質の被験物質に対する感度や測定目的等によって適宜調整することができる。 As a method for holding the labeling reagent in the conjugate pad according to the present invention, a sample (preferably an aqueous solution or aqueous dispersion) or a method in which the labeling reagent can be eluted when the following developing solution is developed. There is no particular limitation, and examples thereof include a method of coating or impregnating the material of the conjugate pad with a solution containing the labeling reagent, followed by drying. Examples of the solution containing the labeling reagent include a buffer solution, and examples of the buffer solution include the same buffers as those mentioned above for the pretreatment solution. The amount of the labeling reagent held in the conjugate pad according to the present invention can be appropriately adjusted depending on the form of the sample, the sensitivity of the first substance to be used to the test substance, the purpose of measurement, and the like.
また、本発明に係るコンジュゲートパッドとしては、上記の非特異反応抑制剤をさらに溶出可能に保持していることが好ましい。前記非特異反応抑制剤をさらに保持させる方法としては上記と同様であり、前記非特異反応抑制剤をさらに保持させる場合、その種類及び量は、測定対象とする試料の種類及び濃度等によって適宜調整することができる。 Moreover, it is preferable that the conjugate pad according to the present invention further retains the non-specific reaction inhibitor in an elutable manner. The method for further retaining the non-specific reaction inhibitor is the same as described above, and when the non-specific reaction inhibitor is further retained, the type and amount thereof are appropriately adjusted depending on the type and concentration of the sample to be measured. can do.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片においては、前記試料が前記コンジュゲートパッドに接触すると、前記標識試薬が溶出されると共に、前記試料中に前記被験物質が存在する場合には、該被験物質と前記標識試薬を構成する第一の物質との相互作用（例えば抗原抗体反応）により、複合体（例えば免疫複合体）が形成される。 In the immunochromatographic test strip of the present invention, when the sample contacts the conjugate pad, the labeling reagent is eluted, and when the test substance is present in the sample, the test substance and the label A complex (eg, immune complex) is formed by interaction (eg, antigen-antibody reaction) with the first substance that constitutes the reagent.
（多孔性メンブレン）
本発明に係る多孔性メンブレン（図１では多孔性メンブレン１２０）は、イムノクロマトグラフィーのクロマトグラフィー媒体（固定相）として機能する不溶性担体である。また、本発明に係る多孔性メンブレンは、下記のテストライン及びコントロールラインを有する抗体固定化メンブレンでもある。
(porous membrane)
The porous membrane according to the present invention (
前記多孔性メンブレンとしては、多孔性膜であれば特に制限されず、例えば、ニトロセルロース膜、ニトロセルロース混合エステル膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布が挙げられ、これらの中でも、テストライン及びコントロールラインを作製し易い傾向にある観点から、ニトロセルロース膜又はニトロセルロース混合エステル膜が好ましい。なお、かかる多孔性メンブレンに展開される試料の移動速度は、当該多孔性メンブレンの材質、大きさ、孔径、及び分布などにより変えることができ、被験物質の種類や濃度、測定目的等に応じて、適宜調整することができる。 The porous membrane is not particularly limited as long as it is a porous membrane, and examples thereof include nitrocellulose membranes, nitrocellulose mixed ester membranes, cellulose membranes, acetylcellulose membranes, polysulfone membranes, polyethersulfone membranes, nylon membranes, and glass fibers. , nonwoven fabrics, and cloths, and among these, nitrocellulose membranes or nitrocellulose mixed ester membranes are preferred from the standpoint of ease of fabricating test lines and control lines. The speed of movement of the sample developed on such a porous membrane can be changed depending on the material, size, pore size, distribution, etc. of the porous membrane. , can be adjusted accordingly.
〔テストライン〕
本発明において、前記多孔性メンブレンが有するテストライン（図１ではテストライン１２２）は、前記多孔性メンブレンのテストライン領域に前記被験物質に対して特異的に結合可能な第二の物質が固定化されてなるものであり、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の検出部として機能する。本発明に係るテストラインは、前記コンジュゲートパッドよりも下流側に配置される。
[Test line]
In the present invention, the test line (
本発明において、「被験物質に対して特異的に結合可能な第二の物質（以下、場合により単に「第二の物質」という）」とは、目的とする被験物質を特異的に認識し、結合することができる物質を示す。このような第二の物質としては、前記第一の物質として挙げたものと同様のものが挙げられ、さらに、前記第二の物質としては、前記被験物質と前記標識試薬を構成する第一の物質との相互作用（例えば抗原抗体反応）によって形成された複合体（例えば免疫複合体）に対して特異的に結合可能な物質であってもよい。前記第一の物質と前記第二の物質とは同一であっても異なっていてもよいが、被験物質の被認識部位によっては、該被験物質に対する結合において競合しないことが好ましい。 In the present invention, "a second substance capable of specifically binding to a test substance (hereinafter, sometimes simply referred to as a "second substance")" specifically recognizes the target test substance, Indicates a substance that can bind. Examples of such a second substance include substances similar to those exemplified as the first substance. Further, the second substance includes the first substance constituting the test substance and the labeling reagent. It may be a substance capable of specifically binding to a complex (eg, immune complex) formed by interaction with a substance (eg, antigen-antibody reaction). The first substance and the second substance may be the same or different, but preferably do not compete in binding to the test substance depending on the recognition site of the test substance.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片においては、前記被験物質に結合して複合体を形成した標識試薬がテストラインまで移動すると、テストラインに固定化された第二の物質に前記被験物質を介して前記複合体が補足され、該複合体を構成する標識試薬が該テストラインに集積する。その結果、テストラインは標識試薬の集積に起因して呈色などを示すため、これをシグナルとして検出し、試料中の被験物質を測定することができる。 In the immunochromatographic test strip of the present invention, when the labeled reagent bound to the test substance to form a complex moves to the test line, the second substance immobilized on the test line passes through the test substance. Complexes are captured and the labeled reagents that make up the complexes accumulate in the test line. As a result, the test line shows coloration or the like due to the accumulation of the labeling reagent, which can be detected as a signal and the test substance in the sample can be measured.
