JP5823446B2 - Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型ｂ外膜タンパク質を含む外膜小胞（ｏｍｖ）ワクチン - Google Patents

Description

本明細書中に引用する全ての文書は、本明細書中にその全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（ＮｍＢ）に対するワクチンに関する。

（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性双球菌ヒト病原体である。これは、咽頭にコロニー形成をし、髄膜炎（および、時折、髄膜炎のない敗血症）を引き起こす。米国において、発病率は１年間に１００、０００人あたり０．６〜１人の割合であり、そして大流行によりずっと大きくなり得る（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９６）ＪＡＭＡ ２７５（１９）：１４９９−１５０３；Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７（１４）：９７０−９７６）。発展途上国では、風土病の割合はずっと大きく、そして流行の間、発生率は１年間あたり１００、０００人あたり５００症例に達し得る。死亡率は極めて高く、米国では１０〜２０％、そして発展途上国においてはよりずっと高い。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する結合ワクチンの導入後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、米国において全ての年齢における細菌性髄膜炎の主な原因である（Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）前出）。

生物の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２血清型が同定されている。現在使用される髄膜炎ワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５によって構成される４価の多糖類ワクチンである。しかし、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａに対するワクチン接種の成功の後、血清型Ａおよび血清型Ｃに対する結合体ワクチンが開発されている。

しかし、血清型Ｂは問題を残したままである。この血清型は現在、米国、欧州および南アメリカにおける全髄膜炎のおおよそ５０％の原因である。この多糖類アプローチは使用できない。なぜなら、ｍｅｎＢ莢膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）結合Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。これは抗原に対する寛容を生ずる；実際、応答が惹起された場合、それは抗自己であり、それ故、所望されない。自己免疫の誘導を回避しそして防御免疫応答を誘導するために、この莢膜多糖類は、特異的抗原性は不変のまま、例えば、Ｎ−アセチル基をＮ−プロピオニル基と置換して化学的に改変される（ＲｏｍｅｒｏおよびＯｕｔｓｃｈｏｏｒｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７（４）：５５９−５７５）。

血清型Ｂに対する効果的な外膜小胞（ＯＭＶ）ワクチンは、ノルウェー国立公衆衛生機関によって生成された［例えば、Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ ３３８（８７７５）：１０９３−９６］。このワクチンは安全であり、そしてＮｍＢ疾患を防止するが、その効果は、ワクチンを作製するために用いた株に限られる。他の外膜調製物などに基づく他のワクチンもまた報告されている。これらのワクチンの効果を他の株に広げることが本発明の目的である。

（発明の開示）
驚くべきことに、ＯＭＶワクチンへの規定された成分のさらなる添加が、それらの効果を有意に拡大することが見出された。

従って本発明は、（ａ）ＮｍＢ外膜調製物、および（ｂ）以下の１つ以上から選択される免疫原性成分を含む組成物を提供する：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ００／６６７９１に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９-１８１５］に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・Ｐａｒｋｈｉｌｌら［Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：５０２−５０６］に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質ＰｏｒＡ、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＰｉｌＣ、ＯｐＡ、またはＯｍｐ８５。

この組成物が、ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／２４５７８に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

。

この組成物が、ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／３６５４４に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

。

この組成物が、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、に開示されるタンパク質（すなわち、その文献で開示される遺伝子の１つによってコードされるタンパク質）を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（またはこれらの２１６０個の遺伝子の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの２１６０個の遺伝子の１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、Ｐａｒｋｈｉｌｌら、に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、その文献で開示される２１２１個のコード配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（またはこれらの２１２１個の配列の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの２１２１個の配列の１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／５７２８０に開示される以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（または以下の配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）：

。

この組成物が、ＷＯ９９／２８２７３に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９７／２８２７３の図４または図１３に開示されるタンパク質である。

