JP2012032279A - Biopolymer analysis method and biopolymer recognition board - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体高分子分析方法および生体高分子認識基板に関するものであり、詳細には、質量分析に基づく生体高分子分析方法および質量分析用生体高分子認識基板に関するものである。 The present invention relates to a biopolymer analysis method and a biopolymer recognition substrate, and more particularly to a biopolymer analysis method based on mass spectrometry and a biopolymer recognition substrate for mass spectrometry.
２００１年にヒトゲノムが１００％解読されて以来、人々の関心は、個体レベルでのタンパク質濃度の変動と疾患との関連性を網羅的に解析するプロテオミクスへと移っている。このため、電気泳動や質量分析装置、そしてＤＮＡ解析のデータベースによるタンパク質の解析手法が一般的に展開されてきた。しかし、実際に同定すべきタンパク質の種類と数は、異なる翻訳後修飾や生体の置かれた状況による変化まで加算すると膨大となる。また、多くの疾患に関連するバイオマーカータンパク質の発現量は極めて少量であり、ＤＮＡのように少量のタンパク質を増幅する技術は未だにない。さらにタンパク質の発現量パターンの多くは細胞の状況やシグナル分子によって敏感に変化する生物の持つ膨大な情報の解明のために研究はますます迅速高効率化が必要となってきている。 Since the human genome was 100% deciphered in 2001, people's interest has shifted to proteomics that comprehensively analyzes the relationship between changes in protein concentration at the individual level and diseases. For this reason, protein analysis methods using electrophoresis, mass spectrometers, and DNA analysis databases have generally been developed. However, the types and number of proteins to be actually identified become enormous when adding to different post-translational modifications and changes due to the state of the living body. In addition, the amount of biomarker protein expression associated with many diseases is extremely small, and there is still no technology for amplifying such a small amount of protein as DNA. Furthermore, many of the protein expression patterns are required to be rapidly and highly efficient in order to elucidate the enormous amount of information possessed by organisms that change sensitively depending on the state of cells and signal molecules.
プロテオミクスにおけるタンパク質検出においては、ＤＮＡチップと同様に多種タンパク質を一つの基板上に固定化したプロテインチップが提唱されている。プロテインチップの用途はプロテオーム解析、創薬、臨床医学や健康化学などの研究分野はもとより、迅速な診断検査による疾病の早期発見、疾病予防、環境モニター、食品や農薬などの安全性評価など、極めて広範囲である。代表的なプロテインチップは、抗体を固定化し、蛍光ラベル化した二次抗体による蛍光解析が主流となっているものの、ｐｍｏｌオーダーでの定量性には乏しい。質量分析法は、ｐｍｏｌオーダー以下のタンパク質を検出できる高感度特性を有していることから、蛍光に置き換わるプロテインチップの検出法に適用できると期待できる。しかし、プロテインチップに固定化されている抗体はアミノ酸を基本構成分子とした複雑な窒素含有化合物であるタンパク質であるため、ここにバイオマーカータンパク質が結合したとしても、同じタンパク質であり、構成成分に大きい違いがないことから、どのようなバイオマーカータンパク質が結合しているかを質量分析で精密に同定することは容易ではない。そこで、質量分析法によりバイオマーカータンパク質を高感度定量するために、抗体に置き換わる単純な組成による分子認識材料を使用する必要がある。 In protein detection in proteomics, a protein chip in which various proteins are immobilized on a single substrate has been proposed in the same manner as a DNA chip. Protein chips are used in research fields such as proteome analysis, drug discovery, clinical medicine and health chemistry, as well as early detection of diseases through rapid diagnostic tests, disease prevention, environmental monitoring, and safety evaluation of food and agricultural chemicals. Wide range. Although typical protein chips are mainly used for fluorescence analysis with a secondary antibody that is immobilized with an antibody and fluorescently labeled, the quantitative property in the pmol order is poor. Since mass spectrometry has a high sensitivity characteristic that can detect proteins of the order of pmol or less, it can be expected that it can be applied to a method for detecting a protein chip that replaces fluorescence. However, since the antibody immobilized on the protein chip is a protein that is a complex nitrogen-containing compound with amino acids as basic constituent molecules, even if a biomarker protein is bound here, it is the same protein, Since there is no significant difference, it is not easy to accurately identify what biomarker protein is bound by mass spectrometry. Therefore, in order to perform high-sensitivity quantification of biomarker protein by mass spectrometry, it is necessary to use a molecular recognition material having a simple composition that replaces an antibody.
本発明者らは、トレハロースを用いた水溶性架橋剤を合成し、タンパク質インプリンティングへの応用を検討したことを報告している（非特許文献１参照）。 The present inventors have reported that a water-soluble crosslinking agent using trehalose was synthesized and studied for application to protein imprinting (see Non-Patent Document 1).
上述のように、従来のタンパク質を基板上に固定化しているプロテインチップは、捕捉したタンパク質等の生体高分子を質量分析法で解析することが困難であった。そこで、本発明は、タンパク質・糖類・脂質などの生体高分子の機能解析に利用可能な分子認識基板を用いる生体高分子の分析方法において、窒素由来の共雑シグナルを低減し、高感度かつ高精度の質量分析に基づく生体高分子分析を簡便に行うことができる方法、および、当該方法に使用可能な基板を提供することを目的とする。 As described above, it is difficult for a protein chip in which a conventional protein is immobilized on a substrate to analyze a biopolymer such as a captured protein by mass spectrometry. Therefore, the present invention provides a high sensitivity and high sensitivity in a biopolymer analysis method using a molecular recognition substrate that can be used for functional analysis of biopolymers such as proteins, sugars, and lipids. It is an object of the present invention to provide a method capable of easily performing biopolymer analysis based on accurate mass spectrometry and a substrate usable for the method.
