JP2011528561A - 診断用抗体アッセイ - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、特に高親和性でAβ-ペプチドに結合することで特徴づけられる抗体又はそれらの変種に関する。前記高親和性とは、本発明の状況においては、親和性が、10-7M以上のKD値、好ましくは10-8M以上のKD値、更により好ましくは10-9M〜10-12MのKD値であることを意味する。
Aβ5-5-6、
Aβ6-1-6、
Aβ17-4-3、
Aβ24-2-3。
本発明の抗体は、アミロイドーシス、特にアルツハイマー病を検出するための診断方法において特に有用である。
(定義)
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、かつ具体的には、それらが所望の生物活性を示す限りは、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を対象としている。本抗体は、例としてIgM、IgG(例えば、IgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4)、IgD、IgA又はIgEであることができる。しかし好ましくは本抗体は、IgM抗体ではない。
本明細書において使用される用語「ある(a、an及びthe)」は、「1以上」を意味するように定義され、かつ文脈が不適切でない限りは、複数を含む。
1.Aβペプチド又はそれらの変種に、好ましくは高親和性で結合することで特徴づけられる、抗体、
2.該高親和性が、解離定数(KD)値10-7M以上を意味する、項目1記載の抗体、
3.該抗体がモノクローナル抗体である、項目1又は2記載の抗体、
4.該抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:49、53、57及び61から選択されたヌクレオチド配列、又は配列番号:50、54、58、及び62から選択されたアミノ酸配列を有する、項目1〜3のいずれか1項記載の抗体、
5.該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:51、55、59及び63から選択されたヌクレオチド配列、又は配列番号:52、56、60及び64から選択されたアミノ酸配列を有する、項目1〜4のいずれか1項記載の抗体、
7.該抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:53のヌクレオチド配列、又は配列番号:54のアミノ酸配列を有し、かつ該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:55のヌクレオチド配列、又は配列番号:56のアミノ酸配列を有する、項目1〜6のいずれか1項記載の抗体、
8.該抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:57のヌクレオチド配列、又は配列番号:58のアミノ酸配列を有し、かつ該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:59のヌクレオチド配列、又は配列番号:60のアミノ酸配列を有する、項目1〜7のいずれか1項記載の抗体、
9.該抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:61のヌクレオチド配列、又は配列番号:62のアミノ酸配列を有し、かつ該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:63のヌクレオチド配列、又は配列番号:64のアミノ酸配列を有する、項目1〜8のいずれか1項記載の抗体、
Aβ5-5-6(寄託番号DSM ACC 2923)
Aβ6-1-6(寄託番号DSM ACC 2924)
Aβ17-4-3(寄託番号DSM ACC 2925)
Aβ24-2-3(寄託番号DSM ACC 2926)
又は、それらの機能的変種、
11.該抗体が、Aβ6-1-6(寄託番号DSM ACC 2924)である、項目1〜10のいずれか1項記載の抗体、
12.該抗体が、Aβ24-2-3(寄託番号DSM ACC 2926)である、項目1〜11のいずれか1項記載の抗体、
13.該抗体が、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体、又は、高親和性を保持している抗体断片である、項目1〜12のいずれか1項記載の抗体、
14.Aβペプチド又はそれらの変種の検出において使用するための、項目1〜13のいずれか1項記載の抗体、
pGlu-Aβ3-38
pGlu-Aβ3-40
pGlu-Aβ3-42、及び
pGlu-Aβ3-x変種、
ここで、xは、10〜42;好ましくは18〜42、より好ましくは30〜42の間の整数である、
16.ヒトである、項目1〜15のいずれか1項記載の抗体、
17.高親和性を保持する、ダイアボディ又は単鎖抗体である、項目1〜16のいずれか1項記載の抗体、
18.項目15において定義された抗体により結合されたエピトープへ結合する、項目1〜17のいずれか1項記載の抗体、
19.項目15において定義された抗体の相補性決定領域を有する、項目1〜18のいずれか1項記載の抗体、
21.固相上に固定されている、項目1〜20のいずれか1項記載の抗体、
22.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、DSM ACC 2926のいずれかひとつから入手可能である、抗体、
23.項目1〜22のいずれか1項で定義された抗体を含有する、組成物、
24.アミロイドーシスの治療、予防又は遅延のための、項目23記載の組成物、
25.該アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病及びダウン症候群の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、項目23又は24記載の組成物、
26. 該アミロイドーシスが、散発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、項目23又は24記載の組成物、
27.該家族性アルツハイマー型認知症が、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、項目26記載の組成物、
29.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2924、
30.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2925、
31.ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2926、
32.診断方法又は治療方法における、項目1〜22のいずれか1項で定義された抗体、又は項目23〜27のいずれか1項で定義された組成物の使用、
33.アミロイド-関連疾患又は状態の診断に関する、項目32記載の使用、
