JP2011511062A

JP2011511062A - ペプチドの精製方法

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Publication number: JP2011511062A
Application number: JP2010545613A
Authority: JP
Inventors: デイブ，ニテシュ; ベンカテサン，クリシュナムルティ; ナガラジャン，ラムプラブ; アイヤー，ハリシュ
Original assignee: バイオコンリミティド
Priority date: 2008-02-06
Filing date: 2008-03-26
Publication date: 2011-04-07
Also published as: EP2245043A1; MX2010008655A; RU2461564C2; KR20100120180A; IL207429A0; EP2245043A4; US20100317827A1; KR101257330B1; RU2010137008A; CN101981048A; WO2009098707A1

Abstract

本発明は、とりわけ、ペプチド、特に環状又は非環状ペプチド、それらの類似体、あるいはその誘導体の精製の分野に関する。より特に、本発明は、環状ペプチドの簡易化、且つ、最適化された精製工程であって、所望の最終産物の高い収量、選択性、及び純度を可能にするクロマトグラフィー法による、上述のペプチドと少なくとも1の関連不純物を含んでなる組成物からの精製工程に関する。その改良された工程は、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、ネシリチド、それらのそれぞれの誘導体及び類似体の調製に特に有用である。前記ポリペプチドは、少なくとも約96%、そして好ましくは少なくとも約99%の高純度で調製される。

Description

本発明の分野：
本発明は、とりわけ、ペプチド、特に環状又は非環状ペプチド、それらの類似体、あるいはその誘導体の精製の分野に関する。より特に、本発明は、環状ペプチドの簡易化、且つ、最適化された精製工程であって、所望の最終産物の高い収量、選択性、及び純度を可能にするクロマトグラフィー法による、上述のペプチドと少なくとも1の関連不純物を含んでなる組成物からの精製工程に関する。その改良された工程は、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、ネシリチド、それらのそれぞれの誘導体及び類似体の調製に特に有用である。前記ポリペプチドは、少なくとも約96%、そして好ましくは少なくとも約99%の高純度で調製される。

本発明の背景と従来技術
ヒト又は動物における治療用途を意図した、環状ペプチドを含めた組み換え（遺伝子操作された）ペプチド、その誘導体及びその類似体の製造の重要な態様は、所望のタンパク質が製造工程の中で生じる可能性がある無関係なタンパク質の汚染を基本的に受けていないような、十分に高いレベルの選択性、製造性、及び純度を得るための本精製工程である。

様々な種類の不純物、例えば、ジアステレオマー、不安定アミド結合の加水分解産物、固相ペプチド合成において主に形成される欠失配列、挿入ペプチドなどがペプチド合成中に生み出され、そして副産物、例えば多形型などが合成の最終段階における保護基の除去中に形成される。多くの場合、これらはジスルフィド結合を含む環状ペプチドの形成に関連する副産物の一部である［Bodansky et. al, Principles of Peptide Synthesis; Springer-Verlag; berlin, 1993］。当該技術分野には、関連不純物の複合混合物からの母液中の所望のペプチドを単離するための最小限のステップで大規模に運用可能でもある簡単なクロマトグラフィー精製法を開発する必要がある。基本的に、合成工程中に作り出される不純物の大部分を、1種類のクロマトグラフィー法によって取り除くことはできず、むしろ（複数の）方法、例えば逆相クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーなどの併用によって取り除くことができ、それは、本発明との関連において医薬品製剤（製剤バッファー中の製剤原料）を調製することである。

本発明は、逆相クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーを含めた2種類の運用可能なクロマトグラフィー法を網羅する。
多くの異なるクロマトグラフィー法が、純度と収率に関して所望の最終結果を得るために適用される。逆相クロマトグラフィーは、主要な分離原理として疎水性相互作用を利用した、用いる精製の中で最も強力な方法の1つである。逆相液体クロマトグラフィー（「RP-LC」）及び逆相‐高速液体クロマトグラフィー（「RP-HPLC」）は、合成又は組み換え法によって製造されたペプチドやタンパク質などの分子を精製するために一般的に使用される。RP-LC及びRP-HPLC法は、近縁にある関連不純物を効率的に分離することができるので、多くのさまざまの分子を精製するのに使用されてきた（Lee et al., "Preparative HPLC,” 8^th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610 (1988)）。さらに、RP-LC及びRP-HPLCは、分子、特に；工業規模でのタンパク質を精製するのにうまい具合に使用されてきた（Olsen et al., 1994, J. Chromatog. A, 675, 101）。

イオン交換クロマトグラフィー原理には、イオン交換樹脂に対するリガンドの荷電により2つの異なるアプローチ：陰イオン交換と陽イオン交換、が含まれる。従来のIEC精製工程は、通常、以下の：平衡段階、適用又は添加段階、洗浄段階、溶出段階、そして再生段階、のうちの1以上から成る（Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990又はRemington: The Science and Practice of Pharamacy, 19th Edition (1995)を参照のこと）。

クロマトグラフィー法の特性ごとに、所望のタンパク質産物を得る際に重要な担当役割を担っている。様々なクロマトグラフィー媒体が、逆相樹脂によるペプチドの大量精製に使用されている。最も一般的なのは、シリカ表面に取り付けられたC-4、C-8、及びC-18アルキル鎖をベースとしたものである。重要な問題の一部には、固定相の樹脂粒子の形状とサイズが含まれる。その他の重要な特性の一部には、バッファー系、pH、流速などが含まれる。ペプチド精製の改善にもかかわらず、一部の精製ペプチドは、望ましくない量の容認できない対イオンをいまだに含んでいる。この認められた理論のため、当該技術分野が直面している問題を克服する代替の精製方法について当該出願を通じて言及する。

US 2006148699は、RP-HPLCベースのペプチドの精製方法であって、医薬的に許容し得る対イオン塩の水溶液によりカラムを洗浄し；そして、有機溶剤と医薬的に許容し得る対イオンの酸の溶媒混合物を用いてカラムからそのペプチドを溶出することを含んでなり、ここで、上記水溶液が少なくとも約6のpHを有する当該精製方法に関する。その後の環状、非環状ペプチド及びエプチフィバチドに関する従属クレームもまた、具体的に主張されている。
WO 2005100388は、アセトニトリル‐水の勾配を使用し、そして97.5%の純度を有する産物を回収するエキセンジン-4のRP-HPLC精製を開示している。

