CN102159720A - 使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法。
Description
本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产甲硫氨酸的方法。
背景
目前世界范围内人工生产氨基酸甲硫氨酸的量为大约500,000吨。标准的工业生产方法不是通过发酵而是通过多步骤化学方法。甲硫氨酸在禽畜饲料中是第一限制性氨基酸，且由此主要用作饲料添加剂。现有技术已经公开了各种尝试，通过例如使用微生物如大肠杆菌的发酵产生甲硫氨酸。
其它氨基酸如谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸是通过例如发酵方法产生的。对于这些目的，经证实某些微生物如谷氨酸棒杆菌特别适用。通过发酵生产氨基酸具有特殊优势，即仅产生L-氨基酸且避免了环境问题化合物如典型用于化学合成中的溶剂。
目前精细化合物的发酵生产典型是在微生物中进行，所述微生物如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯得毕赤酵母(P.pastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、Ashbya gossypii或者Gluconobacter oxydans。特别已知谷氨酸棒杆菌产生大量氨基酸例如L-谷氨酸和L-赖氨酸的能力(Kinoshita，S.(1985)Glutamic acid bacteria；p.115-142 in：A.L.Demain and N.A.Solomon(ed.)，Biology of industrial microorganisms，Bejamin/cummings Publishing Co.，London)。DB：STP
现有技术领域中在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中产生精细化合物如氨基酸、脂质、维生素或者碳水化合物的一些尝试，已经试图实现这个目标，通过增加参与各个精细化合物的生物合成途径的基因的表达而实现。如果已知例如氨基酸如甲硫氨酸或者赖氨酸的生物合成途径中某一步骤是限速的，则各个酶的过表达使得可以获得这样的微生物，其产生更多催化反应产物的微生物，并最终导致各个氨基酸的产量增加。相似地，如果已知例如希望的氨基酸的生物合成途径中某一酶促步骤由于其输送许多代谢能量导致不希望的副产物形成而是不合意的，可预期负调节各个酶活性的表达以仅利于最终导致希望的氨基酸形成的这个代谢反应。
通过正调节和/或负调节参与甲硫氨酸或者赖氨酸的生物合成的基因的表达以增加例如甲硫氨酸产量的尝试在例如WO 02/10209、WO 2006/008097和WO 2005/059093中描述。
异柠檬酸脱氢酶(ICD，优势也称作IDH，EC 1.1.1.42，SEQ ID NO：3)是一种参与例如谷氨酸棒杆菌的柠檬酸循环(TCA)的酶(图1)。其催化该循环的第三个步骤：异柠檬酸的氧化脱羧作用，产生α-酮戊二酸盐和CO2。
Eikmanns等鉴别、克隆和鉴定了谷氨酸棒杆菌中编码ICD的基因(Eikmanns，B.et al，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。谷氨酸棒杆菌中编码ICD的染色体icd基因由于敲除而失活，导致谷氨酸营养缺陷体(Eikmanns，B.et al.，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。
ICD在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中的过表达不增强谷氨酸盐的产生(Eikmanns，B.et al.，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。然而，据DE 10210967报道，ICD在大肠杆菌中的过表达导致苏氨酸的产量增加。对icd与编码谷氨酸脱氢酶的基因在谷氨酸棒杆菌中共表达报道了相矛盾的结果，同时Eikmanns未记录任何效果，改良的谷氨酸产量在JP63214189和JP2520895中报道。
即使鉴于报道的提高甲硫氨酸生产的尝试，仍需要另外的生产方法。
发明目的和概述
本发明的目的是提供另外的发酵方法和微生物，用于所述方法中使用迄今为止未知特性的工业重要微生物如谷氨酸棒杆菌产生甲硫氨酸。
从接下来的本发明描述中清晰可见的这些及其它目的如独立的权利要求书中描述解释。所附权利要求书涉及优选的实施方案。
本发明涉及使用异柠檬酸脱氢酶活性降低的细胞产生甲硫氨酸的方法。所述酶的负调节目前还未知导致甲硫氨酸的产量改良。
所述生产方法中使用的细胞可以是原核细胞、低等真核细胞、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或者分离的哺乳动物细胞，特别是细胞培养***中的细胞。在本发明中，术语“微生物”用于这种细胞。
为了进行本发明其中ICD活性降低的一种优选微生物是棒杆菌，其中ICD表达被降低，特别优选其中ICD表达被降低的谷氨酸棒杆菌。
特别地，本发明提供了如下实施方案：(1)利用与相应起始微生物相比异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性部分或者完全降低的微生物生产甲硫氨酸的方法；以及(2)从通过实施方案(1)的方法产生的甲硫氨酸中制备化合物和化合物终产物如聚合物的方法，包括在一个步骤中根据实施方案(1)的方法产生所述甲硫氨酸。
附图
图1：谷氨酸棒杆菌中产生甲硫氨酸的生物化学途径。
序列表，FREE TEXT
| SEQ ID NO： | 描述 |
| 1 | 编码SEQ ID NO：3的ICD的野生型谷氨酸棒杆菌DNA |
| 2 | 谷氨酸棒杆菌icd，包括icd基因500nt上游和下游的天然DNA序列 |
| 3 | 谷氨酸棒杆菌的野生型异柠檬酸脱氢酶 |
| 4 | 携带ATG-GTG突变的icd(ICD ATG→GTG) |
| 5 | 用于用SEQ ID NO：4置换内源icd基因的载体***序列 |
| 6 | 密码子使用修改的异柠檬酸脱氢酶(icd)CA2 |
| 7 | 用于用SEQ ID NO：6置换内源icd基因的载体***序列 |
| 8 | pClik int sacB delta icd |
| 9 | pClik int sacB delta icd的***序列 |
定义
本文中使用如下缩写、术语和定义。
IDH，异柠檬酸脱氢酶；ICD，异柠檬酸脱氢酶；WT，野生型；PPP，戊糖磷酸途径；缩写“ICD”和“IDH”对于是同义的。
如本发明文中所用，除非特别指出，单数形式的“一”也包括其复数形式。因此，术语“一种微生物”可包括一种以上的微生物，即二、三、四、五种等微生物。
术语“大约”在描述数值或参数范围时表示本领域技术人员理解仍能保证对象特征的技术效果的精确度区间。该术语通常是指与指定数值具有±10％、优选±5％的偏差。
除非特别指出，本发明文中提及的化合物或者氨基酸可具有任何立体化学，包括不同立体异构体的混合物。优选地，所述氨基酸具有L-构型。在适当情况中指出特别优选的构型。
除非特别指出，通过本发明的方法获得的酸可以是游离酸形式、所述酸的部分或者完全盐，或者所述酸及其盐的混合物形式。反之亦然，通过本发明的方法获得的胺可以是游离胺形式、所述胺的部分或者完全盐形式，或者所述胺及其盐的混合物形式。
本发明中术语“宿主细胞”是指任何分离的细胞，其常用于表达核苷酸序列以产生例如多肽或者精细化合物。特别地，术语“宿主细胞”是指原核细胞、低等真核细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或者哺乳动物细胞培养***。
术语“微生物”涉及原核细胞、低等真核细胞、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或者分立的哺乳动物细胞，特别是细胞培养***中的细胞。适于进行本发明的微生物包括酵母如粟酒裂殖酵母或者酿酒酵母以及巴斯得毕赤酵母。哺乳动物细胞培养***可以选自例如NIH T3细胞、CHO细胞、COS细胞、293细胞、Jurkat细胞以及HeLa细胞。在本发明中，微生物优选是原核细胞或者酵母细胞。本发明优选的微生物在下文“详细描述”章节中指出。特别优选的是棒杆菌。
“天然”是“野生型”和“天然存在的”的同义词。除非特别指出，“野生型”微生物通常是指定微生物的天然存在的形式。通常地，野生型微生物是非重组微生物。
“初始”是“起始”的同义词。“初始”核苷酸序列或者酶活性是其修饰的起始点，例如通过突变或者添加抑制剂。任何“初始”序列、酶或者微生物均缺少其“最终”或者“修饰的”对应物具有的区别性特征，这在指定情况中示出(例如ICD活性降低)。本发明文中术语“初始”涵盖术语“天然”的意义，且优选与“天然”是同义词。
任何野生型或者突变(非重组或者重组突变)微生物可以通过非重组(例如加入特异性酶抑制剂)或者重组方法进一步修饰，获得与其初始微生物在至少一种物理或者化学性质方面以及在本发明一特定方面在其ICD活性方面有所不同的微生物。在本发明中，初始的未修饰的微生物称作“初始微生物”或者“初始(微生物)菌株”。微生物中ICD活性与初始菌株中指定ICD表达水平相比的任何降低是通过在相当条件下对比这两个微生物中ICD活性而确定的。
典型地，本发明的微生物是通过在不携带遗传改变的初始微生物中导入所述遗传改变而获得。
微生物菌株的“衍生物”是通过例如传统诱变和选择方法或者通过定向诱变方法衍生自其亲代菌株的菌株。例如，谷氨酸棒杆菌ATCC13032lysCfbr(WO 2005/059093)是衍生自ATCC13032的产生赖氨酸的菌株。
本发明中所用术语“核苷酸序列”或者“核酸序列”涉及编码多肽如肽、蛋白质等的任何核酸分子。这些核酸分子可以由DNA、RNA或者其类似物构成。然而，优选由DNA构成的核酸分子。
本发明中“重组”是指“通过遗传工程制备或者所致”。因此，“重组微生物”包含至少一种“重组核酸”或者“重组蛋白质”。重组微生物优选包含表达载体或者克隆载体，或者其已经遗传工程化为在宿主细胞的内源基因组中含有克隆的核酸序列。
“异源”是指通过遗传工程导入细胞或者生物体中的任何核酸或者多肽，不论其生物体来源如何。因此，分离自微生物并导入相同物种另一微生物中的DNA对于后者-本发明中经遗传修饰的微生物-是异源的，即使术语“同源”在本领域有时也用于描述这种遗传工程化的修饰。然而，术语“异源”在本发明中优选是针对本发明中非同源核酸或者多肽/蛋白质。“异源蛋白质/核酸”与“重组蛋白质/核酸”是同义词。
术语“表达”是指基因产物(例如途径基因的生物合成酶)在宿主生物体中的表达。所述表达可以通过用作起始生物体的微生物的遗传改变而进行。在一些实施方案中，微生物可以被遗传改变(例如遗传工程化)，由此以相对于起始微生物或者未改变的相应微生物增加的水平表达基因产物。遗传改变包括但不限于改变或者修饰与特定基因表达相关的调节性序列或者位点(例如通过加入强启动子，可诱导启动子或者多个启动子，或者通过除去调节性序列，由此表达是组成型的)，修饰特定基因的染色***置，改变特定基因的核酸序列如核糖体结合位点或者转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节性蛋白质，阻抑物，增强子，转录激活物等)，或者本领域负调节特定基因表达的任何其它常规方式(包括但不限于使用反义核酸分子，例如阻断阻抑蛋白的表达)。
“保守氨基酸置换”是指初始氨基酸序列中的一或多个氨基酸由相似化学性质的氨基酸取代，例如Val由Ala取代。与初始多肽序列对比取代的氨基酸的比率优选为初始氨基酸序列的总氨基酸的0-30％，更优选0-15％，最优选0-5％。
保守氨基酸置换优选在如下一组氨基酸的成员之间置换：
-酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；
-碱性氨基酸(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)；
-疏水性氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丙氨酸)；