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］試料中の生体高分子を分析する方法であって、（１）標的生体高分子認識部位を有し、かつ窒素を含有しない人工高分子を備える生体高分子認識基板を試料と接触させる工程と、（２）試料と接触後の基板を質量分析に供し、前記人工高分子に選択的に結合した生体高分子の質量分析を行う工程と、を包含することを特徴とする生体高分子分析方法。
［２］生体高分子がタンパク質である前記［１］に記載の生体高分子分析方法。
［３］人工高分子が、架橋剤に糖誘導体を使用していることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の生体高分子分析方法。
［４］糖誘導体がトレハロース誘導体である前記［３］に記載の生体高分子分析方法。
［５］標的生体高分子認識部位を有し、かつ窒素を含有しない人工高分子を備えることを特徴とする質量分析用生体高分子認識基板。
［６］生体高分子がタンパク質である前記［５］に記載の質量分析用生体高分子認識基板。
［７］人工高分子が、架橋剤に糖誘導体を使用していることを特徴とする前記［５］または［６］に記載の質量分析用生体高分子認識基板。
［８］糖誘導体がトレハロース誘導体である前記［７］に記載の質量分析用生体高分子認識基板。
The present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
[1] A method for analyzing a biopolymer in a sample, wherein (1) a biopolymer recognition substrate having an artificial polymer that has a target biopolymer recognition site and does not contain nitrogen is brought into contact with the sample. And (2) subjecting the substrate after contact with the sample to mass spectrometry, and performing mass spectrometry of the biopolymer selectively bonded to the artificial polymer. Analysis method.
[2] The biopolymer analysis method according to [1], wherein the biopolymer is a protein.
[3] The biopolymer analysis method according to [1] or [2], wherein the artificial polymer uses a sugar derivative as a cross-linking agent.
[4] The biopolymer analysis method according to [3], wherein the sugar derivative is a trehalose derivative.
[5] A biopolymer recognition substrate for mass spectrometry, comprising an artificial polymer having a target biopolymer recognition site and not containing nitrogen.
[6] The biopolymer recognition substrate for mass spectrometry according to [5], wherein the biopolymer is a protein.
[7] The biopolymer recognition substrate for mass spectrometry as described in [5] or [6], wherein the artificial polymer uses a sugar derivative as a crosslinking agent.
[8] The biopolymer recognition substrate for mass spectrometry according to [7], wherein the sugar derivative is a trehalose derivative.
本発明によれば、窒素由来の共雑シグナルが低減された高感度かつ高精度の質量分析に基づく生体高分子分析を簡便に行うことができる。本発明は、プロテオミクス解析に代表される生体高分子機能解析に利用可能な生体高分子分析方法および当該方法に用いる生体高分子認識基板として高い有用性を有する。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the biopolymer analysis based on the highly sensitive and highly accurate mass spectrometry in which the contamination signal derived from nitrogen was reduced can be performed simply. The present invention has high utility as a biopolymer analysis method that can be used for biopolymer function analysis represented by proteomics analysis and a biopolymer recognition substrate used in the method.
〔生体高分子認識基板〕
本発明の質量分析用生体高分子認識基板（以下「本発明の基板」という。）は、標的生体高分子認識部位を有する人工高分子が基板の表面に形成され、かつ、当該人工高分子は窒素を含有しないものである。人工高分子に標的生体高分子が結合または吸着した状態で、基板をそのまま質量分析に供することができるものであることが好ましい。基板表面の人工高分子が窒素を含有しないので、質量分析において窒素由来の共雑シグナルが発生せず、標的生体高分子の高感度かつ高精度な質量分析に用いることができる。特に、窒素含有生体高分子であるタンパク質の分析に用いる基板として非常に有用である。
[Biopolymer recognition substrate]
The biopolymer recognition substrate for mass spectrometry of the present invention (hereinafter referred to as “substrate of the present invention”) has an artificial polymer having a target biopolymer recognition site formed on the surface of the substrate, and the artificial polymer is It does not contain nitrogen. It is preferable that the substrate can be directly subjected to mass spectrometry in a state where the target biopolymer is bound or adsorbed to the artificial polymer. Since the artificial polymer on the surface of the substrate does not contain nitrogen, a crowding signal derived from nitrogen does not occur in mass spectrometry, and can be used for highly sensitive and highly accurate mass spectrometry of the target biopolymer. In particular, it is very useful as a substrate used for analyzing proteins that are nitrogen-containing biopolymers.
本発明の基板に用いられる基板は、その表面に標的生体高分子認識部位を有する人工高分子（以下「分子インプリントポリマー」という。）を形成できるものであれば特に限定されない。具体的には、金属基板、ガラス基板、シリコン基板、窒化シリコン基板、金属酸化物基板、人工高分子基板、天然高分子基板などが挙げられる。好ましくは、ガラス基板、シリコン基板である。 The substrate used in the substrate of the present invention is not particularly limited as long as it can form an artificial polymer having a target biopolymer recognition site on its surface (hereinafter referred to as “molecularly imprinted polymer”). Specific examples include a metal substrate, a glass substrate, a silicon substrate, a silicon nitride substrate, a metal oxide substrate, an artificial polymer substrate, and a natural polymer substrate. A glass substrate and a silicon substrate are preferable.
基板表面に形成される分子インプリントポリマーは、窒素を含有しないものであればよい。窒素を含有しない分子インプリントポリマーは、窒素を含有しない原料（鋳型分子を除く）を用いて合成することが好ましい。
分子インプリントポリマーは、重合反応時に鋳型分子に対して相補的に相互作用する分子認識部位を、ポリマー合成と同時に構築することにより合成することができる。より詳細には、まず、標的分子あるいはその誘導体や類似化合物と結合可能な官能基および重合可能な官能基を併せ持つ機能性モノマーを標的分子と結合させて、標的分子／機能性モノマー複合体を形成させる。なお、この複合体を形成するための結合は、切断可能であれば共有結合でも非共有結合でもかまわない。次に、この標的分子／機能性モノマー複合体に架橋剤および重合開始剤を加え、重合反応を行なう。これにより鋳型分子の形状ならびに相互作用点の配置を記憶した有機高分子が得られる。最後に、得られた高分子より鋳型分子を切断除去することにより、鋳型分子と基質特異的に相互作用する分子認識部位を有する高分子（分子インプリントポリマー）が得られる。なお、分子インプリントポリマーの合成方法については、例えば、参考文献「Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H. "Molecular Imprinting", WILEY-VCH, Weinheim, 2002.」の記載を参照すればよい。
The molecular imprint polymer formed on the substrate surface only needs to contain no nitrogen. The molecularly imprinted polymer not containing nitrogen is preferably synthesized using a raw material not containing nitrogen (excluding template molecules).
