JP2011105763A - Ｐｐａｒ依存的遺伝子転写活性化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】安全性に優れ、肥満、糖尿病、高血糖、高脂血症、インスリン抵抗性の予防・改善に有効なＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤の提供。
【解決手段】ガロイルタンニン類、カテキン及びエピカテキンから選ばれる化合物からなるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体依存的遺伝子転写活性化剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、脂質代謝の活性化および肥満、糖尿病、高血糖、高脂血症、インスリン抵抗性の予防・改善に有効なペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator Activated Receptor：PPAR）依存的遺伝子転写活性化剤に関する。

ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドなどの低分子脂溶性リガンドはリガンド特異的な核内受容体を介して、個体発生における形態形成、細胞の増殖、分化、生体の恒常性の維持など多様な生理機能の調節に関与している。ＰＰＡＲは核内受容体の１種であり、１９９０年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体：PPARα）と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてβ／δ型およびγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。ＰＰＡＲαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるＡＴＰ産生、細胞周期の調節など幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特に脂肪酸代謝に重要なβ−酸化関連酵素の遺伝子発現はＰＰＡＲの活性化に強く依存していることが明らかとなってきている。ＰＰＡＲγ、特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている（非特許文献１）。

高脂血症治療薬であるフィブラート系化合物がＰＰＡＲαのアゴニストであること、糖尿病治療薬として知られるチアゾリジン誘導体がＰＰＡＲγのアゴニストであることが明らかにされて以来、これらの化合物に続くＰＰＡＲアゴニストの探索が進められ、高脂血症や糖尿病の改善薬として開発が試みられている。そしてこれまでにＰＰＡＲアゴニストとして、チアゾリジン誘導体、フィブラート系化合物の他、脂肪酸、ロイコトリエンＢ４、インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン、１５−deoxy-Δ-12, 14-PGJ2など（非特許文献２−６）が報告されている。しかしこれらの化合物には長期摂取による副作用などの問題がある。

細胞：31(6)218-234, 1999、J. Lipid Res. 37, 907-925, 1996、Curr. Opin. Lipidol.10, 151-159, 1999 Cell. 83, 813-819, 1995、 J. Biol. Chem. 272(6)3406-3410, 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4321-4327, 1997、 J. Biol, Chem. 274(10)6718-6725, 1999、 Mebio 別冊；Multiple Risk Factor Syndrome 2, 88-96, 1999

本発明の目的は、安全性に優れ、肥満、糖尿病、高血糖、高脂血症、インスリン抵抗性の予防・改善に有効なＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤を提供することにある。

本発明者らは長期摂取しても安全で、副作用の少ないＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤の探索を行い、天然食物中にも存在し、長い食経験を有する没食子酸誘導体、ケルセチン類、フラボン誘導体、イソフラボン誘導体およびカテキン類にその作用があることを見出した。

すなわち、本発明は次の（Ａ）〜（Ｆ）：
（Ａ）没食子酸エステル、
（Ｂ）ガロイルタンニン類、
（Ｃ）ケルセチン（Quercetin；3, 3', 4', 5,7-pentahydroxyflavone）もしくはその配糖体、
（Ｄ）フラボンもしくはその類縁体、
（Ｅ）イソフラボンもしくはその類縁体、
（Ｆ）カテキンもしくはエピカテキン
から選ばれる化合物からなるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体依存的遺伝子転写活性化剤を提供するものである。

本発明のＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤は優れたＰＰＡＲ活性化作用を有し、かつ安全性も高いので、肥満、糖尿病、高血糖、高脂血症、インスリン抵抗性の予防あるいは改善剤として有用である。

本発明で使用する（Ａ）没食子酸エステルとしては、ヒドロキシ基を置換していてもよい炭素数１〜２４の直鎖または分岐鎖のアルキルエステルまたはアルケニルエステルが挙げられる。特に、炭素数１〜１０のものがよく、メチル、エチル、プロピル、ブチル、オクチルなどのエステルが好ましい。

本発明で使用する（Ｂ）ガロイルタンニン類は、加水分解により没食子酸を生成するタンニン類であり、より具体的にはグルコースやハマメロース、キシロース、ガラクトース、メチルグルコシド、キナ酸、シキミ酸、カテキン、ガロカテキン、エピガロカテキンなどの各水酸基が種々の程度にガロイル化されたものや、タンニン酸と呼ばれるそれらの各種混合物などが挙げられる。当該ガロイルタンニンの例としては１，２，３，６−テトラガロイルグルコース、１，２，３，４，６−ペンタガロイルグルコース、３，４−ジガロイルシキミ酸、ハマメリタンニン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、アッサミカインＡ、アッサミカインＢ、テアフラビンガレート、プロシアニジンガレート、オイゲニン、プニカコルテインＡ、プニグルコニン、ステノフィラニンＡなどが挙げられる。特に、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートが好ましい。