-亲水性氨基酸(丝氨酸，甘氨酸，丙氨酸，苏氨酸)；
-具有脂肪族侧链的氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)；
-具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸(丝氨酸，苏氨酸)；
-具有含有酰胺的侧链的氨基酸(天冬酰胺，谷氨酰胺)；
-具有芳香侧链的氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸)；
-具有碱性侧链的氨基酸(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)；
-具有含硫侧链的氨基酸(半胱氨酸，甲硫氨酸)。
特别优选的保守氨基酸置换如下：
天然残基 取代残基
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln，His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn，Gln
Ile Leu，Val
Leu Ile，Val
Lys Arg，Gln，Glu
Met Leu，Ile
Phe Met，Leu，Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp，Phe
Val Ile，Leu
术语“分离的”是指“从其来源生物体中分离或者纯化”。更特别地，多细胞生物体的分离的细胞是分离的或者已经从其来源生物体中纯化。这包括生物化学纯化的和重组产生的细胞。
如本文所用，氨基酸的“前体”或者“生物化学前体”是这样的化合物，其在生物化学途径中位于氨基酸之前(上游)，导致在本发明的微生物中形成所述氨基酸，特别是在所述生物化学途径的最后几步中形成的化合物。在本发明中，甲硫氨酸的“前体”是天冬氨酸在野生型生物体体内通过生物化学转变成甲硫氨酸期间形成的任何中间产物。
“碳产量(carbon yield)”是(发酵中使用的碳源、通常为糖)每消耗的碳量而发现的(产物的)碳量，即产物与来源的碳比率。
本发明中“ICD活性”是指ICD的任何酶活性，尤其是通过ICD发挥的任何催化作用。特别地，异柠檬酸转变为α-酮戊二酸盐是通过“ICD活性”实现。ICD活性可以用每毫克酶单位表示(特异性活性)，或者每个酶分子每分钟转化的底物分子表示。
发明详述
本发明涉及通过ICD活性降低的微生物生物合成甲硫氨酸。
ICD的活性提供了在细胞中产生氨基酸必需的一些NADPH/NADH。因此，在本发明的观点之前通过降低细胞中ICD活性以扩大甲硫氨酸产量似乎不明显。
令人惊奇地，现在发现微生物中ICD活性降低导致甲硫氨酸的生产水平增加。甲硫氨酸是相当感兴趣的精细化合物。
在本发明一个优选方面中，根据实施方案(1)的生产方法是发酵方法。然而，也考虑化合物的其它生物技术生产方法，包括在植物和非人动物的体内生产。
根据实施方案(1)的通过发酵生产甲硫氨酸的方法可包括培养至少一种-优选重组的-ICD活性降低的微生物，由此通过乙醛酸支路的碳流量增加。
在实施方案(1)的进一步优选方面中，所述生产方法中使用的微生物是重组微生物。也考虑迄今为止的化合物的其它生物技术生产方法，包括在植物和非人动物体内生产，选择的生物体优选是重组生物体。
在本发明的任何实施方案中，用于所述实施方案中的微生物中异柠檬酸脱氢酶活性部分或者完全降低。
本发明的ICD活性降低的微生物与相同物种和遗传背景的初始微生物相比部分或者完全丧失其天然ICD活性。优选地，在所述微生物中ICD的初始活性丧失大约至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％、至少10％，更优选至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少90％、至少95％或者全部丧失。在相当条件下与初始微生物中内源ICD活性的活性水平相比确定活性降低程度。
应理解不总是希望尽可能多地降低ICD活性。在某些情况中，如上述任何水平的不完全降低但也是中间水平如25％、40％、50％等也是足够且希望的。
优选ICD活性不完全丧失，因为这样可保持TCA且使得所述微生物进一步产生从α-酮戊二酸盐中合成的谷氨酸盐及其它生物分子。
在微生物中ICD活性完全或者接近完全(即90％或者更高)丧失为特征的实施方案中，微生物的培养基、尤其是实施方案(1)生产中使用的培养基可以补加所述微生物中由于ICD活性抑制而缺少的一或多种必需化合物。特别是在培养基中可以补加必需的谷氨酸盐，因为其是便宜的易获得的化合物。
在具有一个以上ICD编码基因和/或一种以上ICD的生物体中，ICD活性降低可以是所有、几种或者仅一种ICD活性降低。鉴于上述ICD的不完全丧失的原因，优选不是所有种类ICD活性均特异性降低。
为本发明必需的ICD活性的降低可以是实施方案(1)的方法中使用的微生物的内源性状，例如由于自发突变所致性状，或者由于本领域已知部分或者完全阻抑或者抑制酶活性、特别是体内酶活性的任何方法所致性状。酶活性的降低可以在酶合成和酶反应的任何阶段在遗传、转录、翻译或者反应水平发生。
ICD活性的降低优选是遗传工程的结果。为了降低宿主细胞中一或多个内源ICD基因的表达量以及从而降低其中icd靶基因被阻抑的宿主细胞中ICD的量和/或活性，可以应用本领域已知的任何方法。对于负调节微生物如大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌或者其它宿主细胞如巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)和黑曲霉(A.niger)中基因的表达，可利用多种技术如基因敲除方法、反义技术、RNAi技术等。可以缺失各个基因的初始拷贝和/或将其用示出活性降低、特别是特异性活性降低的突变形式置换，或者从弱启动子中表达。或者，可以置换icd基因的启动子，通过随机或者靶向诱变导入突变，破坏或者敲除icd基因。此外，可以在mRNA中导入去稳定元件或者导入导致RNA的核糖体结合位点(RBS)毁坏(deterioration)的遗传修饰。最后，可以在反应混合物中加入特异性ICD抑制剂。
在实施方案(1)的第一个优选方面，ICD活性由于ICD表达的部分或者完全降低而降低。“降低微生物中至少一种ICD的表达”是指与具有指定ICD表达水平的初始微生物相比所述微生物中表达的任何降低。当然，假定是根据相应宿主细胞类型、相应遗传背景情况等进行对比。优选地，实现如上述或者下文描述的表达降低。
在本发明的一特殊方面，所述微生物由于ICD表达降低而丧失其初始ICD活性，优选随着与初始微生物中多肽的表达水平相比确定的表达程度的降低，其活性降低大约至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者100％。表达降低程度是与在相应条件下在初始微生物中初始icd核苷酸序列中表达的内源ICD表达水平对比而确定的。
在具有一个以上ICD编码基因和/或一种以上ICD的生物体中，ICD表达的降低可以涉及一个、几个或者所有icd基因。由于上述关于ICD补完全丧失的原因而优选不是所有的icd基因的表达均特异性降低。
在一个优选方面，“表达降低”是指如果用编码具有基本相同的氨基酸序列和/或功能的修饰的核苷酸序列置换编码多肽的内源核苷酸序列，则编码的多肽在修饰的细胞中表达的量降低。
这种负调节模式的一个特殊方面是敲除icd基因(对比实施例3)。这可以通过任何已知的适于所述微生物的敲除方法实现。特别优选的敲除方法和使用所得敲除突变体生产甲硫氨酸的方法在实施例2中描述。
所述icd的敲除可以导致ICD活性的完全或者接近完全丧失。因此，为了避免缺陷症状以及保持微生物存活，对于敲除突变体而言必需为培养基补加缺陷ICD依赖的产物如谷氨酸盐。
在进一步优选的方面中，“表达降低”是指通过反义技术或者RNA干扰技术(在可用情况中，如在真核细胞培养中)干扰基因表达。这些技术可影响icdmRNA水平和/或icd翻译效力。
在进一步优选的方面中，“表达降低”是指icd基因的缺失或者破坏组合“弱”icd基因的导入，所述“弱”icd基因即编码其酶活性低于初始ICD活性的ICD的基因，或者通过整合在弱表达位点的icd基因位点使得细胞内ICD活性降低。这可以通过整合在基因不完全转录的染色体座的icd基因，或者通过导入具有较低特异性活性或者未有效转录、未有效翻译或者在细胞中不太稳定的突变体或者异源icd基因进行。这种突变的icd基因的导入可以通过使用复制质粒或者通过整合进基因座中进行。
在另一优选方面，“表达降低”是指降低的ICD活性是通过降低从染色体编码的icd基因中转录而降低mRNA水平的结果，优选通过突变初始启动子或者用所述启动子的较弱形式或者用较弱的异源启动子置换天然ICD启动子进行。特别优选的进行这方面的方法以及使用所得突变体生产甲硫氨酸的方法在实施例4中描述。
在进一步优选的方面中，“表达的降低”是指降低的ICD活性是RBS突变的结果，导致核糖体与翻译起始位点的结合降低，由此导致icdmRNA的翻译降低。所述突变可以是单一核苷酸改变和/或也影响相对于起始密码子的RBS间隔。为了实现这些突变，可以产生含有一系列突变的RBS的突变体文库。可以例如通过选择较低ICD活性而选择合适的RBS。然后可以用选择的RBS置换初始RBS。特别优选的进行这方面的方法以及使用所得突变体生产甲硫氨酸的方法在实施例4中描述。
在进一步优选的方面中，“表达的降低”是通过例如改变二级结构降低mRNA的稳定性而降低mRNA水平实现的。
在进一步优选的方面中，“表达的降低”是通过icd调节子如转录调节子实现的。
在另一进一步优选的方面中，负调节ICD表达的特殊方法是在PCT/EP2007/061151中描述的密码子使用方法，在此将迄今为止应用密码子使用方法负调节微生物、特别是棒杆菌和大肠杆菌中ICD活性的方法并入本文作参考。
PCT/EP2007/061151描述了降低宿主细胞中至少一种多肽的量的复发，包括在所述宿主细胞中表达修饰的核苷酸序列代替编码基本相同安素娟序列和/或功能的未修饰的核苷酸序列的步骤，其中所述修饰的核苷酸序列衍生自未修饰的核苷酸序列，由此未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的核苷酸序列中根据宿主细胞的密码子使用由使用频率较低的密码子置换。
在修饰的核苷酸序列在棒杆菌及特别优选在谷氨酸棒杆菌中表达以降低ICD量的情况中，未修饰的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个，优选至少1％、2％、4％、6％、8％、10％、更优选至少20％、40％、60％、80％、甚至更优选至少90％或者至少95％以及最优选所有密码子在修饰的核苷酸序列中可以由各个氨基酸的使用频率较低的密码子置换。在更优选的实施方案中，前述数目的被置换的密码子是指频繁、非常频繁、极其频繁或者最频繁使用的密码子。在另一特别优选的实施方案中，上述数目的密码子由最不频繁使用的密码子置换。在所有这些情况中，提及的密码子使用频率基于棒杆菌及优选谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率，优选基于棒杆菌及优选谷氨酸棒杆菌的富集蛋白质的密码子使用频率。也见PCT/EP2007/061151详细解释。
本发明特别优选的方面涉及这样的方法，其中微生物中异柠檬酸脱氢酶表达的降低通过采用PCT/EP2007/061151所述密码子使用方法实现。所述微生物可以是棒杆菌，优选谷氨酸棒杆菌。这些方法可用于改良甲硫氨酸的合成。因此，在本发明的一个优选方面中，由于应用PCT/EP2007/061151中所述密码子使用方法所致具有降低的ICD活性的微生物是进行根据实施方案(1)的方法中选择的微生物。PCT/EP2007/061151在一个实施方案中特别描述了通过用GTG置换起始密码子以及通过将在突然ICD的地32和33位置的甘氨酸和异亮氨酸的密码子从GGC ATT改变为GGG ATA，从而降低谷氨酸棒杆菌细胞中ICD(对比实施例1)。在实施方案(1)的生产方法的一方面中，PCT/EP2007/061151的这两个实施方案是微生物的选择，其在本发明的实施方案(1)的方法中的应用因此特别并入参考。其制备和使用在实施例1中证实。
