JP2011055838A - ８５ｋＤａのナイセリア抗原 - Google Patents

Abstract

【課題】髄膜炎ワクチンの抗原性成分を規定すること、より良好に規定されたワクチン（例えば、無細胞性サブユニットワクチン）の産生を可能にするためにこれらを特徴付けること、および免疫が惹起されるナイセリア株を広げること。
【解決手段】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の８５ｋＤａの抗原をクローン化し、配列決定し、そして発現させた。この抗原は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの種々の株、血清群および血清型に共通であり、またＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉａ、およびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａに対しても共通である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａおよび血清群Ｂ）およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのタンパク質配列は高い相同性を有する。
【選択図】なし

Description

本明細書中に引用する全ての文書は、本明細書中にその全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、関連した細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原に関する。

（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性双球菌ヒト病原体である。これは、咽頭にコロニー形成をし、髄膜炎（および、時折、髄膜炎のない敗血症）を引き起こす。これは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに密接に関連しているが、髄膜炎菌が淋菌と明らかに異なる１つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖類性莢膜の存在である。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および伝染病をともに引き起こす。米国において、発病率は１年間に１００、０００人あたり０．６〜１人の割合であり、そして大流行によりずっと大きくなり得る（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９６）ＪＡＭＡ ２７５（１９）：１４９９−１５０３；Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７（１４）：９７０−９７６）。発展途上国では、風土病の割合はずっと大きく、そして流行の間、発生率は１年間あたり１００、０００人あたり５００症例に達し得る。死亡率は極めて高く、米国では１０〜２０％、そして発展途上国においてはよりずっと高い。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する結合ワクチンの導入後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、米国において全ての年齢における細菌性髄膜炎の主な原因である（Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）前出）。

生物の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２血清群が同定されている。現在使用される髄膜炎ワクチンは、血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５によって構成される４価の多糖類ワクチンである。しかし、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａに対するワクチン接種の成功の後、血清群Ａおよび血清群Ｃに対する結合体ワクチンが開発されている。

しかし、髄膜炎菌Ｂは問題を残したままである。この血清型は現在、米国、欧州および南アメリカにおける全髄膜炎のおおよそ５０％の原因である。この多糖類アプローチは使用できない。なぜなら、ｍｅｎＢ莢膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）結合Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。これは抗原に対する寛容を生ずる；実際、応答が惹起された場合、それは抗自己であり、それ故、所望されない。自己免疫の誘導を回避しそして防御免疫応答を誘導するために、この莢膜多糖類は、例えば、Ｎ−アセチル基をＮ−プロピオニル基と置換して化学的に改変され、特異的抗原性は不変のままである（ＲｏｍｅｒｏおよびＯｕｔｓｃｈｏｏｒｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７（４）：５５９−５７５）。

ｍｅｎＢワクチンに対する代替のアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の複雑な混合物（ＯＭＰのみを含むかまたはポーリンに富むＯＭＰのいずれかを含む）を使用したか、または細菌活性をブロックする抗体を誘導すると考えられるクラス４ＯＭＰを欠失した。これらのワクチンは、十分に特徴付けられておらず、相同な株に対してのみ有効である。抗原変異性を克服するために、９つまでの異なるポーリンを含む多価ワクチンが構築されている（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ ＪＴ（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ Ｄｉｓ．４：１３−２８）。外膜ワクチンで使用されるさらなるタンパク質は、ｏｐａおよびｏｐｃタンパク質であるが、これらのアプローチはいずれも抗原変異性を克服できていない（例えば、Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９６）Ｖａｃｃｉｎｅ １４（１）：４９−５３）。しかし、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈワクチンは、安全であり、株特異的免疫を小児および成人において惹起し、そして青年期における疾患を予防する際に有効である（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎ １４（２）：６７−８０および１０７−１２３）。

しかし、これらのワクチンは、ほとんど特徴付けられておらず、そしてこれらの効力および保護についての分子的根拠は詳細には吟味されていない。本発明の目的は、ワクチンの抗原性成分を規定すること、より良好に規定されたワクチン（例えば、無細胞性サブユニットワクチン）が産生されることを可能にするためにこれらを特徴付けること、および免疫が惹起されるナイセリア株を広げることである。

（発明の開示）
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）以下のアミノ酸配列の１つ以上を含む、タンパク質：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４〜配列番号１０４。
（項目２）以下の配列に対して５０％より高いの配列同一性を有する配列を含む、タンパク質：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３。
（項目３）以下の配列由来の連続する少なくとも７個のアミノ酸のフラグメントを含む、タンパク質：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３。
（項目４）項目１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する、抗体。
（項目５）項目１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（項目６）配列番号２、配列番号６、または配列番号１０を含む、核酸。
（項目７）配列番号２、配列番号６、または配列番号１０に対して５０％より高い配列同一性を有する配列を含む、核酸。
（項目８）配列番号２、配列番号６、または配列番号１０由来の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドのフラグメントを含む、核酸。
（項目９）項目１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質、項目４に記載の抗体、および／または項目５〜８のいずれか１項に記載の核酸を含む、組成物。
（項目１０）項目９に記載の組成物であって、以下：
ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質またはこれらの免疫原性フラグメント；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに対する防御抗原；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃに対する防御抗原；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙに対する防御抗原；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗに対する防御抗原；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する防御抗原；ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する防御抗原；ジフテリアに対する防御抗原；破傷風に対する防御抗原；百日咳に対する防御抗原；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；ポリオに対する防御抗原；および／またはＢ型肝炎ウイルスに対する防御抗原；
の１つ以上から選択される免疫原性成分をさらに含む、組成物。
（項目１１）医薬として使用するための、項目９または項目１０に記載の組成物。
（項目１２）ワクチンとして使用するための、項目９または項目１０に記載の組成物。
（項目１３）ナイセリア細菌に起因する感染を処置または予防するための医薬の製造における、項目９または項目１０に記載の組成物の、使用。
（項目１４）患者を処置する方法であって、治療有効量の項目９または項目１０に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
（タンパク質）
本発明は、以下のアミノ酸配列のうちの１以上を含むタンパク質を提供する：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３。

