JP2011521937A - 柑橘精油混合物の蒸気及びその抗微生物特性 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
1992〜2006年に、イングランド及びウェールズ地方において、食物を経由した2,274件の食中毒が発生したことが報告されており、そのうちの4%は、調理済みサラダを摂取したことに関連していた。新鮮なサラダ、野菜、又は果物が、環境が原因で汚染され、かつ近年に限っては、動物以外の原因による食物の関連性が、食品伝染疾患と関連しており、汚染されたサラダ、果物、及び野菜の摂取から健康問題が生じ得ることを示している(Little, C. L. 及び Gillespie, I. A.著(2008)「調理済みサラダと健康(Prepared salads and public health)」Journal of Applied Microbiology(近刊)、において報告される通りである)。このことが関心事である理由は、食品市場の有機生産部門が、2億2300万ポンド(約290億円)の小売価格を有し、1990年代〜2000年にかけて毎年30%の増加率を伴う最も早い成長部門のひとつになっているからである。該増加率は15%に低下し始めたが、それはスーパーマーケット供給網の物価の下落に起因すると考えられる。しかし、有機農業行動計画目標(the Organic Action Plan Target)プランが、2010年までには、英国の国産有機生産物の70%に適用されることになり、サラダ、果物、及び野菜の汚染及び収穫後の腐敗を低下させることができるような天然抗菌剤などの、該部門内の進展が求められる(DEFRA (2006)「英国有機栽培野菜市場(The UK organic vegetable market)」(2004〜2005期)を参照されたい。)。
本発明者らは、抗生物質耐性株を含むグラム陽性菌及びグラム陰性菌の範囲に対して抗微生物性を有し、かつ細菌芽胞に対する活性を有する、柑橘精油の混合物の蒸気を発見した。該蒸気は食品に使用することができ、かつ感覚の変化が生じることはない。また、該蒸気を使用して微生物に汚染されている食品を制御することもできる。
本明細書における用語「抗微生物性」とは、「微生物の増殖を破壊する又は阻害することできる」という意味であることが理解される。該微生物は、細菌、ウイルス、リケッチア、酵母、又は真菌でもよい。
好適には、オレンジ油及びベルガモット油は、該混合物中に容積比1:1の割合で存在する。
一実施態様において、該蒸気は細菌に対する抗微生物性を有するものである。一実施態様において、該細菌は抗生物質耐性菌である。別の実施態様において、該細菌はグラム陽性菌又はグラム陰性菌である。
別の実施態様において、該蒸気は、臨床環境において空気及び/又は装置を衛生的にするため使用される。
本発明の混合物は、ベルガモット(シトラス・ベルガミア)の油、及びオレンジ(スィートオレンジ)の油を含む。一実施態様において、ベルガモットの油及びオレンジの油が混合物の唯一の構成成分である。一実施態様において、該油は容積比1:1の割合で存在する。該混合物の蒸気は、混合物15mg/l(空気1リットルにつき15mgの油)を約15分間加熱することによって製造してもよい。下記技術を用いて、該混合物由来の蒸気を15分蓄積させた後の空気中の主要成分をヘッドスペースGC/MS法で分析した。
表2-(リナロールに対する)3回の反復分析に基づく同定ピーク及び半定量化の集計表
*=関連標準物質を用いた化合物に関してのみ利用できる実際の濃度
**=リナロール標準に基づく推定濃度(「リナロール当量」として公知)。同一濃度の各化合物は、質量分析計において異なる応答係数を有し、従って濃度が推定されるであろう。
ここで本発明を、以下の実施例に示すが、これらは限定されないものとして解釈される。
一夜培養(108)の増殖を阻害する能力を測定するために、ディスク拡散法を用いて、ベルガモット(シトラス・ベルガミア)の油とオレンジ(スィートオレンジ)の油との混合物(容積比1:1の割合)の蒸気のスクリーニングを行った。阻止域を測定した(直径cm)。