この組成物が、ＷＯ９９／２９４１２に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９６／２９４１２に開示される配列番号１〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（またはこれらの配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、ＷＯ９９／０３４１３に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９５／０３４１３に開示される配列番号１〜２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（またはこれらの配列番号の１つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか１つに対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／３１１３２に開示される配列番号２からなるアミノ酸配列を含む（または配列番号２の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２に対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／５８６８３に開示される配列番号２または配列番号４からなるアミノ酸配列を含む（もしくは配列番号２または配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、もしくは配列番号２または配列番号４に対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

この組成物が、ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、ＷＯ９９／５５８７３に開示される配列番号２または配列番号４からなるアミノ酸配列を含む（もしくは配列番号２または配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、もしくは配列番号２配列番号４に対する配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）。

ＯｐａおよびＰｏｒＡの詳細は、Ｗｉｅｒｔｚら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９６）６１：２９８−３０４］に見出され得る。ＰｉｌＣは、Ｎａｓｓｉｆら［ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９９４）９１：３７６９−７３］に開示されている。Ｏｍｐ８５は、Ｍａｎｎｉｎｇら［Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ（１９９８）２５：１１−２１］に開示されている。ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢは、Ａｌａ‘Ａｌｄｅｅｎ ＆ Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：４９−５３］に開示されており、Ｌｅｇｒａｉｎら［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ（１９９５）６：５７０−５７８］にもまた開示されている。

成分（ｂ）にとって好ましいタンパク質は以下のようなものである：
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０６９〜３０７４および３２０７〜３２４１に代表されるタンパク質「９１９」（その中の図２３および実施例１５もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号８６９〜８７４および３１４９〜３１７８に代表されるタンパク質「２３５」（その中の図２０および実施例１２もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０４５〜３０５６および３１８５〜３２０６に代表されるタンパク質「５１９」（その中の図２２および実施例１４もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号７９３〜８０４および３１１５〜３１４８に代表されるタンパク質「２２５」（その中の図１９および実施例１１もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／３６５４４の実施例１（配列番号１〜６）に代表されるタンパク質「ＯＲＦ４０」（ＷＯ００／６６７４１の図１もまた参照のこと；ＷＯ９９／３１１３２およびＷＯ９９／５８６８３もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／５７２８０の実施例９に代表されるタンパク質「２８７」（その中の配列番号１１９９〜１２０４、３１０３〜３１０８、および３１７９〜３１８４を参照のこと）；
・ＷＯ９９／２４５７８の実施例７７（配列番号６４７〜６５４）に代表されるタンパク質「ＯＲＦ１」（ＷＯ９９／５５８７３および登録番号ＡＪ２４２５３５もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／２４５７８の実施例２６（配列番号２１５〜２２６）に代表されるタンパク質「ＯＲＦ４」（ＷＯ００／６６７４１の図２もまた参照のこと）；
・ＷＯ９９／２４５７８の実施例５５（配列番号４５７〜４６６）に代表されるタンパク質「ＯＲＦ４６」（ＷＯ００／６６７４１の図１２もまた参照のこと）。

この組成物の成分（ｂ）は、好ましくはＮｍＢタンパク質である。成分（ｂ）が、成分（ａ）のＯＭＶが由来するＮｍＢ株とは異なる株由来のタンパク質を含むことが好ましい（すなわち、成分（ａ）におけるＯＭＶが、好ましくは異なるＮｍＢ株由来の免疫原性成分（ｂ）により補充される）。

