JP2011512144A - γ−アミノ酪酸の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明はγ-アミノ酪酸(GABA)の発酵生産方法に関し、該方法は組み換え微生物の培養を含み、該微生物はグルタミン酸を生産する能力を有する親微生物に由来することが好ましく、該組み換え微生物は質的又は量的に前記親微生物の前記能力を保持し、グルタミン酸をGABAへ変換するように異種グルタミン酸脱炭酸酵素(E.C. 4.1.1.15)を発現する能力をさらに有し;並びに場合により、発酵ブロスからGABAを単離することに関する。前記改変微生物はまた、グルタミン酸を生産する能力を保持してもよいし、又はしなくてもよい。
a) 配列番号1の第472〜1200位、又は配列番号1の第193〜1605位;
b) 配列番号5;
c) 配列番号7;
d) 或いは上記に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする任意のコード配列
から選択されるコード配列を含む核酸配列によってコードされてよい。
a) 上記に記述される方法によってGABAを生産するステップ;
b) GABAを単離するステップ;並びに
c) (場合により、例えばアミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つのさらなる適切な多価の共重合できるコモノマーの存在下で)前記GABAを重合するステップ
を含む。
特に明記しない限り、「γ-アミノ酪酸」及び「GABA」という表現は同義的に考えられる。本発明によって得られるGABA生成物は、遊離酸の形態、前記酸及び塩基官能基の部分的若しくは完全な塩の形態、又は非荷電の酸とその塩若しくは混合物との混合物の形態であってよい。
3.1 さらなる遺伝子の脱制御
グルタミン酸脱炭酸酵素を発現する組み換えCorynebacteriumグルタミン酸生産菌によるGABAの発酵生産は、以下に記載の少なくとも1つのさらなる遺伝子の脱制御と組み合わせると、さらに改善され得る。
本発明は具体的に言及されるタンパク質に限定されず、その機能的等価物にも及ぶ。
本発明は、本明細書に定義される酵素をコードする核酸配列にも関する。
マルチプルアラインメントパラメーター:
ギャップオープニングペナルティー 10
ギャップ伸長ペナルティー 10
ギャップ分離ペナルティー範囲 8
ギャップ分離ペナルティー オフ
アラインメント遅延に対する同一性% 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション秤量 0
ペアワイズアラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム オン
K-タプルサイズ 1
ギャップペナルティー 3
ウィンドウサイズ 5
ベストダイアゴナル数 5。
DNAギャップオープンペナルティー 15.0
DNAギャップ伸長ペナルティー 6.66
DNAマトリックス 同一性
タンパク質ギャップオープンペナルティー 10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティー 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4。
本発明はまた、制御核酸配列の遺伝的制御下で、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物;並びに少なくとも1つのこれらの発現構築物を含むベクターにも関する。
文脈に応じて、「微生物」という用語は出発微生物(野生型)若しくは本発明の遺伝子改変微生物、又は両者を意味する。
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539、
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
並びにBrevibacterium属の適切な株の非限定的な例は
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869及び
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
或いはそこから由来する株、例えば
Corynebacterium glutamicum KFCC10065
Corynebacterium glutamicum ATCC21608
である。
本発明はGABAの発酵生産法にも関する。
本発明の方法は、GABAを回収するステップをさらに含み得る。「回収する」という用語は、培養培地から化合物を抽出、収穫、単離又は精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂(例えば陰イオン若しくは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等)を用いた処理、従来の吸着剤(例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等)を用いた処理、pHの変化、(例えばアルコール、酢酸エチル、ヘキサン等の従来の溶媒を用いた)溶媒抽出法、蒸留、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥等を含むがそれらに限られない、当技術分野で周知な従来の単離又は精製法に従って実施することができる。例えばGABAは、まず微生物を除去することによって培養培地から回収することができる。次いで、残った培養液は陽イオン交換樹脂を通過させ、不要な陽イオンを除去し、その後陰イオン交換樹脂を通過させ、不要な無機陰イオン及び有機酸を除去する。
