JP2011529683A - Ｍｅｌｋエピトープペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２のアミノ酸配列を有するペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有することが実証された。従って本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。ペプチドは、そのＣＴＬ誘導能が保持される限り、１個、２個、または数個のアミノ酸置換、欠失、挿入、または付加を含み得る。さらに本発明は、これらのペプチドのいずれかを含む、がんの治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤を提供する。本発明の薬剤はワクチンを含む。

Description

本出願は、２００８年８月１日に出願された米国仮特許出願第６１／０８５,６６３号の恩典を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関連する。特に本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関連する。

ＣＤ８陽性ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80（非特許文献１）;Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9（非特許文献２）)。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。

強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床的適用が保証される（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55（非特許文献３）;Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42（非特許文献４）;Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9（非特許文献５）;van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14（非特許文献６）;Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8（非特許文献７）;Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72（非特許文献８）;Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66（非特許文献９）;Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94（非特許文献１０））。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察されていない（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80（非特許文献１１）;Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42（非特許文献１２）;Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15（非特許文献１３））。

最近、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド配列を予測するためのアルゴリズムが開発された(Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190（非特許文献１４）、J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175（非特許文献１５）、protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846（非特許文献１６）)。しかしながら、予測されたエピトープペプチドが標的細胞において自然にプロセシングされ、ＨＬＡ分子と共に標的細胞表面上に発現され得るかどうかを推定することは難しい。さらに、アルゴリズム、例えばＢＩＭＡＳ(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(l):163-75（非特許文献１７）；Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81（非特許文献１８）)が示し得るのは、厳密とは言えないHLA分子結合ペプチドである(Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6（非特許文献１９）)。従って、エピトープペプチドの同定は依然として課題であり、かつ難しい。

ＭＥＬＫ、すなわち母体胚性ロイシンジッパーキナーゼは、哺乳動物胚発生に関与するｓｎｆ１／ＡＭＰＫセリン・スレオニンキナーゼファミリーの新規メンバーとして以前に同定された(Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug 215(4):344-51（非特許文献２０）)。この遺伝子は、幹細胞の再生(Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3):413-27（非特許文献２１）)、細胞周期の進行(Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2):327-38（非特許文献２２）；Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604（非特許文献２３）)、およびmRNA前駆体のスプライシング(Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10):8642-7. Epub 2003 Dec 29（非特許文献２４）)において重要な役割を果たすことが示された。加えて、２３，０４０個の遺伝子を含むゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイル解析を通して、ＭＥＬＫが乳癌において上方制御されることが最近になって示された(Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007; 9 (1):R17（非特許文献２５）、ＷＯ２００６／０１６５２５（特許文献１）、ＷＯ２００８／０２３８４１（特許文献２）)。実際に、ＭＥＬＫは、例えば肺癌細胞、膀胱癌細胞、リンパ腫細胞、および子宮頸癌細胞といったいくつかのがん細胞において上方制御される（ＷＯ２００４／０３１４１３（特許文献３）、ＷＯ２００７／０１３６６５（特許文献４）、および ＷＯ２００６／０８５６８４（特許文献５）を参照されたい；それらの開示は参照により本明細書に組み入れられる）。複数のヒト組織およびがん細胞株でのノーザンブロット解析から、ＭＥＬＫは大部分の乳癌および乳癌細胞株において有意に高レベルで過剰発現するが、正常な重要臓器（心臓、肝臓、肺、および腎臓）では発現しないことが実証された（ＷＯ２００６／０１６５２５（特許文献１））。さらに、ｓｉＲＮＡによるＭＥＬＫ発現の抑制が、ヒト乳癌細胞の増殖を有意に阻害することが示された。従って、ＭＥＬＫはがん免疫療法の適切な標的であると考えられ、それに由来するエピトープペプチドは、幅広いがんのタイプの治療において有効ながん免疫療法剤として役立つことが予測され得る。

ＷＯ２００６／０１６５２５ ＷＯ２００８／０２３８４１ ＷＯ２００４／０３１４１３ ＷＯ２００７／０１３６６５ ＷＯ２００６／０８５６８４

Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190 J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175 protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846 Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(l):163-75 Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81 Bachinsky MM, et. al., Cancer Immun. 2005 Mar 22;5:6 Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug 215(4):344-51 Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3):413-27 Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2):327-38 Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604 Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10):8642-7. Epub 2003 Dec 29 Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007; 9 (1):R17

