JP2011115116A

JP2011115116A - 動物のミルクを原料とした乳糖以外のミルクオリゴ糖混合物の効率的回収法

Info

Publication number: JP2011115116A
Application number: JP2009277550A
Authority: JP
Inventors: Katsumi Ajisaka; 勝美鯵坂; Tatsuo Miyazaki; 達雄宮崎
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-16

Abstract

【課題】牛初乳あるいはヤギミルクオリゴ糖混合物を原材料として、乳糖以外のミルクオリゴ糖混合物を提供する。
【解決手段】牛初乳あるいはヤギのミルクから一定濃度のエタノール水溶液で平衡化した活性炭カラムを通過させて、乳糖を素通り画分として除去した後に、高濃度のエタノール水溶液あるいは酸含有エタノール水溶液によりオリゴ糖を溶出させることを特徴とする、動物のミルクを原料とした乳糖以外のミルクオリゴ糖混合物の効率的回収法。
【選択図】図４

Description

本発明は、動物ミルク中に含まれるオリゴ糖混合物の中から、乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法に関する。さらに詳しくは、本発明では予め乳糖は吸着されずに素通り画分に溶出するようなエタノール濃度のエタノール水溶液で平衡化した活性炭カラムを用いる。これに、動物のミルクを脱脂して得られるオリゴ糖混合物を流すことにより、乳糖は素通りさせてその他のオリゴ糖は吸着保持させる。その後同濃度のエタノール水溶液を当該活性炭カラムに流すことにより乳糖を完全に溶出させる。しかる後に、吸着しているオリゴ糖を溶出させることによる、動物のミルクを原料とした乳糖以外のミルクオリゴ糖混合物の効率的回収法に関する。

動物のミルク１００ｍL中には、２糖である乳糖が４〜６ｇ含まれており、その他のオリゴ糖は全てのオリゴ糖を合わせても0.5〜３ｇと少ない。ところが、病原菌やウイルスへの結合能などの生物学的に重要な生理機能は、乳糖以外のオリゴ糖が有している。

しかるに、動物のミルクからそのような生理機能の高いオリゴ糖を取得して利用するには、動物のミルクを脱脂して得られるオリゴ糖画分の大部分を占める乳糖とその他のオリゴ糖を簡便に分離することが必要なことであった。従来、動物のミルクから乳糖を除去したオリゴ糖画分を得るには、カラムクロマトグラフィーを利用する方法あるいは限外ろ過膜を利用する方法が知られている。

ここでもし活性炭カラムを利用する場合には、まず水で平衡化した活性炭カラムに動物のミルクから得られたオリゴ糖混合物の水溶液をアプライする。それにより単糖からすべてのオリゴ糖までを活性炭カラムに吸着させる。その後、エタノール濃度を段階的あるいはグラジエント方式で上昇させることにより、分子量の小さな糖から順次溶出させる。乳糖は２糖であることから、希薄な濃度、例えば４％(V/V)程度のエタノール濃度で溶出される。しかる後に、一挙に、あるいは徐々に他のオリゴ糖を溶出させることにより、乳糖含量の少ないオリゴ糖画分を得るという方法が取られていた。しかしながら、これらの方法では大量の乳糖を含む全てのオリゴ糖を一度活性炭カラムに吸着させるという操作が入っており、そのためには大きな活性炭カラムを使用する必要があり、極めて不合理なことである。

特開2003-47402。

D.S.Newburg, et al, Journal of Infection Diseases, 162, 1075-1080 (1990)。

ヤクルト研究所研究報告、第17号、1-7 (1997)。

P. K. Gopal, et al, British Journal of Nutrition, suppl 1, S69-S74, (2000)。

A. M. Ferez, et al, International Dairy Journal, 16, 173-181 (2006)。

そこで本発明の目的は、目的物ではない乳糖は活性炭カラムに吸着させずにカラムを素通りで通過させて、必要とするオリゴ糖のみを活性炭カラムに吸着させ、最後にそれらのオリゴ糖をまとめて溶出させる方法を提供する点にある。

動物ミルク中のオリゴ糖のうち乳糖は２糖であり、ミルクオリゴ糖の中では最も小さい。またミルクオリゴ糖の中では、乳糖以外には重要な２糖は知られていない。一方活性炭カラムに関しては、多少の例外はあるが、単糖、２糖、３糖の順に糖鎖の長さが長くなるにつれて吸着力が強くなるという傾向が知られている。実際、従来行われているように、全てのオリゴ糖を一度活性炭カラムに吸着させておき、最初に水で洗浄後エタノール濃度を徐々に上げるグラジエント方式で溶出を行うと、最初に溶出されるのは乳糖である。即ち、極めて希薄なエタノール濃度で乳糖は溶出される。