本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３に対して配列相同性を有する配列を含むタンパク質を提供する。この特定の配列番号に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。これらの相同配列は、変異体および対立遺伝子改変体を包含する。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることの表示であると考えられる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメータ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１）でのａｆｆｉｎｅ ｇａｐ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

本発明はさらに、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、その配列由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸を含むべきであり、そしてその特定の配列に依存して、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）である。好ましくはこのフラグメントは、その配列に由来するエピトープを含む。

本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によって、および種々の形態で（例えば、天然型、融合型など）調製され得る。これらは、好ましくは実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のナイセリアまたは宿主細胞のタンパク質を実質的に含まない）。

（抗体）
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段により産生され得る。

（核酸）
さらなる局面に従って、本発明は、配列番号２、配列番号６または配列番号１０を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、配列番号２、配列番号６または配列番号１０に対する配列同一性を有する配列を含む核酸を提供する。この特定の配列番号に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％よりも大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。配列同一性は、好ましくは、パラメータ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１）でのａｆｆｉｎｅ ｇａｐ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。

さらに、本発明は、配列番号２、配列番号６または配列番号１０に、好ましくは「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で、６５℃）でハイブリダイズし得る核酸を提供する。

配列番号２、配列番号６または配列番号１０のフラグメントを含む核酸もまた、提供される。これらは、配列番号２、配列番号６または配列番号１０由来の少なくともｎ個連続したヌクレオチドを含有すべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０以上）である。

さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸を提供する。

本発明が上記の配列と相補的な配列を含む核酸を（例えば、アンチセンスの目的またはプロービングの目的のために）提供することもまた、認識されるべきである。

本発明に従う核酸は、もちろん、多くの方法（例えば、化学合成により、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、など）をとり得る。

さらに、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、そしてそれらのアナログ（例えば、修飾した骨格を含むアナログ）もまた含み、そしてペプチド核酸（ＰＮＡ）などもまた含む。

さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）およびこのようなベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。

（組成物）
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体、および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、ワクチンとして、例えば、または診断剤として、または免疫原性組成物として適切であり得る。

本発明の組成物は、さらに、以下の１つ以上から選択される免疫原性組成物を含む：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９-１８１５；ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０］に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに対する防御抗原；・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃに対する防御抗原；・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙに対する防御抗原；・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗに対する防御抗原；・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する防御抗原；
・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する防御抗原；
・ジフテリアに対する防御抗原；
・破傷風に対する防御抗原；
・百日咳に対する防御抗原；
・Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
・ポリオに対する防御抗原；および／または
・Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。

好ましくは、組成物は、さらに、以下の１つ以上から選択される免疫原性成分を含む：
・ＷＯ９９／２４５７８に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

；
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９-１８１５］に開示される２１６０個の遺伝子ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０もいずれか１つによりコードされるタンパク質（またはこれらの２１６０個の遺伝子の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの２１６０個の遺伝子のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）；
・ＷＯ９９／５７２８０に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

；
・ＷＯ９７／２８２７３の図４または図１３に開示されるタンパク質；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示される配列番号１〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質（またはこれらの配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示される配列番号１〜２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質（またはこれらの配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示される配列番号２からなるアミノ酸配列を含むタンパク質（または配列番号２の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２に対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに対する多糖類抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃに対する多糖類抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１-６９８）；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙに対する多糖類抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗに対する多糖類抗原；
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する多糖類抗原；
・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する多糖類抗原；
・ジフテリアトキソイド（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１-７０］）からなる、ジフテリアに対する防御抗原；
・破傷風トキソイド［例えば、ＷａｓｓｉｌａｋおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｖａｃｃｉｎｅｓの第４章（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編）、１９８８］からなる、破傷風に対する防御抗原；
・百日咳ホロトキシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および糸状血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＦＨＡ）を含む；必要に応じてパータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）および／または凝集原２および３［例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９-３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ９：２３２-２３８］をさらに含む、百日咳に対する防御抗原；
・ＣａｇＡ（例えば、ＷＯ９３／１８１５０）、ＶａｃＡ（例えば、ＷＯ９３／１９１５０）、ＮＡＰ（例えば、ＷＯ９９／５３３１０）、ＨｏｐＸ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）、ＨｏｐＹ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）、ウレアーゼの１つ以上を含む、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
・ＨＢＶ表面抗原および／またはＨＢＶコア抗原からなる、Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。

組成物が、ジフテリアに対する抗原を含む場合、破傷風およびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、破傷風に対する抗原を含む場合、ジフテリアおよびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、ポリオに対する抗原を含む場合、ジフテリアおよび破傷風に対する抗原を含むこともまた好ましい。

百日咳トキシンは、毒性タンパク質であり、そして組成物中に存在する場合、好ましくは、解毒される。解毒は、化学的手段および／または遺伝子的手段によるものであり得る。好ましい解毒化変異体は、９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体（ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ）［例えば、Ｒａｐｐｕｏｌｉ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：３７４-３７６］である。