本発明は、免疫療法の適切な標的の発見に一部基づいている。ＴＡＡは通常免疫系により「自己」として認識され、従って生得的な免疫原性がない場合が多いため、適切な標的を発見することは極めて重要である。ＭＥＬＫが、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＣ）のがん組織において上方制御されると明らかになったことを認識して、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４７９１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）の遺伝子によってコードされるこの母体胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）を、さらなる解析のための標的とする。特に、対応する分子に特異的なＣＴＬを誘導するエピトープペプチドを含むＭＥＬＫ遺伝子産物を、研究のために選択した。健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＭＥＬＫ由来のＨＬＡ−Ａ^＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ^＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２陽性標的細胞を特異的に認識するＣＴＬを樹立し、腫瘍細胞の表面上に発現されたＭＥＬＫに対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープペプチドを同定した。これらの結果から、ＭＥＬＫは免疫原性が強く、そのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが実証される。

従って、ＣＴＬ誘導能、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することは、本発明の一つの目的である。加えて、本発明は、改変されたペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、取り込み、および／または付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、または６２のアミノ酸配列を有する改変ペプチドを意図する。

対象に投与した場合、本発明のペプチドは抗原提示細胞の表面上に提示され、その後、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。従って、本発明のペプチドのいずれかを提示する抗原提示細胞、および抗原提示細胞を誘導するための方法を提供することは、本発明の目的である。本発明のＭＥＬＫポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにＭＥＬＫポリペプチドを提示するエキソソームおよび抗原提示細胞の投与によって、抗腫瘍免疫応答が誘導される。従って、前記ポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチド、ならびに前記エキソソームおよび抗原提示細胞をその有効成分として含む薬学的な剤または組成物を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明の薬剤はワクチンとして使用される。

本発明のＭＥＬＫポリペプチド、ＭＥＬＫポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＭＥＬＫポリペプチドを提示するエキソソームもしくは抗原提示細胞、または薬剤を投与する段階を含む、がん（腫瘍）の治療および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（すなわち、ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、ならびに／または術後のその再発の予防のための方法、ならびにＣＴＬを誘導するための方法、腫瘍関連内皮に対する免疫応答および抗腫瘍免疫を誘導するための方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。加えて、本発明のＣＴＬもまた、がんに対するワクチンとして使用される。がんの例には、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣが含まれるが、これらに限定されない。

前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。

本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
図１は、ＭＥＬＫ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真である（ａ）〜（ｉ）を含む。ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）で刺激したウェル番号＃５中のＣＴＬ（ａ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）で刺激したウェル番号＃３中のＣＴＬ（ｂ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で刺激したウェル番号＃４中のＣＴＬ（ｃ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）で刺激したウェル番号＃４中のＣＴＬ（ｄ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）で刺激したウェル番号＃５中のＣＴＬ（ｅ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）で刺激したウェル番号＃３中のＣＴＬ（ｆ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）で刺激したウェル番号＃１中のＣＴＬ（ｇ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）で刺激したウェル番号＃２中のＣＴＬ（ｈ）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）で刺激したウェル番号＃２中のＣＴＬ（ｉ）は、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」はウェル中の標的細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は標的細胞にいずれのペプチドもパルスしていないことを示す。 図２は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（ｂ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３（ｃ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７（ｄ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６（ｆ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ｇ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０（ｈ）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ｉ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフである（ａ）〜（ｉ）を含む。各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。図中、「＋」は標的細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は標的細胞にいずれのペプチドもパルスしていないことを示す。 図３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す。本明細書に示した結果から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンが、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」は標的細胞にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７をパルスしたことを示し、「−」は標的細胞にいずれのペプチドもパルスしていないことを示す。 図４は、ＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）（ａ）またはＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）（ｂ）を用いて樹立されたＣＴＬクローンの特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである（ａ）および（ｂ）から構成される。標的細胞は、ＣＯＳ７細胞にＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子遺伝子の両方の全長をコトランスフェクトすることによって調製し（−黒菱形−）、対照標的細胞は、ＣＯＳ７細胞にＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子遺伝子をトランスフェクトし、ＣＴＬクローンを樹立するのに用いたペプチドとは異なる不適切なペプチドをパルスすることによって（−白三角−）、またはＣＯＳ７細胞にＭＥＬＫ遺伝子をトランスフェクトすることによって（−白丸−）調製した。ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）（ａ）およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）（ｂ）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、対照（−白三角−、−白丸−）と比較して、ＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（−黒菱形−）に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。