The molecularly imprinted polymer can be synthesized by constructing a molecular recognition site that interacts complementarily with the template molecule during the polymerization reaction simultaneously with the polymer synthesis. More specifically, first, a functional monomer having both a functional group capable of binding to the target molecule or its derivative or similar compound and a polymerizable functional group is bound to the target molecule to form a target molecule / functional monomer complex. Let The bond for forming this complex may be a covalent bond or a non-covalent bond as long as it can be cleaved. Next, a crosslinking agent and a polymerization initiator are added to the target molecule / functional monomer complex, and a polymerization reaction is performed. Thereby, an organic polymer in which the shape of the template molecule and the arrangement of the interaction points are stored is obtained. Finally, a template molecule is cleaved and removed from the obtained polymer to obtain a polymer (molecular imprint polymer) having a molecular recognition site that interacts with the template molecule in a substrate-specific manner. For the method of synthesizing the molecularly imprinted polymer, for example, the reference “Komiyama, M., Takeuchi, T., Mukawa, T., Asanuma, H.“ Molecular Imprinting ”, WILEY-VCH, Weinheim, 2002.” Please refer to the description.
本発明の基板における分子インプリントポリマーは、架橋剤に糖誘導体を使用して合成することが好ましい。糖誘導体の架橋剤は親水性であるため、得られる分子インプリントポリマーと生体高分子との疎水性相互作用による非特異的吸着を抑制することができる。糖誘導体の糖としては、キシロース、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖、スクロース、マルトース、ラクトース、セルビオース、トレハロース等の二糖、ラフィノース、マルトトリオース等の三糖、アカルボース、スタキオース等の四糖、その他のオリゴ糖などが挙げられる。好ましくは二糖、三糖および四糖であり、より好ましくは二糖であり、特に好ましくはトレハロースである。糖誘導体としては、重合可能な官能基で窒素を含まないものがエステル結合やエーテル結合で連結してあるものが好ましい。具体的には、糖のジアクリル酸エステル誘導体、ジメタクリル酸エステル誘導体、ジアリルエーテル誘導体などが挙げられる。 The molecular imprint polymer in the substrate of the present invention is preferably synthesized using a sugar derivative as a cross-linking agent. Since the cross-linking agent of the sugar derivative is hydrophilic, nonspecific adsorption due to hydrophobic interaction between the obtained molecular imprint polymer and the biopolymer can be suppressed. The sugars of the sugar derivatives include monosaccharides such as xylose, ribose, glucose, mannose, galactose, and fructose, disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose and trehalose, trisaccharides such as raffinose and maltotriose, acarbose, stachyose And other oligosaccharides. Preferred are disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides, more preferred are disaccharides, and particularly preferred is trehalose. The sugar derivative is preferably a polymerizable functional group which does not contain nitrogen and is linked by an ester bond or an ether bond. Specific examples include sugar diacrylate derivatives, dimethacrylate derivatives, diallyl ether derivatives, and the like.
本発明の基板において、異なる生体高分子を標的とする複数種類の分子インプリントポリマーを基板表面に配置したアレイ状の基板としてもよい。アレイ状の基板とすることで、多数の標的生体高分子を同一の基板で分析可能となり、生体試料の網羅的な解析（例えば、プロテオーム解析、メタボローム解析等）に好適に用いることができる。 The substrate of the present invention may be an array substrate in which a plurality of types of molecularly imprinted polymers targeting different biopolymers are arranged on the substrate surface. By using an array substrate, a large number of target biopolymers can be analyzed on the same substrate, and can be suitably used for comprehensive analysis of biological samples (for example, proteome analysis, metabolomic analysis, etc.).
〔生体高分子分析方法〕
本発明の生体高分子分析方法（以下「本発明の方法」という。）は、試料中の生体高分子を分析する方法であり、以下の（１）および（２）の工程を少なくとも包含するものであればよい。
（１）標的生体高分子認識部位を有し、かつ窒素を含有しない人工高分子を備える生体高分子認識基板を試料と接触させる工程
（２）試料と接触後の基板を質量分析に供し、前記人工高分子に選択的に結合した生体高分子の質量分析を行う工程
本発明の方法により、試料中の標的生体高分子を高感度かつ高精度に検出および定量することができる。
(Biopolymer analysis method)
The biopolymer analysis method of the present invention (hereinafter referred to as “method of the present invention”) is a method of analyzing a biopolymer in a sample, and includes at least the following steps (1) and (2). If it is.
(1) A step of bringing a biopolymer recognition substrate having a target biopolymer recognition site and an artificial polymer not containing nitrogen into contact with the sample (2) subjecting the sample and the contacted substrate to mass spectrometry, Step of performing mass spectrometry of biopolymer selectively bonded to artificial polymer By the method of the present invention, the target biopolymer in the sample can be detected and quantified with high sensitivity and high accuracy.
工程（１）における標的生体高分子認識部位を有し、かつ窒素を含有しない人工高分子を備える生体高分子認識基板として、上記本発明の基板を好適に用いることができる。
生体高分子を含む試料は特に限定されない。例えば、動物、植物、微生物等の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、透析排液などを挙げることができる。なお、試料は標的分子を含み得るものであればよい。
基板を試料と接触させた後に、基板を洗浄することが好ましい。基板を洗浄することにより、非特異的な相互作用の影響を減少させることができる。
The substrate of the present invention can be suitably used as a biopolymer recognition substrate having an artificial polymer that has a target biopolymer recognition site and does not contain nitrogen in step (1).
The sample containing a biopolymer is not particularly limited. For example, biological components such as animals, plants, and microorganisms can be suitably used. Examples of samples derived from animals including humans include body fluids such as blood, tissue fluid, lymph fluid, cerebrospinal fluid, pus, mucus, nasal discharge, sputum, urine, feces, ascites, skin, lung, kidney, mucous membrane, various organs, Examples thereof include a washing solution after washing tissue such as bone, nasal cavity, bronchi, skin, various organs, bone, and the like, and dialysis drainage. In addition, the sample should just contain a target molecule.
