JP2011084580A - ストレス誘導性リガンド依存性egfr活性化の阻害 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】浸透ストレスまたは酸化ストレスに応答するEGFR活性化がメタロプロテアーゼに媒介されるproHB-EGFの切断に関わるという新たな知見により、前記新規薬剤または方法が発明された。
【選択図】図1
Description
a)レセプターチロシンキナーゼリガンドを切断できるメタロプロテアーゼの阻害剤であるか、またはメタロプロテアーゼの上流の調節段階の阻害剤であるレセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤および
b)過剰増殖性疾患を治療するための更なる薬剤
を有する製剤学的組成物またはキットである。
a)レセプターチロシンキナーゼリガンドを切断できるメタロプロテアーゼの阻害剤であるか、またはメタロプロテアーゼの上流の調節段階の阻害剤であるレセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤および
b)過剰増殖性疾患を治療するための更なる薬剤
を有する製剤学的組成物またはキットである。
図1:種々の細胞系におけるストレス誘導性EGFRおよびMAPKリン酸化の経時変化。(A)浸透ストレスと酸化ストレスに応答するEGFRおよびMAPKリン酸化。Cos−7細胞は、ソルビトール(0.3M)と過酸化水素(200μM)で記載された時間の間処理した。抗−EGFR抗体タンパク質を用いる細胞抽出物の免疫沈降(IP)に続いて、抗−ホスホチロシン抗体で免疫ブロットし(IB)、抗−EGFR抗体でリプローブした。リン酸化したMAPKsは、全体の溶解産物を抗−ホスホERK抗体、抗−ホスホ−JNKおよび抗−ホスホ−p38抗体で免疫ブロットすることにより検出された。同じフィルターを抗−p38抗体でリプローブした。(B)ヒト膀胱癌細胞系におけるストレス誘導性EGFRリン酸化。TCC−Sup細胞は(A)で示したように処理した。
1.材料と方法
1.1細胞培養、プラスミドおよびトランスフェクション
提供者の指示書に従い、全ての細胞系(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を決まった手順で成長させた。メーカーのプロトコールに従い、リポフェクタミン(Invitrogen)を用いてCos-7細胞のトランスフェクションを行った。簡単には、一時的なトランスフェクションのために6cm皿中の細胞を、1皿あたり20μLリポフェクタミンと全体のプラスミドDNA2μg含有の無血清培地2mL中で4時間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を当量の20%胎児ウシ血清で補足し、20時間後に細胞を洗浄し、刺激の前に無血清培地中でさらに24時間培養した。阻害剤AG1478(Alexis Biochemicals)、バチマスタット(BB94, British Biotech, Oxford, UK)、Crm197(Quadratech Ltd., UK)、SB202190(Calbiochem)およびPD98059(Alexis Biochemicals)を各刺激の前に血清飢餓状態の細胞に加えた。
細胞を溶解し、かつ上記のようにタンパク質を免疫沈降させた(Daub et al., 1997)。溶解前に、80%コンフルエンスまで成長させた細胞を図中の説明文に示されているように阻害剤とアゴニストで処理し、次に50μM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、1%トリトンX-100、1mM EDTA、10%グリセロール、10mM ピロリン酸ナトリウム、2mM オルトバナジウム酸ナトリウム、10mM フッ化ナトリウム、1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、10μg/mLアプロチニン含有の緩衝液中、氷上で10分間溶解した。溶解産物を13000rpmにて4℃で10分間の遠心分離により予めきれいにした。予めきれいにした分解遺産物を各抗体およびプロテインA−セファローズ20μLを用いて4℃で4時間免疫沈降した。沈殿物をHNTG緩衝液0.5mLで3回洗浄し、2×SDS試料緩衝液中に懸濁させ、3分間沸騰させ、ゲル電気泳動にかけた。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いて、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。