組成物が、異なる新生形態および成熟形態で存在するタンパク質を含む場合、このタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。例えば、ＮｓｐＡ［ＷＯ９６／２９４１２；Ｍａｒｔｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８５ １１７３-１１８３もまた参照のこと］が含まれる場合、シグナルペプチドを欠くこのタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。

組成物が、多糖類抗原を含む場合、この多糖類は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合体化される。

組成物中に存在する本発明のタンパク質は、好ましくは、組成物中の少なくとも１つの防御抗原と相乗的に相互作用する。

（治療、予防、診断）
本発明はまた、医薬として（好ましくはワクチンとして）または診断試薬として使用するための、本発明の組成物を提供する。本発明はまた、以下の製造における、本発明の組成物の使用を提供する：（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬；（ｉｉ）ナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／または（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は任意の種または菌株であり得る（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が、好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（特に、血清群Ｂ）であり得る。

本発明はまた、治療的有効量の、本発明に従う核酸、タンパク質、および／または抗体を患者に投与する工程を含む、患者の処置の方法を提供する。この方法は好ましくは免疫である。

本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。

（プロセス）
さらなる局面によれば、本発明は、種々のプロセスを提供する。

本発明のタンパク質を産生するためのプロセスであって、タンパク質の発現を誘導する条件下において、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセスが提供される。

本発明のタンパク質または核酸を産生するためのプロセスであって、ここでそのタンパク質または核酸は、化学的手段を使用して、一部または全体が合成されるプロセスが提供される。

本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う核プローブを、ハイブリダイズする条件下で生物学的サンプルと接触させて二重鎖を形成させる工程；および（ｂ）この二重鎖を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。

本発明のタンパク質を検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。

図１は、コンピューター分析のデータと共にＯＲＦ２１の配列を示す。 図１は、コンピューター分析のデータと共にＯＲＦ２１の配列を示す。 図１は、コンピューター分析のデータと共にＯＲＦ２１の配列を示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。 図２は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを示す。

（発明を実施するための形態）
本発明を実行するために用いられ得る標準的な技術および手順（例えば、ワクチン接種目的または診断目的のために、開示された配列を利用するための）の要旨は以下の通りである。この要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ使用され得るが必要とされるわけではない例を与えるものである。
（総論）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ｉｉ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）、特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）。

ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略号が、本明細書において使用される。

Ｘを含む組成物は、組成物中のＸ＋Ｙの合計のうちの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中のＸ＋Ｙの合計のうちの少なくとも９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％を、または９９重量％さえも構成する。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに何かを付加したものも含み得る。

用語「異種」とは、天然では一緒には見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では一緒には見られないが、例えば、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときは、それらは一緒に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられた、同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。

「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要とされ得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。

「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として定義される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより大きい）。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列が提供される核酸分子（または領域）の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは第２の単離体のゲノム中の本質的に同じ遺伝子座で生じ、かつ、例えば、変異または組換えにより生ずる天然のバリエーションに起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子（または領域）である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５、７５３、２３５号を参照のこと）。

（発現系）
ナイセリアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母について使用される発現系において発現され得る。

（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれの方向にも作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。

哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主域を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得る。

上記のプロモーターエレメントと組み合わされたエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結されたとき、転写を１００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で始まる。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流もしくは下流に、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿主域を有するため、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガロウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。

ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸は常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得るプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３部構成リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。

通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を導き、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライス供与部位およびスプライス受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳動物レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用に哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用に原核生物の宿主内で、そのレプリコンが維持されることが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。

使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。

発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。

（ｉｉ バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を含む転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。

転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでこのベクターとウイルスゲノムとを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター、リーダー（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間置換（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは調節エレメントの同じセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間置換構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。

現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。

そのプラスミドはまた通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、ならびに大腸菌においての選択および増殖のための複製起点を含む。

バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは存在する場合は、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は調節されるか、または構成的であるかのいずれかであり得る。

ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質または分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子（例えば、バキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ、７３：４０９））から誘導され得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されると思われるために、ヒトα−インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら、（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のリーダーのような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。

組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、または適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。

あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内へのトランスロケーションを指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードしている。

タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内へであり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子内に設計された制限酵素部位内へであり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化した場合、このＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列が５’および３’の両側に隣接しており、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。

新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％と約５％との間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定する方法が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別し得る視覚的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後の時期に、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染した細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスとを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。

組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら、（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。

細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、上記ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。

改変した昆虫細胞をさらに、適切な栄養培地で増殖させる。この培地は、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給しながら、栄養培地を連続的に循環させる必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切な場合、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中にまた分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じたあらゆる昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。

タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。

（ｉｉｉ 植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５、６９３、５０６号；米国特許第５、６５９、１２２号；および米国特許第５、６０８、１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら、Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモンジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｌｃｏｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編 １９８４ Ｐｉｔｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、２１−５２頁の中に見出され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献：Ｓｈｅｅｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。

代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で作動するように設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主域の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移入のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ、１１（２）：１６５−１８５に見られる。

植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他のＤＮＡ配列はまた、当該分野で公知であるように、そのベクターの中に存在し得る。

本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物の５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうかに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。

異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得るあらゆる配列を欠いている。たいてい、転写開始領域は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子についてのものであるから、トランスロケーションを与えるシグナルペプチドを使用することにより、また、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。このようにして、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過して、種子の胚乳内へと至る。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌されることは必要とされないが、このことは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。