態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。

本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先の発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことを承認するものとしては解釈されるべきではない。

矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は単に例示であり、限定することを意図しない。

Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に他に具体的に指示がない限り「少なくとも１つ」を意味する。
意味する。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。

本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。

アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。

「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、これらは、一般に受け入れられている１文字コードにより参照されるアミノ酸と同様である。

特記しない限り、「がん」という用語はＭＥＬＫ遺伝子を過剰発現しているがんを指し、その例には、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌（ＳＣＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

特記しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識すること、およびそのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。

特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。

ＩＩ．ペプチド
ＭＥＬＫ由来のペプチドが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原として機能することを実証するために、ＭＥＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）由来のペプチドを解析して、それらが、通常ＨＬＡ対立遺伝子に見られるＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２拘束性の抗原エピトープであるかどうかを判定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＭＥＬＫ由来のＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドを負荷した樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞のインビトロでの刺激後、以下の各ペプチドを用いてＣＴＬをうまく樹立した：
ＭＥＬＫ− Ａ２４−９−３２６ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、
ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、
ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０− ５３２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、
ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、
ＭＥＬＫ− Ａ０２−９−１９３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、
ＭＥＬＫ− Ａ０２−９−１７１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、
ＭＥＬＫ− Ａ０２−９−７１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、および
ＭＥＬＫ− Ａ０２− ９−５３２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）。
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、ＭＥＬＫがＣＴＬによって認識される抗原であること、および前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２拘束性のＭＥＬＫのエピトープペプチドであり得ることが実証される。

ＭＥＬＫ遺伝子は、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣなどのほとんどのがん組織で過剰発現するため、これは免疫療法のための優れた標的である。従って本発明は、ＣＴＬに認識されるＭＥＬＫのエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。本発明のノナペプチドおよびデカペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。

一般的に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているソフトウェアプログラムなどを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75;およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81に対する参照において記載されているように、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190、Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。従って本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定された、ＨＬＡ抗原と結合するＭＥＬＫのペプチドを包含する。

本発明のノナペプチドおよびデカペプチドには、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドは、典型的には約４０アミノ酸未満であり、約２０アミノ酸未満である場合が多く、通常は約１５アミノ酸未満である。本発明のノナペプチドおよびデカペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド）に隣接する特定のアミノ酸配列は、それが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。従って本発明は、ＣＴＬ誘導能、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドもまた提供する。

一般的に、あるタンパク質中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。従って、１つの態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能、ならびに１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列の双方を有してよい。

当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の改変が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。従って、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質と類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存するのが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。

このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＭＥＬＫの多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。

必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、欠失、付加、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個もしくは３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。

本発明の好ましいペプチドであるＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）の相同性解析から、これらのペプチドが任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが確認された。従って、免疫療法に用いた場合に、これらのペプチドが未知または望ましくない免疫応答を生じさせる可能性が有意に低くなる。従って、これらのペプチドは、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣなどのがん細胞上のＭＥＬＫに対し腫瘍患者において免疫を誘発するのに非常に有用であると予測される。

免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。従って、ＣＴＬを誘導するばかりでなく、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得ることができる。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913;Immunogenetics 1995, 41: 178;J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合を増大させるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい場合がある。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。一方、高いＨＬＡ−Ａ０２結合親和性を有するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリンもしくはロイシンで置換されている。従って、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴＣＲ認識の部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３_{（264-272）}、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ_{（369-377）}、またはｇｐ１００_{（209-217）}など、ペプチド中のアミノ酸置換が元のものと同等であるかまたはより優れたものであり得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。

本発明はまた、記載したペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１個〜２個のアミノ酸の付加を意図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。

しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。従って、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、第一に、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。

上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、指標としての高い結合親和性の存在に従って選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合に、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。

ＣＴＬ誘導能の確認は、ペプチドで刺激することによりヒトＭＨＣ抗原を保有する抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））を誘導し、誘導した抗原提示細胞をＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより達成される。好ましくは、抗原提示細胞はヒト末梢血単核白血球由来のＤＣである。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A^*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を^５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で、ＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。