WO 2005019262は、グルカゴン様ペプチドのRP-HPLC精製へのポリスチレン／ジビニルベンゼン・ベースの樹脂の使用に関する。
当該技術分野には、固相合成法による調製後に環状ペプチドなどの分子を選択的に分離して、高度に純粋なペプチド最終産物を得るための効果的なクロマトグラフィー法が必要である。この必要性は、その工程がクロマトグラフィー工程（ここで、溶出は、選択された溶媒系、pH範囲、及び他の関連要因によって行われる）の収率、純度、処理能力、及び運用条件を可能な限り再現するときに満たされるであろう。運用手順は、商業的な分離のために有利に利用されることもできる。

本発明による分離工程の別の重要な利点は、一貫した再現性のよい様式でそれらを大規模化することもできる点である。さらに、本発明の工程は、これまで知られている精製方法によって得られたものより優れていて、且つ、より高い収率をもたらす産物を提供する。
本発明は、2〜8の範囲のpHにおける環状ペプチドとその類似体又は誘導体のRP-HPLC精製のための、有機溶出剤として極性溶媒を含んでなるpH緩衝溶媒の適用にある。本発明は、前述の溶媒系を使用した環状ペプチドのRP-HPLC精製の範囲内で、当該技術分野の現状と比較して、向上した分離効率、より高い純度、及び工業的使用のための容易な運用を容易にする。驚いたことに、標的環状ペプチド化合物と関連不純物の分離は、本発明において利用される新しい方法論によって改善され、そしてより純粋な環様ペプチド産物をもたらす。

製剤溶液中へのペプチドの溶出は、従来の方法と比較して利点がある。従来の方法は、溶液の精製したペプチドを凍結乾燥し、そして賦形剤の添加前に凍結乾燥粉末を再溶解することから構成される。製剤溶液中へのペプチドの溶出は、凍結乾燥機の操作とそのすぐ後の再溶解を回避する。よって、標準的な抽出及びクロマトグラフィー法を単独で又は組み合わせて使用するとき、本発明の抽出方法は、従来の方法によって必要とされるよりも少ないステップにより高収率、且つ、高純度で本発明の環状ペプチドの分離を可能にする。

本発明の目的
本発明の主目的は、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、逆相‐高速液体クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを使用した精製の方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、ネシリチド、及び関連類似体又は誘導体を含んでなる群から選択される環状又は非環状ペプチドの精製方法を提供することである。

本発明の説明
したがって、本発明は、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法（上述の方法は、ペプチド混合物と逆相‐高速液体クロマトグラフィー・マトリックス及び／又はイオン交換クロマトグラフィー・マトリックスとを接触させて、精製されたペプチドを得るステップを含んでなる）；逆相‐高速液体クロマトグラフィーを使用して、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法（上述の方法は、以下のステップ：シリカ・ベースのポリマー樹脂を逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムに充填し、続いて有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒でそれを平衡化し；少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を約≦100〜400cm／時間の流速でクロマトグラフィー・カラムに添加し；ステップ（a）のものと同じ緩衝溶液でカラムを洗浄し；そして8‐14%の線形勾配を実施することによって上記カラムから精製産物を溶出して、精製されたペプチド産物を得る、を含んでなる）；

イオン交換クロマトグラフィーを使用して、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法（上述の方法は、以下のステップ：陽イオン交換カラムを弱酸バッファーの水溶液で平衡化し；逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムに精製したペプチドを添加し；そしてそのカラムを洗浄し、ステップ（a）で使用したバッファーでペプチドを溶出して、精製したペプチド産物を得る、を含んでなる）；

及び少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法（上述の方法は、以下のステップ：シリカ・ベースのポリマー樹脂で逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムを充填し、続いて有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒でそれを平衡化し；少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を上記カラムに約≦100〜400cm／時間の流速で添加し、続いてステップ（a）のものと同じ緩衝溶液でカラムを洗浄し；8‐14%の線形勾配を実施することによって上記カラムから精製産物を溶出し；逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムから溶出した産物を弱酸バッファーの水溶液で平衡化した陽イオン交換カラムに添加し；そしてカラムを洗浄し、溶出バッファーでペプチド産物を溶出して、精製ペプチド産物を得る、を含んでなる）と関連する。

本発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法に関し、上述の方法は、逆相‐高速液体クロマトグラフィー・マトリックス及び／又はイオン交換クロマトグラフィー・マトリックスとペプチド混合物とを接触させて、精製されたペプチドを得るステップを含んでなる。
本発明の別の実施形態において、前述のペプチドは、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、ネシリチド及び関連類似体又は誘導体を含んでなる群から選択される環状又は非環状ペプチドである。
本発明のまた別の実施形態において、前述のペプチド混合物を、任意の順番でシリカ・ベースのポリマー樹脂で構成されている前述のマトリックスと接触させる。

本発明のさらに別の実施形態において、前記樹脂を、Sephadex、Sephadex LH20、Sephadex G-25、Sephadex G-10、Sepharose、Superdex、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチル・セルロース、スルホプロピル・セルロース、カルボキシメチルsephadex、スルホプロピルsephadex、スルホプロピルsepharose及びカルボキシメチルsepharoseを含んでなる群から、好ましくはポリスチレン又はジビニルベンゼンから選択することもできる。
本発明のさらに別の実施形態において、樹脂ビーズの粒径と細孔サイズは、それぞれ1μm〜50μmと100Å〜500Åに及んでいる。
本発明のさらに別の実施形態において、前述の精製に、有機酸バッファーを含む水相中、極性有機緩衝溶媒の約2%から約30%への勾配を利用する。

本発明のさらに別の実施形態において、前述の極性緩衝溶媒はアセトニトリルである。
本発明のさらに別の実施形態において、前述の有機酸バッファーは、クエン酸、酢酸、過塩素酸及びギ酸を含んでなる群から選択される。
本発明の別の実施形態において、前記バッファーのモル濃度は、10mM〜50mMにわたる。

本発明の別の実施形態において、前記精製は、2〜9のpHにて実施される。
本発明の別の実施形態において、前述の方法は、任意の別のサイズ排除クロマトグラフィー・ステップをさらに含んでなる。
本発明の別の実施形態において、精製ペプチド産物を本発明の方法によって得、ここで、そのペプチド産物の純度は、97%〜100%の範囲にある。
本発明の別の実施形態において、前記産物の純度は、少なくとも96%である。