所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのような、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構よりプロセシングされて除去される配列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコードとして遺伝的メッセージの一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１：９５−１０５（１９８５）。

ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７、７０−７３、１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９１、Ｐｌａｎｔａ、１８５：３３０−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の物体（ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の易融な脂肪表面体のいずれか）とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、１８５９−１８６３、１９８２）。

ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４、１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレートされる。高電界強度での電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、***し、植物カルスを形成する。

プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、移入した遺伝子を含む完全な植物が回収される。実際に、全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹および他の樹木、マメ科植物および野菜という全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞または組織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる：Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、およびＤａｔｕｒａ。

再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することもまた、特にコーンおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発達する。効率的な再生は培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これらの３つの変動要因が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。

いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または他の植物組織は、機械的に破壊されて細胞間および組織間のあらゆる分泌タンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁されて、可溶タンパク質が回収され得る。次いで、従来のタンパク質単離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量というパラメーターは、異種タンパク質の発現および回収を最適化するために慣用的な方法により調整される。

（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これは、ＲＮＡ合成が開始する、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質がこのオペレーターに結合し、それによって、特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、この配列は、通常、存在する場合には、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって、転写を増強するかまたは低下し得る。

代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４、７３８、９２１号；ＥＰＯ公開番号０３６ ７７６および１２１ ７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４、６８９、４０６号）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する（米国特許第４、５５１、４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列、およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌プロモーターには、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合しそして転写を開始させる能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼが結合され、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現をもたらし得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開番号２６７ ８５１）。

機能性プロモーター配列に加え、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そしてこれは、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成により、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには、ＳＤ配列と真核生物遺伝子のＡＴＧとの間の距離を最適化することが、しばしば、必要とされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、そのＤＮＡ分子と直接的に連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これは、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、あるいは細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボインキュベーションまたはインビトロインキュベーションのいずれかによって、タンパク質から切断され得る（ＥＰＯ公開番号２１９ ２３７）。

融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内在性の細菌タンパク質あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列を、異種コード配列の５’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、その２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され得、そして細菌において発現され得る。この生じた融合タンパク質は、好ましくは、このバクテリオファージタンパク質をこの外来遺伝子から切断するためのプロセシング酵素（Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰＯ公開番号３２４ ６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。この２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌において外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４、３３６、３３６号）。このシグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）またはペリプラズム空間（細胞の内膜と外膜との間に位置する）（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、プロセシング部位が存在する。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰＯ公開番号２４４ ０４２）。

通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指向し、このｍＲＮＡが、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列は、頻繁には、ステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含み、この構造が、転写の終結を補助する。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。

通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）が、発現構築物へと組み立てられる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば、細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは、複製系を有し、従って、これが、このレプリコンを、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００、そして通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、そしてより好ましくは、少なくとも約２０個のプラスミドを含む。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌ゲノム内に組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、このベクターにおける相同なＤＮＡと細菌染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡで構築した組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（欧州特許公開番号１２７ ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。

通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、この細菌宿主において発現され得、そしてこれらには、薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリン）に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれ得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるかまたは組み込みベクターへと展開されるかのいずれかの、選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。

発現ベクターまたは形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも）は、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６ ２５９および欧州特許公開番号０６３ ９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許公開番号０３６ ７７６、欧州特許公開番号１３６ ８２９および欧州特許公開番号１３６ ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４、７４５、０５６）。

外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ₂または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと：［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６ ２５９および欧州特許公開番号０６３ ９５３；ＷＯ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ Ｃｏ１Ｅ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの使用］、［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］。

（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し得そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。このＵＡＳは、調節された（誘導性）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それによって、転写を増強または減少させ得る。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許公開番号２８４ ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許公開番号３２９ ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。

さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列（米国特許第４、８７６、１９７号および同第４、８８０、７３４号）が挙げられる。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる（欧州特許公開番号１６４ ５５６）。さらに、酵母プロモーターには、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合しそして転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。

ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、この組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これが、ＡＴＧ開始コドンによってコードされている。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、このタンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系においての、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列を、異種コード配列の５’末端に融合する。発現に際して、この構築物は、この２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子を、外来遺伝子の５’末端に連結し、そして酵母において発現させ得る。この２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、欧州特許公開番号１９６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質の遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号０１２ ８７３；日本国公開公報６２、０９６、０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許４、５８８、６８４））由来であり得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（欧州特許公開番号０６０ ０５７）。

好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。使用され得るこの型のα因子フラグメントは、完全長のプレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許４、５４６、０８３および４、８７０、００８；欧州特許公開番号３２４ ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては、第１の酵母のプレ配列および第２の酵母α因子からのプロ領域を用いて作製される、ハイブリッドα因子リーダーが挙げられる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。

通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指向し、このｍＲＮＡが、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。

通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコード配列および転写終結配列を含む）を、発現構築物に組み立てる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいて維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、これが、例えば、発現のために酵母中で維持され、そしてクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中で維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００、そして通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、そしてより好ましくは、少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するための適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、これが、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与える（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメントとして存在し得るか（これは、ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメントとして存在し得る（これは、発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）。

通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、その形質転換された酵母株の選択を可能にする、選択マーカーを含み得る。選択マーカーとしては、、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７）ならびにＧ４１８耐性遺伝子が含まれ得、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）。

あるいは、上記成分のうちのいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるかまたは組み込みベクターに展開される、選択マーカーから構成される。

発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する発現ベクターおよび方法は、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４、８３７、１４８号および同第４、９２９、５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。