另一方面，在本发明的不同的特别优选的方面中，由于应用在PCT/EP2007/061151中所述的密码子使用方法导致ICD活性降低的微生物不包括在所述实施方案(1)的方法中选择的微生物中。根据所述方面，实施方案(1)的方法是本发明的一个实施方案，附带条件是ICD表达的降低不是由于修饰的ICD编码核苷酸序列(icd序列)的表达所致，而是(instead of)微生物的天然icd序列的表达所致，其中所述修饰的icd编码序列衍生自未修饰的icd序列，由此未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的icd序列中根据宿主细胞的密码子使用由使用频率较低的密码子置换。换句话说，实施方案(1)的方法是本发明的一个实施方案，附带条件是ICD表达的降低不是如PCT/EP2007/061151所述修饰的密码子使用所致，且不使用PCT/EP2007/061151中所述微生物。更优选地，实施方案(1)的方法是本发明的一个实施方案，附带条件是当生产甲硫氨酸时，ICD表达降低不是由于修饰的ICD编码核苷酸序列(icd序列)的表达所致，而是所述微生物的天然icd序列的表达所致，其中所述修饰的icd编码序列衍生自未修饰的icd序列，由此未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的icd序列中由根据微生物的密码子使用而不频繁使用的密码子置换。
在实施方案(1)的第二个优选方面中，ICD活性降低是由于所述酶的部分或者完全抑制所致。所述抑制可以是任何已知的可逆或者不可逆的ICD抑制剂与ICD的结合的结果。这种抑制剂如本领域已知，例如已知是谷氨酸棒杆菌中ICD的弱抑制剂的草乙酸盐、2-酮戊二酸以及柠檬酸盐，或者已知是强抑制剂的草乙酸盐和乙醛酸(Eikmanns et al(1995)loc.cit.)。所述抑制剂可以加入发酵培养基中，或者其在细胞内的合成可以通过外部刺激诱导。
在实施方案(1)和(2)的几个优选方面中，降低的ICD活性是对宿主细胞(优选微生物，尤其是棒杆菌)进行遗传工程的结果，而不是降低ICD表达的结果。
特别地，在第三个优选方面中，缺失icd基因的初始拷贝及将其用编码示出ICD活性降低的ICD的突变形式或者用编码ICD活性低于初始ICD活性的异源icd基因置换，导致本发明的微生物中ICD活性降低。特别优选的进行这个方面的方法以及使用所得突变体生产甲硫氨酸的方法在实施例3中描述。
在第四个优选方面，在本发明的微生物中实现导致ICD活性降低的两或多种前述特征的组合。
本发明的实施方案(1)的优选方法包括降低微生物、优选棒杆菌及更优选谷氨酸棒杆菌中ICD活性的步骤，其中使用上述原理。
ICD活性降低的微生物中甲硫氨酸的生物合成增加可以是由于ICD抑制导致通过PPP和乙醛酸支路的碳流量增加所致。前者导致提供氨基酸生产足够的还原等价物，即NAD(P)H，后者提供甲硫氨酸的生物合成必需的碳前体。因此，在本发明的一个优选方面中，实施方案(1)中使用的微生物或者实施方案(2)的微生物，与野生型微生物相比通过(i)乙醛酸支路和/或(ii)磷酸戊糖途径(PPP)的碳流量增加。优选地，通过乙醛酸支路的碳流量增加。任何所述增加均可以是ICD活性降低的结果、遗传工程化所述微生物的结果、所述微生物的天然性状，或者任何这些因素的组合。通过乙醛酸支路的碳流量增加优选是ICD活性降低和/或遗传工程化所述微生物的结果。通过PPP的碳流量增加优选是遗传工程化微生物的结果，更优选是主动正调节PPP酶表达水平的结果，例如通过使用强启动子如Psod(WO 2005/059144)。
如上所述，本发明涉及微生物及所述微生物在甲硫氨酸生产中的应用。然而，本发明也涵盖使用除了所述实施方案(1)的生产方法中的微生物之外的其它生物体。对于本发明，术语“生物体”是指任何非人生物体，其常用于核苷酸序列的表达以生产精细化合物，特别是如上述微生物，以及植物包括藻类植物、苔藓植物、酵母以及非人动物。除了特别适于精细化合物产生的微生物之外的生物体是植物和植物的一部分。这种植物可以是单子叶植物或者双子叶植物如单子叶或者双子叶农作物、食用植物或者饲料植物。举例的单子叶植物是属于燕麦属植物(燕麦)、小麦属植物(小麦)、secale(黑麦)、大麦属植物(大麦)、稻属植物(水稻)、黍属植物、狼尾草属植物、狗尾草属植物、高梁属植物(小米millet)、玉蜀黍属(玉米)等植物。
双子叶农作物包括棉花，leguminoses如pulse及具体是苜蓿、大豆、油菜籽、番茄、糖用甜菜、马铃薯，观赏植物以及树木。进一步的农作物可包括果实(特别是苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘、菠萝和香蕉)、油椰子、茶树、可可树和咖啡树、烟草、剑麻以及涉及药用植物、萝芙木属植物和洋地黄植物。特别优选的是谷物小麦、黑麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和小米、糖用甜菜、油菜籽、大豆、番茄、马铃薯和烟草。进一步的农作物可以见US 6,137,030所述。
本领域技术人员意识到不同的生物体和细胞如微生物、植物和职务细胞、动物以及动物细胞等在icd基因和ICD蛋白质的数目和种类方面不同。甚至在相同生物体中，不同菌株有时也示出在蛋白质水平的异质表达。
在使用与微生物不同的生物体进行本发明情况中，可以应用非发酵生产方法。
在本发明中，根据实施方案(1)和(2)，可以使用上述任何微生物。优选地，所述微生物是原核生物。特别优选的进行本发明的是选自棒杆菌属和短杆菌属的微生物，优选棒杆菌特别是谷氨酸棒杆菌，埃希氏菌属特别是大肠杆菌，杆菌属特别是枯草芽胞杆菌，链霉菌属和曲霉属。
本发明的优选实施方案涉及使用选自棒状杆菌如棒杆菌属的细菌的微生物。特别优选的是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)以及Corynebacterium effiziens菌种。本发明其它优选的实施方案涉及使用短杆菌属，特别是黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和Brevibacterium divarecatum菌种。
在本发明优选的实施方案中，所述微生物可以选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032、醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、热产氨棒状杆菌FERMBP-1539、栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965、Corynebacterium effiziens DSM 44547、Corynebacterium effiziens DSM 44549、黄色短杆菌ATCC14067、乳发酵短杆菌ATCC 13869、Brevibacterium divarecatum ATCC 14020、谷氨酸棒杆菌KFCC 10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608以及通过例如传统诱变和选择方法或者通过定向诱变方法衍生自其中的菌株。
其它优选的谷氨酸棒杆菌菌株可以选自ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC21492、ATCC21513、ATCC21526、ATCC21543、ATCC13287、ATCC21851、ATCC21253、ATCC21514、ATCC21516、ATCC21299、ATCC21300、ATCC39684、ATCC21488、ATCC21649、ATCC21650、ATCC19223、ATCC13869、ATCC21157、ATCC21158、ATCC21159、ATCC21355、ATCC31808、ATCC21674、ATCC21562、ATCC21563、ATCC21564、ATCC21565、ATCC21566、ATCC21567、ATCC21568、ATCC21569、ATCC21570、ATCC21571、ATCC21572、ATCC21573、ATCC21579、ATCC19049、ATCC19050、ATCC19051、ATCC19052、ATCC19053、ATCC19054、ATCC19055、ATCC19056、ATCC19057、ATCC19058、ATCC19059、ATCC19060、ATCC19185、ATCC13286、ATCC21515、ATCC21527、ATCC21544、ATCC21492、NRRLB8183、NRRL W8182、B12NRRLB12416、NRRLB12417、NRRLB12418以及NRRLB1 1476。
缩写词KFCC是指韩国培养物保藏中心，ATCC是指美国模式培养物保藏中心，DSM是指德国微生物菌种保藏中心。缩写词NRRL是指ARS培养物保藏中心Northern Regional Research Laboratory，Peorea，IL，USA。
特别优选已经能产生精细化合物如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和/或L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株进行本发明。这种菌株例如是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032及其衍生物。也可优选使用已知产生赖氨酸的菌株ATCC 13286、ATCC 13287、ATCC 21086、ATCC 21127、ATCC 21128、ATCC 21129、ATCC 21253、ATCC 21299、ATCC 21300、ATCC 21474、ATCC 21475、ATCC 21488、ATCC 21492、ATCC 21513、ATCC 21514、ATCC 21515、ATCC 21516、ATCC 21517、ATCC 21518、ATCC 21528、ATCC 21543、ATCC 21544、ATCC 21649、ATCC 21650、ATCC 21792、ATCC 21793、ATCC 21798、ATCC 21799、ATCC 21800、ATCC 21801、ATCC 700239、ATCC 21529、ATCC 21527、ATCC 31269和ATCC 21526。特别优选的是已经能产生精细化合物如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。因此，特别优选谷氨酸棒杆菌ATCC13032及其衍生物。这种优选涵盖菌株ATCC13032lysCfbr和ATCC 13286。谷氨酸棒杆菌ATCC13032lysCfbr、ATCC 13032或者ATCC 13286在本发明中也是特别优选的微生物。
应理解为了适合本发明，上文列举的所有微生物均呈现出ICD活性部分或者完全降低。本发明中优选的微生物是重组微生物，其降低的ICD活性是遗传工程的结果。
本发明的实施方案(1)涉及使用前述ICD活性降低的微生物生产甲硫氨酸，特别是L-甲硫氨酸。甲硫氨酸可用于制药工业、农业生产以及化妆品、食物和饲料工业的不同方面中。
对于实施方案(1)的方法，可以使用这样的微生物，其不仅具有降低的ICD活性，而且还经特别修改而适于甲硫氨酸的生产。这种修改可以是由于已知不希望的副产物的合成相关酶活性抑制或者降低所致。降低组成生物合成途径一部分的酶的量或者活性可以增加甲硫氨酸的合成，通过例如停止副产物的产生以及通过打开代谢物流进甲硫氨酸生物合成途径的通道而实现。另一方面，这种修改可以是由于甲硫氨酸生物合成中酶的活性增加所致。优选所述微生物的修改包括催化产生甲硫氨酸的一个或者一个以上转变步骤的酶的活性和/或表达增加，特别是催化天冬氨酸下游转变步骤的酶、更特别是催化天冬氨酸转变为甲硫氨酸的转变步骤的酶的活性和/或表达增加。进一步优选所述修改是由于遗传工程微生物所致，导致在所述微生物中存在增强甲硫氨酸产生的至少一种异源酶。
在本发明的方法(1)的一个优选实施方案中，修饰除了微生物的内源生物合成途径中ICD活性之外的一或一种以上酶的活性，导致靶化合物甲硫氨酸的碳产量增加。优选地，催化天冬氨酸经生物化学转变为赖氨酸、甲硫氨酸或者异亮氨酸的一或一种以上酶被正调节或者负调节。