このような知見のもとで本発明者らは、２糖である乳糖は活性炭カラムから溶出されるが、３糖以上のオリゴ糖は溶出されずに活性炭カラム内に保持されるようなエタノール濃度の水溶液で活性炭カラムを平衡化しておき、これに同濃度のエタノール水溶液に溶解した乳糖を含むオリゴ糖溶液をアプライすると、乳糖は活性炭カラムに吸着されずに活性炭カラムを通過し、３糖以上のオリゴ糖のみが活性炭カラムに吸着されることを見出した。同濃度のエタノール水溶液で乳糖を完全に洗い流した後、それよりも高い濃度のエタノール水溶液で溶出することにより、乳糖以外のオリゴ糖混合物を得ることができることを確認して、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、
（１）活性炭カラムを利用して動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（２）動物のミルクがヤギのミルクである（１）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（３）動物のミルクが牛のミルクである（１）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（４）ウシのミルクが初乳である（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（５）動物のミルクがチーズホエーあるいはカゼインホエー、あるいはそれらの乾燥粉体である（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（６）活性炭カラムを予め希薄な有機溶剤水溶液で平衡化しておくことを特徴とする（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（７）希薄な有機溶剤がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリルの中から選ばれた有機溶剤であることを特徴とする（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（８）希薄な有機溶剤含有水溶液の有機溶剤濃度が１％(V/V)〜６％(V/V)であることを特徴とする（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
（９）希薄なエタノール水溶液のエタノール濃度が３％(V/V)〜５％(V/V)であることを特徴とする（１）、（２）、または（３）に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
に関する。
以下、発明を詳細に説明する。

人乳中には１００種類以上のオリゴ糖が含まれており、それらのオリゴ糖は病原菌やウイルスへの感染防御作用を示すことが知られている。そのような活性は、それらのオリゴ糖が病原菌やウイルスの受容体に結合するために、病原菌やウイルスが人体の細胞膜表層に存在する糖鎖に結合できなくなることによるとされている。通常飲用されている牛乳は常乳と呼ばれており、乳糖以外のオリゴ糖の種類および量は少ないが、牛初乳には種類および量ともに多く含まれている。ここで言う牛初乳とは、子牛が生まれて２週間以内のミルクを指す。牛初乳中の中性オリゴ糖の含有率は、産地、飼料などによって多少の差異はあるが、常乳よりも多く含まれている。例えば、初乳の乾燥粉体１００ｇ中にはオリゴ糖は１−３ｇ程度含まれている。

その他の入手しやすい乳の中ではヤギのミルク中には３０種類程度のオリゴ糖が比較的多量含まれていることが知られている。ヤギミルク中あるいは牛初乳中にこのように多種類のオリゴ糖が含まれているということは、これらのオリゴ糖混合物も人乳オリゴ糖混合物と同様に多種類の病原菌やウイルスの受容体に対応しており、同様の感染防御機能を持っていることが期待できる。日本ではヤギのミルクは頻用されてはいないが、海外に於いてはヤギのミルクを原料とした調製乳も製造販売されており、食品としても安全であることは既に証明されている。従って、ヤギのミルクからオリゴ糖混合物を取り出してこれを食品あるいは食品添加物として利用するに際しては、安全性の面からも全く問題はない。

産業的にオリゴ糖を製造することを考えた場合、オリゴ糖の原料としては、牛初乳あるいはヤギのミルクそのものを用いても良いが、コスト面を重要視する場合にはチーズあるいはカゼイン製造で生じたホエーを用いることもできる。チーズホエーあるいはカゼインホエーでは、オリゴ糖画分はそのまま保持されており、ミルクから製造する場合と同じ方法によってオリゴ糖画分を得ることができる。上記した原料をそのまま、あるいは水等に溶解し、遠心分離等の操作により脱脂、脱蛋白したものを本発明方法に従い活性炭カラム処理することにより、オリゴ糖混合物を調製することができる。

本発明においては、活性炭カラムに対して乳糖は吸着されないが乳糖以外のオリゴ糖は吸着されるエタノール濃度を求めることがクリティカルである。そのようなエタノール濃度で平衡化した活性炭カラムに全オリゴ糖を添加すると、乳糖は吸着されずに大部分が活性炭カラムを通過し、その他のオリゴ糖は吸着される。