外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの形質転換またはアルカリ陽イオンで処理したインタクトな酵母細胞の形質転換が含まれる。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４、８３７、１４８号および同第４、９２９、５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。

（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。

本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａのタンパク質の識別／同定に有用である。

本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来の方法によって調製され得る。一般に、このタンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理的食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射することによって、行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理的食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いて）中のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１、０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、採血１回につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、（非特異的付着細胞の回収後）タンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへ細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落とされない。得られるＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されたＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。

所望の場合、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に³²Ｐおよび¹²⁵Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青い色素へ変換するその能力（分光光度計を用いて定量可能）によって、検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド結合体を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、¹²⁵Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして¹²⁵Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の並べ替えおよび可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で等価であると考えられる。

（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。

本明細書において使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。

本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。

薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく、ゆっくり代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。

薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて入手可能である。

治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。

（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。

その組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔、静脈内、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間隙空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。

（ワクチン）
ワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリアは、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生をそれ自体は誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体化され得る。

この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニウム塩（「ミョウバン」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を含むか含まない）を含むが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてμ未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９^TM（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の第１０章）；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^TM）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ^TMアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^TM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激剤として作用する他の物質を含むが、それらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９^TMが好ましい。

上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、それらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、免疫抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、このようなビヒクルにおいて存在し得る。

代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、個体へのその量の投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、医療的状況の処置する医師の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲にあり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。

免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンが使用され得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６１７−６４８；本明細書以下を参照のこと）。

（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。

（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られる熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。

（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。

（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥ−デキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。

脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るかまたは核酸を捕捉および維持し得る、リポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。

本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。

カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１、２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。

同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。

このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を参照のこと。

（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドと共に含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。

天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。

１つのリポタンパク質は、１つより多くのアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するカイロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥから構成され、時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。

これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；およびＵｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５：２３２に記載されている。

リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、カイロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するように選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。

天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロ方法によってかまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現により組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６５にて見い出され得る。

（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを含む組成物中に、リポタンパク質を伴ってかまたはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。

ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ適用、エキソビボ適用、およびインビボ適用のいずれも有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。

以下は、ポリカチオン性薬剤として有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例としては、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）が挙げられる。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。

有機ポリカチオン性薬剤としては、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）が挙げられる。

ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から推定されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。

有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンが挙げられる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^TMは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。

（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いに対する会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子としては以下が挙げられる：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。

「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。

例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については１０^-9〜１０^-8ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０⁸ｃｐｍ／μｇを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０⁸ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる。

いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、ハイブリダイズする配列の長さおよび全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ₁₀Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、そして塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。

ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。

一般的に、５０％ホルムアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。

（発明を実施するための形態）
（髄膜炎菌の（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）８０〜８５ｋＤａのタンパク質の同定）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の種々の外膜の小胞調製物は、約８０〜８５ｋＤａの成分を含んでいたことが観察された。このタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、そしてＮ末端を配列決定した（配列番号１）。

抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製した５０より多くの様々な血清群および血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株における等価のタンパク質と交差反応したタンパク質に対して惹起させた。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉａ、およびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａとの交差反応もまた、観察した。ワクチン接種された患者由来の免疫後血清もまた、このタンパク質と反応した。

完全な遺伝子を、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（配列番号２）からクローン化し、そしてコードされたタンパク質を、推定した（配列番号３）。上記のＮ末端の配列決定との比較により、シグナルペプチド（配列番号４）および成熟配列（配列番号５）を推定する。

（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群ＡおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおける対応する遺伝子の同定）
血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ配列に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群ＡおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の対応する遺伝子をクローン化し、そして配列決定した（「ＯＲＦ」と称される）。

血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の完全な遺伝子を、配列番号６に示し、このコードされたタンパク質を配列番号７に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号８および配列番号９である。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の完全な遺伝子を、配列番号１０に示し、このコードされたタンパク質を配列番号１１に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号１２および配列番号１３である。

（配列比較）
これらのタンパク質の配列を比較した。これらの配列は、非常に相同である。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの配列およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの配列は、７９７ａａの重複において、９５．４％の同一性を示す：

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａの配列およびＢの配列は、７９７ａａの重複において、９９．９％の同一性を示す：

この高度な保存は、単一のタンパク質が、種々のＮｅｓｓｅｒｉａｅ種に対する免疫応答を誘導し得ることを、示唆する。

（クローニング、発現、および精製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６およびＭＣ５８を、１００ｍｌのＧＣ培地中で対数期まで増殖させて、遠心分離により収集し、そして５ｍｌの緩衝液（２０％ｗ／ｖのスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。氷上で１０分間のインキュベション後、この細菌を１０ｍｌの溶解液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮａ−サルコシル、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ）を添加することにより溶解し、この懸濁液を３７℃で２時間インキュベートした。２回のフェノール抽出および１回のＣＨＣｌ₃／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。ＤＮＡを、０．３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２容量のエタールの添加により沈殿させ、遠心分離により収集した。このペレットを、７０％（ｗ／ｖ）のエタノールで１回洗浄し、そして４．０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再溶解した。このＤＮＡ濃度をＯＤ₂₆₀で読みとることにより測定した。