本発明で使用する（Ｃ）ケルセチンはフラボノールの１種で、植物界に広く分布する黄色色素で、その多くは配糖体として存在している。

ケルセチンの配糖体の糖残基としてはグルコース、ラフィノース、ラムノース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどを挙げることができ、このうちグルコース、ラフィノース、ラムノースが好ましい。また、糖残基の数は１〜５０、通常１〜２０が好ましく、糖残基の数により水への溶解性を調節することが可能である。ケルセチン配糖体の一例としてはルチン（Rutin；Quercetin-3-rutinoside）、クエルシトリン（Quercitrin；Quercetin-3-ramunoside）、クエルシメリトリン（Quercimeritrin；Quercetin-7-glucoside）、αＧ−ルチン（東洋精糖（株））などが挙げられる。

没食子酸エステル、ガロイルタンニン類およびケルセチンもしくはその配糖体のうち、特にガロイルタンニン類およびケルセチンもしくはその配糖体は、植物または生薬に含まれているので、これらを含有する植物、生薬またはそれらの抽出物を配合することにより、本発明のＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤中にこれらの化合物を含有せしめてもよい。ガロイルタンニン類を含有する生薬としては没食子、五倍子が、植物としては茶、ブドウなどが挙げられる。ここで、お茶としては緑茶のほか、紅茶、ウーロン茶が含まれるが、特に緑茶が好ましい。また、ぶどうについてはぶどう果実の他、特にガロイルタンニン類を多く含むぶどう種子および果皮、またはその抽出物あるいはその乾燥粉末が特に好ましい。ケルセチンもしくはその配糖体を含有する植物としては、ミカン科のヘンルーダ（Ruta graveolens L.）、まめ科のエンジュ（Sophora japonica L.）、タデ科のソバ（Fagopyrum esculentum Moench）などが挙げられる。これらの花蕾には約２０重量％含まれることから特に好ましい。これらの生薬および植物は、前記のようにそのまま乾燥粉砕などをして用いてもよいが、水、アルコール類、エーテル類、ハロゲン化炭化水素類などの抽出溶剤により抽出して用いてもよい。

本発明で使用する（Ｄ）フラボンおよびその異性体である（Ｅ）イソフラボンは、ポリフェノールの１種であって、通常は水酸基またはメトキシ基が付加したり、配糖体などとして植物界に広く存在している。これらの配糖体なども（Ｄ）および（Ｅ）に包含される。（Ｄ）フラボンの類縁体としては、アピゲニン、アカセチン、ルテオリン、クリシン、ミリセチンなどが挙げられ、（Ｅ）イソフラボンの類縁体としては、ダイゼイン、ゲニステイン、プルネチン、アフロモシン、イリゲニン、ホルモネチン、ダイジン、ゲニスチンバイオカニン、グリシティンなどが挙げられる。これらの種々の類縁体がバラ科、マメ科、アヤメ科などの植物に多く存在することが知られている。特にイソフラボン類はマメ科植物に多く含まれ、長年にわたる食経験があり、長期間摂取しても安全性は高い。フラボンもしくはその類縁体、イソフラボンもしくはその類縁体を含有する植物または生薬としては、パセリ、大豆、シソなどが挙げられる。フラボノイドを多く含むパセリ抽出物、シソ種子抽出物や、イソフラボノイドを多く含む大豆抽出物などが好ましい。具体的な製品としては、例えば、アップルフェノン（ニッカウイスキー（株））、ソイアクト（キッコーマン（株））、ゲラビノール（キッコーマン（株））などがある。

本発明で使用する（Ｆ）カテキン（３，５，７，３′，４′−ペンタオキシフラバン）もしくはエピカテキンは、煎茶、香茶、釜入り茶などの緑茶類や半発酵茶、発酵茶の茶葉から水や熱水により抽出してもよい。また抽出水に予めアスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸またはその塩類を添加してもよい。煮沸脱気や窒素ガスなどの不活性ガスを通気して、抽出水中の溶存酸素を除去した非酸化的雰囲気下で抽出する方法を併用してもよい。茶葉から抽出する代りに、緑茶抽出物の濃縮物を水に溶解して用いてもよく、また茶葉からの抽出液と緑茶抽出物の濃縮物とを併用してもよい。ここで緑茶抽出物の濃縮物とは、緑茶葉を熱水もしくは水溶性有機溶剤で抽出して得られた抽出物を濃縮したもので、例えば特開昭５９−２１９３８４号公報、特開平４−２０５８９号公報、特開平５−２６０９０７号公報、特開平５−３０６２７９号公報などに記載された方法で調製することができる。市販の三井農林（株）「ポリフェノン」、伊藤園（株）「テアフラン」、太陽化学（株）「サンフェノン」シリーズなどを用いてもよい。その他、カテキンもしくはエピカテキンは、他の原料起源、カラム精製のもの、化学合成品などを用いてもよい。

本発明のＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤は医薬品、食品に用いられる賦形剤およびその他の添加剤とともに任意の形態に製剤化してもよい。

