JP2011522545A - 糖化酵素組成物及びその糖化方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図8
Description
本出願は、2008年6月6日に出願された米国仮特許出願シリアル番号61/059,535及び2009年4月1日に出願された米国仮特許出願シリアル番号61/165,856の優先権を主張する。両出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号1−34を含む配列リストを添付する。これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、グルコアミラーゼ及びバチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE)またはその変異体を含む組成物は、例えば、デンプン基質からの発酵性糖の生産に有用である。例えば、デンプンからエタノールを生産するためのグルコアミラーゼ及びAmyEまたはその変異体を用いる方法も開示される。
野菜デンプン、例えば、コーンスターチは、シロップ及びバイオ燃料のような製品の産業生産で広く用いられる。例えば、フルクトース高含有コーンシロップ(HFCS)は、高いフルクトース含量と、砂糖に匹敵する甘みをもつコーンシロップの加工品であり、HFCSはそのためソフトドリンクや他の加工食品において砂糖の代替品として有用である。HFCSは現在、10億ドル規模の産業となっている。同様に、野菜デンプンに由来するエタノールの生産は、急速に拡大する産業である。エタノールは、産業化学薬品、ガソリン添加物または液体燃料として広範囲の適用をそれ自身有している。燃料または燃料添加物としてのエタノールの使用は、エンジン性能を維持するか、さらに改良する一方、大気放出を著しく削減する。他方では、エタノールは再生可能な原料であるため、その使用は、有限である化石燃料源への依存を減らすことが出来る。さらに、エタノールの使用は、空気中の二酸化炭素の正味蓄積を減少させることが出来る。
前記過程での分岐点が、上記の反応経路の左側に示すグルコース高含有シロップの生成の後に生じる。最終目的生成物がバイオ燃料である場合、酵母により、グルコース高含有シロップをエタノールへ発酵させることが出来る。他方では、最終目的生成物がフルクトース高含有シロップである場合、グルコースイソメラーゼによりグルコース高含有シロップのフルクトースへの転化を触媒させることが出来る。
のために同時に行われることが出来る。さらに、前記エタノールを回収する工程をさらに含む方法が提供される。エタノール生産は、エタノールを蒸留する工程を含むことが出来る。発酵と蒸留は、同時に、別途または連続して行なわれることが出来る。
この詳細な説明に従い、以下の略号と定義が使用される。本明細書で用いる単数形冠詞(a、an)及び定冠詞(the)は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。従って、例えば、「酵素(an enzyme)」への言及は複数のそのような酵素を含み、「配合物(the formulation)」への言及は一以上の配合物と、当業者に知られるそれらの同等物への言及を含む。
本明細書で用いる「アミノ酸配列」は、「ポリペプチド」という語及び/または「タンパク質」の語と同義である。いくつかの場合に、「アミノ酸配列」の語は、「ペプチド」の語と同義である。いくつかの場合に、「アミノ酸配列」の語は、「酵素」の語と同義である。
水より比重の重い液体について:
s.g.=145÷(145−ボーメ度)、及び
水より比重の軽い液体について:
s.g.=145÷(ボーメ度+130)である。
別途記載のない限り、以下の略語が適用される。
AEO アルコールエトキシレート
AEOS アルコールエトキシ硫酸塩
AES アルコールエトキシ硫酸塩
AkAA アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ
AmyE バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ
AmyE−tr 切断AmyE
AmyE FL 全長AmyE
AmyL バチルス・リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼ
AmyR SPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼ
AmyS ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ
AS アルコール硫酸塩
BAA 細菌アルファ・アミラーゼ
cDNA 相補的DNA
CMC カルボキシメチルセルロース
DE デキストロース等価物
DI 蒸留、脱イオン化
DNA デオキシリボ核酸
DP3 3個のサブユニットを有する重合度
DPn n個のサブユニットを有する重合度
DSまたはds 乾燥固形物
DTMPA ジエチルトリアミン5酢酸
EC 酵素分類用酵素番号
EDTA エチレンジアミン4酢酸
EDTMPA エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸
EO エチレンオキシド
F&HC 布及び家庭用品ケア
gpm ガロン/分
GAU グルコアミラーゼ活性単位
HFCS フルクトース高含有コーンシロップ
HFSS フルクトース高含有デンプンベースシロップ
HGA フミコーラ・グリセア・グルコアミラーゼ
HPLC 高圧液体クロマトグラフィー
IPS ヨウ素陽性糖
IPTG イソプロピルβ−D−チオガラクトシド
IRS 不溶性残留デンプン
kg キログラム
LA ラウリーア寒天
LB ラウリーア培養地
L1T アミノ酸が当該技術分野で一般に知られる単一文字の略語で示される場合、位置1でのロイシン(L)残基がトレオニン(T)残基と置き換えられている
LU リパーゼ単位
MOPS 3−(N−モルフォリノ)プロパンスルホン酸
MT メートルトン
MW 分子量
NCBI 全米バイオテクノロジー情報センター
nm ナノメートル
NOBS ノナノイロキシベンゼンスルホン酸塩
NTA ニトリロ3酢酸
OD 光学密度
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
pI 等電点
ppm 百万分当たりの割合
PVA ポリ(ビニルアルコール)
PVP ポリ(ビニルピロリドン)
RAU 基準アミラーゼ単位
RMSD 2乗平均平方根
RNA リボ核酸
rpm 毎分回転数
SAS 2級アルカンスルホン酸塩
1XSSC 0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0
SSF 同時糖化発酵
SSU 可溶性デンプン単位、分当たりの遊離グルコース1mgの還元力と等価
TAED テトラアセチルエチレンジアミン
TNBS トリニトロベンゼンスルホン酸
TrGA トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ
w/v 重量/容量
w/w 重量/重量
wt 野生型
μL マイクロリットル
μNm マイクロニュートン×メーター
XTRA SPEZYME(登録商標)XTRA(ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン)
2.アルファ・アミラーゼ
2.1.構造及び機能
アルファ・アミラーゼは、微生物及び動植物の組織に存在する酵素の群を構成する。それらは、グリコーゲン、デンプン、関連する多糖類及びいくつかのオリゴサッカライドのアルファ−1,4−グルコシド結合を加水分解することが出来る。アルファ・アミラーゼは全て、同一の触媒機能を持つが、それらのアミノ酸配列は大幅に異なる。異なるアミラーゼ間の配列同一性は、例えば、25%未満であったりと、実質的に存在しないことが出来る。相当なアミノ酸配列の多様性にもかかわらず、アルファ・アミラーゼは、異なる種に由来するアルファ・アミラーゼの三次元構造が測定された後に同定された、共通の全体的な幾何学的構造(topological scheme)を共有する。共通の三次元構造は三個のドメインを示す:
すなわち、(1)ドメインAとして知られる「TIM」バレル、(2)ドメインA内に挿入されるドメインBとして知られる長ループ領域、及び(3)ギリシャ・キー(Greek−key)モチーフを伴う特有のベータ構造を含むドメインCとして知られるC末端に近い領域である。
本明細書で開示する用途の実施に有用な、AmyE酵素及びその変異体を提供する。AmyE及びその変異体をコードする核酸と同様に、その核酸を含むベクターと宿主細胞をさらに提供する。
AmyE変異体は、その核酸及び主要ポリペプチド配列、3D構造モデリング及び/または比活性度により特徴づけることが出来る。AmyE変異体の追加の特徴は、安定性、カルシウムイオン(Ca2+)依存性、pH範囲、酸化安定性及び熱安定性を含む。一の側面において、AmyE変異体は、野生型AmyEの性能特性を保持する一方、野生型AmyEよりも高いレベルで発現される。発現と酵素活性のレベルは、当業者に知られる標準的アッセイ法を用いて評価出来る。別の側面において、変異体は、野生型酵素に比べ、改良された性能特性、例えば、高温での改良された安定性または多様なpH値(例えば、pH4.0−6.0またはpH8.0−11.0)での改良された活性等を示す。
本明細書で記載する方法により、または当該技術分野で知られる任意の別の方法により生産されたアルファ・アミラーゼをコードするDNA配列は、適したプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意に、リプレッサー遺伝子または種々の活性化物質遺伝子をコードする制御配列を通常含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現させることが出来る。
アルファ・アミラーゼをコードするDNA配列を有する組み換え発現ベクターは、組み換えDNA処置が好都合に行われる任意のベクターとすることが出来る。また、ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外に存在するベクターであり、その複製は染色体の複製と独立し、例えばプラスミド、バクテリオファージまたは染色体外エレメント、ミニクロモソームまたは人工染色体であることが出来る。あるいは、ベクターは、宿主細胞へ導入される場合、宿主細胞のゲノムに統合され、統合された染色体と共に複製されるものとすることが出来る。前記統合された遺伝子は、抗生物質の選択または他の選択圧、例えば、必須の調節遺伝子または必須の代謝経路の遺伝子の相補性等により誘導される増幅可能な構築物を使用して、染色体中でこの遺伝子の複数のコピーを作製するために増幅されることも出来る。