34.該アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病及びダウン症候群の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、項目33記載の使用、
35.該アミロイドーシスが、散発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、項目33記載の使用、
36.該家族性アルツハイマー型認知症が、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、項目35記載の使用、
該試料由来のpGlu-アミロイドタンパク質、好ましくはpGlu-Aβペプチドに対する、本抗体の結合を検出する工程:を含む、アミロイド-関連疾患又は状態、特にアルツハイマー病を診断するための、インビトロ診断方法、
38.項目1〜22のいずれか1項で定義された抗体、及び使用説明書、並びに−任意に−更なる生物学的活性物質(1又は複数)を備える、診断キット、
39.該更なる生物学的物質が、グルタミニルシクラーゼ(glutaminy cyclase)の阻害剤である、項目32の診断用キット、
40.配列番号:23〜48からなる群から選択される、オリゴヌクレオチド。
本発明の抗体は、アフィニティ精製物質として使用されることができる。このプロセスにおいて、抗体は、当該技術分野において周知の方法を用い、Sephadex樹脂又はフィルターペーパーのような固相上に固定される。固定された抗体は、精製されるべきAβ-ペプチド(又はそれらの断片)を含有する試料と接触され、その後この支持体は、固定された抗体に結合されているAβ-ペプチド以外の試料中の物質全てを実質的に除去する好適な溶媒により洗浄される。最後に、この支持体は、Aβ-ペプチドを抗体から放出するグリシン緩衝液(pH5.0)などの別の好適な溶媒により洗浄される。
(a) 35S、14C、125I、3H、及び131Iなどの、放射性同位元素。本抗体は、例えば、「免疫学最新プロトコール(Current Protocols in Immunology)」、第1及び2巻、Gutigenら編集、Wiley-Interscience社、ニューヨーク、NY. 刊行1991年に説明された技術を用い、放射性同位元素により標識されることができ、かつ放射活性は、シンチレーションカウンティングを用いて測定されることができる。
(b)希土類キレート(ユーロピウムキレート)又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン及びテキサスレッドなどの蛍光標識が、利用可能である。これらの蛍光標識は、例えば、「免疫学最新プロトコール」(前掲)に明らかにされた技術を用い、本抗体に複合されることができる。蛍光は、蛍光光度計を用い定量されることができる。
(c)様々な酵素-基質標識が利用可能である。この酵素は一般に、様々な技術を用い測定されることができる発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、この酵素は、基質内の色の変化を触媒することができ、この変化は分光光度計により測定されることができる。あるいはこの酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変更することができる。蛍光の変化を定量する技術は、先に説明されている。化学発光基質は、化学反応により電子的に励起され始め、その後測定され得る光を放出するか(例えばケミルミノメーターを用いて)、又は蛍光アクセプターへエネルギーを提供する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ(例えばホタルのルシフェラーゼ及び細菌のルシフェラーゼ;米国特許第4,737,456号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、O-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環オキシダーゼ(ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素を抗体に複合する技術は、O'Sullivanらの文献、「酵素免疫検定法における使用のための酵素-抗体複合体の調製方法(Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)」、Methods in Enzym (編集Langone及びH. Van Vunakis)、Academic Press社、ニューヨーク、73: 147-166 (1981)に説明されている。
(i)基質としてのハイドロジェンペルオキシダーゼ(hydrogen peroxidase)と、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)、ここで過酸化水素は、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)又は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する;
(ii)発色基質としてのp-ニトロフェニルリン酸と、アルカリホスファターゼ(AP);並びに
(iii)発色基質(例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ)又は発蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼとの、β-D-ガラクトシダーゼ(β-D-Gal)。
数多くの他の酵素-基質組合せが、当業者には利用可能である。
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイなどの、いずれか公知のアッセイ方法において利用されることができる。Zolaの文献、「モノクローナル抗体:技術マニュアル(Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques)」、147-158頁(CRC Press社、1987)。
免疫組織化学に関して、本組織試料は、新鮮若しくは凍結されているか、又はパラフィン内に包埋され、かつ例えばホルマリンなどの保存剤により固定されることができる。
便宜上本発明の抗体は、キット、すなわち予め定められた量の試薬のその診断用アッセイの実行に関する指示書との包装された組合せにおいて提供されることができる。抗体が酵素により標識されている場合、このキットは、その酵素により必要とされる基質及び補因子(例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団を提供する基質前駆体)を備えるであろう。加えて、安定剤、緩衝液(例えばブロック緩衝液又は溶解緩衝液)などの他の添加剤が備えられることができる。これらの様々な試薬の相対量は、このアッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するために、広範に変動されることができる。特にこれらの試薬は、溶解時に好適な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供されることができる。