従来の方法に従って、ウェスタンブロットを行った。ヒトEGFR(108.1)とSHCに対する抗体は前に特徴付けてある(Prenzel et al., 1999)。4G10モノクロナール抗体を用いてホスホチロシンを検出した(UBl, Lake Placid, NY)。ポリクロナール抗−ホスホ−p44/p42(Thr202/Tyr204)MAPK抗体、抗−ホスホ−JNK(Thr183/Tyr185)および抗−ホスホ−p38(Thr180/Tyr182)抗体はNew England Biolabs(Beverly, MA)から購入した。ポリクロナール抗−ERK2、抗−JNK1および抗−p38抗体はSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)から購入した。
上記のようにJNK活性をアッセイした(Sudo and Karin, 2000)。培養した細胞を、20mM トリス(pH 7.6)、0.5%Nonidet P-40、250mM NaCl、3mM EDTA、1mM ジチオトレイトール、0.5mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、20mM β−グリセロホスフェート、1mM オルトバナジウム酸ナトリウムおよび1μ/mLロイペプチン含有の溶解緩衝液中で溶解した。ポリクロナール抗−JNK抗体を用いて6ウェル皿から得られた溶解産物よりJNKを免疫沈降した。免疫沈降物を溶解緩衝液で2回洗浄し、かつキナーゼアッセイ緩衝液(25mM HEPES(pH 7.5)、20mM β−グリセロホスフェート、20mM PNPP、20mM MgCl2、2mMジチオトレイトールおよび0.1mM オルトバナジウム酸ナトリウム)で2回洗浄した。1μgGST-c-Jun(aa1-79)、20μMの冷たいATPおよび[y-32P]ATP5μCiを補足したキナーゼ緩衝液30μL中30℃で30分間キナーゼ反応を行った。Laemmli緩衝液30μLを添加することにより反応を中止し、12.5%ゲル上でゲル電気泳動にかけた。標識したGST-c-Junをホスホイメージャー(Fuji)で定量した。
FACS分析を上記のように行った(Prenzel et al., 1999)。簡単には、細胞を播種し、20時間成長させ、24時間血清飢餓状態にした。上記のように阻害剤で細胞を処理し、かつ刺激した。回収した後、proHB-EGFに対するエクトドメインに特異的な抗体で細胞を45分間染色した。PBSで洗浄後、細胞をFITC共役二次抗体で15分間インキュベートし、PBSで再び洗浄した。細胞をBecton Dickinson FACS caliburフローサイトメーターで分析した。
pcDNA3-proHB-EGF-VSVで一時的にトランスフェクションしたCos-7を24時間血清飢餓状態にした。刺激の前に細胞を洗浄し、BB94(10μM)でプレインキュベートし、かつ記載したように刺激した。刺激後、上澄液を回収し、デソキシコリン酸ナトリウム(100μg/mL)を添加し、氷上での10分間のインキュベーションに続いて、溶液にトリクロロ酢酸(TCA)を加えて10%TCAの最終濃度にした。氷上で30分間インキュベーションした後、試料を遠心分離し、上澄液を捨て、かつ沈殿物をSchaegger-Jargow試料緩衝液中で再懸濁させた。Tris-HCl(pH8.8)を用いてTCAを中和し、トリシンSDSゲル電気泳動プロトコールを用いて試料を分離した(Schaegger and von Jargow, 1987)。
内因性遺伝子をターゲティングするための21-ヌクレオチドsiRNA二本鎖(Dharmacon Research, Lafayette, CO, USA)のトランスフェクションを、NCl-H292細胞用のオリゴフェクタミン(Invitrogen)と6ウェルプレート当たり4.2μgのsiRNA二本鎖を用いて前記のように行った(Elbashir et al., 2001)。メーカーのプロトコールに従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてCos-7細胞をトランスフェクションした。簡単には、6cm皿あたり8.4μgのsiRNA二本鎖を無血清培地1mL中のリポフェクタミン2000 10μLと一緒に20分間インキュベートした。トランスフェクション混合物を血清含有の細胞培養培地に加え、6時間後に細胞を洗浄し、かつ血清含有の培地中で一晩インキュベートした。NCl-H292とCos-7細胞を血清餓死にし、トランスフェクション後2日目にアッセイした。有利な遺伝子の種々の領域をターゲティングするsiRNA二本鎖の混合物を使用することによりターゲット遺伝子のサイレンシングにおいて最も高い効率が得られた。使用したsiRNAの配列は以下のものである。