本発明は、逆相‐高速液体クロマトグラフィーを使用して、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法に関し、上述の方法は、以下のステップ：
a）シリカ・ベースのポリマー樹脂を逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムに充填し、続いて有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒でそれを平衡化し；
b）少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を約≦100〜400cm／時間の流速にて上記クロマトグラフィー・カラムに添加し；
c）ステップ（a）のものと同じ緩衝溶液でカラムを洗浄し；そして
d）8‐14%の線形勾配を実施することによってカラムから精製された産物を溶出して、精製ペプチド産物を得る、
を含んでなる。

本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法と関し、上述の方法は、以下のステップ：
a）弱酸バッファーの水溶液で陽イオン交換カラムを平衡化し；
b）精製ペプチドを逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムに添加し；そして
c）カラムを洗浄し、ステップ（a）で使用したバッファーでペプチドを溶出して、精製ペプチド産物を得る、
を含んでなる。

本発明は、少なくとも1の関連不純物を含む混合物からペプチドを精製する方法に関連し、上述の方法は、以下のステップ：
a）シリカ・ベースのポリマー樹脂を逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムに充填し、続いて有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒でそれを平衡化し；
b）上記カラムに約≦100〜400cm／時間の流速にて少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を添加し、続いてステップ（a）のものと同じ緩衝溶液でそのカラムを洗浄し；
c）8‐14%の線形勾配を実施することによって上記カラムから精製された産物を溶出し；
d）逆相‐高速液体クロマトグラフィー・カラムからの溶出産物を、弱酸バッファーの水溶液で平衡化した陽イオン交換カラムに添加し；そして
e）カラムを洗浄し、溶出バッファー中にペプチド産物を溶出して、精製ペプチド産物を得る、
を含んでなる。

本発明の別の実施形態において、前記樹脂を、Sephadex、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチル・セルロース、カルボキシメチルsephadex、スルホプロピル・セルロース、及びスルホプロピルsephadexを含んでなる群から、好ましくはポリスチレン又はジビニルベンゼンから選択することもできる。
本発明のまた別の実施形態において、樹脂ビーズの粒径と細孔サイズは、それぞれ、1μm〜50μmと100Å〜500Åにわたる。
本発明のさらに別の実施形態において、前述の方法は、任意の別のサイズ排除クロマトグラフィー・ステップをさらに含んでなる。

本発明のさらに別の実施形態において、前述のペプチドは、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、ネシリチド及び関連類似体又は誘導体を含んでなる群から選択される環状又は非環状ペプチドである。
本発明のさらに別の実施形態において、前記極性緩衝溶媒は、アセトニトリルである。
本発明のさらに別の実施形態において、前記有機酸バッファーは、クエン酸、酢酸及びギ酸を含んでなる群から選択される。
本発明のさらに別の実施形態において、使用されるバッファーのモル濃度は、10mM〜50mMにわたる。

本発明のさらに別の実施形態において、前記精製は、2〜9のpHにて実施される。
本発明のさらに別の実施形態において、本発明の方法によって精製ペプチド産物を得、ここで、そのペプチド産物の純度は97%〜100%にわたる。
本発明のさらに別の実施形態において、前記ペプチドのエプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン、及びネシリチドは、少なくとも96%の純度を伴う。
本発明の前記及び他の目的は、固相合成法の後に得られる環状又は非環状ペプチド化合物を形成し、そして精製するための具体的に描写された工程で提供される。

ペプチドの精製方法、前述の工程は、約2〜約5のpHにて、有機酸バッファーを含む水相中、約2%〜約20%の極性緩衝溶媒、好ましくはアセトニトリルの勾配を利用することによる逆相‐高速液体クロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィー精製を含んでなる。

クロマトグラフィー媒体／溶媒系を提供することが本発明の目的であり、ここで、前記工程は、RP-HPLCと陽イオン交換クロマトグラフィーに基づいている。
広い態様において、本発明は、ペプチドを、上述のペプチドと関連不純物を含んでなる混合物から精製するためのRP-HPLCクロマトグラフィー工程であって、以下のステップ：有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒で平衡化したポリマー・ベースの樹脂を充填したRP-HPLCカラムを通して溶出することによって、上述の混合物の上述のペプチドと上述の関連不純物を分離し、≦360cm／時間の所望の流速にてカラムにペプチドの溶液を添加し、50mMの有機酸中、低いパーセンテージ（5%）の極性有機溶媒でカラムを洗浄し、上述のバッファーの組み合わせを用いて8‐14%の線形勾配を実施することによってペプチド産物を溶出する、を含んでなる工程に関する。
当業者は、本発明のクロマトグラフィー法中に調整できる様々な変数があることを認識しているであろう。そういった変数としては、添加及び溶出条件、例えば、イオン強度、バッファー組成、pH、温度、少量の有機溶剤の添加などが挙げられる。しかしながら、そういった変数は、この分野では日常的に調整されているので、当業者は最適条件を容易に確立できる。

代表的な図面、実験、結果、及び手順を通して詳細に本発明の少なくとも1つの実施形態について説明する前に、本発明は、その適用が以下の明細書に説明されたか、又は図面、実験及び／又は結果に解説された構成要素の構造及び配置の詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、別の実施形態が可能であるか、又はいろいろやり方で実行若しくは実施することができる。そういうものとして、本明細書中に使用される言語には、可能な限り広い範囲と意味が与えられることを意図し；そして、実施形態は、包括的なものではなく、例示的なものである。また、本明細書中に利用される言い回しと専門用語は、説明を目的としたものであるので、限定と見なすべきでないことを理解すべきである。

本願発明は、天然ペプチドのものと同様の生物学的活性を有する環状／非環状ペプチドを精製するのに有用な工程と手順；そしてより特に、上記活性を有しておらず、それで不純物と見なすことができる他の物質と、活性ペプチド物質を分離するためのクロマトグラフィー、RP-HPLCを利用する工程に関する。精製ペプチド産物は、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを使用して、製剤溶液中に調製される。

本発明の1つの実施形態は、固相合成法によって調製されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を精製する方法であって、以下のステップ：99%に近い純度の上述のペプチドを得るのに十分なクロマトグラフィー条件下、ポリマー・ベースの樹脂マトリックスを含んでなる逆相クロマトグラフィーによる精製の第1ステップにペプチド・サンプルを供し、そして製剤溶液中での濃縮のために陽イオン交換クロマトグラフィーに溶出ペプチドをさらに供して、医薬品製剤を調製する、を含んでなる上述の方法を提供する。

製剤溶液中へのペプチドの溶出は、従来の方法と比較して利点がある。従来の方法は、精製したペプチドを凍結乾燥し、そして賦形剤の添加前に、その凍結乾燥粉末を溶液中に再溶解することを含んでなる。製剤溶液中へのペプチドの溶出は、凍結乾燥機とそれへの再溶解の操作を回避する。