It is preferable to clean the substrate after contacting the substrate with the sample. By washing the substrate, the influence of non-specific interactions can be reduced.
試料に標的生体高分子が含まれていれば基板表面の分子インプリントポリマーに特異的に吸着するので、工程（２）では、基板表面に標的生体高分子が吸着した状態のままで、基板を質量分析に供試する。すなわち、基板表面に標的生体高分子が吸着した状態の基板を質量分析のサンプルとして質量分析を行う。基板に形成された分子インプリントポリマーは窒素を含有せず、質量分析において窒素由来の共雑シグナルが発生しないので、基板から標的生体高分子を分離しなくても、標的生体高分子の高感度かつ高精度な質量分析を行うことができる。特に、窒素含有生体高分子であるタンパク質の分析に用いる方法として非常に有用である。また、基板から標的生体高分子を分離してから質量分析に供することを要しないため、標的生体高分子を分離するための煩雑な工程を省略することができる点で、簡便であり、低コストである。 If the target biopolymer is contained in the sample, it is specifically adsorbed to the molecular imprint polymer on the substrate surface. Therefore, in the step (2), the target biopolymer is adsorbed on the substrate surface. Test for mass spectrometry. That is, mass analysis is performed using a substrate in a state where the target biopolymer is adsorbed on the substrate surface as a sample for mass analysis. The molecularly imprinted polymer formed on the substrate does not contain nitrogen and does not generate nitrogen-derived confusion signals in mass spectrometry, so the target biopolymer is highly sensitive without separating the target biopolymer from the substrate. In addition, highly accurate mass spectrometry can be performed. In particular, it is very useful as a method for analyzing proteins that are nitrogen-containing biopolymers. In addition, since it is not necessary to separate the target biopolymer from the substrate and then subjected to mass spectrometry, it is simple and low-cost in that a complicated process for separating the target biopolymer can be omitted. It is.
質量分析法は特に限定されず、どのようなタイプの質量分析計を用いてもよい。試料のイオン化法としては、例えばマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化(ＡＰＣＩ)法、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）法、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、最近開発された大気圧直接イオン化法であるＤＡＲＴＴＭ法などが挙げられる。分析部は、例えば磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などが挙げられる。
本発明の方法は、市販の質量分析計用いて好適に行うことができる。質量分析計の操作方法は、その取り扱い説明書に従えばよい。
The mass spectrometry method is not particularly limited, and any type of mass spectrometer may be used. Sample ionization methods include, for example, matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), atmospheric pressure photoionization (APPI). ) Method, electron ionization (EI) method, chemical ionization (CI) method, DART TM method which is a recently developed atmospheric pressure direct ionization method, and the like. Examples of the analysis unit include a magnetic field deflection type, a quadrupole type, an ion trap type, a time-of-flight type, and a Fourier transform ion cyclotron resonance type.
The method of the present invention can be suitably performed using a commercially available mass spectrometer. The operation method of the mass spectrometer may follow the instruction manual.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these.
〔実施例１〕
〔１〕水溶性架橋剤 6,6’-diacryloyl-trehalose (DAT) の合成
（１）Octa(trimethlsilyl)trehalose（化合物I）の合成
準備として、トレハロース２水和物を凍結乾燥した。また、ピリジン300 mlに水素化カルシウムを加え、一晩撹拌し予備乾燥を行なった。その後蒸留し、純粋なドライ−ピリジンを得た。
[Example 1]
[1] Synthesis of water-soluble crosslinking agent 6,6′-diacryloyl-trehalose (DAT) (1) Synthesis of Octa (trimethlsilyl) trehalose (Compound I) Trehalose dihydrate was freeze-dried as preparation. In addition, calcium hydride was added to 300 ml of pyridine and stirred overnight to perform preliminary drying. Distillation then gave pure dry pyridine.
以下のスキーム１に従って化合物Ｉを合成した。すなわち、Trehalose 5 g (14.61 mmol) をpyridine 80 ml に溶解させた。氷冷下で攪拌しながらtrimethylchlorosilane 37.5 ml (292 mmol)を滴下した。３０分間氷冷下で攪拌し、２時間室温で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒：塩化メチレン、検出：アニスアルデヒド）で原料（Rf=0.00）の消失および目的物と思われるスポット（Rf=0.81）の出現を確認したため、反応を停止するために、純水25 mlを氷水下で滴下し、１時間攪拌した。得られた溶液をジエチルエーテルと純水により抽出し、希塩酸を少しづつ加えエーテル層内のpyridineを除去した。pyridineの有無はＴＬＣ（原点付近に広がる）で確認した。得られたエーテル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を除去すると無色透明のオイル状の物質が得られ、これを真空乾燥させると半透明の結晶が得られた。
1H-NMR(solvent: CDCl3):δ=4.77-4.76[d,2H,H-1,1’], 3.77-3.22[m,12H], 0.19-0.00[t,72H,Si-(CH3)3]
MALDI-TOF-MS(CHCA):分子量 Mw=918.81に対して、m/z=941.86 [M+Na+]に化合物Iを確認した。収量：11.13(12.11 mmol)、収率: 82.95%
Compound I was synthesized according to Scheme 1 below. That is, Trehalose 5 g (14.61 mmol) was dissolved in 80 ml of pyridine. While stirring under ice cooling, 37.5 ml (292 mmol) of trimethylchlorosilane was added dropwise. The mixture was stirred for 30 minutes under ice cooling and allowed to react at room temperature for 2 hours. In TLC (developing solvent: methylene chloride, detection: anisaldehyde), the disappearance of the raw material (Rf = 0.00) and the appearance of a spot (Rf = 0.81) that seemed to be the target were confirmed. ml was added dropwise under ice water and stirred for 1 hour. The obtained solution was extracted with diethyl ether and pure water, diluted hydrochloric acid was added little by little to remove pyridine in the ether layer. The presence or absence of pyridine was confirmed by TLC (spreading around the origin). The obtained ether solution was dried over magnesium sulfate, and then the solvent was removed to obtain a colorless and transparent oily substance, which was dried in vacuo to obtain translucent crystals.