上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を評価した結果、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有すると予測されたペプチドが、必ずしも高いＣＴＬ誘導能を有するわけではないことが見出された。しかしながら、同定および評価されたペプチドのうち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２の中から選択されたアミノ酸配列を有するノナペプチドまたはデカペプチドは、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが判明した。従って、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例証される。

上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、限定するわけではないが、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれる。前記ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、例えば、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。

例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本ペプチドに適合させることもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。

さらに、本発明のペプチドを、スペーサーまたはリンカーを介して他のペプチドに連結させてもよい。他のペプチドの例には、他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれるが、これに限定されない。あるいは、本発明の２つまたはそれ以上のペプチドを、スペーサーまたはリンカーを介して連結させてもよい。スペーサーまたはリンカーを介して連結させるペプチドは、互いに同じであっても異なってもよい。スペーサーまたはリンカーは具体的に限定されないが、好ましくはペプチド、より好ましくは、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、およびプロテアソームなどの酵素によって切断され得る１つまたは複数の切断部位を有するペプチドである。リンカーまたはスペーサーの例には、ＡＡＹ(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26)、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315)、または１個〜数個のリジン残基(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドは、スペーサーまたはリンカーを介して他のペプチドに連結されたペプチドも包含する。

本発明のペプチドは、ＭＨＣ分子と組み合わされた複合体として、ヒトＭＨＣ抗原を保有する細胞（例えば、抗原提示細胞）またはエキソソームの表面上に存在してもよく、従ってＣＴＬを誘導する。該細胞および該エキソソームは当技術分野で周知の方法によって調製することができ、例えば、本発明のペプチドと接触させることによって該細胞を調製することができ、また、本発明のペプチドと接触させた細胞からエキソソーム含有画分を回収することによって該エキソソームを調製することができる（例えば、公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９を参照されたい）。本発明のペプチドは、ＭＨＣ分子と組み合わされた複合体として細胞またはエキソソームの表面上に存在するペプチドを包含する。

本明細書において、本発明のペプチドは「ＭＥＬＫペプチド」または「ＭＥＬＫポリペプチド」と記載することもできる。

ＩＩＩ．ＭＥＬＫペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離すること、すなわち他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他の任意の化学物質を実質的に含まないように、精製または単離することができる。

選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1975；
（ｉｖ）Basics and Experiment of Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1985；
（ｖ）Development of Pharmaceuticals (second volume) （日本語）, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。

あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を適合させて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に入れて形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を用いて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。

ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然ＭＥＬＫ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_０１４７９１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能性のあるあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。従って、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。

本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。

本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。

組換え技法および化学合成技法の両方を用いて、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311;Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。

本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および該ベクターを有する宿主細胞もまた本発明に含まれる。

Ｖ． エキソソーム
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞をさらに提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いることによって調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。

前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４、特にＨＬＡ−Ａ２４０２がよく見られ、従って日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現しているＡ２４型またはＡ０２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ２４０２またはＡ０２０１などの亜型もまた使用される。典型的には、臨床では、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型があらかじめ調べられ、これにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＭＥＬＫの部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、および／または付加を行うことができる。

Ａ２４型ＨＬＡ抗原を含むエキソソームを用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが有用である。一方、Ａ０２型ＨＬＡ抗原を含むエキソソームを用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択される配列を有するペプチドが好ましい。

ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。本発明のペプチドを接触させることによって、または本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを発現可能な形態で導入することによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。

前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。

例えば、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによってＡＰＣを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。「ＡＰＣを誘導する」という語句は、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を細胞表面上に提示させることを含む。ＡＰＣが本発明のペプチドを提示できるように該ペプチドをＡＰＣに導入した後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は、以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣとペプチドを接触させる段階；および
ｃ：前記ペプチドを負荷したＡＰＣを第２の対象に投与する段階。

第１の対象と第２の対象は同一の個体であってよく、または異なる個体であってもよい。あるいは、本発明に従って、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法または工程は、薬学的に許容される担体と共に本発明のペプチドを混合または製剤化する工程を含む。さらに、本発明はまた、抗原提示細胞を誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階（ｂ）によって得られたＡＰＣを、ワクチンとして対象に投与することができる。