この成分の１つ以上（またはそれらの全て）が、Ａｌ（ＯＨ）_３に吸着され得る。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１） （ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ外膜調製物、および（ｂ）以下の１つ以上から選択される免疫原性成分を含む、組成物：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ００／６６７９１に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９-１８１５］に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質ＰｏｒＡ、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＰｉｌＣ、ＯｐＡ、Ｏｍｐ８５。
（項目２） 項目１に記載の組成物であって、前記成分（ｂ）がＮｍＢタンパク質である、組成物。
（項目３） 項目２に記載の組成物であって、前記ＮｍＢタンパク質が、タンパク質９１９、タンパク質２３５、タンパク質５１９、タンパク質２２５、タンパク質ＯＲＦ４０、タンパク質２８７、ＯＲＦ１、ＯＲＦ４、またはＯＲＦ４６である、組成物。
（項目４） 項目１〜３のいずれかに記載の組成物であって、前記成分（ｂ）が、前記成分（ａ）が由来するＮｍＢ株とは異なる株に由来するタンパク質を含む、組成物。
（項目５） 項目１〜４のいずれかに記載の組成物であって、前記成分の１つ以上がＡｌ（ＯＨ）_３に吸着される、組成物。
（項目６） 項目１〜５のいずれかに記載の組成物であって、前記成分（ａ）がＯＭＶを含む、組成物。
（項目７） 項目６に記載の組成物であって、前記ＯＭＶが、ＮｍＢ由来のデオキシコレート抽出物である、組成物。
（項目８） 項目１〜７のいずれかに記載の組成物であって、前記成分（ａ）がＡｌ（ＯＨ）_３に吸着される、組成物。
（項目９） 項目１〜８のいずれかに記載の組成物であって、該組成物が、以下の成分の１つ以上をさらに含む、組成物：
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｙに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｗに対する防御抗原；
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する防御抗原；
・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する防御抗原；
・ジフテリアに対する防御抗原；
・破傷風に対する防御抗原；
・百日咳に対する防御抗原；
・Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
・ポリオに対する防御抗原；および／または
・Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。
（項目１０） 前記組成物がワクチンである、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１） 医薬品として使用されるための、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２） 以下の（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）の製造における項目１〜１１のいずれかに記載の組成物の使用。（ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に起因する感染を処置または防止するための医薬品；（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌の存在またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；（ｉｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。
（項目１３） 患者の処置方法であって、項目１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１４） 以下の１つ以上から選択される免疫原性成分を含む、細菌外膜調製物：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ００／６６７９１に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９-１８１５］に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；ならびに／あるいは
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質ＰｏｒＡ、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＰｉｌＣ、ＯｐＡ、Ｏｍｐ８５。

（外膜調製物の成分）
本発明の組成物は、ＮｍＢ外膜調製物（成分（ａ））を含む。これは、膜小胞（ＯＭＶ）の形態が好ましい。

ＮｍＢ由来のＯＭＶの調製物は、当該分野で周知である。適切な調製物を獲得するための方法は、例えば以下に開示されている：Ｃｌａａｓｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００１−１００８］；Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：２６１２−２６１９］；Ｐｅｅｔｅｒｓら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００９−１０１５］；Ｆｕら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＮＹ（１９９５）１２：１７０−７４］；Ｄａｖｉｓら［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９０）１３４：２１５−２２５］；Ｓａｕｎｄｅｒｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：１１３−１１９］；Ｄｒａａｂｉｃｋら［Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８：１６０−１７２］；Ｍｏｒｅｎｏら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８５）４７：５２７−５３３］；Ｍｉｌａｇｒｅｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９４）６２：４４１９−４４２４］Ｎａｅｓｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：９５９−９６５］；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら［Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓａｎｄ．（１９９８）９２：３２３−３３３］；Ｈａｎｅｂｅｒｇら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：１３３４−４１］；Ａｎｄｅｒｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５：１２２５−３４］；Ｂｊｕｎｅら［Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３８：１０９３−９６］など）。

ＯＭＶは、好ましくはＮｍＢからのデオキシコレート抽出物である（すなわち、ＮｍＢからデオキシコレート抽出によって獲得される）。好ましい抽出プロトコルは、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら［Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＭｅｎＢ−ｖａｃｃｉｎｅ“Ｆｏｌｋｅｈｅｌｓａ”：ａｎ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ（１９９１） ＮＩＰＨ Ａｎｎ．１４（２）：６７−８０］に記載されるプロトコルである。