1 H-NMR (solvent: CDCl 3 ): δ = 4.77-4.76 [d, 2H, H-1,1 '], 3.77-3.22 [m, 12H], 0.19-0.00 [t, 72H, Si- (CH 3 ) 3 ]
MALDI-TOF-MS (CHCA): Compound I was confirmed at m / z = 941.86 [M + Na + ] against molecular weight Mw = 918.81. Yield: 11.13 (12.11 mmol), Yield: 82.95%
（２）Hexa(trumethylsilyl)trehalose（化合物II）の合成
以下のスキーム２に従って化合物IIを合成した。すなわち、化合物I 11.13 g (12.11 mmol)を30 mlのメタノールに溶解させた。氷冷下で炭酸カリウム250 mg (1.81 mmol)を加え、３時間反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒：塩化メチレン）で原料のスポット（Rf=0.81）の消失および目的物（Rf=0.22）と思われるスポットの出現を確認したため反応を終了した。氷冷下で希塩酸を溶液のpHが中性になるまで加えた。溶媒を減圧留去させると、白色固体が得られた。これを塩化メチレンに溶解させ、飽和食塩水で抽出した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。これを真空乾燥させると白色固体が得られた。
1H-NMR(300 MHz CDCl3):δ=4.908-4.898[d,2H,H-1,1’], 3.924-3.3.402[m,12H], 1.721[t,2H OH], 0.173-0.00[t,54H H,Si-(CH3)3]
MALDI-TOF-MS(CHCA):分子量 Mw=774.35に対して、m/z=792.47[M+Na+]に目的物IIを確認した。粗収量: 7.02(9.06 mmol)、粗収率: 74.81%
(2) Synthesis of Hexa (trumethylsilyl) trehalose (Compound II) Compound II was synthesized according to the following scheme 2. That is, 11.13 g (12.11 mmol) of Compound I was dissolved in 30 ml of methanol. Under ice cooling, 250 mg (1.81 mmol) of potassium carbonate was added and reacted for 3 hours. The reaction was terminated because TLC (developing solvent: methylene chloride) confirmed the disappearance of the spot (Rf = 0.81) of the raw material and the appearance of the spot considered to be the target product (Rf = 0.22). Dilute hydrochloric acid was added under ice cooling until the pH of the solution became neutral. When the solvent was distilled off under reduced pressure, a white solid was obtained. This was dissolved in methylene chloride and extracted with saturated brine. The organic layer was collected and dried over magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. This was vacuum dried to obtain a white solid.
1 H-NMR (300 MHz CDCl 3 ): δ = 4.908-4.898 [d, 2H, H-1,1 '], 3.924-3.3.402 [m, 12H], 1.721 [t, 2H OH], 0.173- 0.00 [t, 54H H, Si- (CH 3 ) 3 ]
MALDI-TOF-MS (CHCA): The target product II was confirmed at m / z = 792.47 [M + Na + ] with respect to the molecular weight Mw = 774.35. Crude yield: 7.02 (9.06 mmol), crude yield: 74.81%
（３）6-6’-diacrylhexa(trimethlsilyl)trehalose（化合物III）の合成
以下のスキーム３に従って化合物IIIを合成した。すなわち、化合物II 7.02 g (9.06 mmol)を窒素雰囲気下でＴＨＦ(80 ml)に溶解させ、氷冷下でトリエチルアミン 4.3 ml (30 mmol)をシリンジで加えた。アクリロイルクロライド 2.58 ml (30 mmol)をTHF 10 mlに混合した後、シリンジでゆっくり加えた。４時間攪拌し反応させた後、ＴＬＣ（展開溶媒：塩化メチレン）にて原料スポット（Rf=0.22）の消失および目的物（Rf=0.49）と思われるスポットを確認したため反応を停止した。濾過した。得られた黄色の液体を減圧留去し黄色の固体を得た。これをジクロロメタンと飽和食塩水で抽出した。これをカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル：ヘキサン＝１：７)で精製し、白色固体を得た。
1H-NMR(300MHz CDCl3):δ=6.476-5.838[m,6H,-CH=CH2’], 4.947-4.936[d,2H,H-1,1’], 4.330-3.482[m,12H] 0.159-0.000[t,54H H,Si-(CH3)3]
MALDI-TOF-MS(CHCA):分子量Mw=883.02に対して、m/z=905.86[M+Na+]に目的物IIIを確認した。粗収量: 4.03 g(4.57 mmol)、粗収率: 65.01%
(3) Synthesis of 6-6′-diacrylhexa (trimethlsilyl) trehalose (Compound III) Compound III was synthesized according to the following scheme 3. That is, Compound II 7.02 g (9.06 mmol) was dissolved in THF (80 ml) under a nitrogen atmosphere, and triethylamine 4.3 ml (30 mmol) was added with a syringe under ice cooling. Acryloyl chloride (2.58 ml, 30 mmol) was mixed with THF (10 ml), and then slowly added with a syringe. After reacting by stirring for 4 hours, the disappearance of the raw material spot (Rf = 0.22) and the spot considered to be the target product (Rf = 0.49) were confirmed by TLC (developing solvent: methylene chloride), and the reaction was stopped. Filtered. The obtained yellow liquid was distilled off under reduced pressure to obtain a yellow solid. This was extracted with dichloromethane and saturated brine. This was purified by column chromatography (developing solvent; ethyl acetate: hexane = 1: 7) to obtain a white solid.