本発明の１つの局面によると、本発明のＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣによるＣＴＬ誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、当分野において従来より実施される様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などを用いることができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7;J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによって処理されて、提示経路を経てペプチドが提示される。

ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボで腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答を増強させるため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。従って本発明はまた、本ペプチドのいずれかよって特異的に誘導または活性化された、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。

そのような細胞傷害性Ｔ細胞は、（１）本発明のペプチドを対象に投与し、次いで対象から細胞傷害性Ｔ細胞を回収すること、または（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、次いで細胞傷害性Ｔ細胞を単離することによって、得ることができる。

本発明のペプチドを提示するＡＰＣによる刺激によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、または例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。言い換えれば、細胞傷害性Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体により、標的細胞の表面上でＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を認識（すなわち、これに結合）し、次いで該標的細胞を攻撃して標的細胞の死を誘導することができる。標的細胞は、ＭＥＬＫを内因的に発現する細胞、またはＭＥＬＫ遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ、本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。

ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、ＭＥＬＫを提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬにおいて発現されるＴＣＲのα鎖およびβ鎖の核酸配列を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。ＴＣＲ誘導体は、標的細胞上に提示されるＭＥＬＫペプチドと高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＭＥＬＫペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。

ＴＣＲサブユニットをコードする核酸配列を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする、既製の組成物を提供する。

また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２との関連で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２のＭＥＬＫペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつ周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＴ細胞は、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。

ＩＸ．薬学的な剤または組成物
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含む。

がんまたは腫瘍の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療を構成し、および／または予防は１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患を含む。

ＭＥＬＫの発現は、正常組織と比較していくつかのがんにおいて上方制御されるため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、がんまたは腫瘍の治療および／もしくは予防のために、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。従って本発明は、本発明のペプチドの１種もしくは複数種、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含む、がんまたは腫瘍の治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な剤または組成物を提供する。あるいは、薬学的な剤または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述の細胞傷害性Ｔ細胞もまた、本薬学的な剤または組成物の有効成分として用いることができる。本発明との関連において、「ペプチドの標的化」という語句は、Ｔ細胞受容体により、標的細胞の表面上でＨＬＡ抗原とペプチドとの間に形成された複合体を認識（すなわち、これに結合）し、次いで該標的細胞を攻撃して標的細胞の死を誘導することを意味する。

別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸、
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム、および
（ｄ）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞。

あるいは、本発明の薬学的な組成物または剤は、がんまたは腫瘍の予防および術後のその再発の予防のいずれかまたは双方に用いることができる。

本発明の薬学的な剤または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。

本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。

本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、４６、５７、６０、および６２の中より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれ、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープペプチドまたは候補であることが判明している。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、および２７の中より選択されるアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である対象に投与するのに特に適している。一方、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、４６、５７、６０、および６２のアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドのいずれかを含む本発明の薬学的な剤または組成物は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２である対象に投与するのに特に適している。同じことが、これらのポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤にも当てはまる。

本発明の薬学的な剤または組成物によって治療されるがんまたは腫瘍は限定されず、これには、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣを含む、ＭＥＬＫが関与するすべての種類のがんまたは腫瘍が含まれる。

本薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例証されるが、これに限定されない。

必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、例えば本発明のペプチドのいずれかといった有効成分の抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、有効成分として該治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な剤と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な剤の量は、例えば、使用される薬理学的な剤の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。

本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の剤も含み得ることが理解されるべきである。

本発明の１つの態様において、本薬学的な剤または組成物を、例えばがんのような治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを有する本薬学的な剤または組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。

上記の容器に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および添付文書を含む、商業上および使用者の立場から見て望ましい他の材料をさらに含み得る。

必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な剤または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付され得る。

（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。

インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いにコンジュゲートしてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象由来のＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を本発明のペプチドで刺激することによって得られ得る、本発明のペプチドのいずれかをその細胞表面上に提示するＡＰＣを対象に投与してもよく、結果として、対象においてＣＴＬが誘導され、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣ細胞などのがん細胞に対する攻撃性を増大させることができる。

有効成分として本発明のペプチドを含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、効率的な細胞性免疫が知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な剤または組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒内への製剤化によって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。

いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る剤として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。

投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日から数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。