ベルガモット(シトラス・ベルガミア)とオレンジ(スィートオレンジ)との混合物(容積比1:1の割合)由来の当該蒸気の最小阻止量(MID)を、蒸気チャンバ法を用いて確定した(Inouye, S., Takizawa, T. 及び Yamaguchiの文献(2001)「気体状態での接触による気道病原体に対する精油及びその主成分の抗細菌活性(Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact)」Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 47, 565-573)。各抗微生物剤の一定分量(0.1ml)を2倍希釈して(1600、800、400、200、100及び50mg/L)、直径3cmのフィルターペーパーディスク(高速蒸発)上へ置いた。該ディスク及び接種した平板培地(培養させた約108の細胞0.1mlを塗抹)を、1.3Lの密封されたビーカー内に置き、25℃、37℃、かつ50℃で24時間インキュベートした。MIDは、細菌の増殖を阻害する最小濃度であった。対照は、ペーパーディスクを用いない蒸気チャンバであった。
実施例2と同一の方法により、バンコマイシン耐性E.フェシウム及びバンコマイシン耐性E.フェカリスに対して、MIDを確定した。
バンコマイシン耐性株E.フェカリスの増殖を阻害するために必要であるMIDは、該感受性株の増殖を阻害するために必要であるMIDと同じであったが、E.フェシウムバンコマイシン耐性株を阻害するのに必要であるMIDは、400mg/Lから200mg/Lに減少した。このことは当該蒸気が、抗生物質耐性株の増殖を阻害するという点でより優れているものではないとしても、同程度のものであることを示している。
インビトロでの増殖の低下を、ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(初期接種菌液106細胞、25℃又は37℃又は50℃のいずれかにおける混合物のMID)で増殖した菌株(耐性及び感受性)に対して測定した。試料を様々な時間間隔で採取し、BHI寒天上に播き、かつ37℃で24時間インキュベートした。対照は、当該蒸気の非存在下での増殖であった。
また、本実施例は、温室などの高温を伴う環境で該混合物の蒸気を使用する一例、及び抗生耐性株を阻害する蒸気の能力を示す。
低温におけるディフューザーの使用を、より広い空間(600Lの密閉ユニット)において評価した。5mg/l、10mg/l、15mg/l、及び30mg/lの濃度のベルガモット(シトラス・ベルガミア)とオレンジ(スィートオレンジ)との容積比1:1の混合物をヒートディフューザー又はファンディフューザー(AMPHORA社製, UK)のいずれかを用いて拡散させた。pH5.5、7.5又は9.5に調整したBHI寒天平板培地に、一夜培養したE.フェカリス若しくはE.フェシウムバンコマイシン耐性株又は感受性株(107cfu/ml)0.1μlを塗抹して、37℃又は25℃で24時間、ユニットに入れ、阻害を評価した。
BHIブロスにE.フェカリス若しくはE.フェシウムバンコマイシン耐性株又は感受性株(106cfu/ml)を接種し、かつヒートディフューザーにより拡散されている該EO混合物15mg/lを有する蒸気チャンバ内で、37℃又は25℃でインキュベートすることによって、インビトロでの増殖評価を行った。最初の1時間は15分毎に、次いで8時間は1時間毎に、さらに24時間、サンプルを摂取した。これらをBHI寒天培地の上に播いて37℃で24時間インキュベートした。対照は、EO混合物を添加しないでディフューザーを使用したものであった。48時間にわたる総菌株の増殖低下は、約0.5log cfu/mlであった。
生鮮食品の実施例としてのレタス及びキュウリを用いたオンフード蒸気モデル。