Aβ5-5-6 (DSM ACC 2923)
Aβ6-1-6 (DSM ACC 2924)
Aβ17-4-3 (DSM ACC 2925)
Aβ24-2-3 (DSM ACC 2926)。
更に前述の群から選択されるような抗体は、前記群の機能的変種であることもできる。
本発明の状況において、p-Glu-Aβペプチドの変種は、特に下記のものである:
pGlu-Aβ3-38、
pGlu-Aβ3-40、
pGlu-Aβ3-42。
更なる好ましい実施態様において、本発明の抗体は、先に定義されたように抗体により結合されるエピトープに結合する抗体、特に抗体5-5-6、抗体6-1-6、抗体17-4-3及び抗体24-2-3である。
好ましくは、本抗体は、固相上に固定されている。
本発明は、ハイブリドーマ細胞株6-1-6(DSM ACC 2924)から入手可能である抗体にも関する。
本発明は、インビトロ診断方法における使用のための、両方とも先に定義されたような、抗体又はその抗体を含有する組成物の使用にも関する。特に、この診断方法は、特に生物学的試料中のAβペプチド又はそれらの変種の検出による、軽度認知障害(MCI)、例えば散発性アルツハイマー病(SAD)、又は家族性英国型認知症(FBD)及び家族性デンマーク型認知症(FDD)などの家族性アルツハイマー型認知症(FAD)のようなアルツハイマー病(AD)、ダウン症候群の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患;好ましくはアルツハイマー病の診断に対して行われる。
別の好ましい実施態様に従い、前記試料は、液体又は脳脊髄液(CSF)試料である。
本発明の抗体を、該状態又は疾患に罹患していることが疑われる対象の、好ましくは血清、液体若しくはCSF試料から選択された試料と、最も好ましくは血清試料と;又は特定の体部分若しくは体領域と、接触する工程、並びに
該抗体の該試料由来のpGlu-アミロイドタンパク質、好ましくはpGlu-Aβペプチドへの結合を検出する工程:を含む、アミロイド-関連疾患又は状態、好ましくはアルツハイマー病の診断のための、インビトロ又はインサイチュ診断方法。
(a)前記アミロイドタンパク質を含むことが疑われる試料又は特定の体部分若しくは体領域を、抗体、特に本発明のモノクローナル抗体、又はキメラ抗体若しくはそれらの断片、又は本発明の及び先に本明細書において説明されたようなヒト化抗体若しくはそれらの断片、及び/又はそれらの機能部分と接触させる工程であって、ここで抗体はpGlu-Aβペプチドに結合する工程;
(b)前記抗体及び/又はそれらの機能部分を、pGlu-Aβペプチドと結合させ、免疫複合体を形成する工程;
(c)前記免疫複合体の形成を検出する工程;並びに
(d)前記免疫複合体の存在又は非存在を、試料又は特定の体部分若しくは領域中のpGlu-Aβペプチドの存在又は非存在と相関させる工程:を含む方法に関する。
(a)検査下の組織及び/又は体液を代表する試料を得る工程;
(b)前記試料を、アミロイドタンパク質の存在について、抗体、特に本発明のモノクローナル抗体、又はキメラ抗体若しくはそれらの断片、又は本発明の及び先に本明細書において説明されたようなヒト化抗体若しくはそれらの断片、及び/又はそれらの機能部分により試験する工程;
(c)前記タンパク質に結合された抗体の量を決定する工程;並びに
(d)組織及び/又は体液中の斑負荷を算出する工程:を含む方法も含まれる。
その他の生物学的活性物質又は化合物は、本発明の抗体と同じ若しくは同様の機構によるか、又はある無関係の作用機序によるか、又は多数の関連した及び/若しくは無関係の作用機序により、その生物学的作用を発揮することができる。
(1.材料及び方法)
(1.1.抗体の産生)
(マウス)
ハイブリドーマ産生のために、8週齢の雌BALB/Cマウス(Charles River社)を使用した。
(骨髄腫細胞株)
ハイブリドーマの作製のために、ドイツ細胞バンク(DSMZ)からの骨髄腫細胞株SP2/0-Ag14を使用した。
(抗原)
ペプチドpGlu-6166(配列pGlu-FRHDSGC、配列番号:65)を使用した。
免疫原として、本ペプチドを、ウシサイログロブリン(BTG, SIGMA社)と、3種の異なるリンカーに由来したマレイミド基を介して結合した。N-[e-マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル(EMCS)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LCSMCC)及びN-[b-マレイミドプロピルオキシ]スクシンイミドエステル(BMPS)由来の異なる長さの3種のリンカーを使用した。
作製された抗体の検出のために、同じペプチドを、スクシンイミジル-6-[(b-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート](SMPH)由来のマレイミド基を介して、ウシ血清アルブミン(BSA, SIGMA社)に複合した。
(免疫化のためのペプチド複合)
複合は、ペプチドのシステイン残基からのSH基を介して、2工程で行った。
1.担体タンパク質のマレイル化(maleoylation)
各リンカー2〜5mg(N-メチルピロリドン(NMP)中50mg/ml)を、担体タンパク質溶液(0.1mM NaHCO3(pH8.0)中10mg/ml)2mlに添加した。この反応混合液を、室温(RT)で1時間インキュベーションした。その後この反応混合液を、50mMリン酸ナトリウム、250mM NaCl、pH6.8により平衡としたSephadex G-50カラム(1.5×14cm)を用いて脱塩した。
2.マレイル化BTGのペプチドとの結合
前記ペプチド溶液(Aqua bidest中10mg/ml)250μlを、50mMリン酸ナトリウム、250ml NaCl、pH6.8中にマレイル化された担体タンパク質(2.5mg/ml)を含有する溶液2mlと混合し、4℃で2時間、更にRTで4時間インキュベーションした。未反応のマレイミド基を、2-メルカプトエタノールの最大濃度10mMまでの添加、及び4℃で一晩のインキュベーションによりブロックした。得られた複合体を、10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.5に対して4℃で透析した(緩衝液交換3回、MWカットオフ値10,000)。
複合は、ペプチドのシステイン残基からのSH基を介して、2工程で行った。
1.担体タンパク質のマレイル化
SMPHの2mg(N-メチルピロリドン(NMP)中50mg/ml)を、担体タンパク質溶液(BSA、0.1mM NaHCO3(pH8.0)中10mg/ml)2mlに添加した。この反応混合液を、室温(RT)で1時間インキュベーションした。その後この反応混合液を、50mMリン酸ナトリウム、250mM NaCl、pH6.8により平衡としたSephadex G-50カラム(1.5×14cm)を用いて脱塩した。
2.マレイル化BTGのペプチドとの結合