なお、図１において、テストライン１２２はライン状に形成されているが、本発明に係るテストラインの形状はこれに限定されず、円形、多角形等の任意の形状にすることができる。これらの形状の中でも、本発明に係るテストラインの形状としては、ライン状であることが好ましく、幅０．５～１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
Although the
〔コントロールライン〕
本発明において、前記多孔性メンブレンが有するコントロールライン（図１ではコントロールライン１２４）は、前記多孔性メンブレンのコントロールライン領域に対照試薬が固定化されてなるものであり、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片において、試験成立の可否を判定するためのコントロール部として機能する。本発明に係るコントロールラインは、前記コンジュゲートパッドよりも下流側に配置されており、同コントロールラインとしては、前記テストラインと前記コンジュゲートパッドから等距離にあるか、前記テストラインよりも下流側に配置されていることが好ましい。
[Control line]
In the present invention, the control line (
〔対照試薬〕
本発明において、前記コントロールラインに固定化される対照試薬は、前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質である。本発明において、「ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質（以下、場合により単に「第三の物質」という）」とは、前記ブロッキング剤を特異的に認識し、結合することができる物質を示す。このような第三の物質としては、典型的には、前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な抗ブロッキング剤抗体である。また、本発明に係る第三の物質は、種々の生物由来物質の非特異反応抑制剤と結合しない又はし難いものであることがより好ましい。
[Control reagent]
In the present invention, the control reagent immobilized on the control line is a third substance capable of specifically binding to the blocking agent. In the present invention, "a third substance that can specifically bind to a blocking agent (hereinafter, sometimes simply referred to as a "third substance")" specifically recognizes and binds to the blocking agent Indicates a substance that can Such a third substance is typically an anti-blocking agent antibody capable of specifically binding to the blocking agent. Further, it is more preferable that the third substance according to the present invention does not or hardly binds to non-specific reaction inhibitors of various biological substances.
このような第三の物質としては、抗ブロッキング剤抗体であることが好ましく、前記抗ブロッキング剤抗体としては、例えば、前記ブロッキング剤が大腸菌由来熱ショックタンパク質である場合には抗大腸菌由来熱ショックタンパク質抗体（抗ＢＰＦ抗体）が、前記ブロッキング剤が牛血清アルブミンである場合には抗牛血清アルブミン抗体（抗ＢＳＡ抗体）が、前記ブロッキング剤がヒト血清アルブミンである場合には抗ヒト血清アルブミン抗体（抗ＨＳＡ抗体）が、前記ブロッキング剤がカゼイン又はスキムミルクである場合には抗カゼイン抗体が、それぞれ挙げられ、これらの中でも、本発明に係る第三の物質としては、前記ブロッキング剤がブロッキングタンパク質（例えば、カゼイン、大腸菌由来熱ショックタンパク質）であって、これらに対する抗ブロッキングタンパク質抗体（例えば、抗カゼイン抗体、抗ＢＰＦ抗体）からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。 Such a third substance is preferably an anti-blocking agent antibody, and the anti-blocking agent antibody is, for example, an anti-E. coli-derived heat shock protein when the blocking agent is an E. coli-derived heat shock protein. An antibody (anti-BPF antibody), an anti-bovine serum albumin antibody (anti-BSA antibody) when the blocking agent is bovine serum albumin, and an anti-human serum albumin antibody (anti-BSA antibody) when the blocking agent is human serum albumin anti-HSA antibody), and anti-casein antibody when the blocking agent is casein or skimmed milk. , casein, Escherichia coli-derived heat shock protein) and at least one selected from the group consisting of anti-blocking protein antibodies against these (eg, anti-casein antibody, anti-BPF antibody).
前記抗ブロッキング剤抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよく、完全な抗体であっても抗体断片であってもよい。また、前記抗ブロッキング剤抗体としては、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラット、アルパカ、ニワトリ等の様々な動物種由来のものを用いることができる。 The anti-blocking agent antibody may be of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, and IgY, and may be a complete antibody or an antibody fragment. As the anti-blocking agent antibody, those derived from various animal species such as mouse, rabbit, bovine, goat, sheep, rat, alpaca, and chicken can be used.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片においては、前記標識試薬（コントロールラインが前記テストラインよりも下流側に配置されている場合には該テストラインで捕捉されなかった標識試薬）がコントロールラインまで移動すると、コントロールラインに固定化された前記対照試薬（第三の物質、好ましくは抗ブロッキング剤抗体）に前記ブロッキング剤を介して捕捉され、該ブロッキング剤を備える標識試薬が該コントロールラインに集積する。その結果、コントロールラインは標識試薬の集積に起因して呈色などを示すため、これをシグナルとして検出し、イムノクロマトグラフィー試験片上で試料が正常に移動したことを確認することができる。本発明によれば、種々の生物由来物質を非特異反応抑制剤として用いた場合にも、シグナル強度を減弱させることなくコントロールラインを呈色等させることが可能となる。 In the immunochromatographic test strip of the present invention, when the labeling reagent (labeling reagent not captured by the test line when the control line is arranged downstream of the test line) moves to the control line, The control reagent (third substance, preferably anti-blocking agent antibody) immobilized on the control line is captured via the blocking agent, and the labeling reagent comprising the blocking agent accumulates in the control line. As a result, the control line shows coloration or the like due to the accumulation of the labeling reagent, and this can be detected as a signal to confirm normal movement of the sample on the immunochromatographic test strip. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, even when various biological substances are used as non-specific reaction inhibitors, it is possible to color control lines without attenuating signal intensity.
また、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片においては、従来のコントロールラインの検出方法とは異なり、前記標識試薬を構成する抗体の由来となる動物種にとらわれないため、より汎用性の高い、ユニバーサル試薬として用いることが可能となる。 In addition, in the immunochromatographic test strip of the present invention, unlike the conventional control line detection method, it is not bound by the animal species from which the antibody constituting the labeling reagent is derived, so it can be used as a universal reagent with high versatility. can be used.
なお、図１において、コントロールライン１２４はライン状に形成されているが、本発明に係るコントロールラインの形状はこれに限定されず、円形、多角形等の任意の形状にすることができる。これらの形状の中でも、本発明に係るコントロールラインの形状としては、ライン状であることが好ましく、幅０．５～１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
Although the
本発明に係る多孔性メンブレンにおいて、前記テストライン及び前記コントロールラインを作製する方法、すなわち、前記第二の物質及び前記対照試薬（第三の物質、好ましくは抗ブロッキング剤抗体）を固定化する方法としては、特に制限されず、適宜従来公知の方法又はそれに準じた方法を採用することができ、例えば、物理的吸着法や、共有結合させる方法が挙げられる。例えば、前記多孔性メンブレンがニトロセルロース膜又はニトロセルロース混合エステル膜である場合にはこれに物理吸着させることができるため、物理的吸着法を採用することが好ましい。固定化させる第二の物質及び対照試薬の量は、それらの種類、測定対象とする試料の種類、被験物質又はブロッキング剤に対する感度等によって適宜調整することができ、通常、多孔性メンブレン１ｍｍ３あたり、それぞれ独立に、０．０４～１．２μｇとすることが好ましい。 A method for preparing the test line and the control line in the porous membrane according to the present invention, i.e., a method for immobilizing the second substance and the control reagent (third substance, preferably anti-blocking agent antibody). is not particularly limited, and a conventionally known method or a method analogous thereto can be appropriately employed, and examples thereof include a physical adsorption method and a method of covalent bonding. For example, when the porous membrane is a nitrocellulose membrane or a nitrocellulose mixed ester membrane, it is possible to physically adsorb to this, so it is preferable to adopt a physical adsorption method. The amount of the second substance to be immobilized and the control reagent can be appropriately adjusted according to their types, the type of sample to be measured, the sensitivity to the test substance or blocking agent, etc., and is usually per 1 mm3 of the porous membrane. , each independently preferably 0.04 to 1.2 μg.