ＯＲＦ２１（これは、リーダーペプチドをコードする配列を有さない）を、以下のオリゴヌクレオチドヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した：
ｏｒｆ２１ 順方向 ＜配列番号１０５＞（ＢａｍＨ１−Ｎｄｅ１）
ｏｒｆ２１ 逆方向 ＜配列番号１０６＞（Ｘｈｏ１）
この増幅産物（ＯＲＦ２１に対応する）のクローニングを、２つの発現ベクター（Ｎ末端にＧＳＴ融合物を有するためのｐＧＥＸ−ＫＧ（ＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１を用いる）およびＣ末端にＨｉｓ融合物を有するためのｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｄｅ１−Ｘｈｏ１を用いる））中へ指向させるために、５’プライマーは、２つの制限部位（ＢａｍＨ１−Ｎｄｅ１）を含み、３’プライマーは、Ｘｈｏ１制限部位を含む。

標準的なＰＣＲプロトコールは、以下であった：２９９６もしくはＭＣ５８株由来の２００ｎｇのゲノムＤＮＡまたは組換えクローンの１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ調製物を、４０μｇＭの各オリゴヌクレオチドヌクレオチドプライマー、４００〜８００μＭのｄＮＴＰ溶液、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む）、２．５ユニットのＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡｍｐｌｉＴａＱ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｅｘｐａｎｄ^TM Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）存在下でテンプレートとして用いた。

総混合物の９５℃での予備的な３分間のインキュベーション後、各サンプルを、２工程の増幅に供した：最初の５サイクルを、プライマー（Ｔ_m1）の制限酵素尾部を除外したハイブリダイゼーションテンプレートを用いて実施した。続いて、完全長オリゴ（Ｔ_m2）について算出したハイブリダイゼーション温度に従って３０サイクル行った。伸長時間は、６８℃または７２℃で実施し、増幅されるべきＯｒｆの長さに従って変化させた。Ｏｒｆ１の場合、この伸長時間を、３分間から開始し、各サイクルで１５秒増加させた。このサイクルを、７２℃での１０分間の伸長工程で完了させた。

増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲル上に直接ロードした。正確なサイズのこのバンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、製造業者のプロトコールに従って、ゲルから精製した。

この増幅されたフラグメントに対応する精製したＤＮＡを、ｐＥＴ−２１ｂ＋またはｐＥＴ２２ｂ＋中へクローニングするために、適切な制限酵素を用いて消化した。消化したフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて（製造業者の指示書に従って）精製し、Ｈ₂Ｏまたは１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）のどちらかで抽出した。プラスミドベクターを、適切な制限酵素を用いて消化し、１．０％のアガロースゲル上にロードし、そしてこの消化したベクターに対応するこのバンドを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。

既に消化して精製した各遺伝子に対応するフラグメントを、ｐＥＴ−２１ｂ＋またはｐＥＴ２２ｂ＋中に連結した。３：１のモル比のフラグメント／ベクターを、製造業者より供給されるライゲーション緩衝液中でＴ４ ＤＮＡリガーゼとともに用いた。

組換えプラスミドを、リガーゼ反応溶液および細菌を、氷上で４０分間、次いで、３７℃で３分間、インキュベートすることにより、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５またはＨＢ１０１中に形質転換した。続いて、８００μｌのＬＢブロスを添加し、そして３７℃で２０分間、インキュベートした。この細胞を、エッペンドルフ微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で最高速度で遠心分離し、約２００μｌの上清中に再懸濁し、そしてＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）アガロース上にプレートした。

組換えクローンについてのスクリーニングを、ランダムに選んだコロニーを、４．０ｍｌのＬＢブロスおよび１００μｇのアンピシリン中で３７℃で一晩増殖させることにより、実施した。細胞をペレット化し、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、製造業者の指示書に従って抽出した。約１μｇの各々のミニプレップを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして分子量マーカー（１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｌａｄｄｅｒ）、ＧＩＢＣＯ）と同時に、この消化物を１〜１．５％アガロースゲル（予測される挿入物のサイズに依存する）上にロードした。陽性のクローンを、挿入物のサイズに応じて選択した。

各遺伝子を発現ベクター中へクローニング後、組換えプラスミドを、組換えタンパク質の発現に適切なＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換した。１μｌの各構築物を用いて、上記のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３に形質転換した。単一の組換えコロニーを、２ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）中でインキュベートし、３７℃で一晩インキュベートし、次いで１００ｍｌのフラスコの中で２０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）に１：３０で希釈し、０．１と０．２の間のＯＤ₆₀₀を得た。このフラスコを、回転水浴振盪機（ｇｙｒａｔｏｒｙ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｓｈａｋｅｒ）で、ＯＤ₆₀₀が、発現の誘導に適切な指数増殖期を示す（０．４〜０．８ ＯＤ）まで、３０℃または３７℃でインキュベートした。タンパク質発現を、１．０ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。３０℃または３７℃での３時間のインキュベーション後、ＯＤ₆₀₀を測定し、そして発現を調べた。１．０ｍｌの各サンプルを、微量遠心管中で遠心分離し、このペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析した。

ＧＳＴ融合タンパク質を、発現させたが、これが、不溶性（すなわち、精製可能ではない）であるべきでないことを見出した。Ｈｉｓ融合物を、不溶性タンパク質として発現させた。