2cm×2cm四角形のアイスバーグレタス及びキュウリの皮を採取し、競合するミクロフローラを取り除くために30分間紫外線下に置いた。該サンプルを、BHIブロスで105又は108 cfu/mlに希釈した50μlの一夜培養物に接種し、20分間乾燥させた。接種された食品サンプルを、600Lの蒸気チャンバ内に置き、チャンバ内で蒸気を15分間蓄積させた後、15、30、45及び60秒間、25℃でヒートディフューザーを介して、15mg/lのオレンジ/ベルガモット混合蒸気(容積比1:1のオレンジ/ベルガモット)に曝した。次いで、食品サンプルを10mlのPBS溶液に入れ、30秒間消化させ、BHI寒天上に播いて培養し、24時間37℃でインキュベートした。また、初期紫外線殺菌処理をした後の非接種のサンプルを10mlのPBS溶液に入れて消化させ、かつ播いて残留汚染レベルを評価した。
キュウリ及びレタスを、当該混合蒸気に15分間蓄積させた後、15mg/Lの該蒸気に45秒間曝露させ、最小28人の参加者からなる感覚審査員(sensory panel)を利用することによって、トライアングル強制選択法を実施して、該審査員が該蒸気に曝された食物と該蒸気に曝されなかった対照とを判別できるかどうかを確かめた(p=0.05に設定して有意にαリスクを計算した)。
レタスとキュウリとのαリスクはそれぞれ0.62528と0.5157であって、処理された食物と非処理の食物との味の有意差はなかった。このことは、生鮮食品に該混合蒸気を使用しても味には影響を及ぼさないことを示している。
真菌類スクリーニングを下記の通り行った。
a) ベルガモット(シトラス・ベルガミア)とオレンジ(スィートオレンジ)との容積比1:1の割合の混合物の該抗微生物性蒸気を、クロカビ(ATCC 9642)、ペニシリウム・クリゾゲヌム(ATCC 10106)及びアルテルナリア・アルテルネート(CABI 127255)の集菌後の病原菌に対する芽胞及び菌糸体の増殖に対して、ディスク拡散法を用いてスクリーニングした。すべての微生物に対して菌糸体増殖の100%阻害が観察され、増殖阻害は、各芽胞に対して、それぞれ5.97、5.46及び6.22(cm)であった。
従って、本発明による蒸気は、増殖性細胞及び芽胞の両方に対して有効な抗真菌剤である。従って、該蒸気は、食物栽培(温室)、加工、及び貯蔵における用途を有し、集菌後の病原菌由来の真菌汚染及び製造損失を防ぐ。
MRSAスクリーニングを下記の通りに行った。
ベルガモット(シトラス・ベルガミア)とオレンジ(スィートオレンジ)との容積比1:1の割合の混合物の当該抗微生物性蒸気を、ディスク拡散法を用いてMRSA(NCTC 13297)に対してスクリーニングし、2.7cmの阻止域を得た。
従って、本実施例は、本発明の蒸気が抗生物質耐性微生物に対して効果的であるという更なる証拠を提供する。
表面調査を下記の通りに行った。
スチールディスク(直径2cm)に、バンコマイシン感受性若しくはバンコマイシン耐性E.フェシウム又はE.フェカリス、或いはMRSAの20μlの一夜培養物を接種して20分間乾燥させた。次いでディスクを600Lの蒸気チャンバ内に置き、ベルガモット(シトラス・ベルガミア)とオレンジ(スィートオレンジ)との容積比1:1の割合の混合物由来の該蒸気の空気15mg/lに、ヒートディフューザーを介して、様々な時間間隔(15分、1、2、4、15及び24時間)曝した。次いで該ディスクを、5gのガラスビーズ(ディスクの接種面をビーズに接触させたもの)及び10mlのPBSを含有する、覆いをした50mlのビーカー内に置き、1分間150rpmで振盪させた。次いでPBS溶液を、BHI寒天上に螺旋状に播いて、プレートを24時間37℃でインキュベートし、生菌数を測定した。対照は、オレンジ/ベルガモット精油混合蒸気に曝露されなかった表面であった。
従って、本発明の蒸気は、24時間に渡って、医療分野及び食品分野において、抗生物質耐性菌と抗生物質感受性菌との両方に対する表面の細菌負荷を99%〜99.9%減少させることができる。
抗生物質感受性E.フェシウム及びE.フェカリスに対して、該混合蒸気の作用機構に関する予備的研究を行った。細胞を、15mg/lの該混合蒸気にヒートディフューザーを介して37℃で1時間曝露する前と後に評価した。該作用機構法には下記方法が含まれる:
・NPNアッセイによる膜透過性の評価