（吸収パッド）
本発明に係る吸収パッド（図１では吸収パッド１５０）は、クロマトグラフィー媒体である前記多孔性メンブレンを移動した試料や展開液、テストラインやコントロールラインに捕捉されなかった標識試薬や対照試薬などを吸収する機能を有する部材である。本発明に係る吸収パッドは、通常、前記テストライン及び前記コントロールラインよりも下流側に配置される。前記吸収パッドの材料としては、特に制限されず、例えば、セルロースろ紙、不織布、布、セルロースアセテート膜等の吸水性材料が挙げられる。
(absorbent pad)
The absorbent pad according to the present invention (
なお、図１において、サンプルパッド１４０、コンジュゲートパッド１３０、多孔性メンブレン１２０、吸収パッド１５０は、それぞれ別の部材からなるが、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片の構成はこれに制限されるものではなく、これらの部材は、毛細管現象によって試料が移動することができる部材であればよく、例えば、図１に示すシート１１０のような基材に貼り付けたものであっても、単一の多孔性部材からなる一連のシートとしてもよい。
In FIG. 1, the
＜イムノクロマトグラフィー試験片を用いる被験物質測定方法＞
本発明の被験物質測定方法は、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片を用いて試料中の被験物質を測定する方法であり、
前記コンジュゲートパッドに前記試料を接触させ、前記試料中の前記被験物質と前記標識試薬との複合体を形成させる工程、
前記テストラインにおいて、前記第二の物質で前記被験物質を介して前記複合体を捕捉して検出する工程、
前記コントロールラインにおいて、前記第三の物質で前記ブロッキング剤を介して前記標識試薬を捕捉する工程、
を含むことを特徴とする。より好ましくは、
前記試料を前記サンプルパッドに受容させる工程（工程１）、
前記コンジュゲートパッドに前記試料を接触させ、前記試料中の前記被験物質と前記標識試薬との複合体を形成させる工程（工程２）、
前記テストラインにおいて、前記第二の物質で前記被験物質を介して前記複合体を捕捉して検出する工程（工程３）、及び
前記コントロールラインにおいて、前記第三の物質で前記ブロッキング剤を介して前記標識試薬を捕捉する工程（工程４）、
を含むことを特徴とする。
<Test substance measurement method using immunochromatographic test strip>
The test substance measurement method of the present invention is a method of measuring a test substance in a sample using the immunochromatographic test strip of the present invention,
contacting the sample with the conjugate pad to form a complex between the test substance in the sample and the labeling reagent;
Capturing and detecting the complex via the test substance with the second substance in the test line;
Capturing the labeling reagent with the third substance through the blocking agent in the control line;
characterized by comprising More preferably
receiving the sample on the sample pad (step 1);
contacting the sample with the conjugate pad to form a complex between the test substance in the sample and the labeling reagent (step 2);
Capturing and detecting the complex with the second substance via the test substance in the test line (step 3), and in the control line with the third substance via the blocking agent capturing the labeling reagent (step 4);
characterized by comprising
以下に、本発明の被験物質測定方法の一実施形態として、図１の試験片１００を使用した測定方法（イムノクロマトグラフィー法）を説明する。
A measurement method (immunochromatographic method) using the
先ず、試料をサンプルパッド１４０に滴下又は塗布してこれに受容させる（工程１）。前記試料としては、前述のとおりであり、前記前処理液を添加したりこれにより調製されたものであってもよく、前記非特異反応抑制剤をさらに添加したものであってもよい。また、前記サンプルパッドには、前記試料と同時又は別々に、展開液及び／又は前記非特異反応抑制剤を滴下又は塗布してもよい。前記展開液としては、前記前処理液とその使用目的は異なるが、前記前処理液として挙げたものと同様のものが挙げられ、前記前処理液を用いた場合には、これと同一の組成であってもよい。
First, a sample is dropped or applied onto the
サンプルパッド１４０に受容された試料は、毛細管現象によってサンプルパッド１４０を通過し、コンジュゲートパッド１３０へと移動する。それにより、コンジュゲートパッド１３０に前記試料を接触させて、前記標識試薬を溶出させると共に、前記試料中に前記被験物質が存在する場合には、該被験物質（例えば抗原）と前記標識試薬を構成する第一の物質（例えば前記抗原に対する抗体）との相互作用（例えば抗原抗体反応）により、前記被験物質と前記標識試薬との複合体（例えば免疫複合体）を形成させる（工程２）。
The sample received by the
また、このとき、前記試料若しくはコンジュゲートパッド１３０に前記非特異反応抑制剤を添加した場合、又は、コンジュゲートパッド１３０に前記非特異反応抑制剤がさらに溶出可能に保持されている場合であって、前記試料中に異好性抗体が存在する場合には、前記非特異反応抑制剤が前記異好性抗体に結合し、下流側で、該異好性抗体が下記の第一の物質及び／又は第二の物質に結合して偽陽性の判定が生ずることを防ぐ。
Further, at this time, when the non-specific reaction inhibitor is added to the sample or
次いで、前記複合体は、毛細管現象によって下流側に移動し、テストライン１２２（検出部）に到達する。それにより、テストライン１２２において、テストライン１２２に固定化されている第二の物質（例えば前記抗原に対する抗体）で前記被験物質を介して前記複合体を捕捉して検出する（工程３）。前記複合体がテストライン１２２に捕捉される結果、テストライン１２２は前記標識試薬を構成する標識体によって呈色などを示すため、これをシグナルとして検出し、必要に応じて定量することにより、前記試料中の被験物質を測定することができる。
The complex then moves downstream by capillary action and reaches the test line 122 (detector). Thereby, in the
また、コンジュゲートパッドから溶出された標識試薬（コントロールラインが前記テストラインよりも下流側に配置されている場合には該テストラインで捕捉されなかった標識試薬）は、毛細管現象によって下流側に移動し、コントロールラインライン１２４にも到達する。それにより、コントロールライン１２４において、テストライン１２２に固定化されている対照試薬（第三の物質、好ましくは抗ブロッキング剤抗体）で前記ブロッキング剤を介して前記標識試薬を捕捉して検出する（工程４）。なお、図１の試験片１００においては工程３の後に工程４が行われるが、工程３と工程４とは互いに独立していても、同位置において同時であってもよく、また、工程４の後に工程３が行われてもよい。前記標識試薬がコントロールライン１２４に捕捉される結果、コントロールラインライン１２４は前記標識試薬を構成する標識体によって呈色などを示すため、これをシグナルとして検出し、必要に応じて定量することにより、イムノクロマトグラフィー試験片上で試料が正常に移動したことの判定をすることができる。前記判定の基準は、測定の目的及び被験物質の種類等によって適宜設定することができる。
In addition, the labeling reagent eluted from the conjugate pad (the labeling reagent not captured in the test line when the control line is arranged downstream of the test line) moves downstream due to capillary action. and reaches the
＜イムノクロマトグラフィー試験キット＞
本発明のイムノクロマトグラフィー試験キットは、少なくとも、本発明のイムノクロマトグラフィー試験片を含む。
<Immunochromatography test kit>
The immunochromatographic test kit of the present invention contains at least the immunochromatographic test strip of the present invention.