优选地，棒杆菌酶及特别是谷氨酸棒杆菌酶的活性被正调节或者负调节。
优选地，所述修饰是通过修饰编码所述酶的核苷酸序列实现。
优选被负调节的修饰的酶和/或核苷酸序列可以选自编码丝氨酸-激酶、苏氨酸-脱水酶、苏氨酸-合酶、间-二氨基庚二酸D-脱氢酶，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸氧化酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基吡啶羧酸-脱羧酶的序列。优选地，所述酶被负调节。在这些酶中，优选如下酶被负调节：高丝氨酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶。
优选被正调节的基因产物选自：胱硫醚合成酶、胱硫醚裂解酶、高丝氨酸-O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶、高丝氨酸-脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛-脱氢酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转醛醇酶、转酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶，生物素连接酶、蛋白质OpcA、1-磷酸果糖激酶、6-磷酸果糖激酶、果糖-1，6-二磷酸酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶、辅酶B12-依赖性甲硫氨酸合酶、辅酶B12-非依赖性甲硫氨酸合酶以及苹果酸酶。
实施方案(1)可进一步包括回收靶化合物甲硫氨酸的步骤。术语“回收”包括从培养基中提取、收获、分离或者纯化所述化合物。回收化合物可以根据本领域已知的常规分离或者纯化方法进行，包括但不限于用常规树脂处理(例如阴离子或者阳离子交换树脂，非离子吸收树脂等)，用常规吸附剂处理(例如活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)，改变pH，溶剂提取(例如用常规溶剂如醇、乙酸乙酯、己烷等)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、再结晶、pH调整、冻干等。例如靶化合物可以通过首先除去微生物而从培养基中回收。然后将剩余的肉汤通过或者经过阳离子交换树脂以除去不希望的阳离子，然后通过或者经过阴离子交换树脂以除去不希望的无机阴离子和有机酸。
在本发明的实施方案(2)中，提供了从根据实施方案(1)的方法制备的甲硫氨酸中产生进一步产物的方法。本领域技术人员熟知怎样用修饰的核苷酸序列置换例如基因或者编码某多肽的内源核苷酸序列。这可以例如通过电穿孔、化学转化、缀合或者其它合适的转化方法导入合适的构建体而实现(无复制起源的质粒，无复制起源的线性DNA片段)。随后例如使用选择的标记进行同源重组，所述标记保证仅携带修饰的核苷酸序列代替内源天然发生的序列的这种细胞被鉴别。其它方法包括内源染色体座的基因破坏以及修饰的序列从例如质粒中表达。再其它的方法包括例如转座。可以使用的载体和宿主细胞的进一步信息在下文中描述。
通常地，本领域技术人员熟知设计构建体如载体以驱动多肽在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。本领域技术人员也熟知微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的培养条件以及从前述微生物中收获和纯化甲硫氨酸的方法。一些这些方面将在下文详细描述。
本领域技术人员也熟知可以将原始未修饰的核苷酸序列改变为编码相同氨基酸但是具有不同核酸序列的多肽的修饰的核苷酸序列的技术。这可以例如通过基于聚合酶链反应的诱变技术、通过通常已知的克隆程序、通过化学合成等方式实现。重组DNA技术和分子生物学标准技术在多个出版物中描述，例如Sambrook et al.(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者Ausubel et al.(eds)Current protocols in molecular biology.(John Wiley & Sons，Inc.2007)、Ausubel et al.，Current Protocols in Protein Science，(John Wiley & Sons，Inc.2002)、Ausubel et al.(eds.)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，3rd Edition(John Wiley & Sons，Inc.1995)。特别关于谷氨酸棒杆菌的方法在Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005)中描述。一些这样的方法在下文和“实施例”中描述。
下文详细描述了在微生物如大肠杆菌及特别是在谷氨酸棒杆菌中怎样进行遗传操纵。
载体和宿主细胞
如本文所用，术语“载体”是指能转运与其连接的另一核酸的核酸分子。
一种类型的载体是“质粒”，是指环形双链DNA环，其中可以连接额外的DNA节段。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA节段可以连接在病毒基因组中。
某些载体在导入其的宿主细胞中能自主复制(例如具有细菌复制起源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时整合进宿主细胞基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导其可操纵地连接的基因的表达。
这种载体在本文被称作“表达载体”。
通常地，在重组DNA技术中使用的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体最常用的形式。然而，本发明还包括发挥等价功能的这种其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
适于本发明的重组微生物制备的重组表达载体可包含适于各个核酸在宿主细胞中表达形式的上述异源核酸，这意味着所述重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞选择的一或多个调节序列，其与表达的核酸序列可操纵地连接。
在重组表达载体中，“可操纵地连接”是指感兴趣的核酸序列与调节序列以使得所述核苷酸序列表达的方式连接(例如在体外转录/翻译***或者当载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中表达)。术语“调节序列”是指包括启动子、阻抑物结合位点、激活物结合位点、增强子及其它表达控制元件(例如终止子、聚腺苷酸化信号，或者mRNA二级结构的其它元件)。这种调节序列在例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些序列，以及指导核酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些序列。优选的调节序列是例如启动子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、lpp-、lac-、lpp-、lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-ore PL、SOD、EFTu、EFTs、GroEL、MetZ(最后5个来自谷氨酸棒杆菌)其优选用于细菌中。额外的调节序列是例如来自酵母和真菌的启动子，如ADC1、Mfa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，来自植物的启动子如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33，nos-或者遍在蛋白-或者菜豆球蛋白启动子。也可以使用人工启动子。本领域技术人员意识到表达载体的设计可以依赖于如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质表达水平等因素。所述表达载体可以导入宿主细胞中，从而产生蛋白质或者肽，包括融合蛋白或者肽。
适于驱动修饰的核苷酸序列在宿主细胞优选在棒杆菌及特别优选的谷氨酸棒杆菌中表达的任何载体，均可用于降低这些宿主细胞中ICD的量。这种载体可例如是在棒状细菌中可自主复制的质粒载体。例如是pZ1(Menkel et al.(1989)，Applied and Environmental Microbiology 64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns et al.(1991)，Gene 102：93-98)、pHS2-1(Sonnen et al.(1991)，Gene 107：69-74)。这些载体基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或者pGA1。其它合适载体是pCLiK5MCS(WO2005059093)，或者基于pCG4(US-A 4,489,160)或者pNG2(Serwold-Davis et al.(1990)，FEMS Microbiology Letters 66，119-124)或者pAG1(US-A 5,158,891)的载体。举例的其它合适载体可以见于Handbook of Corynebacterium，Chapter 23(edited by Eggeling and Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005)中。
重组表达载体可以设计为在原核或者真核细胞中表达特异的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以在如下细胞中表达：细菌细胞如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)，酵母及其它真菌细胞(见Romanos，M.A.et al.(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)in：More Gene Manipulations in Fungi J.W.Bennet & L.L.Lasure，eds.，p.396-428：Academic Press：San Diego；and van den Hondel，C.A.M.J.J.&Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.et al.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge)，藻类和多细胞植物细胞(见Schmidt，R.and Willmitzer，L.(1988)Plant Cell Rep：.583-586)。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步论述。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核细胞中的表达通常使用含有组成型启动子或者可诱导启动子的载体进行，指导融合蛋白或者非融合蛋白的表达。
融合载体在编码的蛋白质中加入许多氨基酸，通常在重组蛋白质的氨基酸末端加入，但是也可以在C末端或者在蛋白质合适区域内融合。这种融合载体典型发挥四种作用：1)增加重组蛋白质的表达，2)增加重组蛋白质的稳定性，以及3)在亲和性纯化中作为配体帮助重组蛋白质的纯化，4)为随后的蛋白质检测提供“标签”。在融合表达载体中，通常将蛋白酶解位点导入在融合部分与重组蛋白质结合处，以使得所述重组蛋白质与所述融合部分分离以便于随后的融合蛋白质纯化。这种酶及其关联(cognate)识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白以及蛋白质A。
