JP5740955B2 - ロドコッカス属細菌の形質転換のためのランダム遺伝子導入用ツール - Google Patents
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Description
(a)ロドコッカス属細菌を、少なくとも以下の3種類の配列を含む直鎖状DNA断片により形質転換し、形質転換体を作製する工程
(i)選択マーカーをコードする配列
(ii)ロドコッカス属細菌に対する条件致死遺伝子の配列
(iii)互いに相同組換えが可能な2つの相同領域配列、
ここで、直鎖状DNA断片は、選択マーカーをコードする配列および条件致死遺伝子の配列が2つの相同領域配列の間に含まれるように、設計される、
(b)上記工程(a)において作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
本発明に係るゲノム上のランダムな位置に所望のDNA配列を挿入した細菌の製造方法(以下、「本発明の製造方法」という)は、以下の工程(a)及び(b)を含むことを特徴としている。
(i)選択マーカーをコードする配列
(ii)ロドコッカス属細菌に対する条件致死遺伝子の配列
(iii)互いに相同組換えが可能な2つの相同領域配列
ここで、直鎖状DNA断片は、選択マーカーをコードする配列および条件致死遺伝子の配列が2つの相同領域配列の間に含まれるように、設計される、
(b)上記工程(a)において作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
工程(a)では、ロドコッカス属細菌のゲノムに直鎖状DNA断片が挿入された形質転換体を製造する。本発明において、ロドコッカス属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、ロドコッカス・オパカス(Rhodococcus opacus)、ロドコッカス・ジョスティ(Rhodococcus jostii)等が挙げられる。
直鎖状DNA断片に含まれる選択マーカーをコードする配列は、形質転換後に直鎖状DNA断片が挿入されたロドコッカス属細菌の取得を可能にするものをコードする配列であれば特に限定されない。選択マーカーとしては、例えばポジティブセレクションに使用される薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
形質転換体から所望のDNA配列以外を脱落させる際に使用する条件致死遺伝子は、ロドコッカス属細菌のゲノム上に導入され、且つある特定条件下にさらされた場合に、当該細菌を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば限定されない。例えば、sacB遺伝子が好ましく挙げられる。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物(例えばロドコッカス属細菌等)をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質(レバン(levan))を産生する酵素をコードする遺伝子である。グラム陽性菌の一部やグラム陰性菌では、スクロース存在下においてsacB遺伝子が導入された細胞株を排除(ネガティブセレクション)することにより、目的とする遺伝子改変細胞株を効率よく選択することが可能である(Jagar W et al., Journal of bacteriology 1992; 5462-5465、Pelicic V et al., Journal of bacteriology 1996; 1197-1199)。なお、SacB遺伝子の発現が、スクロース存在下において微生物に致死性を付与する理由は、明らかになっていない。
互いに相同組換え可能な2つの相同領域は、上記条件致死遺伝子が機能し得る条件下において相同組換えを起こし、2つの相同領域に挟まれた領域を取り除く(脱落させる)ために必要な領域である。条件致死遺伝子が機能し、それを引き金として相同組換えが起こった場合、一方の相同領域および相同領域に挟まれた領域が脱落して、対象細菌のゲノム上には相同領域が1つ挿入された状態になる。従って、本発明における「所望のDNA配列」とは、相同領域、その直鎖状DNA断片中の5’末端側の相同領域の上流、および3’末端側の相同領域の下流の配列のことを指す。
上述のように、直鎖状DNA断片には上記(i)〜(iii)の他に大腸菌で機能するプラスミド複製開始点等、任意の配列を含めることができる。これら任意配列は選択マーカーや条件致死遺伝子と同様、互いに相同組換えが可能な相同領域に挟まれた部分に含まれていることが好ましい。後述するように、プラスミド複製開始点を直鎖状DNA断片に加えておくことにより、形質転換体製造後、ゲノム上に挿入された直鎖状DNA断片を、挿入個所の周辺ゲノム配列を含む形で大腸菌プラスミドとして回収できるようになるため、ゲノム上の挿入場所をより容易に調べることができるようになる。
工程(b)では、工程(a)で作製された形質転換体を、前記直鎖状DNA断片由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、条件致死遺伝子が機能する限り、特に限定はされない。例えば、条件致死遺伝子がsacB遺伝子のようなレバンスクラーゼ遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が用いられる。