ＯＭＶを抽出するための好ましい株は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの４４／７６株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｐ５．５：Ｌ３，７，９）である。

ＯＭＶ成分のさらなる詳細は、例えば、Ｂｊｕｎｅら［Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３８（８７７５）：１０９３−９６］、またはＦｒｅｄｒｉｋｓｅｎら［Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ＭｅｎＢ−ｖａｃｃｉｎｅ ‘Ｆｏｌｋｅｈｅｌｓａ’，ａｎ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅの８１８−８２４頁（Ｃｏｎｄｅ−Ｇｌｅｚら編）ＩＳＢＮ９６８−６５０２−１３−０］に見出される。

ＯＭＶ成分は、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着され得る。好ましいタンパク質：アジュバントの比は、１：６７（ｗｔ／ｗｔ）である。

ヒトに対するワクチンの代表的な用量は、２５μｇのタンパク質、２μｇのＬＰＳ、および１．６７ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３を含み、そして０．５ｍｌの容量で三角筋に注射され得る。

ＯＭＶ成分（例えば、デオキシコレート抽出によって獲得される成分）は、特定の成分を除去するために処理され得る。例えば、発熱物質または毒素成分が除去され得る（例えば、ＬＰＳ）。

ＯＭＶ成分は、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｅｎら［Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅの８１８−８２４頁］に記載される８０ｋＤａの抗原性成分を保持することが好ましい。

より好ましくは、ＯＭＶ成分は、以下のアミノ酸配列の１つ以上を含むタンパク質：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３［もしくは（ｉ）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３と同一性の配列を有するタンパク質−特定の配列番号に基づき、配列同一性の程度は、好ましくは５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）（変異体および対立遺伝子改変体が挙げられる）、もしくは（ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３の免疫原性フラグメントを含むタンパク質−このフラグメントは、この配列由来の少なくともｎ個の保存性アミノ酸を含み、そして特定の配列に基づき、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上］を保持することが好ましい。

（成分（ａ）と（ｂ）の配合）
成分（ａ）と（ｂ）は、単純に成分（ａ）と外膜調製物を混合することにより（例えば、ＯＲＦ４とノルウェーＯＭＶを混合することにより）配合され得る。

あるいは、それらは、外膜中で成分（ａ）を生成（好ましくは、過剰生成）するよう細菌を操作することにより配合され得る−このような組み換え細菌由来の外膜調製物は、成分（ａ）と（ｂ）の両方を含む。

この方法における操作のために適切な細菌として、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（任意の血清型または株）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａまたは任意の他の非典型的なＮｅｉｓｓｅｒｉａが挙げられる。他のグラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒなど）もまた、用いられ得る。形質転換方法は、当該分野で周知である。

（多価ワクチン）
必要に応じて、本発明の組成物はまた、以下の成分の１つ以上を含み得る：
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｙに対する防御抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｗに対する防御抗原；
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する防御抗原；
・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する防御抗原；
・ジフテリアに対する防御抗原；
・破傷風に対する防御抗原；
・百日咳に対する防御抗原；
・Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
・ポリオに対する防御抗原；および／または
・Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。