また、本発明のイムノクロマトグラフィー試験キットとしては、必要に応じて、前記前処理液、前記展開液、及び非特異反応抑制剤からなる群から選択される少なくとも１種をさらに含んでいてもよい。さらに、前記標識試薬、前記対照試薬、前処理用カートリッジなどを組み合わせることもできる。また、前記標識体として酵素標識を利用する場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液などを含めることもできる。また、前記競合法を検出原理とする場合には、例えば、固相化した被験物質、又は被験物質に結合する物質を固定した固相等を含めることもできる。さらに、本発明のイムノクロマトグラフィー試験キットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることもできる。 In addition, the immunochromatography test kit of the present invention may further contain at least one selected from the group consisting of the pretreatment liquid, the developing liquid, and a non-specific reaction inhibitor, if necessary. Furthermore, the labeling reagent, the control reagent, the pretreatment cartridge, and the like can be combined. In addition, when an enzyme label is used as the label, a substrate, a reaction stop solution, and the like necessary for detection of the label can be included. In addition, when the competitive method is used as the detection principle, for example, a solid phase on which a solid-phased test substance or a substance that binds to the test substance is immobilized can be included. Furthermore, the immunochromatographic test kit of the present invention can further include instructions for use of the kit.
本発明のイムノクロマトグラフィー試験片、被験物質測定方法、及びイムノクロマトグラフィー試験キットは、研究用としてのみならず、例えば、体外診断用医薬品として、前記被験物質に関連する疾患の診断の基礎となる該被験物質の測定に利用することができる。 The immunochromatographic test strip, test substance measurement method, and immunochromatographic test kit of the present invention can be used not only for research but also, for example, as an in-vitro diagnostic drug, which is a basis for diagnosing a disease related to the test substance. It can be used to measure substances.
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below based on examples and comparative examples, but the present invention is not limited by the following examples.
（実施例１）
＜イムノクロマトグラフィー試験片の作製＞
下記の（１）～（３）にしたがって、図１に示す構造を有するイムノクロマトグラフィー試験片を作製した。作製したイムノクロマトグラフィー試験片は、粘着シート１１０上に、ニトロセルロース膜からなる多孔性メンブレン１２０が配置され、さらにその上の一方の端にコンジュゲートパッド１３０が配置された構成を有しており、コンジュゲートパッド１３０には、ブロッキング剤（大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＢＰＦ））によりブロッキングされた標識試薬（抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳウサギポリクローナル抗体感作金コロイド粒子）が保持されている。また、コンジュゲートパッド１３０の下流側に位置する検出部であるテストライン１２２には、抗被験物質抗体として抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳウサギポリクローナル抗体が固定化されている。さらに、コンジュゲートパッド１３０の下流側に位置するコントロール部であるコントロールライン１２４には、抗ブロッキング剤抗体として抗ＢＰＦ抗体が固定化されている。
(Example 1)
<Preparation of immunochromatographic test piece>
An immunochromatographic test piece having the structure shown in FIG. 1 was prepared according to the following (1) to (3). The prepared immunochromatography test piece has a configuration in which a
（１）テストライン及びコントロールラインの作製
従来法で調製した抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳウサギポリクローナル抗体（抗レジオネラウサギ抗体）を予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に希釈し、０．５ｍｇ／ｍｌとした。これをニトロセルロース膜からなる多孔性メンブレンのテストライン領域に塗布して乾燥させ、前記抗レジオネラウサギ抗体が固定化されたテストライン（図１ではテストライン１２２）を作製した。また、従来法で調製したＢＰＦに対するウサギ由来の精製ＩｇＧ抗体（抗ＢＰＦウサギ抗体）を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に希釈し、１．５ｍｇ／ｍｌとした。これを前記多孔性メンブレンのコントロールライン領域に塗布し、乾燥させて、前記抗ＢＰＦウサギ抗体が固定化されたコントロールライン（図１ではコントロールライン１２４）を作製し、テストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレン１２０を得た。
(1) Preparation of test line and control line An anti-Legionella pneumophila serotype 1 LPS rabbit polyclonal antibody (anti-Legionella rabbit antibody) prepared by a conventional method was previously diluted in 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) and added to 0.5 mg. /ml. This was applied to the test line region of a porous membrane made of nitrocellulose and dried to prepare a test line (
（２）コンジュゲートパッドの作製
先ず、金コロイド溶液１０００μＬに対して、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で希釈済みの抗レジオネラニューモフィラ血清型１ＬＰＳウサギポリクローナル抗体（抗レジオネラウサギ抗体）の溶液１００μＬを添加した。次いで、この溶液にブロッキング剤としてＢＰＦ溶液を１００μＬ添加後、遠心分離機を用いて１０，０００×ｇ、２５℃の条件で１０分間遠心分離して上澄み液を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）からなる保存液を加えた。次いで、ボルテックスミキサーにより粒子を再分散させた後、１０，０００×ｇ、２５℃の条件で１０分間遠心分離した。さらに、上澄み液を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）からなる保存液を加えて、ボルテックスミキサーにより粒子を再分散させ、抗レジオネラウサギ抗体感作金コロイド粒子（標識試薬）の溶液を得た。次いで、この標識試薬の溶液１００μＬに対して、Ｎｏｒｍａｌ Ｒａｂｂｉｔ Ｇｌｏｂｌｉｎ（ＮＲＧ、非特異反応抑制剤）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）溶液を４００μＬの割合となるように加え、よく混和した。得られた溶液８００μＬをガラス繊維パッドに添加して均一に馴染ませ、十分に乾燥させて、前記標識試薬及びＮＲＧが保持されたコンジュゲートパッド１３０を得た。
(2) Preparation of conjugate pad First, a solution of anti-Legionella pneumophila serotype 1LPS rabbit polyclonal antibody (anti-Legionella rabbit antibody) diluted with 50 mM borate buffer (pH 9.0) is added to 1000 μL of colloidal gold solution. 100 μL was added. Next, after adding 100 μL of BPF solution as a blocking agent to this solution, the supernatant was removed by centrifugation at 10,000×g and 25° C. for 10 minutes using a centrifuge, followed by addition of 20 mM Tris-HCl ( A stock solution consisting of pH 8.2) was added. After redispersing the particles with a vortex mixer, the particles were centrifuged at 10,000×g and 25° C. for 10 minutes. Furthermore, after removing the supernatant, a storage solution consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 8.2) was added, the particles were redispersed with a vortex mixer, and a solution of anti-Legionella rabbit antibody-sensitized colloidal gold particles (labeling reagent) was prepared. got Next, 400 μL of 20 mM Tris-HCl (pH 8.2) solution containing Normal Rabbit Globlin (NRG, non-specific reaction inhibitor) was added to 100 μL of this labeling reagent solution and mixed well. 800 μL of the resulting solution was added to a glass fiber pad, uniformly applied, and dried sufficiently to obtain a
