JP2011200134A - 薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、薬剤耐性を示すロドコッカス属細菌における薬剤耐性遺伝子が欠失又は不活性化された、薬剤感受性微生物である。当該欠失又は不活性化は、例えば、ドナー微生物から薬剤耐性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した、所定の工程(a)〜(d)を含む方法により行われ得る。
【選択図】なし
Description
(1)ロドコッカス属細菌において、標的とする薬剤耐性遺伝子が欠失又は不活性化されたことにより当該薬剤に対して感受性を示す微生物。
(b)ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中の標的の薬剤耐性遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv) レシピエント微生物生育阻害マーカー、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程;
(c)前記(b)で作製されたドナー微生物から前記(a)で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程;並びに
(d)前記(c)で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
(2)上記(1)に記載の微生物を宿主として用いて培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質製造方法。
1.薬剤に対し感受性を示す微生物
本発明に係る薬剤に対し感受性を示す微生物、すなわち、薬剤に対し感受性を示すロドコッカス属細菌(以下、「本発明の微生物」又は「薬剤感受性株」ということがある)は、前述した通りある薬剤に対する耐性を有するロドコッカス属細菌において、当該薬剤に対する耐性を獲得するために必要な遺伝子(以下、「標的とする薬剤耐性遺伝子」)が欠失又は不活性化された変異株である。
2.薬剤に対し感受性を示す微生物の製造方法
標的とする薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化する方法は限定されず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、当該遺伝子又はその周辺配列と相同な配列を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
(a)レシピエント微生物として、ドナー微生物生育阻害マーカーが強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程;
(b)ドナー微生物として、下記(i)〜(v):
(i)レシピエント微生物中の標的とする薬剤耐性遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv) レシピエント微生物生育阻害マーカー、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程;
(c)工程(b)で作製されたドナー微生物から工程(a)で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程;並びに
(d)工程(c)で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
上記欠失又は不活性化方法においてレシピエントとして使用するロドコッカス属細菌は、限定はされないが、前述したカナマイシン耐性を有するものが例示できる。
2.1. 工程(a)
工程(a)では、ドナー微生物生育阻害マーカーが強化されたロドコッカス属細菌を作製する。
2.2. 工程(b)
工程(b)では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中の標的とする薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化するためのプラスミドとしては、前述の(i)〜(v)の構成(遺伝子・塩基配列等)を含むものを用いる。
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、その配置については特に限定されず、如何なる順番で配置されていてもよい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
2.3. 工程(c)
工程(c)では、工程(b)で得られたドナー微生物から工程(a)で得られたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地(LB培地等)上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換えが起こり、遺伝子改変用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体、すなわち相同組換え株が作製される。
2.4. 工程(d)
工程(d)では、工程(c)で作製されたレシピエント微生物の相同組換え株(相同組換え微生物)を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、条件致死遺伝子が機能する限り、特に限定はされない。例えば、条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が用いられる。
3.タンパク質の製造方法
本発明においては、前述したロドコッカス属細菌の薬剤感受性株を宿主として用いて培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法を提供することができる。宿主として用いる当該感受性株は、あるタンパク質を高発現するプラスミド、例えば、アクリルアミド製造用触媒であるニトリルヒドラターゼ等を発現し得る発現ベクターが別途導入された形質転換体として使用される。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
pDNR-1r(Clontech Laboratories社製)中のsacB遺伝子を、NspV切断サ
イトを付加したプライマーSAC-01(配列番号1)及びSAC-02(配列番号2)を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
プライマー:
SAC-01: 5'- GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG -3' (配列番号1)
SAC-02: 5'- GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG -3'(配列番号2)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
SAC-01(配列番号1) 1 μl
SAC-02(配列番号2) 1 μl