別の形態において、本発明は、GABAの生産について上記に述べたステップを含む、ポリマー、特にポリアミドの製造方法を提供する。GABAは、周知の方法でそれ自体と、又は標準的なポリマー合成法を適用することによってアミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つの異なるコモノマーと反応する。適切なコモノマーは、例えば、少なくとも1つの反応性水酸基又はアミノ基を持つC2〜C31、好ましくはC4〜C10直鎖又は分枝鎖モノカルボン酸に由来する。
- CH3-, C2H5 - ; C3H7 - ; C4H9 - ; C5H11 - ; C6H13 - ; C7H15 - , C8H17 - ; C9H19 - ; C10H21 - ; C11H23 - ; C12H25 - ; C13H27 - ; C14H29 - ; C15H31 - ; C16H33 - ; C17H35 - ; C18H37 - ; C19H39 - ; C20H41 -; C21H43 - ; C23H47 - ; C24H49 ; -C25H51 - ; C29H59 - ; C30H61のような飽和直鎖残基
- iso-C3H7 - ; iso-C4H9 - ; iso-C18H37 -のような飽和分枝鎖残基
- C2H3 - ; C3H5 - ; C15H29 - ; C17H33 - ; C21H41 -のようなモノ-不飽和直鎖残基
- C5H7 - ; C17H31 -のような二不飽和直鎖
これらの残基は修飾され、水酸基及びアミノ基から選択される、共重合に必要な少なくとも1つの機能性置換基を持つ。
特に明記しない限り、以下の実験は、遺伝子工学、微生物の培養による化合物の発酵生産、並びに生成物の分析及び単離において使用される標準的な装置、方法、化学物質、及び生化学物質を適用することによって実施された。本明細書において上記に引用されるSambrookら及びChmielらも参照。
PCRプライマー、WKJ95/WKJ96及びWKJ99/WKJ100を、鋳型としてのE. coli染色体DNAと共に使用し、それぞれgadBC及びgadA遺伝子を含むDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを精製し、制限酵素、gadBCについてはXhoI/XbaI及びgadAについてはXhoI/SpeIで消化し、同じ制限酵素で消化したpClik5aMCS(配列番号14;図3)ベクターに連結させ、それぞれpClik5aMCS gadBC及びpClik5aMCS gadAが得られた。
WKJ95 ccgctcgagcggcccaagcttcggtaaatacttataccggag (配列番号10)
WKJ96 ctagtctagactagcccaagcttgtcgatcatcgcctgttg (配列番号11)
WKJ99 ccgctcgagcggcccaagcttcgtgataaattgcgtcagaaag (配列番号12)
WKJ100 ctagactagtctagcccaagcttctcgaatttggcttgcatcc (配列番号13)
ジャガイモにおいてGADをコードする未知の遺伝子を見つけるために、最初のステップは近縁生物からGADを同定することであった。配列データベースGenbank、Refseq及びUniprotにおいて「Solanum」属で「グルタミン酸脱炭酸酵素」についてのクエリーによって、以前特性づけられたSolanum lycopersicum(トマト)のGAD、Swissprot受入番号P54767が明らかとなった。この配列を鋳型として用い、Genbankのサブセクション植物のEST及びGSSにおけるtblastnサーチを実行した。最もよい100ヒット(期待値<10-118)の中で、16配列がSolanum tuberosum(ジャガイモ)から抽出された。全16配列は発現配列タグ(EST)であり、すなわち発現しスプライスされたmRNAのフラグメントを表す。VectorNTI Contig Express(設定:オーバーラップ=20、同一性=0.8、カットオフスコア=40)を用いたアセンブリーによって、15配列からなるコンティグ及び1配列(BG594946)からなる第二のコンティグが明らかとなった。
植物由来のキメラGAD遺伝子のコドン使用頻度はC. glutamicum遺伝子のものとかなり異なるため、キメラGAD遺伝子の発現はC. glutamicum株において効率的でないだろう。C. glutamicumにおける遺伝子発現を高めるため、C. glutamicumコドン使用頻度に適合した配列を持つ合成GAD遺伝子を、カルモジュリン結合配列を持たないキメラGAD遺伝子を基に作出した。さらに、合成GAD遺伝子はC. glutamicumのsodAプロモーター(Psod)及びgroELターミネーターを有していた。合成GAD遺伝子を制限酵素SpeIで消化し、同じ制限酵素で消化したpClik5aMCSベクターに挿入し、pClik5aMCS Psod SL_gadが得られた。
GABA生産株を構築するため、GAD遺伝子を含む組み換えプラスミドでグルタミン酸生産細菌C. glutamicum ATCC13032をトランスフォームした。
Claims (27)