TCC-膀胱癌細胞を播種し、20時間成長させ、かつ記載したように10μM ドキソルビシンとCrm197で72時間処理した。細胞をヨウ化プロピジウム(PI)含有のアッセイ緩衝液中で回収し、4℃で3時間インキュベートした。核PI染色をBecton Dickinson FACS caliburフローサイトメターで分析した。
2.1 Cos-7とヒト癌細胞系におけるEGFRとMAPK活性化の特異な動力学
浸透ストレスと酸化ストレスは、幅広い種々の細胞系においてEGFRとMAPKsのリン酸化を導いた(Carpenter, 1999; de Nadal et al., 2002; King et al., 1989)。潜在的なメカニズムを調べるために、免疫ブロット分析によりCos-7とTCC-Sup腎臓癌細胞系において経時変化実験を行った。図1に示されるように(上のパネル)、ストレス剤であるソルビトール(0.3M)と過酸化水素(200μM)に応答するEGFRのチロシンリン酸化は両方の細胞系で5〜10分以内に生じたのに対して、MAPKsであるERK1/2およびJNKはそれぞれ10分後と15分後にリン酸化された(図1A/B、下のパネル)。ERK1/2の弱い活性化は既に1分後に検出されたのに対して、リン酸化は10分後に著しく増大した。これとは対照的に、p38のリン酸化はストレス剤に即座に応答した。経時変化実験の結果は、EGFRがストレス刺激に応答してERK1/2とJNK活性化に関わっていることを示唆している。これとは対照的に、p38の活性化がEGFR刺激に先行した。興味深いことに、レセプターの活性化は、リガンド非依存性の活性化メカニズムを可能にするだけではなく、リガンド依存性の活性化メカニズムを可能にする時間の尺度で検出可能であった。
p38活性化がEGFRチロシンリン酸化に先行したという発見は(図1)、p38がCos-7とヒト癌細胞系においてEGFR刺激の上流レギュレーターとして働いているのかどうかという疑問を生じた。
近年の研究はEGFRシグナリング、特に以前はリガンド非依存性であると考えられていたGPCRによるEGFRシグナルトランスアクチベーションのようなシグナルトランスダクション事象におけるEGF様リガンドのタンパク分解の重要性をはっきりと示している(Prenzel et al., 1999)。これらの発見に基づき、ストレス刺激によるEGFR活性化がリガンド依存性メカニズムに関わるかどうかという疑問に取り組んだ。従って、EGF様リガンドプロセシングとそれに続くEGFRトランスアクチベーションを阻害することが示されたメタロプロテアーゼ阻害剤であるバチマスタット(BB94)と一緒に細胞をプレインキュベートした(Prenzel et al., 1999)。EGFRチロシンリン酸化は、免疫ブロット分析を用いるストレス剤で刺激した後にモニターした。図3Aに示されるように、Cos-7およびTCC-Sup腎臓癌細胞においてBB94は殆ど完全にソルビトールまたは過酸化水素−誘導性EGFRリン酸化を遮断した(上と真ん中のパネル)。肺癌細胞系NCl-H292では、BB94はEGFR活性化を50%まで阻害したので、このことは二者択一的な平行の活性化メカニズムを示唆している(図3A、下のパネル)。
このリガンド依存性EGFR刺激メカニズムにおけるHB-EGFの役割を更に実証するために、リガンド自体のレベルで高浸透圧と過酸化水素処理に応答するproHB-EGFのシェディングを調べた。従って、ソルビトールまたは過酸化水素で刺激する前と後にCos-7細胞の細胞表面に存在するproHB-EGFの量をフローサイトメトメトリー分析により分析した。図4Aに示されているように、両方の刺激は細胞表面上でHB-EGF前駆体の著しい減少を導いた。さらに、図3Aに示されている結果と一致して、メタロプロテアーゼ阻害剤BB94を用いる予備処理は、proHB-EGFプロセシングを排除した。HB-EGF前駆体の減少の他に、proHB-EGFを異所性発現してCos-7細胞の細胞表面から細胞培養培地に放出された可溶性の成熟型HB-EGFの量を測定した。図4Bに示されるように、高浸透圧と過酸化水素を用いる両方の処理は、免疫ブロット分析により測定されたように調整培地中でHB-EGFの増大を誘導した。さらにまた、HB-EGF放出がメタロプロテアーゼ阻害剤BB94でのプレインキュベーションにより遮断され、メタロプロテアーゼ活性の関わりを確証している。