（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５,５８０,８５９号；第５,５８９,４６６号；第５,８０４,５６６号；第５,７３９,１１８号；第５,７３６,５２４号；第５,６７９,６４７号；およびＷＯ ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５,９２２,６８７号を参照されたい）。

ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４,７２２,８４８号に記載されている。別のベクターの例はＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかであろう。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71;Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。

ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよいし（この場合、ポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露する）、または間接的であってもよい（この場合、まずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する）。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。

遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95;Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96;Mulligan, Science 1993, 260: 926-32;Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993;およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。

投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、適切な用量を適切に選択することができる。

Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、任意の他の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。従って、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを、以下に議論されるように、ＡＰＣを誘導するために用いることもできる。

（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、ＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上記したように行うことができる。本発明はまた、高レベルのＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、その誘導もまた上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の項目で言及されている。

好ましくは、ＡＰＣを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
ｂ：発現可能な形態で本発明のポリペプチドをＡＰＣに導入する段階。

ＡＰＣを誘導するそのような方法は、好ましくはインビトロまたはエクスビボで行う。この方法をインビトロまたはエクスビボで行う場合、誘導すべきＡＰＣは、治療すべき対象、またはＨＬＡ抗原が該対象と同じである他者から取得してよい。

（２） ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ペプチドを提示するエキソソームもしくはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。

本発明はまた、細胞表面上の本発明のペプチドとＨＬＡ抗原の複合体を認識する（すなわち、これに結合する）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。好ましくは、ＣＴＬを誘導するための方法は、以下の中より選択される少なくとも１つの段階を含む：
ａ：ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階、ならびに
ｂ：本発明のペプチドとＨＬＡ抗原の複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。

本発明のペプチドを対象に投与した場合、該対象の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍関連内皮を標的とする免疫応答の強度が増強される。あるいは、対象由来のＡＰＣ、およびＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核白血球を、インビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、ＣＴＬを誘導した後、活性化したＣＴＬ細胞を該対象に戻すエクスビボ治療法に、前記ペプチドおよび前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣと前記ペプチドを接触させる段階；
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８⁺ Ｔ細胞と混合し、ＣＴＬを誘導するために共培養する段階；および
ｄ：段階ｃの共培養物からＣＤ８⁺ Ｔ細胞を回収する段階。

あるいは、本発明に従って、ＣＴＬを誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。加えて、本発明は、ＣＴＬを誘導する薬学的な剤または組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法は、薬学的に許容される担体と共に本発明のペプチドを混合または製剤化する工程を含む。さらに、本発明はまた、ＣＴＬを誘導するための本発明のペプチドを提供する。段階ｄによって得られた細胞傷害活性を有するＣＤ８⁺ Ｔ細胞を、ワクチンとして前記対象に投与することができる。上記の段階ｃにおいてＣＤ８⁺ Ｔ細胞と混合するＡＰＣは、上記の「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で詳述されているように、本ペプチドをコードする遺伝子をＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、これに限定されない。従って、本発明のペプチドをＴ細胞に対して効果的に提示する任意のＡＰＣまたはエキソソームを、本発明の方法に用いることができる。

以下の実施例は、本発明を例証し、当業者がそれを作製および使用するのを補助するために提供される。実施例は、いかなる形であれ他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＢリンパ球をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによって、Ａ２４リンパ芽球様細胞株（Ａ２４ＬＣＬ）を樹立した。Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、ヒトＢ−リンパ芽球様細胞株、およびＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。

ＭＥＬＫ由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ^*２４０２およびＨＬＡ−Ａ^*０２０１分子に結合するＭＥＬＫ由来の９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒのペプチドを、Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)およびKuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)によってアルゴリズムが記載されている結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳｉｇｍａ（札幌、日本）またはＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２０ ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。

インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ^*２４０２またはＨＬＡ−Ａ^*０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１０００ Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮した集団を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、３７℃にて、３ マイクログラム／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０ マイクログラム／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で不活化し（３０ マイクログラム／ｍｌで３０分間）、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し；各ウェルは、０．５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ ＡＳ培地中に、１．５×１０^４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０^５個のＣＤ８＋ Ｔ細胞、および１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬまたはＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。

ＣＴＬ増殖手順
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養下で増殖させた。４０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、ＭＭＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０^４個のＣＴＬを２５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。

ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において０．３個、１個、および３個のＣＴＬ／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０^４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、１２５ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の最終濃度に到達するように培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。