（３）イムノクロマトグラフィー試験片の作製
（１）で作製したテストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレン１２０上に、（２）で作製したコンジュゲートパッド１３０を配置し、さらにその上にサンプルパッド１４０としてガラス繊維パッドを配置した。また、展開された水溶液を吸収するための吸収パッド１５０としてのセルロースアセテート膜をコントロールラインの下流側となるように多孔性メンブレン１２０上に配置して、イムノクロマトグラフィー試験片１００を得た。
(3) Preparation of immunochromatographic test piece Place the
（実施例２）
抗ＢＰＦウサギ抗体に代えて、従来法で調製したカゼインに対するウサギ由来の精製ＩｇＧ抗体（抗カゼインウサギ抗体）を用いたこと以外は実施例１の（１）と同様にしてテストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。また、ブロッキング剤としてＢＰＦ溶液に代えてカゼイン溶液を用いたこと以外は実施例１の（２）と同様にしてコンジュゲートパッドを作製した。さらに、これらを多孔性メンブレン１２０及びコンジュゲートパッド１３０としてそれぞれ用いたこと以外は実施例１の（３）と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Example 2)
A test line and a control line were prepared in the same manner as in Example 1 (1), except that instead of the anti-BPF rabbit antibody, a rabbit-derived purified IgG antibody against casein (anti-casein rabbit antibody) prepared by a conventional method was used. A porous membrane with A conjugate pad was prepared in the same manner as in Example 1 (2), except that a casein solution was used as the blocking agent instead of the BPF solution. Furthermore, an immunochromatographic test strip was obtained in the same manner as in Example 1 (3) except that these were used as the
（実施例３）
抗レジオネラウサギ抗体に代えて、従来法で調製した抗ＲＳＶラットモノクローナル抗体（抗ＲＳＶラット抗体）を用いたこと以外は実施例１の（１）と同様にして、テストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。また、抗レジオネラウサギ抗体に代えて前記抗ＲＳＶラット抗体を用い、ＮＲＧを加えなかったこと以外は実施例１の（２）と同様にして、コンジュゲートパッドを作製した。さらに、これらを多孔性メンブレン１２０及びコンジュゲートパッド１３０としてそれぞれ用いたこと以外は実施例１の（３）と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Example 3)
In the same manner as in Example 1 (1), except that an anti-RSV rat monoclonal antibody (anti-RSV rat antibody) prepared by a conventional method was used instead of the anti-Legionella rabbit antibody, a porous membrane having a test line and a control line was prepared. A membrane was fabricated. A conjugate pad was prepared in the same manner as in Example 1 (2) except that the anti-RSV rat antibody was used in place of the anti-Legionella rabbit antibody and NRG was not added. Furthermore, an immunochromatographic test strip was obtained in the same manner as in Example 1 (3) except that these were used as the
（実施例４）
抗ＢＰＦウサギ抗体に代えて実施例２と同様の抗カゼインウサギ抗体を用いたこと以外は実施例３と同様にして、テストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。また、ブロッキング剤としてＢＰＦ溶液に代えてカゼイン溶液を用いたこと以外は実施例３と同様にして、コンジュゲートパッドを作製した。さらに、これらを多孔性メンブレン１２０及びコンジュゲートパッド１３０としてそれぞれ用いたこと以外は実施例３と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Example 4)
A porous membrane having a test line and a control line was prepared in the same manner as in Example 3, except that the same anti-casein rabbit antibody as in Example 2 was used instead of the anti-BPF rabbit antibody. A conjugate pad was prepared in the same manner as in Example 3, except that a casein solution was used as the blocking agent instead of the BPF solution. Further, an immunochromatography test piece was obtained in the same manner as in Example 3 except that these were used as the
（実施例５）
抗ＲＳＶラット抗体に代えて、従来法で調製した抗ＮＶマウスモノクローナル抗体（抗ＮＶマウス抗体）を用いたこと以外は実施例３と同様にして、テストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。また、抗ＲＳＶラット抗体に代えて前記抗ＮＶマウス抗体を用いたこと以外は実施例３と同様にして、コンジュゲートパッドを作製した。さらに、これらを多孔性メンブレン１２０及びコンジュゲートパッド１３０としてそれぞれ用いたこと以外は実施例３と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Example 5)
A porous membrane having a test line and a control line was produced in the same manner as in Example 3, except that an anti-NV mouse monoclonal antibody (anti-NV mouse antibody) prepared by a conventional method was used instead of the anti-RSV rat antibody. did. A conjugate pad was prepared in the same manner as in Example 3, except that the anti-NV mouse antibody was used instead of the anti-RSV rat antibody. Further, an immunochromatography test piece was obtained in the same manner as in Example 3 except that these were used as the
（比較例１）
（１）抗ＢＰＦウサギ抗体に代えて、従来法で調製した抗マウスＩｇＧ抗体を用いたこと以外は実施例１の（１）と同様にしてテストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。
(Comparative example 1)
(1) A porous membrane having a test line and a control line was prepared in the same manner as in (1) of Example 1, except that an anti-mouse IgG antibody prepared by a conventional method was used instead of the anti-BPF rabbit antibody. .
（２）先ず、実施例１の（２）と同様にして抗レジオネラウサギ抗体感作金コロイド粒子（標識試薬）の溶液を得た。さらに、抗レジオネラウサギ抗体に代えて、従来法で調製したマウスＩｇＧ抗体を用いたこと以外は前記抗レジオネラウサギ抗体感作金コロイド粒子（標識試薬）の溶液と同様にして、マウスＩｇＧ抗体感作金コロイド粒子（ダミー粒子）の溶液を作製した。次いで、得られた標識試薬の溶液１００μＬ及びダミー粒子の溶液１００μＬに対して、ＮＲＧを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）溶液を４００μＬの割合となるように加えて、よく混和した。得られた溶液８００μＬをガラス繊維パッドに添加して均一に馴染ませ、十分に乾燥させて、前記標識試薬、ダミー粒子、及びＮＲＧが保持されたコンジュゲートパッドを得た。 (2) First, in the same manner as in Example 1 (2), a solution of anti-Legionella rabbit antibody-sensitized colloidal gold particles (labeling reagent) was obtained. Further, mouse IgG antibody sensitization was carried out in the same manner as the solution of anti-Legionella rabbit antibody-sensitized colloidal gold particles (labeling reagent) except that mouse IgG antibody prepared by a conventional method was used instead of anti-Legionella rabbit antibody. A solution of colloidal gold particles (dummy particles) was prepared. Next, 400 μL of a 20 mM Tris-HCl (pH 8.2) solution containing NRG was added to 100 μL of the resulting labeling reagent solution and 100 μL of the dummy particle solution and mixed well. 800 μL of the resulting solution was added to a glass fiber pad, uniformly applied, and dried sufficiently to obtain a conjugate pad holding the labeling reagent, dummy particles, and NRG.