メタロプロテアーゼ依存性メカニズムがストレス誘導性EGFRとShc活性化に著しく寄与するという発見は、どのメタロプロテアーゼが関係しているのかという疑問を生じた。RNA干渉法を使用して、すでにEGF様リガンドの切断に関わっていたADAMプロテアーゼであるADAM9、10、12、15および17の内因発現を阻害した。図5Aは、ADAM9、10および15に対するsiRNAによるターゲット遺伝子発現の効果的かつ特異的ノックダウンをRT-PCRで証明している。ADAM12と17に対するsiRNAsは既に記載してある(Gschwind et al., 2003)。各プロテアーゼに対するsiRNAsを用いる一時的なトランスフェクション、およびそれに引き続くソルビトールまたは過酸化水素で刺激した後のEGFRの免疫ブロット分析は、Cos-7細胞では両方のストレス刺激後にADAM10とADAM17がEGFR活性化に関わっていることを明らかにした(図5B)。しかし、ヒトの癌細胞におけるこれらのプロセス制御に興味があったので、ヒト肺ガン細胞系NCl-H292におけるADAMファミリーメンバーの関係をさらに調べた。すわなち、図5Cで証明されているように、Cos-7細胞で得られた結果と類似して、ADAM17もストレス誘導性EGFR活性化に関わっている。Cos-7細胞とは対照的に、ADAM9および過酸化水素処理の場合でも、ADAM12は、NCl-H292細胞のストレス応答に関わっている。全体として、細胞タイプにより、メタロプロテアーゼの種々のADAMファミリーのメンバー、特にADAM17は、ストレス剤に応答するHB-EGF依存性EGFR活性化において中心的な役割を担っている。
MAPKs であるERK1/2とJNKが高浸透圧と活性酸素種により活性化されるので(de Nadal et al., 2002; Kyriakis and Avruch, 2001)、リガンド依存性EGFRリン酸化がストレス刺激によるMAPK活性化の誘導に寄与するかどうかを調べた。ゆえに、選択的EGFR tyrphostin AG1478を使用して、EGFRキナーゼ活性におけるストレス誘導性MAPK活性化の全体的な依存性を調べた。さらに、この効果をBB94とCrm197によるリガンド依存性EGFR活性化プロセスの阻害と比較した。図6A(上のパネル)に示されているように、ERK1/2のソルビトールと過酸化水素誘導性活性化は、AG1478により遮断された。さらに、BB94とCrm197はERK1/2リン酸化の遮断において殆ど有効であった。これらのデータは、浸透ストレスと酸化ストレスに応答するCos-7細胞におけるERK1/2活性化がリガンド依存性メカニズムに大いに帰因しているEGFR活性化に殆ど完全に依存していることを示唆している。同じ実験構成を使用して、このコンセプトをヒト癌細胞系におけるストレスシグナリングにまで延ばすことができるかどうかという問題に的をしぼった。しかし、TCC-SupおよびNCl-H292細胞における高浸透圧および酸化ストレス誘導性ERK1/2活性化がAG1478、BB94およびCrm197により実質的に遮断されることが分かった(図6A真ん中と下のパネル)。興味深いことに、NCl-H292細胞において酸化ストレスがリガンド依存性メカニズムにより部分的にだけEGFRリン酸化を誘導するにもかかわらず、この細胞タイプではERK活性化はproHB-EGFプロセシングに大いに依存する。
徹底的な調査は、どのように哺乳類細胞がストレス剤に対処しているのかという問題に焦点をおいた。本研究は、ヒト癌細胞において浸透ストレスと酸化ストレスに応答するEGFRとそれに続くMAPK活性化を導く成長因子依存性メカニズムにおいて新たな洞察を提供した。
Claims (30)
- 少なくとも部分的に治療抵抗性の過剰増殖性疾患を予防または治療するための薬剤を製造するための、レセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤の使用。
- 疾患は癌である、請求項1に記載の使用。
- 疾患は少なくとも部分的に照射および/または薬剤耐性癌である、請求項1または2に記載の使用。
- 疾患は少なくとも部分的にアポトーシス誘導治療に対して耐性である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の使用。
- 疾患は、細胞増殖抑制剤および/または細胞毒性剤、特にアポトーシス誘導剤の投与に対して少なくとも部分的に耐性である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の使用。
- レセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤は、更なる治療法および/または薬剤と共同適用される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の使用。
- 薬剤は照射療法と共同適用される、請求項6に記載の使用。
- 薬剤は、更なる抗ガン剤、特に化学療法剤または抗腫瘍抗体と共同適用される、請求項6または7に記載の使用。
- 更なる抗癌剤は、ドキソルビシン、タキサン、シス/トランス−プラチンまたはこれらの誘導体、5−フルオロウラシル、マイトマイシンD、パクリタキセル、エトポシド、シクロホスホアミド、ドセタキセルまたは他のアポトーシス誘導剤またはタンパク質、特に抗体から選択される、請求項8に記載の使用。
- 過剰増殖性疾患に対する治療の効率を上げるための薬剤を製造するための、レセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤の使用。
- 照射療法および/または薬物治療に対する過剰増殖性疾患の感受性を上げるための薬剤を製造するための、レセプターチロシンキナーゼの阻害剤の使用。
- レセプターチロシンキナーゼのストレス誘導性活性化により引き起こされるか、または関連する過剰増殖性疾患を予防または治療するための薬剤を製造するためのレセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤の使用。
- ストレスは酸化ストレスおよび/または浸透ストレスである、請求項12に記載の使用。
- ストレスはp38媒介ストレスである、請求項12または13に記載の使用。
- 疾患は癌である、請求項12から14までのいずれか1項に記載の使用。
- レセプターチロシンキナーゼは、EGFRおよび他のEGFRファミリーのメンバーから選択される、請求項1から15までのいずれか1項に記載の使用。
- レセプターはEGFRである、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- レセプターチロシンキナーゼリガンドは、該レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに結合するリガンドである、請求項1から17までのいずれか1項に記載の使用。
- レセプターチロシンキナーゼリガンドは、HB−EGF、EGF、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピレグリン、TGF-α、ニューレグリンまたはヘレグリンから選択される、請求項1から18までのいずれか1項に記載の使用。
- レセプターチロシンキナーゼリガンドは、HB−EGFである、請求項19に記載の使用。
- 阻害剤は、レセプターチロシンキナーゼリガンドを切断できるメタロプロテアーゼの阻害剤であるか、またはメタロプロテアーゼの上流の調節段階の阻害剤である、請求項1から20までのいずれか1項に記載の使用。
- 阻害剤は、レセプターチロシンキナーゼリガンドの直接的な阻害剤である、請求項1から12までのいずれか1項に記載の使用。
- 阻害剤は核酸レベルで働く、請求項1から22までのいずれか1項に記載の使用。
- 阻害剤は、特異的な転写阻害剤、特にアンチセンス分子、リボザイムまたはRNAi分子から選択される、請求項23に記載の使用。
- 阻害剤は遺伝子不活性化因子である、請求項24に記載の使用。
- 阻害剤は、タンパク質レベルで働く、請求項1から22までのいずれか1項に記載の使用。
- 阻害剤は、特異的タンパク質阻害剤であり、特に抗体または抗体断片および/またはタンパク質分解性阻害剤または低分子量阻害剤から選択される、請求項26に記載の使用。
- 活性成分として
a)レセプターチロシンキナーゼリガンドを切断できるメタロプロテアーゼの阻害剤であるか、またはメタロプロテアーゼの上流の調節段階の阻害剤であるレセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤および
b)過剰増殖性疾患を治療するための更なる薬剤
を有する製剤学的組成物またはキット。 - 付加的に製剤学的に認容性のキャリア、希釈剤および/または助剤を有する請求項28に記載の組成物またはキット。
- レセプターチロシンキナーゼリガンドの阻害剤を、これを必要とする被験者に投与することを含む、少なくとも部分的に治療抵抗性の過剰増殖性疾患を予防または治療する方法。
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