本発明者らが求めたエタノール濃度は、実施例に示したごとく活性炭の種類により異なり多くの場合２〜５％（Ｖ／Ｖ）であったが、これは本実施例における活性炭の種類、カラムの口径および長さ、乳糖を含めたオリゴ糖の濃度で実験を行った場合の数値であり、全ての活性炭に共通の数値というわけではない。従って、予め概ね２〜５％（Ｖ／Ｖ）のエタノール濃度の範囲で平衡化した活性炭カラムを用いて乳糖が吸着されない最希薄なエタノール濃度を決定しておく必要がある。使用する活性炭に適したエタノール濃度が決定されたら、その濃度のエタノール水溶液にオリゴ糖混合物をできるだけ希薄な濃度、好ましくは1重量％（Ｗ／Ｖ）以下の濃度に溶解した溶液を流すと良好な結果を得ることができる。

ここで有機溶剤としてはエタノールに限定されることはなく、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル等の水溶性の溶剤であってもなんら差し支えない。ただし、その場合には、溶剤の疎水性の度合いに従って濃度の調整が必要である。この濃度は活性炭の材質にも依存することから、一概に規定することはできないが、いずれの場合にも１〜７％（Ｖ／Ｖ）の範囲の濃度が好ましい。

乳糖以外のオリゴ糖が吸着された活性炭カラムからミルクオリゴ糖を溶出させるには、例えば３０〜５０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール水溶液あるいはそれに準ずる水溶性有機溶剤を用いる。それにより主として中性オリゴ糖を主成分とするミルクオリゴ糖を得ることができる。ここで溶離液に０.０５〜０.５％（Ｖ／Ｖ）濃度になるように酸を加えておけば、シアル酸残基を有する酸性オリゴ糖を含むミルクオリゴ糖を溶出させることができる。酸としては、トリフルオロ酢酸、酢酸、塩酸、リン酸、硫酸などを用いることができる。

本発明により、動物のミルクあるいはその中間処理物から簡便に乳糖含有率の減少したミルクオリゴ糖を取得することができる。例えば１ｇのオリゴ糖混合物を処理するのに、従来法であれば５０ｇ以上の活性炭を使用する必要があったが、実施例に示すように本発明方法によれば１０ｇ以下の活性炭を詰めたカラムで対応できる。

ＤｉＯＮＥＸ社ＤＸ５００システムによる処理前の牛初乳由来オリゴ糖混合物のＨＰＬＣチャート。カラム：ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏｐａｃＰＡ−１。溶離液、０−１５分：３０ｍＭＮａＯＨ、１５.１−３０分：３０−１００ｍＭＮａＯＨグラジエント、３０.１−４５分：１００ｍＭＮａＯＨ + ０−３０ｍＭＮａＯＡｃグラジエント、45.1-50分：１００ｍＭＮａＯＨ + ３０−２００ｍＭＮａＯＡｃグラジエント、５０.１−５５分：１００ｍＭＮａＯＨ + ２００ｍＭＮａＯＡｃ。流速１ｍＬ／ｍｉｎ。検出はＰＡＤ（パルスド・アンペロメトリック・ディテクター）。５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで平衡化した活性炭カラムで乳糖を減少させた牛初乳由来オリゴ糖のＨＰＬＣチャート。カラム：ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏｐａｃＰＡ−１。溶離液、０−２０分：３０ｍＭＮａＯＨ、２０.１−３４分：３０−１００ｍＭＮａＯＨグラジエント、３４.１−４８分：１００ｍＭＮａＯＨ + ０−３０ｍＭＮａＯＡｃグラジエント、４８.１−５５分：１００ｍＭＮａＯＨ + ３０−２００ｍＭＮａＯＡｃグラジエント、５５.１−６０分：１００ｍＭＮａＯＨ + ２００ｍＭ。流速１ｍＬ／ｍｉｎ。検出はＰＡＤ。５％（Ｖ／Ｖ）エタノールで平衡化した活性炭カラムで乳糖を減少させたヤギミルクオリゴ糖のＨＰＬＣチャート。測定条件は図２と同じ。ヤギミルクからオリゴ糖を得るためのフロー図。

以下、本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。

牛初乳からのオリゴ糖の分離法について説明する。牛初乳５０ｍＬを４℃にて１５,０００ｒｐｍで６０分遠心分離して、脂肪分を除去した。上清の２倍量のエタノールを加えて４℃に１夜静置したのち、１５,０００ｒｐｍで４０分遠心分離して蛋白質を除去した。上清１００ｍＬにエタノール５.２５ｍＬを加えた後（最終エタノール濃度５％（Ｖ／Ｖ））、５％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液で平衡化した活性炭カラム（Ｗａｋｏ．００３１−０２１３５、１５ｇ、２.５ｃｍφx ４０ｃｍ)に供した。全オリゴ糖を活性炭カラムにアプライした後、５％（Ｖ／Ｖ）エタノール３００ｍＬを通液して乳糖を完全に溶出させた。その後５０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを通液して、オリゴ糖画分３００ｍＬを集めた。オリゴ糖画分を濃縮後、凍結乾燥することにより、中性オリゴ糖３２ｍｇを得た。また０.１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸含有５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール３００ｍＬを通液した液を濃縮することにより、酸性オリゴ糖を多く含む大部分の乳糖が除かれたオリゴ糖１５３ｍｇを得た。