前記ペプチド溶液(50mMリン酸ナトリウム、250mM NaCl、pH6.8中10mg/ml)100μlを、50mMリン酸ナトリウム、250ml NaCl、pH6.8中にマレイル化された担体タンパク質(2.5mg/ml)を含有する溶液1mlと混合し、4℃で2時間、更にRTで4時間インキュベーションした。未反応のマレイミド基を、2-メルカプトエタノールの最大濃度10mMまでの添加、及び4℃で一晩のインキュベーションによりブロックした。得られた複合体を、10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.5に対して4℃で透析した(緩衝液交換3回、MWカットオフ値10,000)。
5匹のマウスを、腹腔内経路により39日間免疫化した。免疫化に関して、同等部の抗原溶液(同等部の3種の異なるペプチド-BTG-複合体からなる)及び完全又は不完全フロイントアジュバントからなるからなる油中水型エマルションを使用した。
3匹の免疫化したマウスを、CO2インキュベーションにより屠殺した。脾臓を摘出し、無菌条件下でホモジナイズした。脾細胞及び骨髄腫SP2/0細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、SIGMA社)において数回洗浄し、かつポリエチレングリコール3350(1ml、50%(w/v))を用い、脾細胞:SP2/0細胞の比2,3:1で融合した。融合したハイブリドーマの更なる操作は、標準的方法に従い行った。
IgGに対するELISAを使用し、細胞培養液上清をスクリーニングした。96-ウェルポリスチロール製マイクロタイタープレート(Greiner社、カタログ番号655061)において試験を行った。これらのプレートを、BSA-pGlu-6166ペプチドによりコーティングした。未希釈の細胞培養液上清100μlを、各ウェルに添加し、かつRTで1時間インキュベーションした。SP2/0細胞からの上清を、陰性対照として使用した。脾細胞からの上清を、陽性対照として使用した。
陽性ウェルを、アルカリホスファターゼと複合されたヤギ-抗-マウスIgGを用い検出した。光学密度(OD)を、Dynex Opsys MRマイクロプレートリーダーにおいて405nmで測定した。
陽性ウェルからの細胞を、24-ウェルプレートへ移し、数日間培養した。細胞を再度移し、ELISAにおいてBSA-pGlu6199結合及び交差反応性について試験した。陽性ウェルを、ハイブリドーマ細胞株の凍結保存(cryo-conservation)に使用した。
抗体産生細胞を非産生細胞から分離し、かつ選択された細胞がモノクローナルであることを確実にするために、2回の連続するクローニング工程を行った。クローニング工程は両方共、限定希釈法に従い行った。
(凍結保存)
選択されたハイブリドーマを、DMSO及び標準的方法を用いて凍結保存した。
AβN3pE-40の捕獲は、TGCからのhAβ(x-40)ELISA(HS)(The GENETICS社;スイス)を用い、基本的には製造業者の指示に従い行った。
AβN3pE(pGlu-6166)に関するビオチン化された検出用抗体が作製された。指示された場合、IBL社のHRP-複合したAβN3pE抗体を、陽性対照として使用した(IBL ELISAヒトアミロイドβ(N3pE)アッセイキットと一緒の場合のみ入手可能)。対応するAβN3pE-40ペプチド(ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)中の50μgアリコートは、-80℃で貯蔵した)を合成した。使用直前に、HFIPを蒸発させ、このペプチドを、100mMトリス/HCl(pH10.4)により1μg/μlに希釈した。このストック溶液を、TGC抗体希釈液により更に希釈した。引き続きの捕獲及び検出を、製造業者の指示に従い行った。
AβN3pE抗体及び細胞培養液上清の特異性及び生物学的完全性を、JPT Peptide Technologies社(Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 ベルリン、独国)のPepSpot(商標)技術を用いて決定した。
対応するPepSpot(商標)メンブレンは、JPT社で調製した。この方法の原理は、先にKramerらの論文(Cell, 91:799-809 (1997))により紹介されかつ説明されている。
簡単なドットブロットプロトコールを、各未変性ペプチドに対するAβN3pE抗体及び細胞培養液上清の感度に関する情報を得るために遂行した。その目的のために、漸減濃度(1000ng−8ng)のAβN3pE-40ペプチドを、ニトロセルロースメンブレン小片上にスポットし、PepSpot(商標)メンブレンに関する引き続きの実験手順を行った。
12%SDSポリアクリルアミドゲルを、標準プロトコールに従い成型した。細胞培養液上清15μl及びビオチン化された抗体10μgを、12%SDSポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動を、100V定圧で2時間実行した。
AβN3pE-40ペプチド(陽性対照)及びAβN3E-40ペプチド(陰性対照)を、Biacore CM5チップ上に結合した。修飾されなかったチップを使用し、ブランク値を決定した。TGC希釈液中に20μg/ml〜1μg/mlに希釈されたビオチン化された抗体の会合及び解離をモニタリングし、各KD値の引き続きの決定を可能にした。この方法で、個々の細胞培養液上清の結合特性も決定した。
精製された抗体クローン6-1-6を、HBS-EP緩衝液(Biacore)中に、100、50、30、20、15、10、7、4、2、1nMまで順に希釈した。その上にAβpE3-40が固定されたCM5-チップを備えたBiacore 3000を用い、その親和性を決定した。このシステムは、30μl/分で試行した。測定されたバルク作用及びチップ表面への非特異的結合を、そこにAβpE3-40が固定されたフローセル4及び空のフローセル3のシグナルの減算により補正した。会合(10分間)は、各濃度300μlの注入により得た。解離は、10分間にわたり観察した。残存する抗体分子を、0.1M HClの5μlの注入により除去した。各抗体濃度に関して、会合及び解離を記録した。会合速度及び解離速度及び解離定数の決定は、「二価アナライト(Bivalent analyte)」モデルを使用し、全ての記録された抗体濃度に関する会合相及び解離相の同時のグローバルフィッティング(global simultaneously fit)により行った。
ハイブリドーマ細胞の培養:
ハイブリドーマ細胞を、15%FBS、1%MEM-NEA(非必須アミノ酸、Gibco社)、50μg/mlゲンタマイシン(Gibco社)及び50μMβ-メルカプトエタノールを添加した、D-MEM(+L-グルタミン、+Na-ピルビン酸、4.5g/lグルコース、Gibco社)上で、37℃及び5%CO2で増殖した。細胞密度に応じて、3〜4日後に継代培養を行った。細胞を、濃度0.5×106個細胞/mlで播種し、細胞密度2〜5×106個細胞/mlで分割を行った。