特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬまたはＴ２（１×１０^４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造元の手順に従って行った。

結果
がんにおける過剰発現
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた包括的遺伝子発現プロファイルデータから、ＭＥＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１４７９１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）の発現が上昇していることが明らかになった。ＭＥＬＫ発現は、対応する正常組織と比較して、膀胱癌２９例中２９例、乳癌３４例中３１例、子宮頸癌１５例中１４例、胆管細胞癌１１例中１１例、ＣＭＬ １３例中１０例、結腸直腸癌１５例中１２例、子宮内膜症２例中２例、食道癌４２例中１９例、胃癌６例中５例、肝癌４例中４例、ＮＳＣＬＣ １１例中１１例、リンパ腫１４例中１３例、骨肉腫１８例中１４例、卵巣癌６例中３例、膵癌２例中２例、前立腺癌２１例中１８例、腎癌６例中５例、および小細胞肺癌１５例中１５例において確かに上昇していた。（表１）。

（表１）対応する正常組織と比較してがん組織においてＭＥＬＫの上方制御が認められた症例の比率

ＭＥＬＫ由来のＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの予測
表２は、ＭＥＬＫのＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計で３４種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために試験し（表２ａ）、かつ潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する合計で５８種のペプチドを同様に選択して、エピトープペプチドを決定するために試験した（表２ｂおよびｃ）。

（表２ａ）ＭＥＬＫに由来する９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド

（表２ｂ）ＭＥＬＫに由来する９ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド

（表２ｃ）ＭＥＬＫに由来する１０ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド

開始位置は、ＭＥＬＫのＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。

ＨＬＡ−Ａ ^＊ ２４０２またはＨＬＡ−Ａ ^＊ ０２０１拘束性のＭＥＬＫ由来予測ペプチドを用いたＣＴＬの誘導、およびＭＥＬＫ由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
ＭＥＬＫ由来のペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｉ）。それにより、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）で刺激した＃５（ａ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）で刺激した＃３（ｂ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で刺激した＃４（ｃ）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）で刺激した＃４（ｄ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）で刺激した＃５（ｅ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）で刺激した＃３（ｆ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）で刺激した＃１（ｇ）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）で刺激した＃２（ｈ）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）で刺激した＃２（ｉ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で刺激した陽性ウェル番号＃５中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で刺激した陽性ウェル番号＃３中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で刺激した陽性ウェル番号＃４中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で刺激した陽性ウェル番号＃４中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で刺激した陽性ウェル番号＃５中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で刺激した陽性ウェル番号＃３中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で刺激した陽性ウェル番号＃１中の細胞、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で刺激した陽性ウェル番号＃２中の細胞、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２で刺激した陽性ウェル番号＃２中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｉ）。すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。一方、表２に示した他のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ^＊０２０１との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドを用いた刺激ではＣＴＬ株は樹立できなかった（データは示さず）。結果として、ＭＥＬＫ由来の９２個の候補ペプチドのうち９ペプチドのみが、強力なＣＴＬ株を誘導することができた。

MＥＬＫ特異的ペプチドに対するＣＴＬクローンの樹立
「材料および方法」に記載した通りに、ＣＴＬ株から限界希釈によりＣＴＬクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で刺激したＣＴＬクローンから強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。

ＭＥＬＫから内因的にプロセシングされたペプチドをＨＬＡ−Ａ ^＊ ０２０１と共に提示している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
これらのペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＭＥＬＫから内因的にプロセシングされた候補ペプチドをＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子と共に提示している標的細胞を認識する能力について、試験した。ＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子遺伝子の全長の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子を発現する標的細胞の特異的モデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。ＭＥＬＫ遺伝子またはＨＬＡ−Ａ^＊０２０１の全長のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図４において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（ａ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ｂ）で刺激したＣＴＬは、ＭＥＬＫおよびＨＬＡ−Ａ０２の両方を発現しているＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。一方、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。このように、これらのデータにより、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１分子と共に標的細胞上に天然で提示され、ＣＴＬによって認識されることが明確に実証される。これらの結果から、ＭＥＬＫに由来するそれら２つのペプチドが、ＭＥＬＫを発現している腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するために利用可能である可能性があることが示された。