アルファ・アミラーゼは、宿主細胞内で発現された場合、その酵素が培養地内へ分泌されることは、一般的に有利とされる。この目的のために、前記アルファ・アミラーゼは、培養地へ発現された酵素の分泌を可能にするシグナル配列を含むことが出来る。望まれる場合、このシグナル配列は、異なるシグナル配列により置き換えられることができ、これは各シグナル配列をコードするDNA配列の置換により、好都合に達成される。例えば、AmyEをコードする核酸は、図5で示す発現ベクター内でB.リケニフォルミス・シグナル配列と操作可能に連結される。シグナル配列は、上記でより詳細に記載する。
従来技術が、本明細書で記載するアルファ・アミラーゼを精製するために用いることが出来る。発酵の後、発酵培養液が得られ、微生物細胞と種々の懸濁された固形物が、残留未発酵物質を含めて、アミラーゼ溶液を得るための従来の分離技術により除去される。ろ過、遠心分離、精密ろ過、ロータリー真空ドラムろ過やその後の限外ろ過、抽出またはクロマトグラフィー等が一般的に使用される。
5.1.液化及び糖化
一の側面において、アルファ・アミラーゼを含む組成物は、例えば、液化及び/または糖化等のデンプン加工に利用出来る。この加工は、顆粒デンプンの初期ゼラチン化温度より低い温度でのゼラチン化デンプンまたは顆粒デンプンのスラリーの加水分解、特に可溶性デンプン加水分解産物への顆粒デンプンの加水分解を含むことが出来る。デンプン加工は、甘味料の生産、燃料または飲用アルコール(すなわち、飲料用アルコール)の生産、飲料の生産、サトウキビの加工または所望の有機化合物、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン及びホルモンの生産に有用である。デンプンのフルクトースシロップへの変換は普通、三個の連続した酵素工程からなる。すなわち、液化工程、糖化工程及び異性化工程である。
リイセッタヌス(T.leycettanus)(米国特許番号RE32、153)、T.デュポンティ(T.duponti)、またはT.サーモフィルス(T.thermophilus)(米国特許番号4,587,215)を含む。意図される細菌性グルコアミラーゼは、クロストリジウム(Clostridium)属由来のグルコアミラーゼ、特に、C.サーモアミロリチカム(C.thermoamylolyticum)(EP135138)及びC.サーモヒドロスルフリカム(C.thermohydrosulfuricum)(国際公開番号WO86/01831)を含む。適したグルコアミラーゼは、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコアミラーゼ、例えば、国際公開番号WO00/04136の配列番号2に示されるアミノ酸配列と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%またはさらに90%の相同性を有するグルコアミラーゼを含む。また、市販のグルコアミラーゼ、例えば、AMG200L、AMG300L、SAN(商標)SUPER及びAMG(商標)E(ノボザイムズ)、OPTIDEX(登録商標)300(ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン)、AMIGASE(商標)及びAMIGASE(商標)PLUS(DSM)、G−ZYME(登録商標)G900(エンザイム・バイオ・システム)、及びG−ZYME(登録商標)G990ZR(A.ニガー・グルコアミラーゼ及びプロテアーゼ低含量)が適する。
一般的に、全粒粉からのアルコール生産(エタノール)は、四個の主要工程に分けることが出来る。すなわち、粉砕、液化、糖化及び発酵である。グルコアミラーゼ及び本開示のアルファ・アミラーゼは、糖化で用いられることが出来る。
本開示のAmyEまたはその変異体は、例えば、食器洗浄やその他の洗浄用組成物に用いられる洗剤組成物に配合されることが出来る。これらの組成物は、ゲル状、粉末状または液状とすることが出来る。前記組成物は、アルファ・アミラーゼ変異体単独から成るものでもよく、他の澱粉分解酵素、他の洗浄酵素及びその他の洗浄用組成物に一般的に用いられる成分が含まれることが出来る。
実施態様に従って、一以上のAmyEまたはその変異体は、非粉塵飛散性の顆粒、安定化された液体または保護された酵素の形態で洗剤用組成物に含まれることが出来る。非粉塵飛散性の顆粒は、例えば、米国特許番号4,106,991及び4,661,452に開示されるように生産され、任意に、当該技術分野で知られる方法でコーティングされることが出来る。ワックスコーティング用材料の例には、ポリ(エチレンオキシド)生成物、平均分子量が1,000から20,000のポリエチレングリコール(PEG)、エチレンオキサイド単位が16から50のエトキシ化ノニルフェノール、アルコールが12から20の炭素原子を含み、15から80のエチレンオキシド単位がある、エトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪酸のモノ、ジ、またはトリグリセリドが含まれる。流動床での使用に適したフィルムコーティング用材料の例は、例えば、英国特許番号GB1,483,591に開示されている。酵素調製液は、例えば、プロピレングリコール等のポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸を既存の方法で添加して安定化されることが出来る。その他の酵素安定剤も当該技術分野でよく知られている。保護された酵素は、例えば、米国特許番号US5,879,920(ダニスコA/S)または欧州特許番号EP238216で開示される方法に従って調製されることが出来る。ポリオールは、タンパク質の安定剤である他、タンパク質の溶解性を向上させることが長く知られている。例えば、Kaushik他、J.Biol.Chem.、第278巻、26458−65ページ(2003年)及びその引用文献、及びM.Conti他、J.Chromatography、第757巻、237−245ページ(1997年)を参照されたい。
適したプロテアーゼには、動物、植物または微生物由来のプロテアーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も適する。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ、例えば、アルカリ性微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼであることが出来る。アルカリ性プロテアーゼの例は、ズブチリシン、特に、バチルス種、例えば、ズブチリシン・ノボ(subtilisin Novo)、ズブチリシン・カールスバーグ(subtilisin Carlsberg)、ズブチリシン309、ズブチリシン147及びズブチリシン168(例えば、国際公開番号WO89/06279を参照されたい)等に由来するプロテアーゼである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン(例えば、豚または牛由来)及びフサリウムプロテアーゼ(例えば、国際公開番号WO89/06270、WO94/25583を参照されたい)である。有用なプロテアーゼの例には、国際公開番号WO92/19729及びWO98/20115で記載される変異体が含まれるが、それらに限られない。適した市販のプロテアーゼ酵素には、Alcalase(登録商標)、Savinase(登録商標)、Primase(商標)、Duralase(商標)、Esperase(登録商標)及びKannase(商標)(ノボ・ノルディスクA/S)、Maxatase(登録商標)、Maxacal(商標)、Maxapem(商標)、Properase(商標)、Purafect(登録商標)、Purafect OxP(商標)、FN2(商標)及びFN3(商標)(ダニスコA/S)が含まれる。
適したリパーゼには、細菌または菌類由来のリパーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。有用なリパーゼの例は、例えば、H.ラヌギノサ(lanuginosa)由来(例えば、欧州特許番号EP258068及びEP305216を参照されたい)、H.インソレンス(insolens)由来(例えば、国際公開番号WO96/13580を参照されたい)等のフミコーラ(Humicola)(同義語サーモミセス)由来のリパーゼ、シュードモナス(Pseudomonas)リパーゼ(例えば、P.アルカリゲネス(alcaligenes)またはP.シュードアルカリゲネス(pseudoalcaligenes)由来(例えば、欧州特許番号EP218272を参照されたい)、P.セパシア(cepacia)(例えば、欧州特許番号EP331376を参照されたい)、P.スタッツェリ(stutzeri)(例えば、英国特許番号GB1,372,034を参照されたい)、P.フルオレセンス(fluorescens)、シュードモナス株SD705(例えば、国際公開番号WO95/06720及びWO96/27002を参照されたい)、P.ウィスコンシネシス(wisconsinensis)(例えば、国際公開番号WO96/12012を参照されたい)、バチルス・リパーゼ(例えば、B.スブチリス由来、例えば、Dartois他、Biochemica Biophysica Acta、第1131巻、253−360ページ(1993年)を参照されたい)、B.ステアロサーモフィルス(例えば、日本国特許番号JP64/744992を参照されたい)、またはバチルス・プミルス(pumilus)(例えば、国際公開番号WO91/16422を参照されたい)が含まれるが、それらに限られない。配合剤での使用が意図される追加のリパーゼ変異体は、例えば、国際公開番号WO92/05249、WO94/01541、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、WO97/07202、欧州特許番号EP407225及びEP260105で記載されるものが含まれる。いくつかの市販のリパーゼ酵素の例には、Lipolase(登録商標)及びLipolas
e(登録商標)Ultra(ノボ・ノルディスクA/S社)が含まれる。
適したポリエステラーゼには、国際公開番号WO01/34899(ダニスコA/S)及び国際公開番号WO01/14629(ダニスコA/S)に記載されるものが含まれるが、これらに限られず、また本明細書に記載の他の酵素との組み合わせも含まれることが出来る。
前記組成物は、非変異体アルファ・アミラーゼのような他のアルファ・アミラーゼと組み合わされることが出来る。このようなアルファ・アミラーゼには、例えば、Duramyl(登録商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(登録商標)及びBAN(商標)(ノボ・ノルディスクA/S)、Rapidase(登録商標)及びPurastar(登録商標)(ダニスコA/S)等に限られない市販のアルファ・アミラーゼが含まれることが出来る。