上述した本発明の作製方法により得られる所望のDNA配列が挿入されたロドコッカス属細菌も、本発明の範囲内に含まれるものである。挿入された所望のDNA配列が任意のタンパク質をコードする遺伝子及びプロモーター領域である場合、当該細菌を培養することにより、上記タンパク質を製造することができる。
(1)直鎖状DNA断片作製用鋳型プラスミドpRI02の作製
pK19mobsacB1の作製
pDNR-1r(Clontech Laboratories社製)中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01(配列番号1)及びSAC-02(配列番号2)を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
SAC-01: 5’- GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG -3’(配列番号1)
SAC-02: 5’- GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG -3’(配列番号2)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
SAC-01(配列番号1) 1 μl
SAC-02(配列番号2) 1 μl
pDNR-1r(clontech社製)(100倍希釈) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃10秒、55℃ 15秒及び72℃60秒の反応を30サイクル
プラスミドpK19mobsacB1よりmob領域を除くため、まずpK19mobsacB1を制限酵素NspVにより部分消化し、その後PagI(フェルメンタス社製)を用いた消化後、精製を行い、NspV-PagI断片を得た。制限酵素NspV部分消化時は、反応時間を調整して適当な時間を選択した。NspV-PagI断片を平滑末端化した後、ライゲーション反応を行った。この工程において、目的の断片のセルフライゲーションが起こり、mob領域が除かれたプラスミドが形成される。上記pK19mobsacB1作製工程と同様、大腸菌XL10-Goldの形質転換及びプラスミド抽出を行った。前記mob領域が除かれたプラスミドをpK19sacB1と命名した。
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J1株を100 mlのMYK培地(0.5%ポリペプトン、0.3%バクトイーストエキス、0.3%バクトモルトエキス、1%グルコース、0.2% K2HPO4、0.2% KH2PO4、pH7.0)に植菌し、30℃にて振盪培養したものを、Saito and Miura の方法(Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963))によりゲノムを抽出した。
Pro-12 (Fw primer): 5’- ACACTAGTCAGGCGATTTGGCAGGCAG -3’(配列番号3)
Pro-04 (Rv primer): 5’- ACTCTAGATTGAAGACTCACAATCACCC -3’(配列番号4)
Pro-13 (Fw primer): 5’- ACAAGCTTTCAGGCGATTTGGCAGGCAG -3’(配列番号5)
Pro-14 (Rv primer): 5’- ACAAGCTTTTGAAGACTCACAATCACCC -3’(配列番号6)
反応液組成:
滅菌水 41.8 μl
10×AccuPrime bufferII 5 μl
Fw primer 1 μl
Rv primer 1 μl
J1株ゲノム(10 ng/μl) 1 μl
AccuPrime Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.2 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
94℃30秒、55℃ 30秒及び68℃60秒の反応を30サイクル
プラスミドpSJ034を制限酵素XbaI及びSse8387I(共にタカラバイオ社製)により消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、約2 kbのニトリルヒドラターゼ遺伝子断片部分を切り出した後、精製した。pSJ034はロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、pSJ023を用いて特開平10-337185号公報に示す方法で作製したものである。pSJ023は、形質転換体「R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023」であり、受託番号FERM BP-6232として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
上記pRI02を鋳型にして、直鎖状DNA断片RI-02をプライマーPro-13(配列番号5)及びRI-01(配列番号7)を使用したPCRにより増幅し、約7.3 kbの直鎖状DNA断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
Pro-13: 5’- ACAAGCTTTCAGGCGATTTGGCAGGCAG -3’(配列番号5)
RI-01: 5’- TACCGAGCTCGAATTCGAGCTC -3’(配列番号7)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
Pro-13(配列番号5) 1 μl
RI-01(配列番号7) 1 μl