抗原ペプチドの相同性解析
ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−３２６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−９−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−６３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、ＭＥＬＫ−Ａ２４−１０−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１３８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＭＥＬＫ−Ａ０２−９−７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、およびＭＥＬＫ−Ａ０２−９−５３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）の配列は固有のものであり、従って、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどないことが示される。

結論として、ＭＥＬＫ由来の新規なＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ０２エピトープペプチドが同定され、がん免疫療法に適用可能であることが実証された。

産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、幅広いがんのタイプに対する適用可能性を有する、ＭＥＬＫ由来の新規ＴＡＡについて記載する。このようなＴＡＡは、ＭＥＬＫに関連した疾患、例えば乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、およびＳＣＣなどのがんに対するペプチドワクチンとしてのさらなる発展を保証する。

本発明はその特定の態様に関して本明細書において詳細に記載されるが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。ルーチンな実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。

Claims (23)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に由来する単離されたペプチドであって、
   （ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２；ならびに
   （ｂ） １個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および／または付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、２７、３６、４６、５７、６０、および６２
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する、単離されたペプチド。
2. １５アミノ酸未満の残基からなる、請求項１記載のペプチド。
3. ノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項２記載のペプチド。
4. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２１、２３、および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１〜３いずれか一項記載のペプチド：
   （ａ） Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンの群より選択される、ならびに
   （ｂ） Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンの群より選択される。
5. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、４６、５７、６０、および６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１〜３いずれか一項記載のペプチド：
   （ａ） Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンまたはメチオニンの群より選択される、および
   （ｂ） Ｃ末端のアミノ酸が、バリンまたはロイシンの群より選択される。
6. 請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
7. がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬剤であって、以下からなる群より選択される有効成分を含む、薬剤：
   （ａ） 請求項１〜５のいずれか一項記載の１種または複数種のペプチド；
   （ｂ） 発現可能な形態で前記ペプチドをコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
   （ｃ） ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、１種または複数種の抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
   （ｄ） 請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドに対して誘導された１種または複数種のＣＴＬ；ならびに
   （ｅ） これらの組み合わせ。
8. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である対象への投与のために製剤化される、請求項７記載の薬剤。
9. 膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌からなる群より選択されるがんの治療のために製剤化される、請求項７記載の薬剤。
10. ワクチンとして製剤化される、請求項７記載の薬剤。
11. 高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法であって、抗原提示細胞を請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドと接触させる段階、または発現可能な形態で該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入する段階を含む、方法。
12. 請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドを用いることによってＣＴＬを誘導するための方法。
13. ＣＴＬを誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む、方法：
    （ａ） ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および／またはエキソソームと接触させる段階；ならびに
    （ｂ） ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に導入する段階。
14. 請求項１〜５に記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたＣＴＬ。
15. 請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドによって誘導された、単離されたＣＴＬ。
16. 細胞上の、ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を認識し得る、請求項１４または１５記載のＣＴＬ。
17. ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
18. 請求項１１記載の方法によって誘導された、請求項１７記載の抗原提示細胞。
19. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１７または１８記載の抗原提示細胞。
20. 対象においてがんに対する免疫応答を誘導する剤であって、以下からなる群より選択される有効成分を含む、剤：
    （ａ） 請求項１〜５のいずれか一項記載の１種または複数種のペプチド；
    （ｂ） 発現可能な形態で前記ペプチドをコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
    （ｃ） ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、１種または複数種の抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
    （ｄ） 請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドに対して誘導された１種または複数種のＣＴＬ；ならびに
    （ｅ） これらの組み合わせ。
21. 対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、以下からなる群より選択される有効成分を含む剤を該対象に投与する段階を含む、方法：
    （ａ） 請求項１〜５のいずれか一項記載の１種または複数種のペプチド；
    （ｂ） 発現可能な形態で前記ペプチドをコードする１種または複数種のポリヌクレオチド；
    （ｃ） ＨＬＡ抗原と請求項１〜５のいずれか一項記載のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、１種または複数種の抗原提示細胞および／またはエキソソーム；
    （ｄ） 請求項１〜６のいずれか一項記載のペプチドに対して誘導された１種または複数種のＣＴＬ；ならびに
    （ｅ） これらの組み合わせ。
22. がんが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、ＣＭＬ、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、肝癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、および小細胞肺癌からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
23. 対象がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２を有する、請求項２１または２２記載の方法。

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