前記洗剤用組成物にセルラーゼを添加することが出来る。適したセルラーゼには、細菌または菌類由来のセルラーゼが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。適したセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、シエラビア族、アクレモニウム属由来のセルラーゼが含まれ、例えば、米国特許番号4,435,307、5,648,263、5,691,178、5,776,757及び国際公開番号WO89/09259で開示されるフミコーラ・インソレンス、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、フザリウム・オキシスポルム由来の菌性セルラーゼが含まれる。使用が意図されるセルラーゼの例には、衣料に対しカラーケア(color care)の利点を有するものである。このようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許EP0495257、EP0531372、国際公開番号WO99/25846(ダニスコA/S)、WO96/11262、WO96/29397及びWO98/08940で記載されるセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、例えば、国際公開番号WO94/07998、WO98/12307、WO95/24471、PCT/DK98/00299、欧州特許番号EP531315、米国特許番号5,457,046、5,686,593及び5,763,254で記載されるセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼには、Celluzyme(登録商標)及びCarezyme(登録商標)(ノボ・ノルディスクA/S)、Clazinase(商標)及びPuradax(登録商標)HA(ダニスコA/S)及びKAC−500(B)(商標)(花王株式会社)が含まれる。
前記組成物での使用が意図される適したペルオキシダーゼ/オキシダーゼには、植物、細菌または菌類由来のものが含まれる。化学的に修飾された変異体またはタンパク質操作された変異体も含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、コプリヌス(Coprinus)属、例えば、国際公開番号WO93/24618、WO95/10602及びWO98/15257で記載されるC.シネレウス(cinereus)及びその変異体由来のペルオキシダーゼが含まれる。市販のペルオキシダーゼには、例えば、Guardzyme(商標)(ノボ・ノルディスクA/S)が含まれる。
本願はまた、一以上のAmyEまたはその変異体を用いた布を処理する(例えば、織物を糊抜きする)組成物及び方法が意図される。AmyEまたはその変異体を、任意の布処理方法に用い得ることは公知である(例えば、米国特許番号6,077,316を参照されたい)。例えば、一の側面において、溶液中で布を酵素変異体と接触させる方法により、布の手触りと外観を改良することが出来る。一の側面において、前記布は、加圧下の溶液中で処理される。
1.1.プラスミド構築
配列番号1のAmyEまたはC末端切断AmyE変異体、AmyE−tr(配列番号2)をコードする核酸を、米国特許番号5,024,943で開示される、B.ズブチリスpHPLT発現ベクターにクローン化した。図5は、AmyE−trをコードする核酸を含むベクターを示す。
「ori−pUB」は、pUB110からの複製開始点である:
「reppUB」は、pUB110からのレプリカーゼ遺伝子であり、「neo」は、pUB110からのネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子である:
「bleo」はブレオマイシン耐性マーカーであり、「Tlat」はB.リケニフォルミス・アミラーゼの転写ターミネーターである。
配列番号19:プライマーAMYENOPST−R 5’ CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG 3’
配列番号20:プライマーAMYENOPST−F 5’ CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG 3’
配列番号21:プライマーHPAIAMYE−R 5’ CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC 3’
配列番号22:プライマーHPAIAMYE466−R 5’ CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG 3’
配列番号23:プライマーAMYE SEQ−F1 5’ TACACAAGTACAGTCCTATCTG 3’
配列番号24:プライマーAMYE SEQ−F2 5’ CATCCTCTGTCTCTATCAATAC 3’
プラスミドpME629.5及びpME630.7は、翻訳後に切断される31残基のシグナル配列と共にAmyEを発現する。上記Yang他(1983年)により言及されるように、続く10のN−末端アミノ酸は、別途処理される。
AmyE全長及び切断クローンの形質転換体を、10μg/mLのネオマイシン、1%の不溶性デンプンを用いてLA上で選択し、37℃で一晩インキュベートした。コロニーのまわりに透明(または輪形)を示す形質転換体を選択し、バイアルを後の研究のために作製した。形質転換体のプレ培養を、10μg/mLのネオマイシンを加えたLBで8時間増殖させた。次に、30μLのこのプレ培養を、10μg/mLのネオマイシン及び5mM CaCl2で補給された、30mLの培養地(下記に記載)で満たされた、250mLフラスコに添加した。培養地は、主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅調な細胞増殖のため1%ソイトーン(soytone)を補給した、MOPS緩衝液ベースの強化半合成培地であった。振盪フラスコを、250rpmで混合しながら、37℃で60−65時間インキュベートした。培養を、20分間5000rpmでの遠心分離で円錐管に採取した。AmyE全長及びAmyE切断タンパク質の両方が多量に発現されたことから、培養上清を、それ以上の精製を行わずにアッセイに用いた。
下記の実施例で、以下のアッセイを用いた。下記に提供されるプロトコールの任意の逸脱も実施例で示される。これらの実験において、分光光度計を、反応の終了後に形成された生産物の吸光度を測定するために用いた。
サンプル上清中のタンパク質濃度を、ブラッドフォードQuickStart(商標)Dye試薬(バイオラッド、カリフォルニア州)を用いて測定した。サンプルを、280rpmで振とうし、高湿度の通気で3日間37℃のマイクロタイタープレート(MTP)で増殖した培養からの培養液をろ過して得た。培養ろ液の10μLのサンプルを、第2MTPのウェル内で200μLのブラッドフォードQuickStart(商標)Dye試薬と組み合わせた。完全な混合の後、MTPを室温で少なくとも10分間インキュベートした。気泡を除去し、OD(光学密度)を595nmで測定した。タンパク質濃度を算出するため、(植菌されていないウェルからの)バックグラウンド測定値をサンプル測定値から引き算した。
AmyEはトランスグルコシダーゼ活性を示す。すなわち、AmyEは、マルトースからの三糖の生成を触媒する。図6は、マルトースを加えてAmyEをインキュベートした後の三糖のHPLC検出を示す。図7は、AmyE媒介マルトトリオース合成の反応組成物を時間にわたって示す。AmyEの酵素活性を、そのトランスグルコシダーゼ活性に基づき測定した。マルトースから三糖の一ミクロモルを毎分生産するアッセイ条件下で要求される酵素量から、AmyEの一単位を定義した。代表的なアッセイにおいて、AmyEのサンプルの一部0.1mlを、リン酸緩衝液、pH4.5中の30%マルトース5mlに添加し、60℃で60分間インキュベートした。その反応を、10分間熱湯浴槽にサンプルを置くことで終了させた。サンプル中に存在する三糖の量を、HPLCで測定した。
グルコアミラーゼ活性を、p−ニトロフェニル−アルファ−D−グルコピラノシド(PNPG)からグルコース及びp−ニトロフェノールへの加水分解を触媒するその能力に基づいたアッセイを用いて測定した。アルカリのpHにおいて、遊離されたニトロフェノールは、グルコアミラーゼ活性に比例した黄色を示し、400nmでモニタリングされる。pH4.2及び60℃で可溶性デンプン基質(4%)から、毎時グルコースとして計算される1μモルの還元糖を生産する酵素量として、一のグルコアミラーゼ活性単位(GAU)を定義した。
プルラナーゼ活性を、可溶性赤プラン(red−pullan)基質を利用する比色法で測定した。プルラナーゼは、赤プラン基質の加水分解を触媒することができ、それにより、染色基質からの可溶性断片の遊離がもたらされる。酵素反応は、95%のエタノール溶液で基質を沈殿させることにより終了する。上清を、501nmでの分光測光法で測定した。色彩強度の程度は、酵素活性に比例する。pH4.5及び60℃でプルランから、毎分グルコースとして一の等価還元電位を遊離する酵素量として、一の酸安定プルラナーゼ単位(ASPU)を定義した。
400ppmの尿素を含むイリノイ川エネルギー(Illinois River Energy)から得られた液化物(liquefact)(31%DS)の二バッチを、(5N H2SO4を用いて)pH4.3及びpH5.8に調節した。100gの基質を、125mLのエルレンマイヤーフラスコに添加した。AmyE−tr及びSPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼを、0.20mg/g DSで供給した。発酵では、DI水で〜45分間あらかじめ水和された0.2mlの10%(w/v)レッドスターエタノール紅色酵母(Red Star Ethanol Red yeast)を植菌した。48時間の発酵のため、フラスコを320rpmの撹拌バーと共に32℃でインキュベートした。
400ppmの尿素を含む32%DSコーンフラワー基質の二バッチを、(5N H2SO4を用いて)pH4.3及びpH5.8に調節した。100gの基質を、125mlのエルレンマイヤーフラスコに添加した。全長AmyE(配列番号1)及びAmyE−tr(配列番号2)を0.20mg/g DSで供給し、A.カワチイ・アルファ・アミラーゼ(AkAA、配列番号6)を1.5SSU/g DSで供給した。AkAAのアミノ酸配列は、米国特許番号7,332,319の配列番号4に開示される。また、全粒トウモロコシを加水分解するAmyE及びAmyE−trの能力を、0.5GAU/gで供給されたT.リーセイ・グルコアミラーゼ(TrGA、配列番号7)と1.5SSU/g DSで供給されたA.カワチイ・アルファ・アミラーゼとの混合物とで比べた。TrGAのアミノ酸配列は、国際公開番号WO06/060062の配列番号3に開示される。発酵では、DI水で〜45分間あらかじめ水和された0.2mlの10%(w/v)レッドスターエタノール紅色酵母(Red Star Ethanol Red yeast)を植菌した。72時間の発酵のため、フラスコを300rpmの撹拌バーと共に32℃でインキュベートした。