本発明は、別の態様において、タンパク質を精製する方法であって、以下のステップ：化合物を含んでいる混合物を、逆相HPLCカラムに供し、そして有機溶剤を用いてペプチドを含んでいるサンプルを溶出し、化合物が樹脂に結合されるのを許す条件下でイオン交換樹脂とサンプルを接触させ、そして水性バッファー溶液を用いて樹脂から有機溶剤を洗い流す、を含むその方法を特徴とする。

本発明の実効性能は、効果的な精製のための、使用されるクロマトグラフィー・マトリックスの正しい組み合わせ、pH値、及びバッファーのイオン強度の個性化を必要とする。
クロマトグラフィー法のあらゆる特性が、所望のタンパク質産物を得る際に重要な役割を担っている。精製に使用されるバッファー系は、化合物の疎水性に基づいて、不純物と分子の分離を改善することができる。指定されたpHにてバッファー系は、溶出勾配の中で不純物を早い時期に溶出する。これは、特定の条件にて着目の分子に比べて疎水性が低い不純物の場合に達成される。

バッファー系のpHは、化合物の疎水性と相まって分離に影響を及ぼす。クロマトグラフィー分離の異なるステップ中のものと考えられるpHの変化が、カラム内の化合物の移動性を生み出す。
分離に使用されるビーズは、10μmの粒径と300Åの細孔サイズのポリスチレン／ジビニルベンゼンである。細孔サイズが分子に接近可能な表面積を規制するが、添加サンプルはビーズに結合する能力を有する。ビーズは、それがポリマー・ベースなので高いpH安定性を有し、そして粒径がより良好な分解能を提供するであろう。

製剤溶液の組成
エプチフィバチド
1．注射薬：1mlが、2mgのエプチフィバチド、5.25mgのクエン酸、及び酢酸で調整された溶液pH5.25、適量の水から成る。
2．輸液：1mlが、0.75mgのエプチフィバチド、5.25mgのクエン酸、及び酢酸で調整された溶液pH5.25、適量の水から成る。

アトシバン
1．注射薬：1mlが、7.5mgのエプチフィバチド、50mgのマンニトール、及びHClで調整された溶液pH4.5、適量の水から成る。

用語の定義：
本発明を記載及び主張する際に、以下の専門用語が、本明細書中に示した定義に従って使用されるであろう。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、特定の長さの産物を指すことはない；よって、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれている。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を指しも除きもしないが、これらのポリペプチドの化学的又は発現後修飾は、具体的な実施形態として含むことも除くこともできる。そのため、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含めたポリペプチドへの修飾は、ポリペプチドという用語によって明示的に網羅される。さらに、これらの修飾を持つポリペプチドは、本発明に含まれるべき又は除かれるべき個々の種として指定されることもできる。1つの実施形態において、前記分子は、ポリペプチド、又はそれらの関連類似体若しくはその誘導体である。好ましくは、前記ポリペプチドは、環状ペプチドである。別の好ましい実施形態によると、前記ポリペプチドは、非環状ペプチドである。さらに別の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン又はネシリチドを含んでなる群から選択される。

ペプチドと1以上の混入物を含んでなる組成物からのそのペプチドの「精製する」という用語は、その結果、ペプチド組成物から少なくとも1の混入物の含有量を減らすことによってその組成物中のペプチドの純度を高める。
「不純物」は、所望のポリペプチド産物又は着目のタンパク質と異なった物質である。不純物としては、これだけに限定されるものではないが、ジアステレオマー、不安定アミド結合の加水分解産物、主に固相ペプチド合成で形成された欠失配列、挿入ペプチド、及び合成の最終段階における保護基の除去中に形成される多形型などの副産物が挙げられる。

「クロマトグラフィー」という用語は、移動相の影響下、又は結合及び溶出の工程において、混合物の個々の溶質が固定媒体を通過して移動する速度の違いの結果として混合物中の着目の溶質が混合物中の他の溶質から分離される工程を指す。
「高速液体クロマトグラフィー」という用語は、本明細書中に使用される場合、カラム充填に使用される粒子（固定相）が、小さく（3〜50ミクロン）、且つ、選択されたサイズから違いがほとんどなく均一であるクロマトグラフィー法を指す。そのようなクロマトグラフィーは、比較的高い注入口圧力（約500〜3500psi）を通常用いる。

「イオン交換」及び「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、混合物中の（タンパク質などの）着目の溶質が、（その着目の溶質が混合物中の溶質不純物又は混入物に比べて多かれ少なかれ荷電された化合物と非特異的に相互作用するような）固相イオン交換物質に（共有結合などによって）連結された荷電された化合物と相互作用するクロマトグラフィー工程を指す。混合物中の混入溶質は、着目の溶質に比べて速く若しくは遅くイオン交換物質カラムから溶出するか、又は着目の溶質と比較して樹脂に結合されるか若しくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」としては、具体的には、陽イオン交換、陰イオン交換、及び混合様式のクロマトグラフィーが挙げられる。陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップは、RP-HPLCステップに続いても、又はその逆であってもよい。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィー・ステップには、その後に他のクロマトグラフィー・ステップが続く。

「陽イオン交換クロマトグラフィー」は、陽性荷電イオンが陰性荷電樹脂に結合する工程である。
「添加バッファー」は、着目のポリペプチド分子と1以上の不純物を含んで成る組成物をイオン交換樹脂に添加するために使用されるものである。添加バッファーは、着目のポリペプチド分子（及び通常1以上の不純物）がイオン交換樹脂に結合するような、又は着目のタンパク質がカラムを通過すると同時に、不純物が樹脂に結合するような電導度及び／又はpHを有する。

「極性緩衝溶媒（polar buffer solvent）」は、バッファーとして使用される、イオン化合物若しくは（イオン化する）共有結合化合物を溶解できるあらゆる溶媒であることができる。好ましくは、本発明との関連において、使用される極性溶媒はアセトニトリルである。

固相合成法によって調製される本発明のペプチドの分離及び精製のための方法の代表的な実施例は、以下のステップ：
i．有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒で平衡化したポリマー・ベースの樹脂をRP-HPLCカラムに充填し、
ii．約≦100〜400cm／時間の流速にて上記カラムに、少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を添加し、
iii．ステップiのものと同じ緩衝溶液でそのカラムを洗浄し、
iv．8‐14%の線形勾配を実施してカラムから精製された産物を溶出する、
を含んでなる。