総RNAを、NucleospinRNA単離キット(Macherey-Nagel社)のマニュアルに従い、2×106個細胞から単離した。100ng RNAを、オリゴ(dT)15プライマー(Promega社)及びSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen社)を使用することにより、cDNA合成に適用した。
重鎖可変領域は、プライマーMHV1-12と組み合わせたプライマーMHCG1(クローン5-5-6及び6-1-6の場合)並びにMHCG2b(クローン17-4-3及び24-2-3)と共に、Phusion(商標)高忠実度DNAポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs社)を使用することにより、鋳型cDNAから増幅した。軽鎖可変領域の増幅に関して、プライマーMKV1-MKV11と組合せたプライマーMKCを使用した。プライマー配列は、表1に示している。
PCRにより増幅された重鎖及び軽鎖可変領域を、pJETl.2/平滑端ベクターへClone JET(商標)PCRクローニングキット(Fermentas社)のプロトコールに従いクローニングした。配列決定は、pJET1.2配列決定プライマーにより行った。
96-ウェルマキシソーブプレート(Nunc社)を、D-PBS中に希釈した2μg/ml抗-Aβ抗体4G8の100μl/ウェルを4℃で一晩インキュベーションすることにより、捕獲抗体でコーティングした。これらのプレート(plated)を密封した。そのコーティング溶液を除去し、かつプレートの表面を、200μl/ウェルのPIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20非含有)により、室温で2時間ブロックした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。AβpE3-40標準ペプチドを、PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)中で200、100、50、25、12.5、6.25、3.125pg/mlへ順に希釈した。各濃度100μl及び希釈緩衝液(ブランク)100μlを、プレート上にピペッティングした。このプレートを密封し、かつ4℃で2時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)中に溶解したAβN3pE特異性抗体クローン6-1-6の1μg/ml及びストレプトアビジン-HRP複合体(Sigma社)2μg/mlを含有する検出用抗体-酵素複合溶液100μlを、各ウェルにピペッティングした。このプレートを密封し、4℃で1時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。各ウェル中に、SureBlue基質溶液(KPL)100μlをピペッティングし、かつこのプレートを暗所において、室温で30分間インキュベーションした。この反応を、1M H2SO4の100μl/ウェルの添加により停止した。吸光度を、TECAN Sunriseにより450nmで測定し、540nmの吸光度により補正した。
ELISA:
96-ウェルマキシソーブプレート(Nunc社)を、D-PBS中に希釈した2μg/ml抗-Aβ抗体4G8の100μl/ウェルを4℃で一晩インキュベーションすることにより、捕獲抗体でコーティングした。これらのプレート(plated)を密封した。そのコーティング溶液を除去し、かつプレートの表面を、200μl/ウェルのPIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20非含有)により、室温で2時間ブロックした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。AβpE3-40標準ペプチド及び他のAβ-ペプチド(2-40、3-40、4-40、1-42、3-42及びpE11-40)を、PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)中で800、400、200、100、50、25、12.5へ順に希釈した。各濃度100μl及び希釈緩衝液(ブランク)100μlを、プレート上にピペッティングした。このプレートを密封し、かつ4℃で2時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)中に溶解したAβN3pE特異性抗体クローン6-1-6の1μg/ml及びストレプトアビジン-HRP複合体(Sigma社)2μg/mlを含有する検出用抗体-酵素複合溶液100μlを、各ウェルにピペッティングした。このプレートを密封し、4℃で1時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。各ウェル中に、SureBlue基質溶液(KPL)100μlをピペッティングし、かつこのプレートを暗所において、室温で30分間インキュベーションした。この反応を、1M H2SO4の100μl/ウェルの添加により停止した。吸光度を、TECAN Sunriseにより450nmで測定し、540nmの吸光度により補正した。
様々なAβ種に加え、ヒト体において生じる他のpGlu-ペプチドへの交差反応性も決定した。これは、表面プラズモン共鳴により行った。以下のペプチド又はそれらのN-末端領域を、CM5-チップの表面に固定した:MCP1、MCP2、大ガストリン、ゴナドリベリン、ニューロテンシン、オレキシンA、フィブロネクチン、コラーゲン1及びTRH。陽性対照として、同じくAβpE3-40への結合も分析した。N3pE抗体クローン6-1-6及び24-2-3を、HBS-EP(Biacore社)中に25μg/mlまで希釈した。この結合は、その上に各ペプチド(フローセル2、3及び4)が固定された数個のCM5-チップを備えたBiacore 3000を用い、観察した。このシステムは、20μl/分で試行した。測定されたバルク作用及びチップ表面への非特異的結合を、そこに被験ペプチドが固定されたフローセル2、3及び4並びに空のフローセル1のシグナルの減算により補正した。会合(9分間)は、抗体クローン6-1-6及び24-2-3の各々180μlの注入により得た。解離は、9分間にわたり観察した。残存する抗体分子を、0.1M HClの5μlの注入により除去した。この抗体の様々なペプチドとの各相互作用に関して、会合及び解離を記録した。交差反応性は、最終時の速度及びシグナルに関する会合相の評価により決定した。全てのpGlu-ペプチドの値は、AβpE3-40に関するシグナルと比較した。