- 組み換え微生物の培養を含む、γ-アミノ酪酸(GABA)の発酵生産方法であって、該微生物が、グルタミン酸を生産する能力に加え、グルタミン酸をGABAに変換するように異種グルタミン酸脱炭酸酵素(E.C. 4.1.1.15)を発現する能力を有する親微生物に由来する、前記方法。
- 前記微生物がグルタミン酸生産細菌である、請求項1に記載の方法。
- 前記グルタミン酸生産細菌がコリネフォルム細菌である、請求項2に記載の方法。
- 細菌がCorynebacteriumである、請求項3に記載の方法。
- 細菌がCorynebacterium glutamicumである、請求項4に記載の方法。
- 前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が原核又は真核生物由来である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が植物のグルタミン酸脱炭酸酵素、又は植物のグルタミン酸脱炭酸酵素に由来するアミノ酸配列部分を含むキメラのグルタミン酸脱炭酸酵素である、請求項6に記載の方法。
- 前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum属の植物、特にSolanum tuberosum由来の脱炭酸酵素である、請求項6又は7に記載の方法。
- 異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来であり、配列番号2のThr94からLeu336までのアミノ酸配列又はそれに少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び/又はC末端に補完される、請求項9に記載の方法。
- 異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosumと異なる第二の植物のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び/又はC末端に補完される、請求項9に記載の方法。
- 前記第二の植物がSolanum lycopersicumである、請求項11に記載の方法。
- 前記グルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号2のアミノ酸配列又はそれに少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素がEscherichia属の細菌、特にE. coli由来である、請求項14に記載の方法。
- 前記E. coliグルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号6のGad A、配列番号8のGad B及び配列番号9のGad Cを含むGad BC複合体並びにGad A若しくはGad BCに少なくとも80%の同一性を有する配列から選択される、請求項15に記載の方法。
- グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、グルタミン酸を生産する能力を有する前記親微生物のコドン使用頻度に適合した核酸配列にコードされる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、
a) 配列番号1の第472〜1200位、又は配列番号1の第193〜1605位;
b) 配列番号5;
c) 配列番号7;
d) 或いは請求項6〜17のいずれか1項に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする任意のコード配列
から選択されるコード配列を含む核酸配列にコードされる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項8〜13のいずれか1項に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素。
- 請求項19に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素のコード配列を含む核酸配列。
- 配列が少なくとも1つの制御核酸配列に機能的に連結される、請求項20に記載の少なくとも1つの核酸配列を含む、発現カセット。
- 請求項21に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、組み換えベクター。
- 請求項22に記載の少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた、原核又は真核宿主。
- 組み換えコリネフォルム細菌、特に組み換えCorynebacteriumから選択される、請求項23に記載の宿主。
- 組み換えCorynebacterium glutamicumである、請求項24に記載の宿主。
- 生産されたGABAが発酵ブロスから単離される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- a) 請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法によってGABAを生産するステップ;
b) GABAを単離するステップ;並びに
c) (場合により、アミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つのさらなる適切な多価のコモノマーの存在下で)前記GABAを重合するステップ
を含む、ポリアミドの製造方法。
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