Ｈｉｓ−融合物として精製した各クローンについて、単一のコロニーを、画線し、そしてＬＢ／Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）アガロースプレート上で一晩３７℃で増殖させた。このプレートから単離したコロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）液体培地中に接種し、そして振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩の培養物を、１．０ＬのＬＢ／Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）液体培地中に１：３０で希釈し、そしてＯＤ₅₅₀が、０．６〜０．８に達するまで、最適な室温（３０℃または３７℃）で増殖させた。組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧ（最終濃度１．０ｍＭ）の添加により誘導し、そして、培養物をさらに３時間インキュベートした。細菌を、８０００ｇで４℃にて１５分間、遠心分離することにより収集した。この細菌ペレットを７．５ｍｌの緩衝液Ｂ（８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．８）中に再懸濁した。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を用いる、氷上で４回の４０Ｗにて３０秒間の超音波処理により破砕し、そして１３０００×ｇで４℃にて３０分間、遠心分離した。ペレットを、２．０ｍｌの緩衝液Ｃ（６Ｍの塩酸グアニジン、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、１０パス（ｐａｓｓｅｓ）のＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて処理した。ホモジネートを、１３０００×ｇで３０分間遠心分離し、そしてその上清を残した。上清を、１５０μｌのＮｉ²⁺樹脂（既に、緩衝液Ｂを用いて平衡化した）を用いて混合し、そして、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。この樹脂は、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であり、製造業者のプロトコールに従って調製した。パッチ式（ｂａｔｃｈ−ｗｉｓｅ）の調製物を、７００×ｇで４℃にて５分間、遠心分離し、そしてこの上清を廃棄した。この樹脂を、１０ｍｌの緩衝液Ｂを用いて１０分間、２回（パッチ式）洗浄し、１．０ｍｌの緩衝液Ｂ中に再懸濁し、そして使い捨てのカラムにロードした。この樹脂を、貫流液のＯＤ₂₈₀が、０．０２から０．０１に達するまで、室温で緩衝液Ｂを用いて洗浄し続けた。この樹脂を、貫流液のＯＤ₂₈₀が、０．０２から０．０１に達するまで、緩衝液Ｄ（８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６．３）を用いてさらに洗浄し続けた。Ｈｉｓ融合タンパク質を、７００μｌの抽出緩衝液Ｂ（８Ｍの尿素、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ４．５）の添加により溶出し、そして画分を、ＯＤ₂₈₀が全ての組換えタンパク質が得られたことを示すまで、収集した。各溶出画分の２０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧにより分析した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析を用いて推定した。

このタンパク質を再生するために、グリセロールを、上記で得た変性した画分に添加して、１０％ｖ／ｖの最終濃度を得た。このタンパク質を、透析緩衝液Ｉ（１０％ｖ／ｖのグリセロール、０．５Ｍのアルギニン、５０ｍＭのリン酸緩衝液、５．０ｍＭの還元型グルタチオン、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、２．０Ｍの尿素、ｐＨ８．８）を用いて２００μｇ／ｍｌまで希釈し、そして同じ緩衝液に対して４℃にて１２〜１４時間、透析した。さらに、透析を、緩衝液ＩＩ（１０％ｖ／ｖのグリセロール、０．５Ｍのアルギニン、５０ｍＭのリン酸緩衝液、５．０ｍＭの還元型グルタチオン、０．５ｍＭの酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）を用いて２００μｇ／ｍｌまで希釈し、そして同じ緩衝液に対して４℃にて１２〜１４時間、行った。タンパク質濃度を以下の式を用いて計算した：
Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ₂₈₀）−（０．７６×ＯＤ₂₆₀）
ＯＲＦ２１の免疫学的特徴付けについて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０日目、２１日目および３５日目に抗原で免疫し、そして４９日目に血清を分析した。

ＯＲＦ２１は、以下のＥＬＩＳＡアッセイにおいて陽性の結果を生じた：無莢膜のＭｅｎＢ Ｍ７株および莢膜のある株を、チョコレートアガープレート上にプレートし、そして５％ＣＯ_2を用いて３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して収集し、そして０．２５％グルコースを含有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ₆₂₀を追跡することによりモニターした。細菌をＯＤが０．４〜０．５の値に達するまで増殖させた。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、そして細菌をＰＢＳで１回洗浄し、０．０２５％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベートし、次いで４℃で一晩で攪拌しながらインキュベートした。１００μｌの細菌細胞を、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルに添加し、そして４℃で一晩でインキュベートした。次いでそのウェルをＰＢＴ洗浄緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。２００μｌの飽和緩衝液（２．７％のポリビニルピロリドン １０含有水）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ＮａＮ₃を含有するＰＢＳ）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ−結合体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を含有する希釈緩衝液を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＴ緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌのクエン酸緩衝液、ｐＨ５、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ₂Ｏ₂）を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを室温で２０分間放置した。１００μｌの１２．５％ Ｈ₂ＳＯ₄を各ウェルに添加し、そしてＯＤ₄₉₀を追跡した。得られたＯＤ₄₉₀値が免疫前血清のレベルを超える０．４である血清の希釈としてＥＬＩＳＡ力価を勝手に計算した。ＯＤ₄₉₀が１：４００よりも高い０．４の血清の希釈である場合、ＥＬＩＳＡが陽性であるとみなした。

ＯＲＦ２１の細胞内位置を評価するため、以下のＦＡＣＳアッセイを用いた：無莢膜ＭｅｎＢ Ｍ７株をチョコレートアガープレートにプレートし、そして５％ＣＯ₂を用いて、３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して回収し、そして各々０．２５％グルコースを含有する８ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）を含む４本のチューブに中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ₆₂₀を追跡することによりモニターした。細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の値に達するまで増殖させた。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、ペレットをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ、０．４％ ＮａＮ₃）中に再懸濁し、そして５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＯＤ₆₂₀が０．０５に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔｅｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１００μｌの希釈（１：１００、１：２００、１：４００）血清（ブロッキング緩衝液中）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを４℃で２時間インキュベートした。細胞を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を吸引し、そして各ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、細胞を洗浄した。１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合体化Ｆ（ａｂ）₂ヤギ抗マウス（１：１００希釈）を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間４℃でインキュベートした。細胞を、４０００ｒｐｍ５分間の遠心分離によってスピンダウン（遠心沈殿）し、そして２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、洗浄した。その上清を吸引し、そして細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．２５％のホルムアルデヒドに再懸濁した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎチューブに移して、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定（Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ １５ｍＷ）の条件は、以下のとおりである：ＦＬ２オン、ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；ＦＳＣ ＰＭＴ電圧：Ｅ ０１；ＳＳＣ ＰＭＴ：４７４；増幅利得 ６．１：ＦＬ−２ ＰＭＴ：５８６；補償値：０。