本発明者らが開発したN3pE ELISAは、トランスジェニックマウスの脳内のAβpE3-42濃度の分析に使用されるべきである。概して脳半球及び脳幹は、AβpE3-42含量に関して、個別に分析された。マウス脳を、セラミックビーズを使用するPrecelly(Peqlab社)ホモジナイザー内で、プロテアーゼインヒビターを含む2%SDS溶液500μl中でホモジナイズした。この浮遊液を、ビーズからピペットにより取り出し、遠心管に移した。ビーズは、プロテアーゼインヒビターを含む2%SDS溶液250μlで再度洗浄し、かつ溶液を前記遠心管に移した。SDS脳浮遊液750μlを、粉砕氷上で20秒間音波処理した。この試料を、75000×g、4℃で1時間遠心した。その後、上清を取り出し、アリコートとし、かつELISA分析まで-80℃で貯蔵した。残存するSDS不溶性ペレットを、70%ギ酸150μlと混合し、粉砕氷上で20秒間音波処理した。音波処理の直後に、この溶液を、旧方式である1Mトリス2850μlにより中和するか、又はEIA緩衝液(PBS+10mg/ml BSA+0.05%Tween-20)2850μl+3.5Mトリス860μlにより中和し、これは新方式を表している。これらのギ酸画分試料を、ELISAまで-80℃で貯蔵した。
96-ウェルマキシソーブプレート(Nunc社)を、D-PBS中に希釈した2μg/ml抗-Aβ抗体4G8の100μl/ウェルを4℃で一晩インキュベーションすることにより、捕獲抗体でコーティングした。これらのプレート(plated)を密封した。そのコーティング溶液を除去し、かつプレートの表面を、200μl/ウェルのPIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20非含有)により、室温で2時間ブロックした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。AβpE3-42標準ペプチドを、PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)(旧方式)又はEIA緩衝液(新方式)中で1029.2、514.6、257.3、128.65、64.32、31.16、16.08pg/mlへ順に希釈した。各濃度100μl及び希釈緩衝液(ブランク)100μlを、プレート上にピペッティングした。前述のSDS試料を解凍し、各々PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)(旧方式)又はEIA緩衝液(新方式)中で1:25及び1:100に希釈し、かつELISAプレート上にピペッティングした。前述のギ酸試料(旧方式:ギ酸/トリス;新方式:ギ酸/EIA緩衝液/トリス)を解凍し、かつ希釈せずELISAプレート上にピペッティングした。このプレートを密封し、かつ4℃で2時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。PIERCEタンパク質-非含有ELISA-ブロッカー(Tween-20含有)中に溶解したAβN3pE特異性抗体クローン6-1-6の1μg/ml及びストレプトアビジン-HRP複合体(Sigma社)2μg/mlを含有する検出用抗体-酵素複合溶液100μlを、各ウェルにピペッティングした。このプレートを密封し、4℃で1時間インキュベーションした。その後このプレートを、TBS+0.05%(v/v)Tween-20により6回洗浄した。残存する洗浄液を、プレートを軽く叩くことにより除去した。各ウェル中に、SureBlue基質溶液(KPL)100μlをピペッティングし、かつこのプレートを暗所において、室温で30分間インキュベーションした。この反応を、1M H2SO4の100μl/ウェルの添加により停止した。吸光度を、TECAN Sunriseにより450nmで測定し、540nmの吸光度により補正した。
ヒト脳(皮質)由来のホルマリン-固定切片及びパラフィン-包埋切片を、下記のように処理した:
1.切片(スライド上に固定された)の脱パラフィン化及び再水和:
a.スライドのヒストクリア又はキシレン中で3分間のインキュベーション、
b.クリーニング液の除去、
c.スライドのヒストクリア又はキシレン中で3分間の再度のインキュベーション、
d.スライドのヒストクリア又はキシレンの100%エタノールとの1:1溶液中で3分間のインキュベーション、
e.スライドの100%エタノール中で3分間のインキュベーション、溶液の除去、
f.スライドの100%エタノール中で3分間の再度のインキュベーション、
g.スライドの95%エタノール中で3分間のインキュベーション、
h.スライドの70%エタノール中で3分間のインキュベーション、
i.スライドの50%エタノール中で3分間のインキュベーション、
j.スライドの蒸留水中で3分間のインキュベーション。
スライドのメタノール99ml+30%過酸化水素1mlによる、室温で10分間のインキュベーション、
3.スライドの水による洗浄:2×5分間
4.個々のスライド中の水の除去、及び切片の乾燥を防ぐための、加湿チャンバー内のスライドラック上へのスライドの配置。ドラフト下室温で10分間の88%ギ酸による、切片の被覆。水中で数回のすすぎ、及び水を満たした染色皿内で10分間の振盪、
5. 10%ウマ血清中での室温で20分間のブロッキング、
6.ブロッキング溶液の振り払い(又は吸引)、及び一次抗体(N3pE抗体クローン6又は24)の4℃で一晩の適用、
7. 1枚のスライドから別のスライドへのドラッキングを避けるための、TBSによる10分間の個別のスライド洗浄、
8.ビオチン化された二次抗体(Vector Laboratories社のヤギ抗-マウス抗体)の添加:TBS 9ml、ヤギ血清1ml、二次抗体45μl。室温で30分間のインキュベーション、
9. 1枚のスライドから別のスライドへのドラッキングを避けるための、TBSによる10分間の個別のスライド洗浄、
10. ABC-溶液(TBS 10ml、ウマ血清100μl、成分A 90μl、成分B 90μl)の添加。室温で30分間のインキュベーション、
11.スライドの50mMトリスによる洗浄:2×10分間
12.呈色反応:切片のDAB溶液(50mMトリス100ml中のSigma社のDAB 20mg、濾過し、33%過酸化水素33μlの添加)と一緒のインキュベーション。顕微鏡を使用する、呈色反応の観察。この反応生成物は茶色を呈した。水が入った染色皿へのスライドの投入による反応の停止、
13.スライドの水による10分間の洗浄、
14.ヘマトキシリンによる対比染色、水による洗浄、
15.脱水及びクリーニング:逆順で工程1を辿る(例えば、水、エタノールから100%ヒストクリアへ)、
16. Permount付きカバーガラス(Fisher Scientific社)。空気中でのスライドの乾燥。カミソリの刃及びエタノールによるスライドのクリーニング。
(2.1.抗体の産生)
pGlu-6166-BSAペプチドに対する抗体を安定して産生する6種のクローンを単離した:クローン1-8-12、5-5-6、6-1-6、12-1-8、17-4-3及び24-2-3。これらのクローンを更なる特徴決定に供した。
ELISAアッセイにおけるシグナル強度は、分析物/Aβ変種の濃度に相関されるのみではなく、配置された抗体の濃度にも強力に左右される。Aβ変種は、血清試料中に低濃度でのみ存在するので、対応するAβ変種の低濃度を検出することができる抗体濃度を決定することが必要である。市販のAβELISAキットは、低いpg範囲において、Aβに対する特定された検出限界を有する。標準曲線において、最高濃度は通常500pg/mlである。しかし一般的文献から引き出せる更なる情報では、抗体1μg/mlがデフォルトとして使用されるために、配置された抗体濃度に関する一般的情報は、典型的にはデータシート/指示マニュアル中に欠けている。