牛初乳粉末からのオリゴ糖の分離法について説明する。牛初乳粉末１ｇを２０ｍＬの水に溶解し、１０,０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、不溶物を除去した。上清１５ｍＬに０.６３ｍＬのエタノールを加えて最終濃度４％（Ｖ／Ｖ）とした後、予め４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液で平衡化した活性炭カラム（Ｗａｋｏ．００３１−０２１３５、１０ｇ、２.５ｃｍφ x ２５ｃｍ)に供した。４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液４００ｍＬにて洗浄した後、５０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール水溶液２００ｍＬにより溶出を行った。溶出液を集めて濃縮することにより、１８.４ｍｇの中性オリゴ糖を得た。さらに、０.１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸含有５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール２００ｍＬを通液した液を濃縮することにより、酸性オリゴ糖を多く含む大部分の乳糖が除かれたオリゴ糖７８ｍｇを得た。

ヤギミルクからのオリゴ糖の分離法について説明する。ヤギのミルク５０ｍＬを４℃にて１５,０００ｒｐｍで６０分遠心分離して、脂肪分を除去した。上清の２倍量のエタノールを加えて４℃に１夜静置したのち、１５,０００ｒｐｍで４０分遠心分離して蛋白質を除去した。上清１２０ｍＬにエタノール５ｍＬを加えてよく混合した（エタノール濃度４％（Ｖ／V））後、４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液で平衡化した活性炭カラム（Ｗａｋｏ．００３１−０２１３５、８ｇ、２ｃｍφ x ２０ｃｍ)に供した。全オリゴ糖を活性炭カラムにアプライした後、４％（Ｖ／Ｖ）エタノール２００ｍＬを通液して大部分の乳糖を溶出させた。その後５０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを通液して、オリゴ糖画分１５０ｍＬを集めた。オリゴ糖画分を濃縮後、凍結乾燥することにより、中性オリゴ糖８ｍｇを得た。また０.１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸含有５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール１５０ｍＬを通液した液を濃縮することにより、酸性オリゴ糖を多く含む大部分の乳糖が除かれたオリゴ糖４３ｍｇを得た。

ヤギミルク由来ホエーからのオリゴ糖の分離法について説明する。ヤギミルクから得られたチーズホエイ１ｇを２０ｍＬの４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に溶解してそのまま直接４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液で平衡化した活性炭カラム（Ｗａｋｏ．００３１−０２１３５、１０ｇ、２.５ｃｍφ x ２５ｃｍ)に供した。活性炭カラムに３００ｍＬの４％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液を通液して大部分の乳糖を溶出させた。その後、５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液２００ｍＬを通液し、溶出液を集めて濃縮後凍結乾燥したところ、１７.２ｍｇの中性オリゴ糖が得られた。また０.１％（Ｖ／Ｖ）のトリフルオロ酢酸含有５０％（Ｖ／Ｖ）エタノール３００ｍＬを通液した液を濃縮することにより、酸性オリゴ糖を多く含む大部分の乳糖が除かれたオリゴ糖６８ｍｇを得た。

本発明の、牛初乳やヤギミルクなどのオリゴ糖を多く含む乳およびその脱脂粉体から乳糖以外のオリゴ糖を取り出す方法は、抗感染用食品などを製造する産業で利用される。

Claims

活性炭カラムを利用して動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖を効率的に得る方法。
動物のミルクがヤギのミルクである請求項１に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
動物のミルクが牛のミルクである請求項１に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
ウシのミルクが初乳である請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
動物ミルクがチーズホエーあるいはカゼインホエー、あるいはそれらの乾燥粉体である請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
活性炭カラムを予め希薄な有機溶剤水溶液で平衡化することを特徴とする請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
希薄な有機溶剤がメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリルの中から選ばれた有機溶剤であることを特徴とする請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法
希薄な有機溶剤含有水溶液の有機溶剤濃度が１％(V/V)〜６％(V/V)であることを特徴とする請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。
希薄なエタノール水溶液のエタノール濃度が３％(V/V)〜５％(V/V)であることを特徴とする請求項1、2、または3に記載の動物のミルクから乳糖以外のミルクオリゴ糖画分を効率的に得る方法。