举例的合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体包括pTrc(Amann et al，(1988)Gene 69：301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、egtll、pBdCl以及pET lld(Studier etal.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；and Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。靶基因从pTrc载体中的表达依赖于从杂交trp-lac融合启动子中宿主RNA聚合酶转录。靶基因从pET Hd载体中表达依赖于通过共表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的从T7gnlO-lac融合启动子中转录。这些病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或者HMS 174(DE3)从携带T7gnl基因的居留(resident)X前噬菌体中在lacUV5启动子的转录控制下提供。为了转化细菌的其它变体，可以选择合适的载体。例如，已知质粒pIJ 101、pIJ364、pIJ702和pIJ361可用于转化链霉菌，而质粒pUB110、pC194或者pBD214适于转化杆菌。用于将遗传信息转移进棒杆菌中的一些质粒包括pHM1519、pBL1、pSA77或者pAJ667(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。
举例的合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体是例如pClik5aMCS(WO 2005/059093；或者可见于Eikmanns et al(Gene.(1991)102，93-8)。
举例的操纵棒杆菌的合适载体可见于Handbook of Corynebacterium(edited by Eggeling and Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005)。从中可找到大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体列表(表23.1)，大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体列表(表23.2)，可用于将DNA整合进谷氨酸棒杆菌染色体中的载体列表(表23.3)，整合进谷氨酸棒杆菌染色体中的表达载体列表(表23.4.)以及位点特异性整合进谷氨酸棒杆菌染色体中的载体列表(表23.6)。
在另一实施方案中，表达载体是酵母表达载体。举例的在酿酒酵母中表达的载体包括pYepSecl(Baldari，et al，(1987)Embo J.6：229-234)，2i，pAG-1、Yep6、Yep 13、PEMBLYe23、pMFa(Kurjan and Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz et al.，(1987)Gene 54：113-123)以及pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。构建适用于其它真菌如丝状真菌中的载体和载体构建方法包括在van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy，et al.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge，and Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York(IBSN 0 444 904018)中详细描述的那些。
对于本发明，可操纵地连接应理解为按顺序排列启动子(包括核糖体结合位点(RBS))、编码序列、终止子，以及任选进一步的调节元件，由此当表达所述编码序列时所述每个调节元件根据其决定而可完成其功能。
在另一实施方案中，异源核苷酸序列可以在单细胞植物细胞(如藻类细胞)中表达，或者在高等植物细胞(例如种子植物如农作物)中表达。举例的植物表达载体包括在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.and Masterson，R.(1992)Plant MoI.Biol.20：1195-1197以及Bevan，M.W.(1984)Nucl.Acid.Res.12：8711-8721中描述的那些载体，以及包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。
关于原核细胞和真核细胞二者的其它合适表达***见Sambrook，J.et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003的第16和17章所述。
在另一实施方案中，重组表达载体能指导核酸优先在特定细胞类型中表达，例如在植物细胞中(例如组织特异性调节元件用于表达核酸)。组织特异性调节元件为本领域已知。
本发明另一方面涉及其中已经导入重组表达载体或者核酸生物体或者宿主细胞在实施方案(1)和(2)中的应用。所得细胞或者生物体分别是重组细胞或者生物体。应理解这个术语不仅是指特定对象细胞，且当其后代包含所述重组核酸时还包含这种细胞的后代或者潜在后代。由于某些修饰因为突变或者环境影响而可以在随后的世代中出现，实际上这种后代与亲代细胞可能不相同，但是仍包括在如本文所用该术语范围内，只要所述后代仍表达或者能表达所述重组蛋白质即可。
载体DNA可以通过常规转化或者转染技术导入原核细胞或者真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”，“缀合”和“转导”是指各种本领域公认的技术，将外源核酸(例如线性DNA或者RNA(例如线性化载体或者无载体的单独基因构建体)或者载体形式核酸(例如质粒、噬菌体、噬粒、噬菌体、转座子或者其它DNA)导入宿主细胞中，包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、自然感受态(natural competence)、缀合化合物介导的转移，或者电穿孔。合适的转化或者转染宿主细胞的方法可见于Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003)及其它实验手册。
为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起导入宿主细胞中。优选的选择标记包括授予药物抗性的那些标记，所述药物如G418、潮霉素、卡那霉素、四环素、氨苄青霉素和氨甲喋呤。编码选择标记的核酸可以在编码上述修饰的核苷酸序列的同一载体上导入宿主细胞中，或者可以在单独的载体上导入宿主细胞中。用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择加以鉴别(例如具有掺入的选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。
当使用没有复制起源及具有两个不同标记基因的质粒(例如pClik intsacB)时，也可以产生具有***基因组的***物一部分的无标记菌株。这通过两个连续的同源重组事件实现(见Becker et al，APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，71(12)，p.8587-8596；Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005).)所述。质粒pClik int sacB的序列可见于WO2005/059093中SEQ ID NO：24所示序列，在该文中所述质粒称作pCIS。
在另一实施方案中，可以产生用于实施方案(1)和(2)中的重组微生物，其含有可以调节导入的基因表达的选择的***。例如，载体上包含的核苷酸序列置于lac操纵子控制下，使得该基因仅在存在IPTG的条件下表达。这种调节***为本领域熟知。
大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的生长-培养基和培养条件
在一个实施方案中，所述方法包括在适于甲硫氨酸生产的合适培养基中培养所述微生物。在另一实施方案中，所述方法进一步包括从培养基或者宿主细胞中分离甲硫氨酸。
本领域技术人员熟知一般微生物如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的培养。因此，下文提供了培养大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的一般性教导。其它的信息可以从培养大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的标准教科书中获取。
将大肠杆菌菌株分别在MB和LB肉汤中常规生长(Follettie et al.(1993)J.Bacteriol.175，4096-4103)。大肠杆菌的基本培养基分别是M9培养基和修饰的MCGC培养基(Yoshihama et al.(1985)J.Bacteriol.162，591-507)。加入葡萄糖，终浓度为1％。可以加入如下量的抗生素(μg/ml)：氨苄青霉素，50；卡那霉素，25；萘啶酸，25。可以加入如下量的氨基酸、维生素及其它补充剂：甲硫氨酸，9.3mM；精氨酸，9.3mM；组氨酸，9.3mM；维生素B1，0.05mM。大肠杆菌细胞分别在37℃常规生长。
遗传修饰的棒杆菌典型在合成的或者天然生长培养基中培养。熟知且可易于获得棒状细菌的许多不同生长培养基(Liebl et al.(1989)Appl Microbiol.BiotechnoL，32：205-210；von der Osten et al.(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；Patent DE 4,120,867；Liebl(1992)″The Genus Corynebacterium，in：The Procaryotes，Volume II，Balows，A.et al.，eds.Springer-Verlag)。使用说明也可见于Handbook of Corynebacterium(edited by Eggeling and Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005)。
这些培养基由一或多个碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素组成。优选的碳源是糖，如单糖、二糖或者多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、棉子糖、淀粉或者纤维素是非常好的碳源。
也可以通过复合化合物如糖蜜或者来自糖精细处理的其它副产物为培养基提供糖。提供不同碳源的混合物也是有利的。其它可能的碳源是醇和有机酸，如甲醇、乙醇、乙酸或者乳酸。氮源通常是有机或者无机含氮化合物，或者含有这些1或者(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸的材料，或者复合氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。