pRI02(1 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃10秒、55℃ 15秒及び72℃150秒の反応を30サイクル
(1)コンピテントセルの作製
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)NBRC100887(Rhodococcus erythropolis PR4)株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
実施例1で調製した直鎖状DNA断片RI-02をTE緩衝液(10 mM Tris-HCl、1mM EDTA, pH 8.0)を用いて6倍希釈した溶液1 μlと、(1)で作製したコンピテントセルの菌体懸濁液各10 μlを混合し、氷冷した。遺伝子導入装置Gene Pulser(BIO RAD社製)用のキュベットに前記混合液を入れ、Gene Pulserを用いて20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルスの直後、キュベットにLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、1% NaCl)0.5 mlを加え、30℃、5時間静置した後、200 μg/mlカナマイシン含有LB寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
(1)ショ糖添加培地を用いたRI-02中の相同領域間部分のゲノムからの脱落
実施例2で得られた形質転換株(直鎖状DNA断片RI-02挿入株)をLB液体培地0.2 mlに懸濁し、そのうち0.1 mlを10%ショ糖含有LB培地に塗付し、30℃、3日間培養した。その結果、100程度のコロニーが出現した。
上記(1)で得られたコロニー6個を爪楊枝で10 μg/ml塩化コバルト含有LB寒天培地と200 μg/mlカナマイシン含有LB寒天培地それぞれに植菌した。コントロール株として、RI-02挿入処理を行っていない株(親株)と、上記(1)記載のRI-02脱落処理を行っていない株(RI-02挿入株)も同時に植菌した。その結果、塩化コバルト含有LB寒天培地では全ての株の生育が認められたが、カナマイシン含有LB寒天培地ではコントロール株であるRI-02挿入株のみ生育が認められた(表1)。
前記8株(コントロール株2株+スクロース含有LB培地生育株6株)を10 μg/ml塩化コバルト含有LB培地10 mlで培養後、遠心分離により各株を回収した。各株のペレットを生理食塩水で洗浄後、50 mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.0)に懸濁した。この懸濁溶液1 mlと50 mMリン酸緩衝液(pH 7.7)4 mlを混合し、さらに5.0%(w/v)のアクリロニトリルを含む50 mMリン酸緩衝液(pH 7.7)5 mlを混合液に加えて、10 ℃で10分間反応させた。反応終了後の溶液から菌体を濾別し、ガスクロマトグラフィー分析にて、生成したアクリルアミドを検出した。ガスクロマトグラフィー分析の結果、親株以外の株でアクリルアミドの生成が認められた(表1)。
分析機器:ガスクロマトグラフGC-14B(島津製作所)
検出器:FID(検出温度200℃)
カラム:ポラパックPS(ウォーターズ社カラム充填剤)を充填した1 mlガラスカラム
カラム温度:190℃
Claims (7)
- ゲノムに外来性DNA配列が挿入されたロドコッカス属細菌を作製する方法であり、以下の(a)及び(b)の工程を含むことを特徴とする方法。
(a)ロドコッカス属細菌を、少なくとも以下の3種類の配列を含む直鎖状DNA断片により形質転換し、形質転換体を作製する工程
(i)選択マーカーをコードする配列
(ii)ロドコッカス属細菌に対する条件致死遺伝子の配列
(iii)互いに相同組換えが可能な2つの相同領域配列
ここで、直鎖状DNA断片は、選択マーカーをコードする配列および条件致死遺伝子の配列が2つの相同領域配列の間に含まれるように、設計され、互いに相同組換えが可能な2つの相同領域配列は、プロモーター領域の配列である、
(b)上記工程(a)において作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。 - 選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 条件致死遺伝子がsacB遺伝子である、請求項1又は2に記載の方法。
- 直鎖状DNA断片が、互いに相同組換えが可能な2つの相同領域のいずれに対しても下流に、任意の外来性遺伝子又は遺伝子クラスターをさらに含むものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 直鎖状DNA断片が、大腸菌で機能するプラスミド複製開始点をさらに含むものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- プラスミド複製開始点がプラスミドpMB1及びその変異体に由来するプラスミド複製開始点である、請求項5に記載の方法。
- 請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法により作製された細菌を培養し、培養物から任意の外来性遺伝子又は遺伝子クラスターがコードするタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
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