マルトース及びマルトヘプタオースの加水分解
0.5%のマルトースまたはマルトヘプタオース溶液を、50mM酢酸ナトリウム、pH4.5または5.6で、または50mMリンゴ酸、pH5.6で、各実験で指定されるように調製した。全ての酵素サンプルを、1mg/mLに初めに希釈した。反応混合物を、1ppmの最終酵素濃度にするため、適切な基質溶液を用いた酵素の希釈で調製し、次に、200μL分をねじ蓋の無菌チューブに移した後、37℃のインキュベーターに置いた。その反応を、10mM水酸化ナトリウムで10倍に希釈し、所定時間で止めた。
不溶性顆粒デンプンの加水分解の測定のため、精製AmyE(24.5g/l)を、リンゴ酸緩衝剤、pH5.6で20.4ppmの最終濃度に希釈した。次に、前記タンパク質を、リンゴ酸緩衝剤、pH5.6で調製された5%コーンフラワー溶液に、1ppmの最終濃度になるよう添加した。また、前記混合物を、32℃のシェーカー内でインキュベートした。サンプルを周期的に採取し、反応を止めるため、50mM NaOHで10倍に希釈した。
糖化生産物の組成物を、HPLCシステム(ベックマン・システム・ゴールド32カラット・フラートン、カリフォルニア州)で測定した。50℃で維持された前記システムを、Rezex 8 u8% H単糖カラム及び屈折率(RI)検出器(ERC−7515A、アンスペック・カンパニー・インク(Anspec Company,Inc.))に装備した。希硫酸(0.01N)を、0.6ml/分の流速での移動相に流した。反応混合物の4.0%溶液の20μlを、カラムに注入した。溶出プロフィルを45分間得た。糖の分布及び各糖の量を、事前に測定された基準から判定した。
一定温度にするため、糖化されたシロップのサンプルを、10−30分間60℃の水浴槽でインキュベートした。しかしながら、前記インキュベーションは、一時間より長くあるべきでない。必要な場合、DS値を、試験前に35%±0.5%に調節した。サンプルを、磁気撹拌機上でよく混合し、シリンジで遠心分離管に移した。サンプルを、10分間2,500rpm(1,350×g)で遠心分離機にかけた。沈殿物が存在する場合、沈殿物は、遠心分離管の底に目で見える。
カラムカバーを、60℃で維持した。二個のろ紙ディスクを、挿入し、Oリングガスケットに嵌まるまで接続金具内のねじで留めた。計量された250mlの真空フラスコを設置する一方、100mlの水を、出口を塞さいだカラムに添加した。安定した真空が23−24インチに達するまで、真空ポンプを作動した。チューブ出口を開け、タイマーを開始した。100mlの水は、1分10秒間から1分間30秒間でのろ過が必要とされる。時間が長すぎるか、短すぎる場合、紙が張っているかを確かめるために紙をチェックされたい。紙を乾燥のために引き抜いた後、出口チューブを締めた。出口チューブのクランプを外し、ポンプをそのまま作動させた。フラスコを、計量された250mlのろ過フラスコと取り替えた。およそ2.0グラムのろ過促進剤を、250mlビーカー内の100グラムの試験液と混合した。サンプルを磁性プレート上で攪拌する一方、標的の分量でサンプルを採取するためにシリンジを用いた。電子ばかりが、この工程で用いられることが出来る。懸濁液内で微粒子を維持する一方、全量を、漏斗を使ってカラムに素早く移した。出口チューブのクランプを開け、タイマーを開始した。液がろ床の上部に到着するまで、ろ液を集め、その時間を記録した。集めたろ液は、その後の試験、例えば、ヨウ素試験等に適する。
糖液のヨウ素試験のために、0.2mlの糖液を10mlのDI水で希釈した。希釈した糖液を、10分間沸騰させ、次に、氷浴内で冷やした。0.5mlのヨード液(0.02M)を、冷えた糖液サンプルに添加した。
(酢酸ナトリウム緩衝液を用いて)pH4.5及びpH5.6でAmyEがマルトースをグルコースに転換する能力を、実施例2.7に記載のグルコース生成アッセイを用いて試験した。その反応を、2、5及び8日後に分析した。図8で示すように、AmyE(配列番号1)、AmyE−tr(配列番号2)及びAmy31A(配列番号3)は、マルトースをグルコースに効果的に転換した。しかし、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ及びAmyS(配列番号4、34アミノ酸のリーダー配列で示される)は、これらの条件下で最少量のグルコース生成のみを示した。
DP7または不溶性の非加熱顆粒デンプンの加水分解を触媒する、AmyE(配列番号1)及びAmyE−tr(配列番号2)の能力を試験した。不溶性デンプンから生産された糖の検出に用いられたHPLC方法は、実施例2.7に記載する。反応が開始された後の分解産物を多様な時間でのHPLC解析で数量化した。
従来のエタノール発酵での切断AmyEの性能を、実施例2.5に記載の従来のエタノール発酵アッセイを用いて、イリノイ川エネルギー液化物(31%DS)について試験した。AmyE−tr(配列番号2)の性能を、pH4.3及びpH5.8でのSPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼ(ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン、AmyR、配列番号5)と比較した。発酵を、48時間行なった。AmyE−tr及びSPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼを、0.2mg/g DSで供給した。図13で示すように、pH5.8でAmyE−trにより生産された最終エタノール収率は、12.0%(v/v)であった。pH4.3でAmyE−trにより生産された最終エタノール収率は、7.3%(v/v)であった。SPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼが存在する状態での最終エタノール収率は、pH4.3で2.7%(v/v)及びpH5.8で3.9%(v/v)であった。従って、AmyE−trは、液化物の従来のエタノール発酵で、SPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼより顕著に多くのエタノールを生産する。この実施例は、pH4.3よりもpH5.8で、AmyE−trはより多くのエタノールを生産することをさらに実証する。
pH4.3及びpH5.8での不溶性顆粒(非加熱)デンプンのエタノールへの加水分解を触媒する、AmyE(配列番号1)及びAmyE−tr(配列番号2)の能力を、実施例2.7で記載の全粒トウモロコシ・アッセイにおけるエタノール発酵を用いて比較した。AmyE及びAmyE−trのエタノール生産性能を、1.5SSU/gで供給されたA.カワチイ・アルファ・アミラーゼ(AkAA、配列番号6)、0.5GAU/gで供給されたT.リーセイ・グルコアミラーゼ(TrGA、配列番号7)プラス1.5SSU/gで供給されたA.カワチイ・アルファ・アミラーゼとの混合物とで比較した。AmyE全長及び切断AmyEの両方を、0.2mg/g DSで供給した。
糖化内の補助的な酵素としてのAmyEの能力を、液化デンプン基質にAmyE及びTrGAの多様な組み合わせを適用することで試験した。32%dsの精製デンプン(カーギル、ミネアポリス、ミネソタ州)含有の水性スラリー、10ppmのCa2+及び100ppmの二酸化硫黄(SO2)を、一定の攪拌と共に一晩混合した。スラリーのpHを、炭酸ナトリウム(20%w/v)で約5.8に調節した。スラリーのボーメ度は、およそ22.3であった。熱安定性アルファ・アミラーゼSPEZYME(登録商標)FRED(ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン)を、0.56kg/MT dsトウモロコシに連続して添加した。スラリーを、第一加熱のために約107−109℃の平均温度で加熱し、6分間の滞留時間と共に0.5gpmでM101ハイドロヒーターを装備したパイロットプラント噴流を通って送った。サンプルを出口で集め、95℃の水浴槽に置いた。第2液化を、いずれの酵素も追加しないで、95℃でさらに行なった。デンプン基質の最終DEが10DEに達するまで、第2液化を継続した。次に、95℃でデンプンスラリーのpHをpH4.5に低下させることで液化を終了した。デンプン液化物または液化デンプン基質とも呼ばれる、加工されたスラリーを、以下の糖化実験で用いた。
他のバチルス・アルファ・アミラーゼ、例えば、SPEZYME(登録商標)FRED及びGC358(両方ともダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョンから)について、実施例7のように糖化での特性解析を行った。液化デンプン基質の糖化を、TrGAと共に、pH5.2及び32℃で行った。糖の組成物(発酵性糖及びより高級な糖)を、6、18、24及び54時間で採取したサンプルで測定した。表2で示すその結果は、グルコアミラーゼへのAmyEの補給が他のバチルス・アルファ・アミラーゼの対応量の補給よりも、より多くの発酵性糖を生産出来ることを示す。この所見は、マルトースをグルコースに転換し、かつDP7を加水分解する、AmyEの優れた能力に関して実施例5−6で記載することと一貫している。従って、AmyEの有利な特性は、他のバチルス・アルファ・アミラーゼで普遍的に共有されるものではない。
糖化されたデンプンがヨウ素と共に試験された場合、加水分解を免れた任意のアミロースはヨウ素に結合し、特有の青い色を生じる。これはヨウ素陽性糖(IPS)と呼ばれ、液化/糖化効率の指標となる。IPSの存在は不完全なデンプン分解を表わすため、IPSはデンプン加工用途において非常に望ましくない。図15は、TrGAへのAmyEの補給がろ液内のIPSの存在を顕著に減少させたことを示す。
(1)AmyE、(2)AnGA(OPTDEX L−400、ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン)、及び(3)プルラナーゼ(OPTIMAX(商標)L−1000、ダニスコUS・インク、ジェネンコー・ディビジョン)の異なる量で、pH4.5及び60℃で液化デンプン基質(32%ds)についてさらに糖化を行った。糖の組成物(発酵性糖及びより高級な糖)を、6、18、24、48及び72時間で採取したサンプルのHPLCまたはヨード染色により測定した。その結果を表3に収集した。
糖化において使用可能な酵素としてのAmyEの能力をさらに特性解析するため、グルコアミラーゼ混合物と同様に、異なるグルコアミラーゼと組み合わされたAmyEを、液化デンプン基質に適用した。糖化を、pH5.2及び32℃で行った。糖の組成物(発酵性糖及びより高級な糖)を、6、18、24及び48時間で採取したサンプルで測定した。表4で示すように、他のグルコアミラーゼまたはグルコアミラーゼ配合物へのAmyEの追加は、全体の発酵性糖の増加した値及び非発酵性糖の顕著に減少した値を結果として生じた。