溶出された精製ペプチド溶液を、さらに、陽イオン交換カラムに添加して、産物の濃度を高める。
陽イオン交換クロマトグラフィーを介した製剤バッファー中への溶出と組み合わせた前述のペプチドの濃縮は、以下のステップ：
a．弱酸バッファーの水溶液で陽イオン交換カラムを平衡化し、
b．そのカラムにRP-HPLC精製されたペプチドを添加し、
c．カラムを洗浄し、そしてステップaで使用したバッファーでペプチド産物を溶出する、
を含んでなる。

バッファーAは1〜5%のアセトニトリルであり、及びバッファーBは10〜50mMの有機酸バッファーであり、そしてサンプルは約≦100〜400cm／時間の流速にて添加される。使用される勾配は、精製されるサンプル・ペプチドに関する変化に左右される。

本明細書中の工程の第1ステップは、逆相液体クロマトグラフィー・カラムに混合物を添加することによって、それらを含む混合物から分子を精製することを伴う。前記カラムは、低圧であっても、高圧（HPLC）であってもよく、その後者には、約20μm未満の粒径を持つ媒体を充填する。好ましくは、前記カラムには、約5〜40μm、より好ましくは約10〜40μm、そして最も好ましくは約10〜15μmの粒径を持つ媒体を充填する。本発明との関連において、カラム内に充填する樹脂の粒径は、10μmである。したがって、カラムは、好ましくは、特にそれを必要とするペプチドの精製のためのHPLCカラムである。好ましくは、カラムには、約100〜4000オングストローム、より好ましくは約100〜500オングストロームの細孔サイズがある。本発明との関連において、カラムに充填する樹脂の細孔サイズは、300オングストロームである。カラム長は、好ましくは10〜50cm、より好ましくは約25〜35cmである。

溶出のためのpH又はpH範囲は着目の所望のタンパク質と実施されたクロマトグラフィーのタイプに従って決定されるが、溶出バッファーのpHは、約2〜約9であり得るか、あるいは約3〜約8、約4〜約8、又は約5〜8であり得る。添加、洗浄、又は溶出バッファーの適切なpH範囲は、着目のタンパク質が活性型で回収されるように、標準的な方法によって容易に決定される。このための溶出バッファーの例としては、クエン酸又は酢酸バッファーが挙げられる。

カラムの媒体は、ポリマー・ベースの樹脂媒体、シリカ・ベースの媒体、又はメタクリレート媒体を含めた任意の好適な物質であることができる。好ましくは、媒体は、AMBERCHROM HPR10である。本発明の実施における使用のために想定される陽イオン交換樹脂としては、スルホプロピルsepharose、ヒドロゲル重合化セラミック・ビーズ、カルボキシメチル・セルロース、親水性球状ポリマー・ビーズ、カルボキシメチルsephadex、スルホプロピル・セルロース、スルホプロピルsephadex等が挙げられる。目下の好ましい陽イオン交換樹脂としては、スルホプロピルsepharose及びヒドロゲル重合化セラミック・ビーズが挙げられるが、その入手しやすさと優れた性能によりスルホプロピルsepharoseが本発明の実施における使用のために現在最も好ましい陽イオン交換樹脂である。使用されるサイズ排除樹脂は、Sephadex LH-20、Sephadex G-25、Sephadex G-10である。

流速は、クロマトグラフィーが酸性であるか若しくは中性であるかによって、通常、約20〜400cm／時間、又は4〜40カラム体積（CV）／時間である。好ましくは、ペプチドは、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加される。
カラムのペプチドの添加容量は、存在する分子と不純物に基づいてRP-HPLCクロマトグラフィー分離に関しては、通常、2〜15g/Lである。イオン交換カラムに関する添加容量は、濃縮ステップに関して≦70g/Lである。

本発明のこれら及び他の限定されない実施形態は、本明細書中に提供された開示と請求項を読むことで、当業者によって容易に理解される。当然、前述の所望のタンパク質／ペプチド産物及び方法は変化し得るので、本願発明が記載した特定の方法及び工程に限定されないことは理解される。本明細書中に使用した専門用語が、特定の実施形態だけを説明する目的のためのものであって、限定していることを意図しないこともまた、理解されるべきである。

当然のことながら、分離に使用する成分を併用する、高分解能の分離を得るための実施例に記載の例示された精製方法の使用は、特に簡単で、便利で、そして安価な様式によって所望のペプチドを得るためにその精製方法を特に有効なものにする。

本出願の技術は、次の実施例を用いてさらに詳しく説明される。しかしながら、その実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を表す。

エプチフィバチドの純度を表すクロマトグラム。アトシバンの純度を表すクロマトグラム。ネシリチドの純度を表すクロマトグラム。エクセナチドの純度を表すクロマトグラム。

実施例1：
固相合成法によって調製した66%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、50mMの酢酸溶液中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる8‐14%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、23〜26barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、54%の収率を示す純度98.7%のものである。エプチフィバチドのHPLC分析の条件を、以下の表中に示す。

精製したエプチフィバチド溶液を、陽イオン交換カラムによる添加して、エプチフィバチド濃度を高め、そして薬物製品の濃縮物である製剤バッファー中への溶出を実施する。溶出液を、必要な濃度に希釈し、そして薬物製品としてバイアル中に充填することがあり得る。

陽イオン交換カラムを、27mMのクエン酸pH 2.70で平衡化した。精製したエプチフィバチドを、≧65g/Lマトリックスの濃度まで水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムを、27mMのクエン酸pH 2.70で洗浄した。溶出を、27mMのクエン酸pH 5.25を使用して実施した。薬物製品としてバイアル中に充填するために必要な濃度に希釈した、得られた溶出液は、＞9g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、180cm／時間の流速にて0.5〜0.7barである。この工程から得られたエプチフィバチドは、100%の収率を示す純度98.6%のものである。

実施例2：
固相合成法によって調製した69.5%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。酢酸ナトリウムのpHを、酢酸で3.0に調整した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる9‐14%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、25〜29barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、43.0%の収率を示す純度98.6%のものである。