（３）多孔性メンブレン１２０及びコンジュゲートパッド１３０に代えて、それぞれ、比較例１の（１）で得られた多孔性メンブレン及び（２）で得られたコンジュゲートパッドを用いたこと以外は実施例１の（３）と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(3) Performed except that the porous membrane obtained in (1) and the conjugate pad obtained in (2) of Comparative Example 1 were used instead of the
（比較例２）
ＮＲＧを加えなかったこと以外は比較例１の（２）と同様にして、コンジュゲートパッドを得た。これをコンジュゲートパッド１３０に代えて用いたこと以外は比較例１と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Comparative example 2)
A conjugate pad was obtained in the same manner as in (2) of Comparative Example 1, except that NRG was not added. An immunochromatographic test piece was obtained in the same manner as in Comparative Example 1 except that this was used instead of the
（比較例３）
抗ＢＰＦウサギ抗体に代えて、従来法で調製した抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたこと以外は実施例１の（１）と同様にして、テストライン及びコントロールラインを有する多孔性メンブレンを作製した。これを多孔性メンブレン１２０に代えて用いたこと以外は実施例１と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Comparative Example 3)
A porous membrane having a test line and a control line was prepared in the same manner as in Example 1 (1) except that an anti-rabbit IgG antibody prepared by a conventional method was used instead of the anti-BPF rabbit antibody. An immunochromatography test piece was obtained in the same manner as in Example 1 except that this was used instead of the
（比較例４）
ＮＲＧを加えなかったこと以外は比較例３と同様にしてコンジュゲートパッドを作製し、これをコンジュゲートパッド１３０に代えて用いたこと以外は比較例３と同様にして、イムノクロマトグラフィー試験片を得た。
(Comparative Example 4)
A conjugate pad was prepared in the same manner as in Comparative Example 3 except that NRG was not added, and an immunochromatography test strip was obtained in the same manner as in Comparative Example 3 except that this was used instead of the
（試験例１）
尿を試料とするイムノクロマトグラフィー試験片におけるブロッキング剤検出法によるコントロールラインのシグナル強度及び非特異反応抑制効果（従来技術との対比）
試料として、レジオネラ由来の多糖抗原の不存在を確認済みのヒトの尿検体（陰性試料Ａ～Ｃ）、前記陰性試料Ａ～ＣにＨＡＲＡ血清をそれぞれ１０質量％となるように添加（スパイク）した偽陽性試料Ａ～Ｃ、前記陰性試料Ａ～Ｃにレジオネラ由来の多糖抗原をそれぞれ添加した陽性試料Ａ～Ｃの計９種を用いた。なお、尿検体中のレジオネラ由来の多糖抗原の存在・不存在は、イムノクロマト試薬であるレジオネラキット「イムノキャッチ―レジオネラ」（栄研化学株式会社製）を用いて確認した。
(Test example 1)
Signal intensity and non-specific reaction suppression effect of control line by blocking agent detection method in immunochromatography test piece using urine as sample (comparison with conventional technology)
As samples, human urine specimens (negative samples A to C) in which the absence of Legionella-derived polysaccharide antigens has been confirmed, and HARA serum was added (spiked) to each of the negative samples A to C to a concentration of 10% by mass. A total of 9 types of false-positive samples A to C and positive samples A to C obtained by adding Legionella-derived polysaccharide antigens to the negative samples A to C were used. The presence/absence of Legionella-derived polysaccharide antigens in urine specimens was confirmed using an immunochromatographic reagent Legionella kit "Immunocatch-Legionella" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).
各試料を、実施例１及び比較例１～４で作製したイムノクロマトグラフィー試験片のサンプルパッドに約９０μＬずつ滴下し、１５分後にテストラインのシグナルを確認した。テストラインのシグナルの確認は目視にて行い、次の基準：
＋ ：テストラインの呈色がはっきりと確認できる（陽性）
＋↓：テストラインの呈色がわずかに確認できる（弱陽性）
－ ：テストラインの呈色が確認できない（陰性）
により判定した。また、コントロールラインのシグナルの確認も目視にて行い、次の基準：
Ａ：コントロールラインの呈色がはっきりと確認できる
Ｂ：コントロールラインの呈色がわずかに確認できるが確認しづらい
Ｃ：コントロールラインの呈色が確認できない
により判断した。さらに、テストラインが線状ではなく点状に呈色しており、明らかに多孔性メンブレンが目詰まりを起こしていることが確認されているものについては、詰まりの判定を「あり」とし、それ以外は「なし」とした。得られた結果を下記の表１に示す。
About 90 μL of each sample was dropped onto the sample pad of the immunochromatographic test piece prepared in Example 1 and Comparative Examples 1 to 4, and the signal of the test line was confirmed after 15 minutes. Confirmation of the signal of the test line is done visually, and the following criteria are used:
+: The coloration of the test line can be clearly confirmed (positive)
+ ↓: Slight coloration of the test line can be confirmed (weakly positive)
－ : Color development of the test line cannot be confirmed (negative)
determined by In addition, the signal of the control line was visually confirmed, and the following criteria were observed:
A: The coloration of the control line can be clearly confirmed. B: The coloration of the control line can be slightly confirmed, but it is difficult to confirm. C: The coloration of the control line cannot be confirmed. In addition, if the test line is colored in dots instead of linear, and clogging of the porous membrane is clearly confirmed, clogging will be determined as "Yes". Other than that, "none". The results obtained are shown in Table 1 below.
表１に示したとおり、実施例１のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原は含有しないがＨＡＲＡ血清を含有する偽陽性の試料であっても、陽性判定（偽陽性）の発生を有意に抑制し、かつ、コントロールラインの呈色がはっきりと確認され、シグナル強度を十分な強さとできることが確認された。また、実施例１のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原を含有する陽性試料に対するテストライン及びコントロールラインの呈色もはっきりと確認され、シグナル強度が大きく低下することはなかったことから、迅速な検査及び診断に資する免疫学的測定法の利点を損なうことがないことも確認された。 As shown in Table 1, in the immunochromatographic test strip of Example 1, the occurrence of positive determination (false positive) was significantly suppressed even in false-positive samples containing HARA serum but not antigens, In addition, the coloration of the control line was clearly confirmed, and it was confirmed that sufficient signal intensity could be obtained. In addition, in the immunochromatographic test strip of Example 1, the coloration of the test line and control line for the positive sample containing the antigen was clearly confirmed, and the signal intensity did not decrease significantly. It was also confirmed that the advantages of diagnostic immunoassays are not compromised.