AβN3pE-x抗体pGlu-6166をスクリーニングプロセスにおいて選択したが、その理由は、その当初の細胞クローン(12-1-8と称される)が、免疫化のために採取した該ペプチドに対する強力な結合及び非常に低い交差反応性を示したからである(表2参照)。
次に特異性を、ビオチン化されたAβN3pE-x抗体pGlu-6166と、ハイブリドーマ細胞クローンとで比較するために、PepSpot解析によりチェックした。表3に、PepSpotメンブレン上のスポットに相当する全てのペプチドを列記している。図3において認められるように、pGlu-6166クローン6-1-6及び24-2-3は、pGlu-6166抗体クローン12-1よりもより多くの交差シグナルを生じなかった。調べた全てのクローンは、主としてスポット番号6−特異的AβN3pE-xスポット(pEFRHD...、すなわち配列番号:12)、それに続くスポット番号5(EFRHD...配列番号:11)及び7(FRHD... 配列番号:13)を認めた。かすかなシグナルも、スポット番号4(AEFRHD... 配列番号:10)において得られた。
Aβ-N3pE抗体及びハイブリドーマ細胞培養液上清の生物学的完全性を、SDS-PAGE解析によりおおまかに決定した(詳細については前掲の「材料及び方法」を参照されたい)。
図4に認められるように、ゲルに装加した全ての試料は、不明瞭部分(smear)のない尖鋭なバンドを明らかにし、このことはpGlu-6166 12-1抗体及びハイブリドーマ細胞クローン上清の完全性を示している。
ドットブロット解析により、ハイブリドーマ細胞クローン上清のAβN3pE-40ペプチドに対する感度を、ビオチン化されたpGlu-6166抗体と比較し、有意差を判断した。しかしこの方法では、エンドポイントの結果のみをモニタリングした。他方Biacore解析は、所定の抗体の結合過程の時間に関する(timewise)解明を可能にする。pGlu-6166抗体12-1の不十分な結合は、AβN3pE-40ペプチドへの低い会合の結果であるかどうかをチェックするために、Biacore解析を、前掲の「材料及び方法」に説明されたように行った。
N3pE抗体クローン6-1-6に関して、会合速度、解離速度、及び解離定数を、図6に示された全てのセンサグラムのグローバルフィッティングにより算出した。
会合速度は1.67e5 M-1s-1、解離速度は2.63e-4 s-1、及び解離定数は1.57nMと算出した。
N3pE抗体クローン24-2-3に関して、会合速度、解離速度及び解離定数は、図7に示された全てのセンサグラムのグローバルフィッティングにより算出した。
会合速度は3.25e3 M-1s-1、解離速度は3.29e-4 s-1、及び解離定数は101nMと算出した。
最終のN3pE ELISAプロトコールを、定量限界(LOQ)及びシグナル-対-ノイズ比(S/N)に関して試験した。このELISAの標準曲線は、図8に示している。この標準曲線の形状は、特に低濃度範囲について非常に良好であり、これは吸光度にほぼ直線的依存関係と思われる。この標準曲線を基に、S/N=1.3で、LOQは3.125pg/mlと決定した。
ELISA:
他のAβ変種に対する交差反応性を、本発明者らのN3pE-ELISAを用い決定した。生データを、表4に示している。
クローン6-1-6及び24-2-3の他の非-AβpGluペプチドに対する交差反応性を、表面プラズモン共鳴により解析した。典型的結合センサグラムを示すAβpE3-40の代わりに試験した他のpGluペプチドは全て、クローン6-1-6及び24-2-3と、各々、相互作用をほぼ示さず、これも図9に示している(データはクローン6-1-6についてのみ示している)。pGluペプチドのセンサグラムを、AβpE3-40のセンサグラムと比較した。概算された交差反応性は、全て1%未満であった。全ての解析されたペプチドのまとめを、表5に示している。
マウス脳幹中のAβpE3-42濃度を、使用した方法に応じて分析した。これらの試料は、QCによりAβpE3-42に環化されている、ヒトAβQ3-42を脳内に過剰発現しているトランスジェニックマウス(tg)に由来した。ヘテロ接合型トランスジェニックマウス(tg het)及びホモ接合型トランスジェニックマウス(tg hom)及び野生型非-トランスジェニックマウス(wt)から得た試料を比較した。試料作製に使用したマウスは、WO2009034158に開示されたように作出された。
本発明のN3pE抗体により、AβpE3-xを、散発性アルツハイマー病(SAD)及び家族性アルツハイマー病(FAD)の後期の患者、すなわちプレセニリン1(PS1)遺伝子に変異を持つ患者の脳切片において染色した。染色した脳切片を、図11に示す。図11は、本発明のN3pE抗体は、免疫組織化学に適していることを示している。この抗体は、SAD及びFAD患者の脳内でpGlu-Aβを特異的に検出する。N3pE抗体は、これらの画像においてバックグラウンドシグナルを示さず、このことは、ELISA及びSPR解析により示された特異的結合を証明している。
AβN3pE-xを特異的に認識するモノクローナル抗体が作製された。現在、モノクローナル抗体発現する対応するハイブリドーマ細胞株5-5-6、6-1-6、17-4-3、及び24-2-3は全て、「ブダペスト条約(Budapest Treaty)」に基づき寄託されており、かつドイツ細胞バンク(Deutsche Stammsammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen(DSMZ))(ブラウンシュヴァイク, DE)において、かつ各々寄託日2008年6月17日付けの、各々下記寄託番号で入手可能である:
(クローン5-5-6):DSM ACC2923
(クローン6-1-6):DSM ACC2924
(クローン17-4-3):DSM ACC2925
(クローン24-2-3):DSM ACC2926。
本発明の主目的は、生物学的試料中のAβ変種の定量測定を可能にする高感度かつ堅牢な検出技術を確立することであった。
好ましくは、ELISAベースの技術を追跡した。この作業はAβN3pE ELISAから始め、その理由はこのAβ変種に関しては好適なELISAシステムが既に市販されているからである(IBL社)。このシステムは、参照及び内部定量対照として使用した。
Claims (40)
- アミロイド(A)ペプチド、又はそれらの変種へ、好ましくは高親和性で、結合することを特徴とする、抗体。