生物燃料生産における酵素としてAmyEを用いる利点を、さらに解析した。イリノイ川エネルギー(ロシェル、イリノイ州)からの全粒トウモロコシ液化物を、室温に置く前に75℃で溶かした。pHを5.5に保った。その液化物を、150グラムの分量で250mlエルレンマイヤーフラスコに分配した。各フラスコ内の液化物に、500μlの20%酵母/水溶液及び600μlの10%尿素/水溶液(最終濃度400ppm)を加えた。各発酵実験に供給された酵素タンパク質の合計は、0.16mg/g dsであった。TrGAに供給された量は、0.325GAU/g dsの標準GA供給量と同量である。酵素及び/または酵素の組み合わせを、表6で示す実験計画法に従って供給した。
配列リスト
配列番号1:全長バチルス・ズブチリスAmyEのアミノ酸配列。天然シグナル配列は示されない:
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL
451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT
501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL
551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD
601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH
配列番号2:切断バチルス・ズブチリスAmyE(AmyE−tr)のアミノ酸配列。天然シグナル配列は示されない:
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD
配列番号3:バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ変異体Amy31Aのアミノ酸配列(UniProtKB/TrEMBL登録番号O82953)。天然シグナル配列は太字で示す:
1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG
51 TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA
151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK
201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK
451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK
501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ
551 EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM
601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN
651 SGLNGYLPH
配列番号4:切断ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ(AmyS、a/k/a「Ethyl3」)のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す:
1 MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW
251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY
301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD
351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD
401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE
451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG
501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT
配列番号5:ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ(AmyR、SPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼ)のアミノ酸配列:
1 AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT
51 SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA
101 DVVFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT
151 YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM
201 YADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FSFFPDWLSY
251 VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK
301 SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA
351 YAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH
401 DYLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY
451 DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPRKTT
配列番号6:アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ(AkAA)のアミノ酸配列:
1 MRVSTSSIAL AVSLFGKLAL GLSAAEWRTQ SIYFLLTDRF GRTDNSTTAT
51 CNTGDQIYCG GSWQGIINHL DYIQGMGFTA IWISPITEQL PQDTSDGEAY
101 HGYWQQKIYN VNSNFGTADD LKSLSDALHA RGMYLMVDVV PNHMGYAGNG
151 NDVDYSVFDP FDSSSYFHPY CLITDWDNLT MVQDCWEGDT IVSLPDLNTT
201 ETAVRTIWYD WVADLVSNYS VDGLRIDSVE EVEPDFFPGY QEAAGVYCVG
251 EVDNGNPALD CPYQKYLDGV LNYPIYWQLL YAFESSSGSI SNLYNMIKSV
301 ASDCSDPTLL GNFIENHDNP RFASYTSDYS QAKNVLSYIF LSDGIPIVYA
351 GEEQHYSGGD VPYNREATWL SGYDTSAELY TWIATTNAIR KLAISADSDY
401 ITYANDPIYT DSNTIAMRKG TSGSQIITVL SNKGSSGSSY TLTLSGSGYT
451 SGTKLIEAYT CTSVTVDSNG DIPVPMASGL PRVLLPASVV DSSSLCGGSG
501 NTTTTTTAAT STSKATTSSS SSSAAATTSS SCTATSTTLP ITFEELVTTT
551 YGEEVYLSGS ISQLGEWDTS DAVKLSADDY TSSNPEWSVT VSLPVGTTFE
601 YKFIKVDEGG SVTWESDPNR EYTVPECGSG SGETVVDTWR
配列番号7:トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ(TrGA)のアミノ酸配列(国際公開番号WO2006/060062の配列番号3)。プロ配列はイタリック体で示す:
1 MHVLSTAVLL GSVAVQKVLG RPGSSGLSDV TKRSVDDFIS TETPIALNNL
51 LCNVGPDGCR AFGTSAGAVI ASPSTIDPDY YYMWTRDSAL VFKNLIDRFT
100 ETYDAGLQRR IEQYITAQVT LQGLSNPSGS LADGSGLGEP KFELTLKPFT
151 GNWGRPQRDG PALRAIALIG YSKWLINNNY QSTVSNVIWP IVRNDLNYVA
201 QYWNQTGFDL WEEVNGSSFF TVANQHRALV EGATLAATLG QSGSAYSSVA
251 PQVLCFLQRF WVSSGGYVDS NINTNEGRTG KDVNSVLTSI HTFDPNLGCD
301 AGTFQPCSDK ALSNLKVVVD SFRSIYGVNK GIPAGAAVAI GRYAEDVYYN
351 GNPWYLATFA AAEQLYDAIY VWKKTGSITV TATSLAFFQE LVPGVTAGTY
401 SSSSSTFTNI INAVSTYADG FLSEAAKYVP ADGSLAEQFD RNSGTPLSAL
451 HLTWSYASFL TATARRAGIV PPSWANSSAS TIPSTCSGAS VVGSYSRPTA
501 TSFPPSQTPK PGVPSGTPYT PLPCATPTSV AVTFHELVST QFGQTVKVAG
551 NAAALGNWST SAAVALDAVN YADNHPLWIG TVNLEAGDVV EYKYINVGQD
601 GSVTWESDPN HTYTVPAVAC VTQVVKEDTW QS
配列番号8:SPEZYME(登録商標)FREDアルファ・アミラーゼのアミノ酸配列:
1 ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS
51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD
101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTH FHFPGRGSTY
151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSSEN GNYDYLMYAD
201 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE
251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG
301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF
351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH
401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH
451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR
配列番号9:配列番号1のAmyEをコードするヌクレオチド配列:
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGG
CTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATATTGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGATCAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATGGACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAAAACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGTTTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCCAGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCCTGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGATACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTGGCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT
配列番号10:AmyE−trをコードするヌクレオチド配列(配列番号2):
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGG
CTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT
配列番号11:B.ズブチリスAmy31Aをコードするヌクレオチド配列(配列番号3):
TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAACACGCTGACCCAGAACATGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGAAGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAGATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCGGCTGAGAAATATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAGCGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTGGAGCGACCGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAAAACACCGAAGTACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTACGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAACATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACACCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCTGAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAACTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACGACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGAGCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTTCTTTAGCCGTCCGGAAGGTGGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGATCGTGGCTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGG
TGAATCAGTTCCATAATGAGATGGCAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGGCAGCAAAGGCGTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAACTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGCTGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCCGCACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCGTCACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGAAACTGCTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACTTATAACGTTAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGAAAGACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGGTAATGTGAACGCTTACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCTTGGCCAGGTAAAGCCATGACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCAATGCGGATACCGCAGATGCGAAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCAAAACCATCCGGGCTTTGACTACGTACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC
配列番号12:ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスAmySをコードするヌクレオチド配列(配列番号4):
GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCC
AAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC
配列番号13:SPEZYME(登録商標)XTRAアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号5):
GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCAGGGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAAC
CCGGCCAAGCGCTTCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC
配列番号14:アスペルギルス・カワチイ・アルファ・アミラーゼ(AkAA)遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号6):
ATGAGAGTGTCGACTTCAAGTATTGCCCTTGCTGTGTCCCTTTTTGGGAAGCTGGCCCTTGGGCTGTCAGCTGCAGAATGGCGCACTCAATCCATCTACTTCCTTTTGACGGATCGGTTCGGTAGGACGGACAATTCGACTACAGCTACGTGCAATACGGGTGACCAAATCTACTGTGGTGGAAGTTGGCAAGGAATTATCAACCATCTGGACTATATCCAGGGCATGGGATTCACAGCTATCTGGATCTCGCCTATCACTGAGCAGCTACCCCAGGATACTTCGGATGGTGAAGCCTACCATGGATACTGGCAGCAGAAGATATACAATGTGAACTCCAACTTCGGCACGGCAGATGATCTGAAGTCCCTCTCCGATGCTCTTCACGCCCGCGGAATGTACCTCATGGTCGACGTCGTCCCTAACCACATGGGCTACGCAGGTAACGGCAACGATGTGGATTACAGCGTCTTCGACCCCTTCGACTCCTCCTCCTACTTCCATCCATACTGCCTCATCACAGATTGGGACAACTTGACCATGGTCCAAGACTGTTGGGAGGGTGACACCATCGTGTCTCTGCCAGATCTGAACACCACGGAAACCGCCGTGAGAACCATTTGGTACGATTGGGTAGCCGACCTGGTATCCAACTACTCAGTCGACGGCCTCCGTATCGACAGTGTCGAAGAAGTCGAACCCGACTTCTTCCCGGGCTACCAAGAAGCAGCAGGAGTCTACTGCGTCGGTGAAGTCGACAACGGCAACCCTGCTCTCGACTGCCCATACCAAAAATATCTAGATGGTGTTCTCAACTATCCCATCTACTGGCAACTCCTCTACGCCTTTGAATCCTCCAGCGGCAGCATCAGCAACCTCTACAACATGATCAAATCCGTCGCCAGCGACTGCTCCGATCCGACCCTCCTGGGCAACTTTATCGAAAACCACGACAACCCCCGCTTCGCCTCCTACACATCCGACTACTCCCAAGCCAAAA