使用不同的硫源过量生产甲硫氨酸是可能的。可以使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐，以及更还原硫源如H2S和硫化物及衍生物。也可以使用有机硫源如甲硫醇、巯基乙酸盐、硫氰酸盐以及硫脲，含硫氨基酸如半胱氨酸及其它含硫化合物，以实现有效的甲硫氨酸生产。甲酸盐也可以与补充剂一样作为其它C1源，如甲醇或者甲醛。可以包含在培养基中的无机盐包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜、和铁的氯化盐、磷酸盐或者硫酸盐。在培养基中可以加入螯合化合物以保持溶液中的金属离子。特别适用的螯合化合物包括二羟基苯酚(dihydroxyphenols)，如儿茶酚或者protocatechuate，或者有机酸，如柠檬酸。培养基典型还含有其它生长因子，如维生素或者生长促进剂，其例子包括生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐通常来自复杂培养基成分如酵母膏、糖蜜、玉米浸液等。培养基化合物的精确组成强烈依赖于立即实验并针对各个具体情况逐个确定。培养基优化的信息可在教科书″Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach(Eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0 19 963577 3)中获得。还可以选择来自商业供应商的生长培养基，如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)或其它。
所有培养基成分应通过加热(1.5巴和120℃下20分钟)或者通过无菌过滤而灭菌。所述成分可以一起灭菌或者如果需要分开灭菌。
所有培养基成分可以在生长开始时就存在，或者它们可以任选地连续或者分批方式加入。培养条件对于每个实验分别定义。
温度取决于所用微生物并且通常应在15℃-45℃范围内。温度可以保持恒定或者可以在实验期间改变。培养基的pH可以在5-8.5范围，优选在7.0左右，并且可以通过向培养基中加入缓冲液而保持。用于这个目的的举例缓冲液是磷酸钾缓冲液。可以另外或者同时使用合成缓冲液如MOPS、HEPES、ACES等。还可以通过在生长期间加入NaOH或者NH4OH而维持恒定培养物pH。如果使用复杂培养基成分如酵母膏，可降低对额外缓冲液的需要，因为许多复杂化合物具有高缓冲能力。如果用发酵罐培养微生物，则pH还可以用气态氨控制。
保温时间通常从几小时到几天。这个时间的选择是用于允许最大量产物积累在发酵液中。公开的生长实验可以在各种容器中进行，如微滴定板、玻璃试管、玻璃瓶或者不同大小的玻璃或金属发酵罐。为了筛选大量克隆，微生物应该在微滴定板、玻璃试管或者有或无挡板的摇瓶中培养。优选使用100ml摇瓶，填充10％(体积)所需培养基。摇瓶应在旋转摇床(幅度25mm)上使用100-300rpm的速度范围振荡。蒸发损失可以通过保持潮湿气氛而消除；或者应进行蒸发损失的数学校正。
如果测试遗传修饰的克隆，则应该还测试未修饰的对照克隆(例如亲代菌株)或者含有无任何***序列的基础质粒的对照克隆。用在琼脂平板上生长的细胞接种培养基至OD600为0.5-1.5，所述琼脂平板例如为已在30℃保温的CM平板(10g/l葡萄糖，2,5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母膏，5g/l肉膏，22g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母膏，5g/l肉膏，22g/l琼脂，用2M NaOH调节为pH 6.8)。培养基的接种通过导入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬液或者加入这种细菌的液体预培养物而完成。
甲硫氨酸的定量
甲硫氨酸的定量可以通过本领域技术人员已知的任何教科书方法进行。在下面，举例示出这种定量。
分析用具有防护盒(guard cartridge)和Synergi 4μm柱(MAX-RP 80
150*4.6mm)(Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)的HPLC(Agilent1100，Agilent，Waldbronn，Germany)进行。在注射之前，分析物用o-phthaldialdehyde(OPA)和作为还原剂的巯基乙醇(2-MCE)衍生化。另外巯基基团用碘乙酸封闭。用40mM NaH2PO4(洗脱剂A，pH＝7.8，用NaOH调节)作为极性相和甲醇水混合物(100/1)作为非极性相(洗脱剂B)以1ml/分钟流速进行分离。应用下述梯度：起始0％B；39min 39％B；70min 64％B；100％B 3.5min；2min 0％B用于平衡。室温衍生化如下自动化进行。最初0.5μl 0.5％ 2-MCE于bicine中(0.5M，pH 8.5)与0.5μl细胞提取物混合。
随后加入1.5μl的50mg/ml碘乙酸于bicine中(0.5M，pH 8.5)，随后加入2.5μl bicine缓冲液(0.5M，pH 8.5)。通过加入0.5μl溶解于1/45/54 v/v/v2-MCE/MeOH/bicine(0.5M，pH 8.5)中的10mg/ml OPA试剂而进行衍生化。最后用32μl H2O稀释所述混合物。在上述移液步骤的每一步骤之间，等待时间为1分钟。然后将总体积37.5μl注射进柱中。如果在样品制备期间(例如在等待时间内)或者之后定期清洁自动取样针，分析结果可以显著改善。通过荧光检测仪(340nm激发，发射450nm，Agilent，Waldbronn，Germany)进行检测。用α-氨基丁酸(ABA)作为内标进行定量。
谷氨酸棒杆菌的重组方案
下面描述用特异的重组方案构建具有增加的甲硫氨酸生产效率的谷氨酸棒杆菌菌株。
″Campbell in″如本文所用是指原始宿主细胞的转化体，其中完整环状双链DNA分子(例如基于pCLIK int sacB的质粒)已通过单次同源重组事件(cross-in事件)整合进染色体中，其有效导致所述环状DNA分子的线性版本***与所述环状DNA分子的第一个DNA序列同源的染色体的第一个DNA序列中。″Campbelled in″是指已整合进“Campbell in”转化体的染色体中的线性DNA序列。″Campbell in″含有第一个同源DNA序列的复制品，其每个拷贝包括并包围同源重组交换点的拷贝。该命名来自Alan Campbell教授，他首次提议了这种重组。
″Campbell out，″如本文所用是指从″Campbell in″转化体传下来的细胞，其中，在包含在“Campbelled in”DNA的线性***DNA中的第二个DNA序列与染色体来源的与所述线性***序列的第二个DNA序列同源的第二个DNA序列之间发生第二个重组事件(cross out事件)，所述第二个重组事件导致整合的DNA序列的一部分的缺失(jettisoning)，但是重要的是，也导致整合的Campbelled in DNA的一部分(这可以是少至1个碱基)保持在染色体中，从而与原始宿主细胞相比，“Campbell out”细胞在染色体中含有一或多个有意变化(例如，单碱基取代，***异源基因或者DNA序列，***同源基因或修饰的同源基因的一个或多个额外拷贝，或者***包含一个以上上述这些例子的DNA序列)。
″Campbell out″细胞或菌株通常但非必需通过针对包含在“Campbelled in”DNA序列的一部分(希望被jettisoned的部分)中的基因反选择而获得，所述基因例如为枯草芽孢杆菌sacB基因，其当在存在大约5％-10％蔗糖的情况下生长的细胞中表达时是致死的。使用或者不使用反选择，希望的“Campbell out”细胞可以通过用任何可筛选表型筛选希望的细胞而获得或者鉴别，所述可筛选表型例如但不限于菌落形态学、菌落颜色、抗生素抗性的存在与否、通过聚合酶链反应给定DNA序列的存在与否、营养缺陷型的存在与否、酶的存在与否、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语″Campbell in″和″Campbell out″也可以用作各种时态的动词以表示上述方法。
应理解导致″Campbell in″或者″Campbell out″的同源重组事件可以在同源DNA序列内的一系列DNA碱基中发生，因为同源序列对于这一系列的至少一部分是彼此相同的，因此通常不能精确描述交换事件在哪里发生。换句话说，不能精确描述哪个序列源自***的DNA，哪个序列源自染色体DNA。另外，第一个同源DNA序列与第二个同源DNA序列通常通过部分非同源性区域分开，这种非同源性区域保持在″Campbell out″细胞的染色体中。为了实践，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一个和第二个同源DNA序列的长度至少为大约200个碱基对，并且可以直至几千碱基对长。但是，可以使用更短或更长序列进行这个方法。例如，第一个和第二个同源序列的长度可以从大约500到2000个碱基，从″Campbell in″中获得″Campbell out″通过将第一个和第二个同源序列安排为大约相同长度，优选差异少于200个碱基对、最优选两者中的较短者在碱基对方面是较长者长度的至少70％。″Campbell In and-Out-method″描述于WO 2007/012078及Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005)，第23章。
本发明参照下述实施例更详细描述。应理解这些实施例仅用于举例目的，不应被理解为限制本发明。
实施例
在下述实施例中，使用各种出版物如Sambrook et al.(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，or Ausubel et al.(2007)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols in Protein Science，edition as of 2002，Wiley Interscience中描述的重组DNA技术和分子生物学的标准技术。
PCT/EP2007/061151中有关经密码子使用进行的ICD还原及其对甲硫氨酸产生的作用的实施例引入本文作参考。实施例1与PCT/EP2007/061151的实施例3.1相同。
实施例1：降低异柠檬酸脱氢酶(icd)的表达，如PCT7EP2007/061151所述克隆
为降低异柠檬酸脱氢酶(Genbank登录号X71489)的活性，产生密码子使用中的两个不同变化。在所有情况中，编码序列的密码子均被改变而不改变编码的蛋白质的氨基酸序列。操作均在谷氨酸棒杆菌的icd基因的唯一染色体拷贝中进行。ICD活性的后续测量直接使得读出所述作用，因为人们可以假定鉴于酶本身未改变，因此其反映了表达水平。修饰如表1所示。
表1-ICD中密码子交换的概览
ICD ATG-GTG的序列示于PCT/EP2007/061151的图2a)。ICD CA的序列示于PCT/EP2007/061151的图3a)。为将这些突变导入icd编码区的染色体拷贝中，构建了2个不同质粒，它们使得可以通过2个连续同源重组事件进行无标记操作。
为此，将ICD ATG-GTG和ICD CA2的序列克隆进载体pClik int sacB(Becker et al(2005)，Applied and Environmental Microbiology，71(12)，p.8587-8596)中，其是含有下述元件的质粒：
卡那霉素抗性基因
可以用作阳性选择标记的SacB基因，因为携带这个基因的细胞不能在含有蔗糖的培养基上生长
用于大肠杆菌的复制起点
多克隆位点(MCS)
这个质粒能允许序列整合在谷氨酸棒杆菌的基因组基因座。
质粒构建
所有***序列均用ATCC 13032的基因组DNA作为模板经PCR扩增。编码区的修饰通过用下述寡核苷酸经融合PCR实现。下表示出所用引物及模板DNA：
表2-用于克隆idh构建体的引物概览
Old 441 GAGTACCTCGAGCGAAGACCTCGCAGATTCCG
(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.6)
Old 442 CATGAGACGCGTGGAATCTGCAGACCACTCGC
(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.7)
Old 443 GAGACTCGTGGCTAAGATCATCTG(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.8)
Old 444 CAGATGATCTTAGCCACGAGTCTC(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.9)