他方、比較例１～２のイムノクロマトグラフィー試験片においては、目詰まりが起こったり、テストラインのシグナル強度にばらつきが生じたり、陰性試料においても偽陽性が生じたりした。これは、ダミー粒子の存在による粒子量の増加や、それによるバックグラウンドの上昇、ダミー粒子に対する非特異反応によるものと考えられる。また、比較例３のイムノクロマトグラフィー試験片においては、テストラインのシグナル強度に問題はなかったものの、コントロールラインのシグナル強度が著しく減弱するため、検体展開の有無を確認することが困難となった。これは、非特異反応抑制剤としてのＮＲＧがコントロールラインに捕捉されて標識試薬の捕捉を阻害したためといえる。 On the other hand, in the immunochromatographic test strips of Comparative Examples 1 and 2, clogging occurred, variations in the signal intensity of the test line occurred, and false positives occurred even in negative samples. This is thought to be due to an increase in the amount of particles due to the presence of dummy particles, an increase in the background due to this, and non-specific reactions to the dummy particles. In the immunochromatographic test piece of Comparative Example 3, although there was no problem with the signal intensity of the test line, the signal intensity of the control line was significantly attenuated, making it difficult to confirm the presence or absence of sample development. It can be said that this is because NRG as a non-specific reaction inhibitor was captured in the control line and inhibited capture of the labeling reagent.
（試験例２）
尿を試料とするイムノクロマトグラフィー試験片におけるブロッキング剤検出法によるコントロールラインのシグナル強度及び非特異反応抑制効果（ブロッキング剤の種類）
試料として、レジオネラ由来の多糖抗原の不存在を確認済みのヒトの尿検体（陰性試料Ｄ～Ｆ）、前記陰性試料Ｄ～ＦにＨＡＲＡ血清をそれぞれ１０質量％となるように添加（スパイク）した偽陽性試料Ｄ～Ｆ、前記陰性試料Ｄ～Ｆにレジオネラ由来の多糖抗原をそれぞれ添加した陽性試料Ｄ～Ｆの計９種を用いた。なお、尿検体中のレジオネラ由来の多糖抗原の存在・不存在は、イムノクロマト試薬であるレジオネラキット「イムノキャッチ―レジオネラ」（栄研化学株式会社製）を用いて確認した。
(Test example 2)
Signal intensity and non-specific reaction suppression effect of control line by blocking agent detection method in immunochromatography test piece using urine as sample (type of blocking agent)
The samples used were human urine specimens (negative samples D to F) in which the absence of Legionella-derived polysaccharide antigens had been confirmed, and HARA serum was added (spiked) to each of the negative samples D to F to a concentration of 10% by mass. A total of 9 types of false-positive samples D to F and positive samples D to F obtained by adding Legionella-derived polysaccharide antigens to the negative samples D to F were used. The presence/absence of Legionella-derived polysaccharide antigens in urine specimens was confirmed using an immunochromatographic reagent Legionella kit "Immunocatch-Legionella" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).
各試料を、実施例１～２で作製したイムノクロマトグラフィー試験片のサンプルパッドに約９０μＬずつ滴下し、１５分後にテストライン及びコントロールラインのシグナルを確認し、試験例１に記載の基準により判定した。得られた結果を下記の表２に示す。 About 90 μL of each sample was dropped onto the sample pad of the immunochromatographic test piece prepared in Examples 1 and 2, and after 15 minutes, the signals of the test line and the control line were confirmed and judged according to the criteria described in Test Example 1. . The results obtained are shown in Table 2 below.
表２に示したとおり、実施例１～２のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原を含有しないがＨＡＲＡ血清を含有する偽陽性の試料であっても、偽陽性の発生を有意に抑制し、かつ、コントロールラインのシグナル強度を十分な強さとできることが確認された。また、実施例１～２のイムノクロマトグラフィー試験片のいずれにおいても、抗原を含有する陽性試料に対するテストライン及びコントロールラインのシグナル強度が大きく低下することはなかったことから、迅速な検査及び診断に資する免疫学的測定法の利点を損なうことはないことも確認され、本発明において、ブロッキング剤としてはＢＰＦに限定されないことが確認された。 As shown in Table 2, in the immunochromatographic test strips of Examples 1 and 2, the occurrence of false positives was significantly suppressed even in false positive samples containing HARA serum but not containing antigens, and It was confirmed that the signal intensity of the control line could be made sufficiently strong. In addition, in any of the immunochromatographic test strips of Examples 1 and 2, the signal intensity of the test line and control line for the positive sample containing the antigen did not decrease significantly, which contributes to rapid examination and diagnosis. It was also confirmed that the advantages of the immunoassay method are not compromised, and it was confirmed that the blocking agent in the present invention is not limited to BPF.
（試験例３）
鼻腔ぬぐい液を試料とするイムノクロマトグラフィー試験片におけるブロッキング剤検出法によるコントロールラインのシグナル強度及び非特異反応抑制効果
試料として、ＲＳＶ抗原の不存在を確認済みのヒトの鼻腔ぬぐい液検体を、非特異反応抑制剤としてのラット抗体（従来法で調製）を含む抽出用液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）で懸濁した陰性試料Ｇ～Ｉ、前記陰性試料Ｇ～Ｉにヒト抗ラット抗体血清をそれぞれ１０質量％となるように添加（スパイク）した偽陽性試料Ｇ～Ｉ、前記陰性試料Ｇ～ＩにＲＳＶ抗原をそれぞれ添加した陽性試料Ｇ～Ｉの計９種を用いた。なお、検体中のＲＳＶ抗原の存在・不存在は、ＰＣＲ試薬である「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒａｌ Ｐａｎｅｌ」（ＧｅｎＭａｒｋ社製）を用いて確認した。
(Test example 3)
Signal intensity and non-specific reaction suppression effect of control line by blocking agent detection method in immunochromatographic test piece using nasal swab as sample Negative samples G to I suspended in an extraction solution (HEPES buffer) containing a rat antibody (prepared by a conventional method) as a reaction inhibitor, and 10% by mass of human anti-rat antibody serum in each of the negative samples G to I. False-positive samples G to I were added (spiked) in such a manner as to obtain positive samples G to I, and positive samples G to I were added to the negative samples G to I with RSV antigen, respectively. The presence/absence of the RSV antigen in the sample was confirmed using the PCR reagent "Respiratory Viral Panel" (manufactured by GenMark).
各試料を、実施例３～４で作製したイムノクロマトグラフィー試験片のサンプルパッドに約９０μＬずつ滴下し、１５分後にテストライン及びコントロールラインのシグナルを確認し、試験例１に記載の基準により判定した。得られた結果を下記の表３に示す。 About 90 μL of each sample was dropped onto the sample pad of the immunochromatography test piece prepared in Examples 3 and 4, and after 15 minutes, the signals of the test line and control line were confirmed and judged according to the criteria described in Test Example 1. . The results obtained are shown in Table 3 below.