ＦＡＣＳと同様、細胞位置を評価するためにウエスタン分析を用いた：ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜小胞（５μｇ）、および総細胞抽出物（２５μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。この転写は、２時間、１５０ｍＡ、４℃で転写緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｓベース、１．４４％ グリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）を用いて行った。この膜を飽和緩衝液（１０％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００含有ＰＢＳ）中での４℃の一晩のインキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液（３％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００含有ＰＢＳ）を用いて２回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に１：２００に希釈したマウス血清とともに、２時間３７℃でインキュベートした。この膜を２回洗浄し、そして１：２０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇとともに９０分間インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて２回洗浄し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、発色させた。この反応を水を添加して停止した。

ＯＭＶを、以下のとおり調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を５ＧＣプレート上で５％ＣＯ₂を用いて３７℃で一晩増殖させ、ループを用いて回収し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。５６℃、４５分の熱不活化を行い、そして細菌を５分間氷上で超音波処理することにより破壊した（５０％負荷サイクル、５０％出力、Ｂｒａｎｓｏｎ 聴音器３ｍｍマイクロチップ）。未破壊細胞を５０００ｇ、１０分間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を含む上清をさらに５００００ｇ、４℃、一晩の遠心分離によって回収した。内部膜を可溶化するために、膜を含有するペレットを、２％サルコシル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、そして室温で２０分間インキュベートした。この懸濁液を、１００００ｇで１０分間遠心し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに５００００ｇで３時間、遠心分離した。外膜を含有するこのペレットを、ＰＢＳ中で洗浄し、そして同じ緩衝液中に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｄ．Ｃ．Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（改変ローリー法）によって、ＢＳＡを標準物として用いて測定した。

総細胞抽出物を以下のとおり調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６をＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃、３０分の熱不活化を行った。

ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよびウエスタンブロット分析は全て、ＯＲＦ２１が表面に露出されていることを示す。

ＯＲＦ２１は、以下の殺菌性アッセイを用いて良好な結果を得た：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、チョコレートアガープレート上で（凍結貯蔵から開始して）５％ＣＯ₂を用いて３７℃で一晩増殖させた。コロニーを回収し、そしてこれを用いて、７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（０．２５％グルコース含有）に接種し、ＯＤ₆₂₀が０．０５〜０．０８に到達させた。この培養物を、ＯＤ₆₂₀が０．２３〜０．２４に達するまで振盪しながら３７℃で約１．５時間インキュベートした。細菌を１０⁵ＣＦＵ／ｍｌの使用時希釈で、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、および０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２中で希釈した。最終反応混合物の総容積は、５０μｌであり、これは試験血清の２倍階段希釈の２５μｌ、使用時希釈での１２．５μｌの細菌、１２．５μｌの乳飲みウサギ補体（最終濃度２５％）を含んだ。コントロールは、補体血清とともにインキュベートした細菌、細菌とともにインキュベートした免疫血清、および５６℃３０分の加熱により不活化した補体とともにインキュベートした免疫血清を含んだ。乳飲みウサギ補体の添加直後、１０μｌのコントロールを傾斜法（ｔｉｌｔ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートした（０時点）。この９６ウェルプレートを、１時間３７℃で回転しながらインキュベートした。各サンプルの７μｌをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にスポットとしてプレートし、一方、１０μｌのコントロールを傾斜法を用いてプレートした（時間１）。アガープレートを３７℃で１８時間インキュベートし、そして０時点および１時点に対応するコロニーをカウントした。

（コンピューター分析）
図１は、コンピューター分析のデータと共にＯＲＦ２１の配列を示す。

ＯＲＦ２１は、次のようなＡＭＰＨＩ領域を有する［Ｇａｏら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９６）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ １２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら（１９９２）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｓｕｐｐｌ．１１：９］：配列番号１４〜３２。

抗原性指数のアルゴリズムは、次の領域を同定した：配列番号３３〜７０。

Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏｏｄｓ分析は、次の親水性領域を明らかにする：配列番号７１〜１０４。

配列番号１４〜１０４は、これらのオリゴペプチドとしてか、またはより長いポリペプチドの一部分として用いられ得る。

ＭｅｎＡ、ＭｅｎＢおよびｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ由来のＯＲＦ２１配列のアラインメントを図２に示す。

（ワクチン）
上記のように同定されたこれらのタンパク質を発現させ、そして免疫化のために使用する。良好な免疫応答が、このタンパク質に対して観察される。

（配合ワクチン）
さらに、このタンパク質を、他の病原性生物に対する抗原とそれぞれ配合し（例えば、血清群Ｃのｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓに対してカイロンポリサッカリドワクチン）、そして免疫化のために使用した。良好な免疫応答が観察された。

本発明は、実施例のみによって記載され、そして改変がなされ得るが、依然として本発明の範囲および意図内であることが理解される。
［配列表］

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。

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