Old 447 CTACCGCGGGGATAGAGG(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.10)
Old 448 CCTCTATCCCCGCGGTAG(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.11)
在所有情况中，融合PCR的产物被纯化，用XhoI和MluI消化，再次纯化，连接进已用相同限制酶线性化的pClik int sacB中。***序列的完整性用测序证实。
优化的序列ICD ATG→GTG的编码序列如PCT/EP2007/061151的图2所示(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：2；本申请序列表的SEQ ID NO：4)。优化的序列ICD CA2的编码序列如PCT/EP2007/061151的图3所示(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：4；本申请序列表的SEQ ID NO：6)。
构建具有修饰的ICD表达水平的菌株
所述质粒然后用于用具有修饰的密码子使用的编码区置换这些基因的天然编码区。所用菌株是ATCC 13032lysCfbr。
需要两个连续重组事件改变完整编码序列，两个事件分别在上游和下游区。用优化基因置换内源基因的方法的原理在Becker et al.的出版物中描述(vide supra)。最重要的步骤是：
-通过电穿孔将质粒导入菌株中。该步骤例如在DE 10046870中描述，该文献引入本文作参考，其中描述了将质粒导入菌株中
-选择在第一个同源重组事件后已成功将质粒整合进基因组的克隆。这种选择通过在含卡那霉素琼脂平板上的生长而实现。除了该选择步骤，成功的重组可以通过菌落PCR检查。用于证实质粒在基因组中的存在的引物为BK1 776(AACGGCAGGTATATGTGATG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.12)和OLD 450(CGAGTAGGTCGCGAGCAG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.13)。阳性克隆给出大约600bp的条带。
-通过将阳性克隆在不含卡那霉素的培养基中保温，实现第二个重组事件。
-通过在含有蔗糖的培养基上生长鉴别其中载体骨架已通过第二个重组事件成功去除的克隆。仅丧失了包含SacB基因的载体骨架的那些克隆能存活。
-然后，通过测序跨越相关区域的PCR产物鉴别其中两个重组事件导致成功置换天然idh编码区的克隆。所述PCR产物用个体克隆的基因组DNA作为模板及引物OLD 441和OLD 442产生。PCR产物被纯化并用Old 471(GAATCCAACCCACGTTCAGGC)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO.14)测序。
人们可以使用不同的谷氨酸棒杆菌菌株用于置换icd的内源拷贝。但是，优选使用谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌株，例如ATCC13032lysCfbr或者ATCC13032或ATCC13286的其它衍生物。
ATCC13032lysCfbr可以从ATCC13032起始而产生。为了产生这种赖氨酸生产菌株，在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中进行lysC野生型基因的等位基因交换。为此，将核苷酸交换导入lysC基因中，从而所得蛋白质在311位携带异亮氨酸而不是苏氨酸。这个菌株的详细构建描述于专利申请WO2005/059093中。lysC基因的登录号是P26512。
为分析密码子使用被修改的IDH ATG-GTG和IDH CA2的作用，优化的菌株与亲代菌株比较赖氨酸产量。
ICD活性的确定
每个突变体菌株的两个克隆之一被测试ICD活性。细胞在液体培养基中于30℃生长过夜，在指数生长期经离心收获。细胞用50mM Tris-HCl，pH7.0洗2次。200mg细胞重悬于800μl裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.0，10mM MgCl2，1mM DTT，10％甘油)中并用珠击打(Ribolyser，2x 30s，intensity6)破碎。细胞碎片离心沉淀(台式离心机，30min，13K)。所得上清是可溶性蛋白质的提取物，其用于下述酶测定中。
ICD活性通过在下述条件下在总体积1ml中NADP的还原所致的340nm吸收增加而监测：
30mM三乙醇胺-盐酸盐，pH 7.4，0.4mM NADP，8mM DL-异柠檬酸盐，2mM MnSO4，细胞裂解物相应于0.1-0.2mg蛋白质
ICD活性用NADPH的摩尔消光系数6.22/mM*cm而计算。
结果
测量的ICD活性如下：
表3-ICD活性
对赖氨酸产量的作用
为分析ICD修饰的表达对赖氨酸产量的作用，优化的菌株与亲代菌株的赖氨酸产量进行比较。
为此，菌株在CM平板(10％蔗糖，10g/l葡萄糖，2,5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l Bacto Pepton，10g/l酵母膏，22g/l琼脂)上在30℃生长2天。随后，从平板上刮下细胞并重悬于盐水中。为进行主培养，在100ml Erlenmeyer瓶中的10ml培养基I(见WO 2005/059139)和0.5g高压灭菌的CaCO3与细胞悬液一起保温直至OD600为1.5。细胞然后在Infors AJ118型摇床(Infors，Bottmingen，Switzerland)上以220rpm生长72小时。
随后，确定分离进培养基中的赖氨酸浓度。这使用HPLC在Agilent 1100Series LC system HPLC中进行。用正苯二醛进行的柱前衍生化使得可以定量形成的氨基酸。氨基酸混合物的分离可以在Hypersil AA-柱(Agilent)上进行。
显示的确定的赖氨酸浓度值是来自2个独立培养的平均值。平均值的偏差总是低于4％。
表4-赖氨酸产量
| 菌株 | 克隆 | 相对赖氨酸量[％] | 相对OD[％] |
| ATCC lysC fbr | 100.00 | 100.00 | |
| ATCC lysC fbr | 99.81 | 101.22 | |
| ICD ATG→GTG | 102.34 | 92.77 | |
| ICD CA2 | 1 | 101.44 | 99.80 |
| ICD CA2 | 2 | 104.85 | 96.23 |
可以容易发现，具有降低的ICD活性的菌株具有更高的赖氨酸产量。因为在72小时后所有碳源均被使用，因此可以直接发现在这些菌株中碳产量(每消耗的糖形成的产物量)更高。
用于甲硫氨酸生产的菌株的构建及对甲硫氨酸产量的作用
在PCT/EP2007/061151中描述的进一步实验中，在起始密码子中携带上述ATG-GTG突变的异柠檬酸脱氢酶如上所述被克隆进pClik，导致产生pClik int sacB ICD(ATG-GTG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：15，本申请序列表的SEQ ID NO：5示出载体***序列)。随后，通过将质粒pClik int sacB ICD(ATG-GTG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：15)campbelling in和campbelling out进菌株OM469的基因组而构建菌株M2620。
菌株OM469已在WO 2007/012078中描述。在30℃保温48小时后，分析样品的糖消耗。发现菌株已使用了全部加入的糖，即所有菌株均使用了相同量的碳源。如以上及WO 2007/020295所述经HPLC确定合成的甲硫氨酸。
表5-甲硫氨酸产生
| 菌株 | 甲硫氨酸(mM) |
| OM469 | 10.2 |
| M2620 | 23.7 |
从表5数据可以看出具有改变的ICD基因起始密码子及因此改变的ICD活性的菌株M2620具有更高的甲硫氨酸产量。因为所有碳源在48小时后均已用完，因此可以直接发现对于产生的甲硫氨酸，碳产量(每消耗的糖形成的产物的量)在这个菌株中更高。
实施例2：icd的敲除
为缺失icd编码区，将一缺失盒***pClik int sacB中，所述缺失盒含有icd编码序列上游的～300-600个连续核苷酸，其直接融合于icd编码区下游的300-600个连续核苷酸。所得质粒称为pClik int sacB delta icd(SEQ ID 8)。
该质粒然后经标准方法例如电穿孔转化进谷氨酸棒杆菌。转化方法见例如Thierbach et al.(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))，Dunican und Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))，Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))，和DE 10046870。
需要两个连续重组事件缺失完整编码序列，两个事件分别在上游和下游区。使用质粒pClik int sacB用缺失盒基因置换内源基因的方法的原理在Becker et al.的出版物中描述(vide supra)。最重要的步骤是：
-选择在第一个同源重组事件后已成功将质粒整合进基因组的克隆。这种选择通过在含卡那霉素琼脂平板上的生长而实现。除了该选择步骤，成功的重组可以通过菌落PCR检查。
-通过将阳性克隆在不含卡那霉素的培养基中保温，实现第二个重组事件。
-通过在含有蔗糖的培养基上生长鉴别其中载体骨架已通过第二个重组事件成功去除的克隆。仅丧失了包含SacB基因的载体骨架的那些克隆能存活。
-然后，通过用PCR特异性引物或者通过Southern印迹分析鉴别其中两个重组事件导致缺失天然idh编码区的克隆。合适的引物是(5′to 3′)：
ICD up：GAACAGATCACAGAATCCAACC
ICD down：TGGCGATGCACAATTCCTTG
其中ICD完整编码区被去除的菌株应导致大约440碱基对(更精确地：442bp)的PCR产物，而具有野生型icd基因的亲代菌株应显示大约2660碱基对的条带。
成功的缺失可以进一步通过Southern印迹分析或者测量ICD活性而证实。
含有icd编码区的完整缺失的所得菌株称为delta icd。
因为这个菌株缺乏ICD活性并因此不能合成谷氨酸，其可以用于使这个菌株在丰富培养基上生长或者如果在最小培养基上生长则补充谷氨酸。
缺失谷氨酸棒杆菌中的基因的更详细方法也描述于Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium″(Taylor and Francis Group，2005)Chapter23.8。
icd缺失对于甲硫氨酸产量的作用可以如上所述及WO 2007/012078，WO 2007/020295所述监测。
总之，为生产甲硫氨酸，可以采用与WO 2007/012078，WO 2007/020295中所述的相同培养基和条件。菌株在CM琼脂上于30℃预培养过夜。培养的细胞收获在含有1.5ml 0.9％NaCl的微离心管中，在涡旋后经610nm的吸收而确定细胞密度。为了主培养，悬浮的细胞接种在具有0.5g CaCO3的高压灭菌的100ml Erlenmeyer瓶中所含的10ml生产培养基，至初始OD为1.5。在旋转摇床(Infers AJl 18，Bottmingen，Switzerland)上以200rpm在30℃进行主培养48-78小时。为了测量细胞生长，将0.1ml培养液与0.9ml 1NHCl混合以消除CaCO3，在合适稀释后测量610nm吸收。产物浓度及残余的糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖经HPLC方法测量(Agilent 1100 Series LC system)。
实施例3：用具有更低比活性的变体置换天然icd编码区