精製したエプチフィバチド溶液を、陽イオン交換カラムによる添加して、エプチフィバチド濃度を高め、そして薬物製品の濃縮物である製剤バッファー中への溶出を実施する。溶出液を、必要な濃度に希釈し、そして薬物製品としてバイアル中に充填することがあり得る。
陽イオン交換カラムを、27mMのクエン酸pH 2.70で平衡化した。精製したエプチフィバチドを、≧65g/Lマトリックスの濃度まで水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムを、pH 2.70にて27mMのクエン酸で洗浄した。溶出を、27mMのクエン酸pH 5.25を使用して実施した。薬物製品としてバイアル中に充填するために必要な濃度に希釈した、得られた溶出液は、＞9g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、180cm／時間の流速にて0.5〜0.7barであった。この工程から得られたエプチフィバチド産物は、100%の収率を示す純度98.6%のものである。

実施例3：
固相合成法によって調製した69.5%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのクエン酸pH 2.5中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのクエン酸pH 2.5中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる9‐14%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのクエン酸pH 2.5がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、22〜28barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、57%の収率を示す純度98.6%のものである。

陽イオン交換カラムを、27mMのクエン酸pH 2.70で平衡化した。精製したエプチフィバチドを、≧50g/Lマトリックスの濃度まで水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムを、27mMのクエン酸pH 2.70で洗浄した。溶出を、27mMのクエン酸pH 5.25を使用して実施した。薬物製品としてバイアル中に充填するために必要な濃度に希釈した、得られた溶出液は、＞9g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、180cm／時間の流速にて0.5〜0.7barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、100%の収率を示す純度98.6%のものである。

実施例4：
固相合成法によって調製した66%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、0.05%の過塩素酸pH 1.70中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、0.05%の過塩素酸pH 1.70中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる8‐12%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、0.05%の過塩素酸pH 1.70がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、28〜32barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、40%の収率を示す純度96.6%のものである。

実施例5：
固相合成法によって調製した69.5%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる5‐17%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、30〜33barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、54.0%の収率を示す純度96.8%のものである。

実施例6：
固相合成法によって調製した69.5%の純度のエプチフィバチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エプチフィバチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエプチフィバチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのホウ酸pH 4.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エプチフィバチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのホウ酸pH 4.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる5‐17%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのホウ酸pH 4.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、30〜33barであった。この工程から得られたエプチフィバチドは、51.0%の収率を示す純度98.0%のものである。

実施例7：
アトシバン
固相合成法によって調製した73.5%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、アトシバン粗製塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのアトシバン濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、50mMの酢酸中、低いパーセンテージ（9%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる9‐12%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、26〜32barであった。この工程から得られたアトシバンは、57%の収率を示す純度98.6%のものである。アトシバンのHPLC分析の条件を、以下の表中に示す。

実施例8：
固相合成法によって調製した73.5%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。アトシバン粗粉末を、5%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施する。添加後に、カラムを、50mMの酢酸中、低いパーセンテージ（5%と9%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる9‐13%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、26〜32barである。この工程から得られたアトシバンは、71.0%の収率を示す純度99.6%のものである。

精製したアトシバン溶液を、陽イオン交換カラムによる添加して、濃度を高めた。陽イオン交換（CIEX）カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で平衡化した。精製したアトシバンを、水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムへの添加は、≦50g/L樹脂である。カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で洗浄した。溶出を、500mMの酢酸アンモニウムpH 7.8を使用して実施した。得られた溶出液は、＞15g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、60cm／時間の流速にて0.2〜0.3barであった。この工程から得られたアトシバンは、80%の収率を示す純度99.6%のものである。

陽イオン交換カラムから得られた溶出プールを、サイズ排除カラムに注ぎ込んで、薬物製品濃縮物になるであろう酢酸へのバッファー交換を実施する。溶出液は、製剤成分で必要な濃度になるように希釈し、そして薬物製品としてバイアル中に充填することがあり得る。

サイズ排除カラムを、低濃度の酢酸（2〜5mM）で平衡化した。カラムに注ぎ込まれるサンプル（CIEX溶出プール）体積は、カラム体積の30%であった。アトシバンの濃度が＞15g/Lになるように、カラムからの溶出を回収する。工程を、カラム全体を通して＜3barの圧力低下を示す15cm／時間の流速にて行う。カラムから得られた溶出液は、製剤成分の添加によって、バイアル中に充填するのに必要な濃度に希釈されるところの濃縮物であった。

実施例9：
固相合成法によって調製した84.1%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。アトシバン粗粉末を、5%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。
Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる13‐20%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、19〜22barであった。この工程から得られたアトシバンは、94.0%の収率を示す純度99.6%のものである。

精製したアトシバン溶液を、陽イオン交換カラムによる添加して、濃度を高めた。陽イオン交換（CIEX）カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で平衡化した。精製したアトシバンを、水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムへの添加は、≦50g/L樹脂であった。カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で洗浄した。溶出を、500mMの酢酸アンモニウムpH 7.8を使用して実施した。得られた溶出液は、＞15g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、60cm／時間の流速にて0.2〜0.3barであった。この工程から得られたアトシバンは、80%の収率を示す純度99.6%のものである。

サイズ排除カラムを、低濃度の酢酸（2〜5mM）で平衡化する。カラムに注ぎ込まれるサンプル（CIEX溶出プール）体積は、カラム体積の30%である。アトシバンの濃度が＞15g/Lになるように、カラムからの溶出を回収した。工程を、カラム全体を通して＜3barの圧力低下を示す15cm／時間の流速にて行った。カラムから得られた溶出液は、製剤成分の添加によって、バイアル中に充填するのに必要な濃度に希釈されるところの濃縮物であった。

実施例10：
固相合成法によって調製した81.5%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。アトシバン粗粉末を、5%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのクエン酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのクエン酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる12‐20%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのクエン酸pH 3.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、22〜23barであった。この工程から得られたアトシバンは、73.0%の収率を示す純度99.8%のものであった。

陽イオン交換カラムから得られた溶出プールを、サイズ排除カラムに注ぎ込んで、薬物製品濃縮物になるであろう酢酸へのバッファー交換を実施した。溶出液は、製剤成分で必要な濃度になるように希釈し、そして薬物製品としてバイアル中に充填することがあり得る。

サイズ排除カラムを、低濃度の酢酸（2〜5mM）で平衡化した。カラムに注ぎ込まれるサンプル（CIEX溶出プール）体積は、カラム体積の30%であった。アトシバンの濃度が＞15g/Lになるように、カラムからの溶出を回収した。工程を、カラム全体を通して＜3barの圧力低下を示す15cm／時間の流速にて行った。カラムから得られた溶出液は、製剤成分の添加によって、バイアル中に充填するのに必要な濃度に希釈されるところの濃縮物であった。