1 H-NMR (300 MHz CDCl 3 ): δ = 6.476-5.838 [m, 6H, -CH = CH2 '], 4.947-4.936 [d, 2H, H-1,1'], 4.330-3.482 [m, 12H ] 0.159-0.000 [t, 54H H, Si- (CH 3 ) 3 ]
MALDI-TOF-MS (CHCA): The target product III was confirmed at m / z = 905.86 [M + Na + ] with respect to the molecular weight Mw = 883.02. Crude yield: 4.03 g (4.57 mmol), crude yield: 65.01%
（４）6,6’-diacryloyl-trehalose (DAT) の合成
以下のスキーム４に従ってＤＡＴ（目的物）を合成した。すなわち、化合物III 4.03 g (4.57 mmol)をメタノール 150 mlに溶解させ、水 10 mlおよび酢酸 4 mlを氷水下で滴下し攪拌した。ＴＬＣで原料のスポット（Rf=0.49）の消失、および原点に目的物と思われるスポットを確認したため、反応を終了した。溶媒を減圧留去および真空乾燥によって除去したところ白色固体を得た。
1H-NMR (solvent:D2O):δ=6.476-5.838[m,6H,-CH=CH2], 4.947-4.936[d,2H,H-1,1’], 4.330-3.482[b,-OH]
MALDI-TOF-MS(CHCA):分子量Mw=450.14に対して、m/z=473.70[M+Na+]に目的物(DAT)を確認した。収量: 1.89 g(4.20 mmol)、収率: 91.92％、原料からの最終的な収率は34.68％
(4) Synthesis of 6,6′-diacryloyl-trehalose (DAT) DAT (target product) was synthesized according to the following scheme 4. That is, 4.03 g (4.57 mmol) of Compound III was dissolved in 150 ml of methanol, and 10 ml of water and 4 ml of acetic acid were added dropwise under ice water and stirred. Since the disappearance of the spot (Rf = 0.49) of the raw material and the spot considered to be the target substance at the origin were confirmed by TLC, the reaction was terminated. The solvent was removed by distillation under reduced pressure and vacuum drying to obtain a white solid.
1 H-NMR (solvent: D 2 O): δ = 6.476-5.838 [m, 6H, -CH = CH2], 4.947-4.936 [d, 2H, H-1,1 '], 4.330-3.482 [b, -OH]
MALDI-TOF-MS (CHCA): The target product (DAT) was confirmed at m / z = 473.70 [M + Na +] against a molecular weight Mw = 450.14. Yield: 1.89 g (4.20 mmol), Yield: 91.92%, final yield from raw material 34.68%
〔２〕MALDI-TOF-MS測定用分子インプリントポリマー薄膜基板の作製
（１）基板への重合開始剤（V-50）の導入
ガラス基板（MATSUNAMI, micro cover glass (9.7×11.7 mm)）表面に金蒸着した金基板を自製した。金基板をＵＶ−Ｏ３で30分間処理した。この基板を5 mM 11-mercapto undecanoic acid EtOH溶液に浸し、１時間冷蔵庫内(4℃)に静置し、ＳＡＭ膜修飾を行った。ＳＡＭ膜修飾を行った基盤をEtOHで洗浄し、真空乾燥した。次に、基板を 0.1 M WSC(含 0.2 M NHS) EtOH溶液に浸し、１時間室温にて静置し、ＳＡＭ末端のカルボキシル基の活性化を行った。静置後取り出し、EtOHにて洗浄後、真空乾燥した。続いて、基板を10 mM V-50 MeOH溶液に浸し、１時間室温にて静置し、重合開始剤の導入を行った。開始剤を導入した基板をMeOHにて洗浄した後真空乾燥した。
[2] Preparation of molecularly imprinted polymer thin film substrate for MALDI-TOF-MS measurement (1) Introduction of polymerization initiator (V-50) to substrate Glass substrate (MATSUNAMI, micro cover glass (9.7 × 11.7 mm)) surface A gold substrate on which gold was deposited was manufactured by itself. The gold substrate was treated with UV-O 3 for 30 minutes. This substrate was immersed in a 5 mM 11-mercapto undecanoic acid EtOH solution and left in a refrigerator (4 ° C.) for 1 hour to modify the SAM film. The substrate subjected to the SAM film modification was washed with EtOH and vacuum-dried. Next, the substrate was immersed in a 0.1 M WSC (containing 0.2 M NHS) EtOH solution and allowed to stand at room temperature for 1 hour to activate the carboxyl group at the SAM end. It was taken out after standing, washed with EtOH, and then vacuum-dried. Subsequently, the substrate was immersed in a 10 mM V-50 MeOH solution and allowed to stand at room temperature for 1 hour to introduce a polymerization initiator. The substrate into which the initiator was introduced was washed with MeOH and then vacuum-dried.
（２）ポリマー薄膜基板の作製
上記基板表面に、リゾチーム認識部位を有する分子インプリントポリマー薄膜（DATlys-MIP）、シトクロムＣ認識部位を有する分子インプリントポリマー薄膜（DATcyt-MIP）、またはタンパク質認識部位を有しないコントロール薄膜（DAT-NIP）をそれぞれ形成し、ポリマー薄膜基板を作製した。すなわち。表１のレシピに従って、各ポリマー溶液を調製し、重合開始剤を導入した基板をポリマー溶液に浸し、恒温槽にて６０℃、６時間重合を行った。分子インプリントポリマーからのタンパク質の洗浄は、ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、塩化ナトリウム水溶液、純水により行った。
以下、それぞれ「DATlys-MIP基板」、「DATcyt-MIP基板」、「DAT-NIP」基板と称する。
(2) Production of polymer thin film substrate On the surface of the substrate, a molecular imprinted polymer thin film (DATlys-MIP) having a lysozyme recognition site, a molecular imprinted polymer thin film (DATcyt-MIP) having a cytochrome C recognition site, or a protein recognition site Each of the control thin films (DAT-NIP) not having a polymer was formed to produce a polymer thin film substrate. That is. According to the recipe of Table 1, each polymer solution was prepared, the board | substrate which introduce | transduced the polymerization initiator was immersed in the polymer solution, and superposition | polymerization was performed at 60 degreeC for 6 hours in the thermostat. Protein washing from the molecularly imprinted polymer was performed with a sodium dodecyl sulfate aqueous solution, a sodium chloride aqueous solution, and pure water.
Hereinafter, they are referred to as “DATlys-MIP substrate”, “DATcyt-MIP substrate”, and “DAT-NIP” substrate, respectively.