现在描述用于通过具有更低ICD活性的突变体序列置换原始icd序列的一种可能策略的更多实验细节。
1.产生及选择具有更低活性的icd突变体
在第一个步骤中，icd编码序列被克隆进复制质粒中，该质粒含有在宿主细胞如谷氨酸棒杆菌中有功能的所有调节序列，如启动子、RBS和终止子序列。理想地，使用穿梭质粒，其可以在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制。这种穿梭载体的例子是pClik5aMCS(WO 2005/059093)。更多适合的穿梭载体可以在Eikmanns et al(Gene.(1991)102，93-8)或者在″Handbook of Corynebacterium″(edited by Eggeling and Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005)中发现。人们可以发现大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体列表(表23.1)和大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的列表(表23.2)。后者是优选的，因为它们已经含有驱动克隆基因表达的合适启动子。
分子生物学标准方法如克隆包括经PCR扩增、用限制酶消化、连接、转化是技术人员已知的并且可以在标准方案著作中发现，如Ausubel et al.(eds)Current protocols in molecular biology.(John Wiley & Sons，Inc.2007)，Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，and Ausubel et al.(eds.)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，3rd Edition(John Wiley & Sons，Inc.1995)。
通过定点诱变产生了一系列icd编码序列的突变变体。诱变方法可见于Glick and Pasternak MOLECULAR BIOTECHNOLOGY.PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT DNA；2nd edition(American Sicienty for Microbiology，1998)，Chapter 8：Directed Mutagenensis and ProteinEngineering，and Ausubel et al.(eds)Current protocols in molecular biology.(John Wiley & Sons，Inc.2007).Chapter 8.
编码icd变体文库的所得系列质粒通常在大肠杆菌中产生。随后，文库可以通过标准方法如电穿孔转化进谷氨酸棒杆菌中。转化方法见于例如Thierbach et al.(Applied Microbiology and Biotechnology 29，356-362(1988))，Dunican und Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))，Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))或者Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium″(Taylor and Francis Group，2005)ISBN 0-8493-1821-1。
所得克隆应该然后测试ICD活性。测量来自粗细胞提取物的ICD酶活性的方法如实施例1所述。
作为对照，克隆在相同质粒中的野生型icd基因作为icd变体文库平行确定。
基于这些结果，具有更低活性的ICD变体与野生型icd基因相比可以被选择。
产生更低ICD活性的突变体可以具有更低比活性(例如每种蛋白质分子活性更低)，被转录或翻译效率更低，或者更不稳定。
2.用具有更低ICD活性的突变体置换野生型icd基因
为了用具有更低ICD活性的变体置换野生型icd编码区，可以采用二步骤策略。在第一个步骤中，野生型icd基因的编码区从基因组中完全缺失。有文献描述具有被破坏的icd的细胞是存活的。(Eikmanns et al(1995)J Bacteriol(1995)177(3)，774-782).
a)野生型icd的缺失
icd的缺失方法如实施例2所述。所得菌株称为delta icd。
b)***突变体icd序列
在第二个步骤中，变体icd编码序列被***delta icd菌株中。为此，突变体icd序列被克隆进合适的整合质粒中，例如pClik int sacB(见上述)，侧翼为用于实施例2中的缺失构建体的相同的～300-600个上游和下游核苷酸。
一旦含有突变体icd的这个质粒被转化进谷氨酸棒杆菌，在2个连续同源重组步骤后具有***到icd基因座的突变icd编码区的克隆可以通过上述的类似策略被鉴别。特异于突变ICD编码区的PCR引物可以用于区分delta icd菌株和阳性克隆。
已成功用突变体icd编码区置换野生型icd编码区的克隆以下被称为″icd(mut)″。
3.确定ICD活性
菌株″icd(mut)″的ICD活性应该与含有野生型icd基因的亲代菌株的活性相比较。这个方法描述于实施例1。
4.甲硫氨酸产生的作用分析
上述用突变体icd置换野生型icd可以在发酵产生甲硫氨酸的不同菌株中进行。
合适的菌株包括工程化为生产甲硫氨酸的谷氨酸棒杆菌，如例如WO 2007/012078，WO 2007/020295所述。
培养和检测甲硫氨酸在其它实施例中所述。总之，为生产甲硫氨酸，可以采用WO 2007/012078，WO 2007/020295所述的相同培养基和条件。菌株在CM琼脂上于30℃预培养。培养的细胞收获在含有1.5ml 0.9％NaCl的微离心管中，在涡旋后经610nm的吸收而确定细胞密度。为了主培养，悬浮的细胞接种在具有0.5g CaCO3的高压灭菌的100ml Erlenmeyer瓶中所含的10ml生产培养基，至初始OD为1.5。在旋转摇床(Infers AJl 18，Bottmingen，Switzerland)上以200rpm在30℃进行主培养48-78小时。为了测量细胞生长，将0.1ml培养液与0.9ml 1N HCl混合以消除CaCO3，在合适稀释后测量610nm吸收。产物浓度及残余的糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖经HPLC方法测量(Agilent 1100 Series LC system)。
靶产物甲硫氨酸的积累如预期在其中ICD活性被降低的菌株中更高。
实施例4：通过改变上游序列降低icd转录/翻译
a)鉴别合适上游序列(启动子加RBS)
首先，需鉴别弱于天然icd启动子的上游序列。该新的上游序列可以衍生自棒杆菌或者其它生物体。已鉴别了在细菌中、更特别在棒状细菌中有功能的几种启动子(包括RBS)。这种启动子的例子描述于：DE-A-44 40 118，Reinscheid et al，Microbiology 145：503(1999)，Patek et al，Microbiology 142：1297(1996)，WO 02/40679，DE-A-103 59 594，DE-A-103 59 595，DE-A-103 59 660和DE-A-10 2004 035 065。
另外，可以使用其它弱于天然icd启动子的上游区以置换icd启动子。
上游区的强度可以用报道基因***测量，如Patek et al(1996)Promoters from corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif.Microbiology 142，1297-1309所述。
或者，可以在天然上游序列中导入突变，随后分析其转录活性。优选地，使用icd起始密码子的83nt上游序列，因为在这个区域没有其它基因编码区。所述上游区域的序列示于如下(黑体字母)。
诱变DNA序列包括启动子序列的方法是本领域熟知的并且还描述于例如Bernard R.Glick，Jack J.Pasternak：Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA.2nd edition.1998.ISBN 1-55581-136-1；Chapter 8：Directed Mutagenesis and Protein engineering。合适的启动子序列可以然后被选择。
具有更低转录或者翻译活性的上游区应该被用于置换驱动ICD表达的原始启动子。技术上，置换可以通过前述实施例中所述的置换icd编码区的相同方法学通过两个连续同源重组事件进行。所得菌株具有降低的ICD活性。对产量的作用可以如实施例3所述分析。
包括500nt上游和下游区的ICD基因的序列(SEQ ID NO：2)
假定的启动子区(上游区)：黑体字母
黑体、非下划线：位于icd上游的基因的(部分)3′编码区
黑体、下划线：没有任何编码区的83nt
编码区：斜体
下游区：正常
ctcttcacaaaaagcgctgtgcttcctcacatggaagcacagcgctttttcatatttttattgccataatgggcacatgcgtttttctcgagttcttcccgcacttcttatcaccaccgccgtgagcatcccaacagcatctgctgccacactcaccgccgacaccgacaaggaattgtgcatcgccagcaacaccgacgattccgcggtggttaccttctggaactccattgaagactccgtgcgcgaacaacgcctcgacgaactagacgcccaagatccaggaatcaaagcggcgattgaaagctacatcgcccaagatgacaacgccccaactgctgctgaactgcaagtacgcctcgatgccatcgaatccggcgaaggcctagccatgctcctcccagacgatcccacgctggcagaccccaacgccgaggaaagtttcaaaacggagtacacatacgacgaagccaaagacatcatcagcggattctcca
Claims (6)
1.生产甲硫氨酸的方法，该方法使用与相应的起始微生物相比异柠檬酸脱氢酶活性部分或者完全降低的微生物。
2.权利要求1的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性部分或者完全降低的微生物是重组微生物。
3.权利要求1或2的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性由于异柠檬酸脱氢酶表达的部分或者完全降低而降低。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌、优选谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、ATCC 13032lysCfbr或者ATCC 13286或者这些菌株的衍生物。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述甲硫氨酸是L-甲硫氨酸。
6.权利要求1-5任一项的方法，附有条件是异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达所致，而是由所述微生物的天然异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达所致，其中所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列衍生自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，由此所述未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中根据微生物的密码子使用由使用频率较低的密码子置换。
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