実施例11：
固相合成法によって調製した80.2%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。アトシバン粗粉末を、5%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、0.05%の過塩素酸pH 1.70中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、0.05%の過塩素酸pH 1.70中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる12‐20%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、0.05%の過塩素酸pH 1.70がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、23〜24barであった。この工程から得られたアトシバンは、94.0%の収率を示す純度99.6%のものである。

精製したアトシバン溶液を、陽イオン交換カラムによる添加して、濃度を高めた。陽イオン交換（CIEX）カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で平衡化した。精製したアトシバンを、水で1：1に希釈した後に、陽イオン交換カラムに添加した。カラムへの添加は、≦50g/L樹脂であった。カラムを、5mMの酢酸pH 3.3で洗浄した。溶出を、500mMの酢酸アンモニウムpH 7.8を使用して実施した。得られた溶出液は、＞15g/Lの濃度のものであった。工程中のカラム全体を通した圧力低下は、60cm／時間の流速にて0.2〜0.3barであった。この工程から得られたアトシバンは、80%の収率を示す純度99.6%のものであった。

実施例12：
固相合成法によって調製した73.5%の純度のアトシバン粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。アトシバン粗粉末を、5%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、0.05%の過塩素酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。アトシバンの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、0.05%の過塩素酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる12‐20%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、0.05%の過塩素酸pH 3.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、26〜32barであった。この工程から得られたアトシバンは、71.0%の収率を示す純度99.4%のものである。

サイズ排除カラムを、低濃度の酢酸（2〜5mM）で平衡化した。カラムに注ぎ込まれるサンプル（CIEX溶出プール）体積は、カラム体積の30%である。アトシバンの濃度が＞15g/Lになるように、カラムからの溶出を回収した。工程を、カラム全体を通して＜3barの圧力低下を示す15cm／時間の流速にて行った。カラムから得られた溶出液は、製剤成分の添加によって、バイアル中に充填するのに必要な濃度に希釈されるところの濃縮物であった。

実施例13：
ネシリチド
固相合成法によって調製した59.0%の純度のネシリチド粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。ネシリチド粗粉末を、10%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加する。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。ネシリチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施する。添加後に、カラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる5‐15%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMの酢酸ナトリウムpH 3.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、28〜33barであった。この工程から得られたネシリチドは、50.0%の収率を示す純度92.5%のものであった。ネシリチドのHPLC分析の条件を、以下の表中に示す。

実施例14：
固相合成法によって調製した59.0%の純度のネシリチド粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。ネシリチド粗粉末を、10%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのクエン酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。ネシリチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのクエン酸pH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる5‐15%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのクエン酸pH 3.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、28〜33barであった。この工程から得られたネシリチドは、33.0%の収率を示す純度97.2%のものである。

実施例15：
固相合成法によって調製した59.0%の純度のネシリチド粗製塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。ネシリチド粗粉末を、10%のアセトニトリルと50mMの酢酸の混合物中に溶解して、透明の溶液、且つ、＜2g/Lの産物濃度を得た。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。ネシリチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、≦10g/L樹脂の濃度まで実施する。添加後に、カラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。25CVsにわたる12‐20%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのギ酸ナトリウムpH 3.0がバッファーAである）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、24〜28barであった。この工程から得られたネシリチドは、18.0%の収率を示す純度98.7%のものである。

実施例16：
エクセナチド
固相合成法によって調製した56%の純度のエクセナチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エクセナチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエクセナチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのクエン酸pH 5.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで平衡化した。エクセナチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜5g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのクエン酸pH 5.0中、低いパーセンテージ（5%）のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる30‐33%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのクエン酸pH 5.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、15〜25barであった。この工程から得られたエクセナチドは、49%の収率を示す純度92.2%のものであった。エクセナチドのHPLC分析の条件を、以下の表中に示す。

先の工程から得た溶出プールを、水で3倍に希釈して、カラムへの結合を容易にした。純度92.0%の実施例1からのエクセナチド溶出プールを、水で3倍に希釈して、カラムへの結合を容易にする。

Rohm and Haas製のAmberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、10%のパーセンテージのアセトニトリルで平衡化した。92.0%の純粋なエクセナチドから調製したサンプルを、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜5g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、50mMの酢酸中、20%のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる25‐28%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、20〜25barである。この工程から得られたエクセナチドは、50%の収率を示す純度99.6%のものであった。

実施例17：
固相合成法によって調製した46.2%の純度のエクセナチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エクセナチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエクセナチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 4.0中、低いパーセンテージ（10%）のアセトニトリルで平衡化した。エクセナチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMの酢酸ナトリウムpH 4.0中、低いパーセンテージ（10%）のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる28‐33%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMの酢酸ナトリウムpH 4.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、18〜20barであった。この工程から得られたエクセナチドは、57%の収率を示す純度94.2%のものであった。
純度94.2%の先の実施例からのエクセナチド溶出プールを、水で3倍に希釈して、カラムへの結合を容易にした。

Rohm and Haas製のAmberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、10%のパーセンテージのアセトニトリルで平衡化した。94.2%の純粋なエクセナチドから調製したサンプルを、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、50mMの酢酸中、20%のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる25‐28%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、20〜25barであった。この工程から得られたエクセナチドは、50%の収率を示す純度99.6%のものであった。

実施例18：
固相合成法によって調製した46.2%の純度のエクセナチドTFA塩を、ポリマー・ベースの樹脂を充填したカラムによる精製に使用した。最初に、エクセナチドTFA塩を、アセトニトリルと50mMの酢酸、1：1の混合物中に溶解して、透明の溶液を得る。得られた溶液を、50mMの酢酸を使用して、5%のアセトニトリル濃度、且つ、＜2g/Lのエクセナチド濃度までさらに希釈した。その溶液を濾過して、カラムに添加した。

Amberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 4.0中、低いパーセンテージ（10%）のアセトニトリルで平衡化した。エクセナチドの濾過溶液を、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施した。添加後に、カラムを、10mMのギ酸ナトリウムpH 4.0中、低いパーセンテージ（10%）のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる27‐35%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、10mMのギ酸ナトリウムpH 4.0がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、24〜29barであった。この工程から得られたエクセナチドは、52%の収率を示す純度94.9%のものである。