本発明のＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤は、経口、経腸、経皮、注射、経粘膜などでヒトに投与あるいは摂取することができる。またその量は、年齢、体重、性別、投与方法などの種々の要因によって異なるが、経口投与の場合は通常大人１人当たり０．１〜５０００mg、特に１００〜２０００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。

本発明ＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤の剤型としては、医薬品、食品に用いられるもので例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、種々の形態の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品などが挙げられる。

本発明のＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化剤は、通常製剤中に０．００１〜８０重量％配合される。

実施例１
ＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化試験：
小腸上皮細胞株ＩＥＣ−６または肝細胞株ＨｅｐＧ２を１２well plateにまき、ＤＭＥＭ（５％FCS）中で１日培養する。ＰＰＡＲ応答配列（下線）（AACGTGACCTTTGTCCTGGTCAACGTGACCTTTGTCCTGGTC AACGTGACCTTTGTCCTGGTC）を含むＤＮＡ鎖、ＳＶ４０プロモター遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むＰＰＡＲレポータープラスミド（PPAR-Luc）および、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼプロモーター遺伝子を連結したコントロールプラスミド（TK-Luc：Promega）を同時に各々０．５μｇ／wellとなるようトランスフェクション試薬（Superfect transfection reagent；Promega）を用いて導入した。その後培養液を被験物質を含むＤＭＥＭ（-FCS）培地に交換し、さらに２４時間培養した。ＰＢＳにて洗浄後デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにて蛍およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。本実験系でＰＰＡＲ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を測定することにより、ＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化物質の探索を行った。尚、ＰＰＡＲ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。

ＰＰＡＲ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（PPAR-Lucによる蛍ルシフェラーゼ活性）／（TK-Lucによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）

ＩＥＣ−６およびＨｅｐＧ２細胞における各被験物質によるＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化能を表１に示す。尚、コントロールにおけるＰＰＡＲ依存的転写活性を１００とし、それに対する相対値を示す。陽性対照として、フェノフィブラートを用いた。

表１により、没食子酸エステル（１）およびガロイルタンニン類が、ＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化に有効であることがわかる。

実施例２
実施例１と同様にしてＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化試験を行った。尚、細胞としてＩＥＣ−６を用い、陽性対照としてカルバサイクリンを用いた。結果を表２に示す。

表２より、ケルセチンもしくはその配糖体が、ＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化に有効であることがわかる。

実施例３
実施例１と同様にしてＰＰＡＲ依存的遺伝子転写活性化試験を行った。結果を表３に示す。

表３より、フラボンもしくはその類縁体、イソフラボンもしくはその類縁体が、ＰＰＡＲ依存性遺伝子転写活性化に有効であることがわかる。

実施例４
下記成分を用い、常法に従って１錠２００mgの錠剤を製造した。
（組成） （ｇ）
没食子酸エチルまたはケルセチン １０００
ヒドロキシプロピルセルロース ８００
軽質無水ケイ酸 ２００
乳糖 ５００
結晶セルロース ５００
タルク ５００
ジアシルグリセロール ３００

実施例５
下記成分を用い、常法に従って１錠２００mgの錠剤を製造した。
（組成） （ｇ）
没食子酸プロピルまたはルチン ２０
デンプン １３０
ステアリン酸マグネシウム １０
乳糖 ４０

実施例６
下記の成分を混合後ゼラチンカプセルに充填し、１錠２５０mgの軟カプセル剤を得た。
（組成） （ｇ）
没食子酸プロピルまたはルチン ２０
エピガロカテキンガレートまたはαＧ−ルチン ２０
トリグリセリド（なたね油） ６０

実施例７
下記の成分を混合後ゼラチンカプセルに充填し、軟カプセル剤を得た。
（組成） （ｇ）
没食子酸エチルまたはケルセチン ２０
エピガロカテキンガレートまたはαＧ−ルチン ２０
大豆油 ２００
γ−オリザノール １０
無水カフェイン １０
ドコサヘキサエン酸 １０
エイコサペンタエン酸 １０
α−リノレン酸 １０
ビタミンＣ １０

実施例８
下記の成分を混合後ゼラチンカプセルに充填し、１錠２５０mg軟カプセル剤を得た。
（組成） （ｇ）
大豆抽出物（ソイアクト（キッコーマン（株））） ２０
茶抽出物（テアフラン90S（伊藤園（株））） ２０
没食子抽出物（アルコール抽出、乾固物） １０
トリグリセリド（なたね油） ５０

Claims (3)

1. ガロイルタンニン類、カテキン及びエピカテキンから選ばれる化合物からなるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体依存的遺伝子転写活性化剤。
2. ケルセチンもしくはその配糖体からなるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体依存的遺伝子転写活性化剤。
3. フラボンもしくはその類縁体、及びイソフラボンもしくはその類縁体から選ばれる化合物からなるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体依存的遺伝子転写活性化剤。