pDNR-1r(clontech社製)(100倍希釈) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV(タカラバイオ社製)で消化後、pK19mob(ナ
ショナルバイオリソースプロジェクトから分譲可能(ナショナルバイオリソースプロジェクトE. coli strain Cloning Vectorコレクション))のNspVサイトに接続し、sacB遺
伝子がカナマイシン耐性遺伝子の下流且つ同方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。
消化したものをpTrc99マルチクローニングサイト内に挿入し、プラスミドライブラリーを製造した。プラスミドライブラリーにより大腸菌JM109を形質転換し、カナマイシン硫酸塩(40μg/ml)とIPTG(イソプロピル−β−チオガラクトシド)(1mM)を含むLBプレート(1% Bact tryptone、0.5% bact yeast extract、1% NaCl、1.5%寒天)を用いてカナマイシン耐性を示す形質転換株を選択した。本形質転換株からプラスミドを抽出し、pKM031と命名した。
イシン耐性遺伝子とその周辺配列を含む約3.3 kbの断片をpUC18のHindIIIサイトに
挿入したプラスミドpKM041を構築した。
プライマー:
KMD-01: 5'-GACCATTGTTCCAGGTCGACTGGGACGAGT-3'(配列番号3)
KMD-02: 5'-ACTCGTCCCAGTCGACCTGGAACAATGGTC-3'(配列番号4)
反応液組成:
滅菌水 38.5 μl
10×PfuTurbo buffer 5 μl
dNTP(25 mM each) 3 μl
KMD-01(配列番号3) 1 μl
KMD-02(配列番号4) 1 μl
pKM041 1.5 μl
PfuTurbo(STRATAGENE社製) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
95℃ 60秒の反応を1サイクル、95℃ 50秒、60℃ 50秒及 び72℃ 16分の反応を30サイクル、72℃ 7分の反応を1サイクル
pKM042を制限酵素HindIIIで切断し、カナマイシン耐性遺伝子周辺配列約2.8 kb(
カナマイシン耐性遺伝子が欠失したもの)をpK19mobsacB1のHindIIIサイトに挿入したプ
ラスミドpKM043を構築した(図2参照)。
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 12674株を、より高濃度のクロラムフェニコールを含む培地に継代培養することにより自然変異を誘発し、200 mg/Lのクロラムフェニコールに耐性を示す変異株RhCmSR-01株を単離した。継代培養の詳細は下記の通りである。
ATCC 12674株を10 mg/Lクロラムフェニコールを含むMYKプレート(0.5% polypeptone、0.3% bact yeast extract、0.3% malt extract、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天)に植菌し、30℃で3日間培養した。生育したコロニーを、10 mg/Lクロラムフェニコールを含むMYK培地(0.5% polypeptone、0.3% bact yeast extract、0.3% malt extract、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4)に植菌し、30℃、200rpmで2日間培養した。次に、上記培養液を40 mg/Lクロラムフェニコールを含むMYK培地に0.1%植菌し、30℃、200rpmで2日間培養した。
大腸菌(Escherichia coli)S17-1λpirをpKM043により形質転換し、50 mg/Lカナマイシン硫酸塩含有LBプレートにて37℃で一晩生育させた。S17-1λpir/pKM043をLB培地に懸濁後、遠心分離(室温、4500ppm、2 min)を行い、菌体を回収した後、LBで一度洗浄し、LBに再懸濁した。
DB上で全ゲノム配列が公開されているロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)PR4(製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門;受託番号:NBRC 100887)もATCC 12674がもつカナマイシン耐性遺伝子のホモログを有する。ホモロジー検索の結果、両株のカナマイシン耐性遺伝子が96.1%一致(塩基配列)という高い相同性を示したため、pKM043を用いた遺伝子欠失を実施した。各段階における培養時のベースとなる培地にはLB又はLBプレートを使用した。
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
Claims (5)
- ロドコッカス属細菌において、標的とする薬剤耐性遺伝子が欠失又は不活性化されたことにより当該薬剤に対して感受性を示す微生物。
- 前記欠失又は不活性化が、ドナー微生物からレシピエント微生物への接合伝達を利用した、以下の工程(a)〜(d)を含む方法により行われるものである、請求項1記載の微生物。
(a)レシピエント微生物として、ドナー微生物生育阻害マーカーが強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程;
(b)ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中の標的の薬剤耐性遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv) レシピエント微生物生育阻害マーカー、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程;
(c)前記(b)で作製されたドナー微生物から前記(a)で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程;並びに
(d)前記(c)で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。 - ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)又はロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)である、請求項1又は2記載の微生物。
- 欠失又は不活性化された薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の微生物
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の微生物を宿主として用いて培養し、得られる培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質製造方法。
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