純度94.9%の先の実施例からのエクセナチド溶出プールを、水で3倍に希釈して、カラムへの結合を容易にした。Rohm and Haas製のAmberchrom HPR10（粒径10μm及び細孔サイズ300Å）樹脂を充填したカラムを、50mMの酢酸中、10%のパーセンテージのアセトニトリルで平衡化した。94.2%の純粋なエクセナチドから調製したサンプルを、≦360cm／時間の流速にてカラムに添加した。カラム上へのペプチド添加を、＜10g/L樹脂の濃度まで実施する。添加後に、カラムを、50mMの酢酸中、20%のアセトニトリルで洗浄した。20CVsにわたる25‐28%のアセトニトリル（バッファーB）（一方、50mMの酢酸がバッファーAであった）の線形勾配を実施することによって、カラムから純粋な産物を溶出した。精製中のカラム全体を通した圧力低下は、20〜25barである。この工程から得られたエクセナチドは、50%の収率を示す純度99.6%のものである。

Claims

少なくとも1の関連不純物を含む混合物からの環状若しくは非環状ペプチド及び関連類似体又は誘導体の精製方法であって、上記ペプチド混合物を、任意の順番でRP-HPLCクロマトグラフィー・マトリックス及び／又はイオン交換クロマトグラフィー・マトリックス、すなわち、シリカ・ベースのポリマー樹脂で構成される上記分離マトリックスと接触させることを含んでなる前記方法。
前記精製が、有機酸バッファーを含む水相中、約2%から約30%への極性有機緩衝溶媒の勾配を利用して実施される、請求項1に記載の方法。
前記樹脂を、Sephadex、Sephadex LH20、Sephadex G-25、Sephadex G-10、Sepharose、Superdex、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチル・セルロース、スルホプロピル・セルロース、カルボキシメチルsephadex、スルホプロピルsephadex、スルホプロピルsepharose、カルボキシメチルsepharoseを含んでなる群から選択できる、請求項1に記載の方法。
前記樹脂が、ポリスチレン又はジビニルベンゼンである、請求項1に記載の方法。
前記樹脂ビーズの粒径と細孔サイズが、それぞれ、1μm〜50μmと100Å〜500Åにわたる、請求項1に記載の方法。
前記の環状又は非環状ペプチドが、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン又はネシリチドを含んでなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
前記極性緩衝溶媒が、アセトニトリルである、請求項2に記載の方法。
前記有機酸バッファーが、クエン酸、酢酸、過塩素酸及びギ酸を含んでなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
使用されるバッファーのモル濃度が、10mM〜50mMにわたる、請求項2に記載の方法。
前記精製を、2〜9のpHにて実施する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
前記方法が、任意の別のサイズ排除クロマトグラフィー・ステップをさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。
請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法に従って得られる、97〜100%の純度を有するペプチド産物。
請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法に従って得られる、少なくとも96%の純度を有するペプチド産物。
少なくとも1の関連不純物を含む混合物からの環状若しくは非環状ペプチド、及び関連類似体又は誘導体の精製方法であって、以下のステップ：
a）有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒で平衡化したシリカ・ベースのポリマー樹脂をRP-HPLCカラムに充填し；
b）少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を、約≦100〜400cm／時間の流速にて上記カラムに添加し；
c）ステップaのものと同じ緩衝溶液で上記カラムを洗浄し；そして
d）8‐14%の線形勾配を実施して上記カラムから精製産物を溶出する；
を含んでなる、逆相クロマトグラフィーによる前記方法。
少なくとも1の関連不純物を含む混合物からの環状若しくは非環状ペプチド、及び関連類似体又は誘導体の精製方法であって、以下のステップ：
a）弱酸バッファーの水溶液で陽イオン交換カラムを平衡化し；
b）上記カラムにRP-HPLC精製ペプチドを添加し；そして
c）上記カラムを洗浄し、ステップaにおいて使用したバッファーでペプチド産物を溶出する；
を含んでなる、イオン交換クロマトグラフィーによる前記方法。
少なくとも1の関連不純物を含む混合物からの環状若しくは非環状ペプチド、及び関連類似体又は誘導体の精製方法であって、以下のステップ：
a）有機酸バッファー中、約5%の極性溶媒で平衡化したシリカ・ベースのポリマー樹脂をRP-HPLCカラムに充填し；
b）少なくとも1の関連不純物を含むペプチド組成物を、約≦100〜400cm／時間の流速にて上記カラムに添加し；
c）ステップaのものと同じ緩衝溶液で上記カラムを洗浄し；
d）8‐14%の線形勾配を実施して上記カラムから精製産物を溶出し；
e）弱酸バッファーの水溶液で陽イオン交換カラムを平衡化し；
f）RP-HPLC精製ペプチドを、そのカラムに添加し；そして
g）上記カラムを洗浄し、溶出バッファー中にペプチド産物を溶出する；
を含んでなる、上記ペプチド混合物を任意の順番でRP-HPLCクロマトグラフィー・マトリックス及び／又はイオン交換クロマトグラフィー・マトリックスと接触させる前記方法。
前記樹脂を、Sephadex、メチルアクリレート樹脂、カルボキシメチル・セルロース、カルボキシメチルsephadex、スルホプロピル・セルロース、スルホプロピルsephadexを含んでなる群から選択できる、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記樹脂が、ポリスチレン又はジビニルベンゼンである、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記樹脂ビーズが、1〜50μmの粒径を持つ、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記樹脂ビーズの細孔サイズが、100〜500Åである、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記方法が、任意の別のサイズ排除クロマトグラフィー・ステップをさらに含んでなる、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記の環状又は非環状ペプチドが、エプチフィバチド、エクセナチド、アトシバン又はネシリチドを含んでなる群から選択される、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記極性緩衝溶媒が、アセトニトリルである、請求項14、15又は16に記載の方法。
前記有機酸バッファーが、クエン酸、酢酸、過塩素酸及びギ酸を含んでなる群から選択される、請求項14、15又は16に記載の方法。
使用されるバッファーのモル濃度が、10mM〜50mMにわたる、請求項2に記載の方法。
前記精製を、2〜9のpHにて実施する、請求項14〜25のいずれか1項に記載の方法。
純度が少なくとも96%である、請求項14〜26のいずれか1項に記載の方法に従って得られたペプチド産物。
純度が97〜100%にわたる、請求項14〜26のいずれか1項に記載の方法に従って得られたペプチド産物。
少なくとも96%の純度を有する精製エプチフィバチド。
少なくとも96%の純度を有する精製エクセナチド。
少なくとも96%の純度を有する精製アトシバン。
少なくとも96%の純度を有する精製ネシリチド。
実質的に、添付の図面と実施例を用いて本明細書中に説明したとおりのものであるペプチドの精製方法、及び精製ペプチド産物。