・ルミネセンスFLAA-1KTアッセイキット(Sigma社、英国)を用いた細胞内及び細胞外ATP濃度の測定
・3,3-ジプロピルチアカルボシアニン及びカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル蛍光(carboxyflurescein diacetate succinimidyl ester florescence)をそれぞれ用いた、膜電位及び細胞内pH測定値に対する該混合蒸気の影響
・細胞の形態変化を評価するための透過型電子顕微鏡(TEM)の使用。
本発明は、添付の特許請求の範囲内において改変され得ることが理解されるであろう。
Claims (29)
- オレンジの油及びベルガモットの油を含む、混合物の蒸気。
- 前記オレンジ油及びベルガモット油が、前記混合物中に容積比1:1の割合で存在する、請求項1記載の蒸気。
- オレンジの油及びベルガモットの油を含む混合物の蒸気の製造方法であって、該混合物を30〜50℃の温度に10分〜20分間加熱することを含む、前記製造方法。
- 前記混合物を15分間加熱する、請求項4記載の方法。
- 請求項4又は5記載の方法で製造される、請求項1〜3のいずれか1項記載の蒸気。
- 抗微生物剤としての、請求項1〜3又は6のいずれか1項記載の蒸気の使用。
- 前記蒸気が、細菌に対する抗微生物性を有するものである、請求項7記載の使用。
- 前記細菌が、抗生物質耐性菌である、請求項8記載の使用。
- 前記細菌が、グラム陽性菌又はグラム陰性菌である、請求項8記載の使用。
- 前記細菌が、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、アルコバクター・ブツレリ、カンピロバクター・ジェジュニ、大腸菌、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、黄色ブドウ球菌、MRSAから選択される、請求項8記載の使用。
- 前記エンテロコッカス・フェシウム菌が、エンテロコッカス・フェシウムNCTC 07171及び/又はエンテロコッカス・フェシウム NCTC 12202である、請求項11記載の使用。
- 前記エンテロコッカス・フェカリス菌が、エンテロコッカス・フェカリスNCTC 12697及び/又はエンテロコッカス・フェカリスNCTC 12203である、請求項11記載の使用。
- 前記細菌が、有芽胞菌である、請求項8記載の使用。
- 前記蒸気が、前記芽胞の増殖を破壊する又は阻害することができる、請求項14記載の使用。
- 前記有芽胞菌が、クロストリジウム・ディフィシル及び/又はバチルス・セレウスである、請求項14又は15記載の使用。
- 前記蒸気が、真菌類に対する抗微生物性を有するものである、請求項7〜16のいずれか1項記載の使用。
- 前記細菌及び/又は真菌類が食物に存在する、請求項8〜17のいずれか1項記載の使用。
- 前記蒸気が、前記食物を加工、包装及び/又は貯蔵する間に使用される、請求項18記載の使用。
- 前記食物が、サラダ、野菜及び/又は果物である、請求項18又は19記載の使用。
- 前記食物が、前記蒸気に30秒〜1分間曝される、請求項18、19又は20記載の使用。
- 前記食物が、前記蒸気に45秒間曝される、請求項21記載の使用。
- 前記蒸気が、食品産業環境において空気及び/又は装置を衛生的にするため使用される、請求項7〜17のいずれか1項記載の使用。
- 前記蒸気が、臨床環境において空気及び/又は装置を衛生的にするため使用される、請求項7〜17のいずれか1項記載の使用。
- 前記蒸気が、表面を衛生的にするため使用される、請求項23又は24記載の使用。
- 前記蒸気が、植物病原菌に対する抗微生物性を有するものである、請求項7記載の使用。
- 前記蒸気が、温室で使用される、請求項26記載の使用。
- 実質的に実施例に関して本明細書中に記載されているものとしての蒸気。
- 実質的に実施例に関して本明細書中に記載されているものとしての使用。
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