ACGTCCTCAGCTACATCTTCCTCTCCGACGGCATCCCCATCGTCTACGCCGGCGAAGAACAGCACTACTCCGGCGGCGACGTGCCCTACAACCGCGAAGCTACCTGGCTATCAGGCTACGACACCTCCGCGGAGCTCTACACCTGGATAGCCACCACAAACGCGATCCGGAAACTAGCTATCTCAGCAGACTCGGACTACATTACTTACGCGAACGACCCAATCTACACAGACAGCAACACCATCGCGATGCGCAAAGGCACCTCCGGCTCCCAAATCATCACCGTCCTCTCCAACAAAGGCTCCTCCGGAAGCAGCTACACCCTCACCCTCAGCGGAAGCGGCTACACGTCCGGCACGAAGCTCATCGAAGCGTACACCTGCACGTCCGTGACGGTGGACTCGAACGGGGATATCCCTGTGCCGATGGCTTCGGGATTACCTAGAGTTCTCCTCCCTGCTTCGGTGGTTGATAGTTCTTCGCTTTGTGGGGGGAGTGGTAACACAACCACGACCACAACTGCTGCTACCTCCACATCCAAAGCCACCACCTCCTCTTCTTCTTCTTCTGCTGCTGCTACTACTTCTTCATCATGCACCGCAACAAGCACCACCCTCCCCATCACCTTCGAAGAACTCGTCACCACTACCTACGGGGAAGAAGTCTACCTCAGCGGATCTATCTCCCAGCTCGGAGAGTGGGATACGAGTGACGCGGTGAAGTTGTCCGCGGATGATTATACCTCGAGTAACCCCGAGTGGTCTGTTACTGTGTCGTTGCCGGTGGGGACGACCTTCGAGTATAAGTTTATTAAGGTCGATGAGGGTGGAAGTGTGACTTGGGAAAGTGATCCGAATAGGGAGTATACTGTGCCTGAATGTGGGAGTGGGAGTGGGGAGACGGTGGTTGATACGTGGAGGTAG
配列番号15:トリコデルマ・リーセイ・グルコアミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号7):
1 ATGCACGTCC TGTCGACTGC GGTGCTGCTC GGCTCCGTTG CCGTTCAAAA GGTCCTGGGA
61 AGACCAGGAT CAAGCGGTCT GTCCGACGTC ACCAAGAGGT CTGTTGACGA CTTCATCAGC
121 ACCGAGACGC CTATTGCACT GAACAATCTT CTTTGCAATG TTGGTCCTGA TGGATGCCGT
181 GCATTCGGCA CATCAGCTGG TGCGGTGATT GCATCTCCCA GCACAATTGA CCCGGACTAC
241 TATTACATGT GGACGCGAGA TAGCGCTCTT GTCTTCAAGA ACCTCATCGA CCGCTTCACC
301 GAAACGTACG ATGCGGGCCT GCAGCGCCGC ATCGAGCAGT ACATTACTGC CCAGGTCACT
361 CTCCAGGGCC TCTCTAACCC CTCGGGCTCC CTCGCGGACG GCTCTGGTCT CGGCGAGCCC
421 AAGTTTGAGT TGACCCTGAA GCCTTTCACC GGCAACTGGG GTCGACCGCA GCGGGATGGC
481 CCAGCTCTGC GAGCCATTGC CTTGATTGGA TACTCAAAGT GGCTCATCAA CAACAACTAT
541 CAGTCGACTG TGTCCAACGT CATCTGGCCT ATTGTGCGCA ACGACCTCAA CTATGTTGCC
601 CAGTACTGGA ACCAAACCGG CTTTGACCTC TGGGAAGAAG TCAATGGGAG CTCATTCTTT
661 ACTGTTGCCA ACCAGCACCG AGCACTTGTC GAGGGCGCCA CTCTTGCTGC CACTCTTGGC
721 CAGTCGGGAA GCGCTTATTC ATCTGTTGCT CCCCAGGTTT TGTGCTTTCT CCAACGATTC
781 TGGGTGTCGT CTGGTGGATA CGTCGACTCC AACATCAACA CCAACGAGGG CAGGACTGGC
841 AAGGATGTCA ACTCCGTCCT GACTTCCATC CACACCTTCG ATCCCAACCT TGGCTGTGAC
901 GCAGGCACCT TCCAGCCATG CAGTGACAAA GCGCTCTCCA ACCTCAAGGT TGTTGTCGAC
961 TCCTTCCGCT CCATCTACGG CGTGAACAAG GGCATTCCTG CCGGTGCTGC CGTCGCCATT
1021 GGCCGGTATG CAGAGGATGT GTACTACAAC GGCAACCCTT GGTATCTTGC TACATTTGCT
1081 GCTGCCGAGC AGCTGTACGA TGCCATCTAC GTCTGGAAGA AGACGGGCTC CATCACGGTG
1141 ACCGCCACCT CCCTGGCCTT CTTCCAGGAG CTTGTTCCTG GCGTGACGGC CGGGACCTAC
1201 TCCAGCAGCT CTTCGACCTT TACCAACATC ATCAACGCCG TCTCGACATA CGCCGATGGC
1261 TTCCTCAGCG AGGCTGCCAA GTACGTCCCC GCCGACGGTT CGCTGGCCGA GCAGTTTGAC
1321 CGCAACAGCG GCACTCCGCT GTCTGCGCTT CACCTGACGT GGTCGTACGC CTCGTTCTTG
1381 ACAGCCACGG CCCGTCGGGC TGGCATCGTG CCCCCCTCGT GGGCCAACAG CAGCGCTAGC
1441 ACGATCCCCT CGACGTGCTC CGGCGCGTCC GTGGTCGGAT CCTACTCGCG TCCCACCGCC
1501 ACGTCATTCC CTCCGTCGCA GACGCCCAAG CCTGGCGTGC CTTCCGGTAC TCCCTACACG
1561 CCCCTGCCCT GCGCGACCCC AACCTCCGTG GCCGTCACCT TCCACGAGCT CGTGTCGACA
1621 CAGTTTGGCC AGACGGTCAA GGTGGCGGGC AACGCCGCGG CCCTGGGCAA CTGGAGCACG
1681 AGCGCCGCCG TGGCTCTGGA CGCCGTCAAC TATGCCGATA ACCACCCCCT GTGGATTGGG
1741 ACGGTCAACC TCGAGGCTGG AGACGTCGTG GAGTACAAGT ACATCAATGT GGGCCAAGAT
1801 GGCTCCGTGA CCTGGGAGAG TGATCCCAAC CACACTTACA CGGTTCCTGC GGTGGCTTGT
1861 GTGACGCAGG TTGTCAAGGA GGACACCTGG CAGTCGTAA
配列番号16:AmyL遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号8):
ACAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACACGCCCAATGACGGCCAACATTGGAAGCGTCTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGATGTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCCGGAGAATACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAGTGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGTAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAGCTCCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAGT
CGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGA
配列番号17:配列番号1のAmyEの天然シグナル配列:
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE
配列番号18:プライマーPSTAMYE−F:
CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC
配列番号19:プライマーAMYENOPST−R:
CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG
配列番号20:プライマーAMYENOPST−F:
CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG
配列番号21:プライマーHPAIAMYE−R:
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC
配列番号22:プライマーHPAIAMYE466−R:
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG
配列番号23:プライマーAMYE SEQ−F1:
TACACAAGTACAGTCCTATCTG
配列番号24:プライマーAMYE SEQ−F2:
CATCCTCTGTCTCTATCAATAC
配列番号25:全長ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス・アルファ・アミラーゼ(AmyS、P06279)のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す:
1 MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TALLFCPTGQ PAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGAVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFRGIGKAWD WEVDTENGNY DYLMYADLDM DHPEVVTELK
251 SWGKWYVNTT NIDGFRLDAV KHIKFSFFPD WLSDVRSQTG KPLFTVGEYW
301 SYDINKLHNY IMKTNGTMSL FDAPLHNKFY TASKSGGTFD MRTLMTNTLM
351 KDQPTLAVTF VDNHDTEPGQ ALQSWVDPWF KPLAYAFILT RQEGYPCVFY
401 GDYYGIPQYN IPSLKSKIDP LLIARRDYAY GTQHDYLDHS DIIGWTREGV
451 TEKPGSGLAA LITDGPGGSK WMYVGKQHAG KVFYDLTGNR SDTVTINSDG
501 WGEFKVNGGS VSVWVPRKTT VSTIAWSITT RPWTDEFVRW TEPRLVAWP
配列番号26:全長バチルス・リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼ(AmyL、P06278)のタンパク質配列。シグナル配列は太字で示す:
1 MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAAAAA NLNGTLMQYF EWYMPNDGQH
51 WKRLQNDSAY LAEHGITAVW IPPAYKGTSQ ADVGYGAYDL YDLGEFHQKG
101 TVRTKYGTKG ELQSAIKSLH SRDINVYGDV VINHKGGADA TEDVTAVEVD
151 PADRNRVISG EHRIKAWTHF HFPGRGSTYS DFKWHWYHFD GTDWDESRKL
201 NRIYKFQGKA WDWEVSNENG NYDYLMYADI DYDHPDVAAE IKRWGTWYAN
251 ELQLDGFRLD AVKHIKFSFL RDWVNHVREK TGKEMFTVAE YWQNDLGALE
301 NYLNKTNFNH SVFDVPLHYQ FHAASTQGGG YDMRKLLNST VVSKHPLKAV
351 TFVDNHDTQP GQSLESTVQT WFKPLAYAFI LTRESGYPQV FYGDMYGTKG
401 DSQREIPALK HKIEPILKAR KQYAYGAQHD YFDHHDIVGW TREGDSSVAN
451 SGLAALITDG PGGAKRMYVG RQNAGETWHD ITGNRSEPVV INSEGWGEFH
501 VNGGSVSIYV QR
配列番号27:全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE、NP_388186)。シグナル配列は太字で示す:
1 MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG
51 TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA
151 ISNEVKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK
201 RFLDRALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDAA YANYMDVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FEDQAITAVN RFHNVMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSH GVVLANAGSS SVSINTATKL PDGRYDNKAG AGSFQVNDGK
451 LTGTINARSV AVLYPDDIAK APHVFLENYK TGVTHSFNDQ LTITLRADAN
501 TTKAVYQINN GPDDRRLRME INSQSEKEIQ FGKTYTIMLK GTNSDGVTRT
551 EKYSFVKRDP ASAKTIGYQN PNHWSQVNAY IYKHDGSRVI ELTGSWPGKP
601 MTKNADGIYT LTLPADTDTT NAKVIFNNGS AQVPGQNQPG FDYVLNGLYN
651 DSGLSGSLPH
配列番号28:全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE、NCBI登録番号ABW75769):
1 MFAKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLAGPAA ASAETANKSN ELTAPSIKSG
51 TILHAWNWSF NTLKHNMKDI HDAGYTAIQT SPINQVKEGN QGNKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKEMCAAAEE YGIKVIVDAV INHTTSDYAA
151 ISNEIKSIPN WTHGNTQIKN WSDRWDVTQN SLLGLYDWNT QNTQVQSYLK
201 RFLERALNDG ADGFRFDAAK HIELPDDGSY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDAA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRNLGVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIASRSGS TPLFFSRPEG
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配列番号33:全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE:NCBI登録番号AAQ83841):
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配列番号34:全長バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE、NCBI登録番号BAA31528):
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651 SGLNGYLPH
Claims (24)
- グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼを含む、デンプンを糖化するための組成物であって、前記アルファ・アミラーゼが、配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性があるアミノ酸配列を有する、バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE)またはAmyE変異体である、前記組成物。
- 前記アルファ・アミラーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33または配列番号34で示すアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記AmyE変異体が、配列番号1のアミノ酸配列を有するAmyEと比較して、一以上の改変された特性を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記一以上の改変された特性が、基質特異性、基質結合性、基質切断パターン、熱安定性、pH/活性プロファイル、pH/安定性プロファイル、酸化への安定性、カルシウムイオン(Ca2+)のより少ない量での安定性、比活性度またはそれらの任意の組み合わせである、請求項3に記載の組成物。
- フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- デンプンを糖化するのに十分な時間で請求項1に記載の組成物を混合する工程を含む、デンプンの加工方法。
- フルクトース高含有コーンシロップを生産する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- グルコースイソメラーゼの混合により、フルクトース高含有コーンシロップの生産が達成される、請求項7に記載の方法。
- エタノールを生産するためにデンプンを発酵する工程をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 糖化と発酵が同時に行われる、請求項9に記載の方法。
- エタノールを回収する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- エタノールを得るためにデンプンを蒸留する工程であって、発酵及び蒸留が、同時に、別途または連続して行なわれる、前記工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- グルコアミラーゼ及びアルファ・アミラーゼをオリゴ糖またはデンプン基質と混合する工程であって、前記アルファ・アミラーゼが、配列番号1と少なくとも約80%の配列同一性があるアミノ酸配列を有する、バチルス・ズブチリス・アルファ・アミラーゼ(AmyE)またはAmyE変異体である、前記工程を含む、デンプンの糖化方法。
- 前記アルファ・アミラーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33または配列番号34で示すアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記AmyE変異体が、配列番号1のアミノ酸配列を有するAmyEと比較して、一以上の改変された特性を有する、請求項13に記載の方法。
- 前記一以上の改変された特性が、基質特異性、基質結合性、基質切断パターン、熱安定性、pH/活性プロファイル、pH/安定性プロファイル、酸化への安定性、カルシウムイオン(Ca2+)のより少ない量での安定性、比活性またはそれらの任意の組み合わせである、請求項15に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼは、乾燥固形物のグラム当たりのグルコアミラーゼ単位(GAU/g ds)が0.11以下の量で用いられる、請求項13に記載の方法。
- フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ・アミラーゼ、菌性アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、セルロース、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、イソアミラーゼまたはそれらの任意の組み合わせをオリゴ糖またはデンプン基質と混合する工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- フルクトース高含有コーンシロップを生産する工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- グルコースイソメラーゼの混合により、フルクトース高含有コーンシロップの生産が達成される、請求項19に記載の方法。
- エタノールを生産するためにデンプンを発酵させる工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 糖化と発酵が、同時に行われる、請求項21に記載の方法。
- エタノールを回収する工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- エタノールを得るためにデンプンを蒸留する工程であって、発酵及び蒸留が、同時に、別途または連続して行なわれる、前記工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
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