- 前記高親和性が、解離定数(KD)値10-7M以上を意味する、請求項1記載の抗体。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1又は2記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:49、53、57及び61から選択されたヌクレオチド配列、又は配列番号:50、54、58及び62から選択されたアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:51、55、59及び63から選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号:52、56、60及び64から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:49のヌクレオチド配列又は配列番号:50のアミノ酸配列を有し、ここで該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:51のヌクレオチド配列、又は配列番号:52のアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:53のヌクレオチド配列又は配列番号:54のアミノ酸配列を有し、ここで該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:55のヌクレオチド配列、又は配列番号:56のアミノ酸配列を有する、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:57のヌクレオチド配列又は配列番号:58のアミノ酸配列を有し、ここで該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:59のヌクレオチド配列、又は配列番号:60のアミノ酸配列を有する、請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖の可変部分が、配列番号:61のヌクレオチド配列又は配列番号:62のアミノ酸配列を有し、ここで該抗体の重鎖の可変部分が、配列番号:63のヌクレオチド配列、又は配列番号:64のアミノ酸配列を有する、請求項1〜8のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体が:
Aβ 5-5-6 (寄託番号DSM ACC 2923)
Aβ 6-1-6 (寄託番号DSM ACC 2924)
Aβ 17-4-3 (寄託番号DSM ACC 2925)
Aβ 24-2-3 (寄託番号DSM ACC 2926)
又はそれらの機能的変種の群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項記載の抗体。 - 前記抗体が、Aβ 6-1-6 (寄託番号DSM ACC 2924)である、請求項1〜10のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体が、Aβ 24-2-3(寄託番号DSM ACC 2926)である、請求項1〜11のいずれか1項記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体、又はその高親和性を保持している抗体断片である、請求項1〜12のいずれか1項記載の抗体。
- Aβペプチド又はそれらの変種の検出において使用するための、請求項1〜13のいずれか1項記載の抗体。
- 前記変種が:
pGlu-Aβ3-38
pGlu-Aβ3-40
pGlu-Aβ3-42、及び
pGlu-Aβ3-x変種:の群から選択され、ここでxは、10〜42;好ましくは18〜42、より好ましくは30〜42の間の整数である、請求項14記載の抗体。 - ヒトである、請求項1〜15のいずれか1項記載の抗体。
- 前記高親和性を保持している、ダイアボディ又は単鎖抗体である、請求項1〜16のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項15記載の抗体により結合されたエピトープへ結合する、請求項1〜17のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項15記載の抗体の相補性決定領域を有する、請求項1〜18のいずれか1項記載の抗体。
- 標識されている、請求項1〜19のいずれか1項記載の抗体。
- 固相上に固定されている、請求項1〜20のいずれか1項記載の抗体。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、DSM ACC 2926のいずれか1つから入手可能である抗体。
- 請求項1〜22のいずれか1項記載の抗体を含有する組成物。
- アミロイドーシスの治療、予防又は遅延のための、請求項23記載の組成物。
- 前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病及びダウン症候群の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項23又は24記載の組成物。
- 前記アミロイドーシスが、散発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、請求項23又は24記載の組成物。
- 前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、請求項26記載の組成物。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2923。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2924。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2925。
- ハイブリドーマ細胞株DSM ACC 2926。
- 診断方法又は治療方法における、請求項1〜22のいずれか1項記載の抗体、又は請求項23〜27のいずれか1項記載の組成物の使用。
- アミロイド-関連疾患又は状態の診断のための、請求項32記載の使用。
- 前記アミロイドーシスが、軽度認知障害、アルツハイマー病及びダウン症候群の神経変性からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項33記載の使用。
- 前記アミロイドーシスが、散発性アルツハイマー病又は家族性アルツハイマー型認知症である、請求項33記載の使用。
- 前記家族性アルツハイマー型認知症が、家族性英国型認知症又は家族性デンマーク型認知症である、請求項35記載の使用。
- 請求項1〜22のいずれか1項記載の抗体を、該疾患又は状態に罹患していることが疑われる対象からの試料と接触する工程、並びに該抗体の該試料由来のpGlu-アミロイドタンパク質、好ましくはpGlu-Aβペプチドへの結合を検出する工程を含む、アミロイド-関連疾患又は状態、特にアルツハイマー病の診断のための、インビトロ診断方法。
- 請求項1〜22のいずれか1項記載の抗体、及び使用説明書、並びに任意に更なる生物学的活性物質を備える、診断用キット。
- 前記更なる生物学的物質が、グルタミニルシクラーゼの阻害剤である、請求項32記載の診断用キット。
- 配列番号:23〜48からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
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