〔３〕表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用分子インプリントポリマー薄膜基板の作製
比較のために、ＳＰＲ用の金基板表面に、リゾチーム認識部位を有する分子インプリントポリマー薄膜（DATlys-MIP）またはタンパク質認識部位を有しないコントロール薄膜（DAT-NIP）を有するＳＰＲ基板を作製した。ＳＰＲ用の金基板を用いた以外は、上記〔２〕と同様の方法で作製した。
[3] Preparation of molecularly imprinted polymer thin film substrate for surface plasmon resonance (SPR) measurement For comparison, a molecularly imprinted polymer thin film (DATlys-MIP) or protein recognition having a lysozyme recognition site on the surface of a gold substrate for SPR An SPR substrate having a control thin film (DAT-NIP) having no site was prepared. It was produced by the same method as in [2] except that a gold substrate for SPR was used.
〔４〕DATlys-MIP基板による吸着タンパク質の質量分析
DATlys-MIP基板およびDAT-NIP基板を、リゾチーム、ミオグロビン、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を各１μＭに調整した混合タンパク質溶液に１時間浸透させ、ポリマー薄膜にタンパク質を吸着させた。Tris-HCl buffer（pH7.4）で基板を洗浄した後、または基板を洗浄せずに、マトリックス溶液（10 mMシナピン酸、0.1％TFA、アセトニトリル50％、水50％）を添加し真空乾燥させ、基板をMALDI-TOF-MS測定の基板専用のプレートであるSAMPLE PLATE BIACORE上にカーボンテープにて固定し、MALDI-TOF-MSにて測定した。MALDI-TOF-MSの測定条件を表２に示した。
[4] Mass spectrometry of adsorbed protein using DATlys-MIP substrate
The DATlys-MIP substrate and the DAT-NIP substrate were infiltrated into a mixed protein solution in which lysozyme, myoglobin, and HSA (human serum albumin) were adjusted to 1 μM each for 1 hour to adsorb the protein to the polymer thin film. After washing the substrate with Tris-HCl buffer (pH 7.4) or without washing the substrate, add matrix solution (10 mM sinapinic acid, 0.1% TFA, 50% acetonitrile, 50% water) and vacuum dry. The substrate was fixed on a SAMPLE PLATE BIACORE, which is a plate dedicated to the substrate for MALDI-TOF-MS measurement, with carbon tape, and measured by MALDI-TOF-MS. Table 2 shows the measurement conditions of MALDI-TOF-MS.
図１にDATlys-MIP基板洗浄前のMALDI-TOF-MS測定結果を示し、図２にDATlys-MIP基板洗浄後のMALDI-TOF-MS測定結果を示した。洗浄前の図１には、リゾチーム（Mw:14300）およびミオグロビン（Mw:17500）のピークが認められたが、洗浄後の図２には、リゾチーム（Mw:14300）のピークのみが認められた。この結果から、DATlys-MIP薄膜にリゾチームが特異的に吸着していることが明らかとなった。 FIG. 1 shows the MALDI-TOF-MS measurement results before DATlys-MIP substrate cleaning, and FIG. 2 shows the MALDI-TOF-MS measurement results after DATlys-MIP substrate cleaning. In FIG. 1 before washing, peaks of lysozyme (Mw: 14300) and myoglobin (Mw: 17500) were observed, but in FIG. 2 after washing, only a peak of lysozyme (Mw: 14300) was observed. . From this result, it was revealed that lysozyme was adsorbed specifically to the DATlys-MIP thin film.
DATlys-MIP基板およびDAT-NIP基板におけるリゾチームのピーク強度を比較した結果を図３に示した。ピーク強度は、測定結果からマトリックスであるシナピン酸由来の分子量ピーク（225）の強度に対する測定サンプルの分子量ピーク（14kDa）の強度の比を取り、それを異なる測定箇所約７点からの強度比を平均化したものである。図３から明らかなように、リゾチームのピーク強度はDATlys-MIP基板の方が大きかった。この結果から、マトリックスのピークと強度比をとることにより、DATlys-MIP薄膜に特異的に吸着したリゾチームを質量分析により定量できることが示された。 FIG. 3 shows the result of comparing the peak intensity of lysozyme on the DATlys-MIP substrate and the DAT-NIP substrate. The peak intensity is the ratio of the intensity of the molecular weight peak (14 kDa) of the measurement sample to the intensity of the molecular weight peak (225) derived from sinapinic acid, which is the matrix, and the intensity ratio from about 7 different measurement points. Averaged. As is clear from FIG. 3, the lysozyme peak intensity was higher for the DATlys-MIP substrate. From this result, it was shown that lysozyme adsorbed specifically on the DATlys-MIP thin film can be quantified by mass spectrometry by taking the intensity ratio of the matrix peak.
ＳＰＲ用のDATlys-MIP基板およびDAT-NIP基板をそれぞれ用い、BIACORE 3000にてリゾチーム、ミオグロビン、ＨＳＡを各１μＭに調整した混合タンパク質溶液に対するＳＰＲを測定した。測定条件を表３に示した。 Using a DATlys-MIP substrate and a DAT-NIP substrate for SPR, the SPR for the mixed protein solution in which lysozyme, myoglobin, and HSA were adjusted to 1 μM each was measured with BIACORE 3000. Table 3 shows the measurement conditions.
図４にDATlys-MIP基板およびDAT-NIP基板におけるピーク波長のシフト値（ΔＲＵ）を比較した結果を示した。図４から明らかなように、ΔＲＵ値はDATlys-MIP基板のほうが大きかった。図３に示したMALDI-TOF-MS測定結果と図４に示したＳＰＲの結果が同様であったことから、分子インプリントポリマーと質量分析の組み合わせによるタンパク質分析が実用可能であることが示された。 FIG. 4 shows a result of comparison of peak wavelength shift values (ΔRU) between the DATlys-MIP substrate and the DAT-NIP substrate. As apparent from FIG. 4, the ΔRU value was larger for the DATlys-MIP substrate. The MALDI-TOF-MS measurement results shown in FIG. 3 and the SPR results shown in FIG. 4 were similar, indicating that protein analysis using a combination of molecularly imprinted polymer and mass spectrometry is practical. It was.