表３に示したとおり、実施例３～４のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原を含有しないがヒト抗ラット抗体血清を含有する偽陽性の試料であっても、偽陽性の発生を有意に抑制し、かつ、コントロールラインのシグナル強度を十分な強さとできることが確認された。また、実施例３～４のイムノクロマトグラフィー試験片のいずれにおいても、抗原を含有する陽性試料に対するテストライン及びコントロールラインのシグナル強度が大きく低下することはなかったことから、迅速な検査及び診断に資する免疫学的測定法の利点を損なうことはないことも確認され、本発明が、試料として鼻腔ぬぐい液検体を用いた際にも有効であることが確認された。 As shown in Table 3, in the immunochromatographic test strips of Examples 3 and 4, even false positive samples containing human anti-rat antibody serum but not containing antigens significantly suppressed the occurrence of false positives. Moreover, it was confirmed that the signal intensity of the control line can be sufficiently increased. In addition, in any of the immunochromatographic test strips of Examples 3 and 4, the signal intensity of the test line and control line for the positive sample containing the antigen did not decrease significantly, which contributes to rapid examination and diagnosis. It was also confirmed that the advantages of the immunoassay method are not compromised, and it was confirmed that the present invention is also effective when nasal swab samples are used as samples.
（試験例４）
便を試料とするイムノクロマトグラフィー試験片におけるブロッキング剤検出法によるコントロールラインのシグナル強度及び非特異反応抑制効果
試料として、ＮＶ抗原の不存在を確認済みのヒトの便検体を、非特異反応抑制剤としてのマウス抗体（従来法で調製）を含む抽出用液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）で懸濁した陰性試料Ｊ～Ｌ、前記陰性試料Ｊ～ＬにＨＡＭＡ血清をそれぞれ５質量％となるように添加（スパイク）した偽陽性試料Ｊ～Ｌ、前記陰性試料Ｊ～ＬにＮＶ抗原をそれぞれ添加した陽性試料Ｊ～Ｌの計９種を用いた。なお、ＮＶ抗原の存在・不存在は、イムノクロマト試薬である「イムノキャッチ―ノロ」（栄研化学社製）を用いて確認した。
(Test example 4)
Signal strength and non-specific reaction inhibition effect of control line by blocking agent detection method in immunochromatographic test piece using stool sample As a sample, human stool specimen confirmed the absence of NV antigen was used as a non-specific reaction inhibitor. HAMA serum was added (spike ), and positive samples J to L in which NV antigen was added to the negative samples J to L, respectively. The presence/absence of NV antigen was confirmed using an immunochromatographic reagent, "Immunocatch-Noro" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).
各試料を、実施例５で作製したイムノクロマトグラフィー試験片のサンプルパッドに約９０μＬずつ滴下し、１５分後にテストライン及びコントロールラインのシグナルを確認し、試験例１に記載の基準により判定した。得られた結果を下記の表４に示す。 About 90 μL of each sample was dropped on the sample pad of the immunochromatography test piece prepared in Example 5, and after 15 minutes, the signals of the test line and control line were confirmed and judged according to the criteria described in Test Example 1. The results obtained are shown in Table 4 below.
表４に示したとおり、実施例５のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原を含有しないがＨＡＭＡ血清を含有する偽陽性の試料であっても、偽陽性の発生を有意に抑制し、かつ、コントロールラインのシグナル強度を十分な強さとできることが確認された。また、実施例５のイムノクロマトグラフィー試験片において、抗原を含有する陽性試料に対するテストライン及びコントロールラインのシグナル強度が大きく低下することはなかったことから、迅速な検査及び診断に資する免疫学的測定法の利点を損なうことはないことも確認され、本発明が、試料として便検体を用いた際にも有効であることが確認された。 As shown in Table 4, in the immunochromatographic test strip of Example 5, even in the false-positive sample containing HAMA serum but not containing the antigen, the occurrence of false-positive was significantly suppressed, and the control line It was confirmed that the signal intensity of the signal can be sufficiently strong. In addition, in the immunochromatographic test strip of Example 5, the signal intensity of the test line and the control line for the positive sample containing the antigen did not decrease significantly. It was also confirmed that the advantages of the method are not impaired, and it was confirmed that the present invention is effective even when a stool sample is used as a sample.
本発明によれば、イムノクロマトグラフィー法において、コントロールラインでシグナルを検出するために標識試薬及び対照試薬以外の試薬を別途準備する必要がなく、かつ、試料中に異好性抗体に対する非特異反応抑制剤が存在していてもコントロールラインにおけるシグナル強度が影響を受けないコントロールラインシグナル形成機構を備える、イムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キットを提供することが可能となる。 According to the present invention, in the immunochromatographic method, there is no need to separately prepare reagents other than the labeling reagent and the control reagent in order to detect the signal in the control line, and non-specific reaction suppression against heterophile antibodies in the sample It is possible to provide an immunochromatographic test strip with a control line signal formation mechanism that does not affect the signal intensity in the control line even in the presence of an agent, and a method for measuring a test substance and an immunochromatographic test kit using the same. becomes.
１００…試験片、１１０…シート、１２０…多孔性メンブレン、１３０…コンジュゲートパッド、１４０…サンプルパッド、１５０…吸収パッド、１２２…テストライン、１２４…コントロールライン
DESCRIPTION OF
Claims (10)
コンジュゲートパッド、テストライン、及びコントロールラインを備えており、
前記コンジュゲートパッドには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第一の物質、ブロッキング剤、及び標識体を含む標識試薬が溶出可能に保持されており、
前記標識体は、前記第一の物質と結合しており、かつ、前記ブロッキング剤でブロッキングされており、
前記テストラインには、前記被験物質に対して特異的に結合可能な第二の物質が固定化されており、
前記コントロールラインには、前記ブロッキング剤に対して特異的に結合可能な第三の物質が固定化されている、
ことを特徴とする、イムノクロマトグラフィー試験片。 An immunochromatographic test strip for measuring a test substance in a sample,
Equipped with conjugate pads, test lines, and control lines,
The conjugate pad retains an elutable labeling reagent containing a first substance capable of specifically binding to the test substance, a blocking agent, and a label,
the label is bound to the first substance and blocked with the blocking agent;
A second substance that can specifically bind to the test substance is immobilized on the test line,
A third substance that can specifically bind to the blocking agent is immobilized on the control line,
An immunochromatographic test strip characterized by:
前記コンジュゲートパッドに前記試料を接触させ、前記試料中の前記被験物質と前記標識試薬との複合体を形成させる工程、
前記テストラインにおいて、前記第二の物質で前記被験物質を介して前記複合体を捕捉して検出する工程、
前記コントロールラインにおいて、前記第三の物質で前記ブロッキング剤を介して前記標識試薬を捕捉する工程、
を含むことを特徴とする、被験物質測定方法。 A method for measuring a test substance in a sample using the immunochromatographic test strip according to any one of claims 1 to 5,
contacting the sample with the conjugate pad to form a complex between the test substance in the sample and the labeling reagent;
Capturing and detecting the complex via the test substance with the second substance in the test line;
Capturing the labeling reagent with the third substance through the blocking agent in the control line;
A method for measuring a test substance, comprising:
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