〔５〕DATcyt-MIP基板による吸着タンパク質の質量分析
DATcyt-MIP基板およびDAT-NIP基板を、シトクロムＣ、ミオグロビン、ＨＳＡを各１μＭに調整した混合タンパク質溶液に１時間浸透させ、ポリマー薄膜にタンパク質を吸着させた。Tris-HCl buffer（pH7.4）で基板を洗浄した後、マトリックス溶液（10 mMシナピン酸、0.1％TFA、アセトニトリル50％、水50％）を添加し真空乾燥させ、基板をMALDI-TOF-MS測定の基板専用のプレートであるSAMPLE PLATE BIACORE上にカーボンテープにて固定し、MALDI-TOF-MSにて測定した。MALDI-TOF-MSの測定条件は表２のとおりである。
[5] Mass spectrometry of adsorbed protein using DATcyt-MIP substrate
The DATcyt-MIP substrate and the DAT-NIP substrate were infiltrated into a mixed protein solution in which cytochrome C, myoglobin, and HSA were adjusted to 1 μM each for 1 hour to adsorb the protein to the polymer thin film. After washing the substrate with Tris-HCl buffer (pH 7.4), a matrix solution (10 mM sinapinic acid, 0.1% TFA, acetonitrile 50%, water 50%) is added and vacuum dried, and the substrate is MALDI-TOF-MS. The sample was fixed on SAMPLE PLATE BIACORE, a plate dedicated to the substrate for measurement, with carbon tape and measured with MALDI-TOF-MS. Table 2 shows the measurement conditions of MALDI-TOF-MS.
DATcyt-MIP基板およびDAT-NIP基板におけるシトクロムＣのピーク強度を比較した結果を図５に示した。図５から明らかなように、DATcyt-MIP薄膜はリゾチームを特異的に吸着していることが示された。
以上の結果から、鋳型タンパク質を変更することにより、種々のタンパク質を分子インプリントポリマーに特異的に吸着させ、質量分析によりタンパク質分析を行うことが可能であることが示された。
FIG. 5 shows the result of comparing the peak intensities of cytochrome C on the DATcyt-MIP substrate and the DAT-NIP substrate. As is apparent from FIG. 5, it was shown that the DATcyt-MIP thin film specifically adsorbs lysozyme.
From the above results, it was shown that by changing the template protein, various proteins can be specifically adsorbed on the molecularly imprinted polymer, and protein analysis can be performed by mass spectrometry.
〔６〕架橋剤の比較
架橋剤にメチレンビスアクリルアミド（MBAA）を使用したリゾチーム認識部位を有する分子インプリントポリマー薄膜（MBAAcyt-MIP）基板、およびタンパク質認識部位を有しないコントロール薄膜（MBAA-NIP）基板を作製し、DATcyt-MIP基板およびDAT-NIP基板と比較した。MBAAcyt-MIP基板およびMBAA-NIP基板は、上記〔２〕に記載の基板作製方法において、表１のDATをMBAAに代えて作製した。上記〔５〕に記載と同様に、各基板をリゾチーム、ミオグロビンおよびＨＳＡの混合タンパク質溶液に浸透させ、基板を洗浄後、MALDI-TOF-MSにて測定した。
[6] Comparison of cross-linking agents Molecular imprinted polymer thin film (MBAAcyt-MIP) substrate with lysozyme recognition site using methylenebisacrylamide (MBAA) as cross-linking agent and control thin film without protein recognition site (MBAA-NIP) Substrates were prepared and compared with DATcyt-MIP and DAT-NIP substrates. The MBAAcyt-MIP substrate and the MBAA-NIP substrate were produced by replacing the DAT in Table 1 with MBAA in the substrate production method described in [2] above. As described in [5] above, each substrate was infiltrated into a mixed protein solution of lysozyme, myoglobin and HSA, the substrate was washed, and then measured by MALDI-TOF-MS.
DATlys-MIP基板、DAT-NIP基板、MBAAcyt-MIP基板およびMBAA-NIP基板におけるリゾチームのピーク強度を比較した結果を図６に示した。図６から明らかなように、架橋剤にMBAAを用いた場合、MBAAcyt-MIP基板とMBAA-NIP基板との間に大きな差は認められなかった。一方、DATlys-MIP基板とDAT-NIP基板との間には大きな差が認められた。この結果から、架橋剤にDATを用いたほうが、標的タンパク質の選択性が高いことが示された。これは、DATが親水性架橋剤であるために、タンパク質の疎水性相互作用による非特異的吸着が抑制されたためと考えられた。 FIG. 6 shows the results of comparing the lysozyme peak intensities on the DATlys-MIP substrate, DAT-NIP substrate, MBAAcyt-MIP substrate, and MBAA-NIP substrate. As is clear from FIG. 6, when MBAA was used as the cross-linking agent, no significant difference was observed between the MBAAcyt-MIP substrate and the MBAA-NIP substrate. On the other hand, a large difference was observed between the DATlys-MIP substrate and the DAT-NIP substrate. From this result, it was shown that the selectivity of the target protein is higher when DAT is used as the cross-linking agent. This was thought to be because nonspecific adsorption due to hydrophobic interaction of proteins was suppressed because DAT was a hydrophilic cross-linking agent.
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 The present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications are possible within the scope shown in the claims, and technical means disclosed in different embodiments are appropriately combined. The obtained embodiment is also included in the technical scope of the present invention. Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
Claims (8)
（１）標的生体高分子認識部位を有し、かつ窒素を含有しない人工高分子を備える生体高分子認識基板を試料と接触させる工程と、
（２）試料と接触後の基板を質量分析に供し、前記人工高分子に選択的に結合した生体高分子の質量分析を行う工程と、
を包含することを特徴とする生体高分子分析方法。 A method for analyzing a biopolymer in a sample,
(1) contacting a biopolymer recognition substrate having a target biopolymer recognition site and comprising an artificial polymer not containing nitrogen with a sample;
(2) subjecting the substrate after contact with the sample to mass spectrometry, and performing mass spectrometry of the biopolymer selectively bonded to the artificial polymer;
A biopolymer analysis method comprising:
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