これらの任意の成分の好ましい例は、以下のようなものである：
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａに対する多糖類抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃに対する多糖類抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１-６９８）；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｙに対する多糖類抗原；
・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｗに対する多糖類抗原；
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する多糖類抗原；
・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する多糖類抗原；
・ジフテリアトキソイド（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、Ｄｅｌ Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１-７０］）からなる、ジフテリアに対する防御抗原；
・破傷風トキソイド［例えば、ＷａｓｓｉｌａｋおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｖａｃｃｉｎｅｓの第４章（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編）、１９８８］からなる、破傷風に対する防御抗原；
・百日咳ホロトキシン（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および糸状血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＦＨＡ）を含む；必要に応じてパータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）および／または凝集原２および３［例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９-３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ９：２３２-２３８］をさらに含む、百日咳に対する防御抗原；
・ＣａｇＡ（例えば、ＷＯ９３／１８１５０）、ＶａｃＡ（例えば、ＷＯ９３／１９１５０）、ＮＡＰ（例えば、ＷＯ９９／５３３１０）、ＨｏｐＸ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）、ＨｏｐＹ（例えば、ＷＯ９８／０４７０２）、ウレアーゼの１つ以上を含む、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
・ＨＢＶ表面抗原および／またはＨＢＶコア抗原からなる、Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。

組成物が、ジフテリアに対する抗原を含む場合、破傷風およびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、破傷風に対する抗原を含む場合、ジフテリアおよびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、ポリオに対する抗原を含む場合、ジフテリアおよび破傷風に対する抗原を含むこともまた好ましい。

百日咳トキシンは、毒性タンパク質であり、そして組成物中に存在する場合、好ましくは、解毒される。解毒は、化学的手段および／または遺伝子的手段によるものであり得る。好ましい解毒化変異体は、９Ｋ／１２９Ｇ二重変異体（ｄｏｕｂｌｅ ｍｕｔａｎｔ）［例えば、Ｒａｐｐｕｏｌｉ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：３７４-３７６］である。

組成物が、異なる新生形態および成熟形態で存在するタンパク質を含む場合、このタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。例えば、ＮｓｐＡ［ＷＯ９６／２９４１２；Ｍａｒｔｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８５ １１７３-１１８３もまた参照のこと］が含まれる場合、シグナルペプチドを欠くこのタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。

組成物が、多糖類抗原を含む場合、この多糖類は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合体化される。

（治療、予防、診断）
本発明の組成物は、好ましくはワクチンである。本発明に基づくワクチンは、予防的（すなわち感染を防止する）であるか、または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置する）であるかのいずれかであり得る。

本発明はまた、医薬として（好ましくはワクチンとして）または診断試薬として使用するための、本発明の組成物を提供する。本発明はまた、以下の製造における、本発明の組成物の使用を提供する：（ｉ）ナイセリア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬；（ｉｉ）ナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬；および／または（ｉｉｉ）ナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は任意の種または菌株であり得る（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が、好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（特に、血清型Ｂ（ＮｍＢ））であり得る。

本発明はまた、治療的有効量の、本発明に従う組成物を患者に投与する工程を含む、患者の処置の方法を提供する。この方法は好ましくは免疫である。

（プロセス）
さらなる局面によれば、本発明は、種々のプロセスを提供する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＯＭＶの抽出工程（例えば、デオキシコレート抽出）を含む、本発明の組成物を生成するためのプロセスが提供される。

（配列表）
この配列表における配列は以下のようなものである。

（発明を実施するための形態）
本発明を実行するために用いられ得る標準的な技術および手順（例えば、ワクチン接種目的または診断目的のために、開示された配列を利用するための）の要旨は以下の通りである。この要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ使用され得るが必ずしもそうではない例を与えるものである。

（総論）
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ｉｉ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）、特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編 １９８６）。

ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略号が、本明細書において使用される。

本発明に用いられるタンパク質は、種々の手段（例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によって、そして種々の形態（例えば、ネイティブ、融合など）で調製され得る。それらは好ましくは、実質的な純粋形態（すなわち、実質的に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質または宿主細胞タンパク質を含まない）で調製される。

本発明に用いられる核酸は、種々の方法（例えば、化学合成によって、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むアナログ）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含む。

（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中のＸ＋Ｙの合計のうちの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中のＸ＋Ｙの合計のうちの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％を、または９９重量％さえも構成する。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに何かを付加したものも含み得る。

用語「異種」とは、天然では一緒には見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では一緒には見られないが、例えば、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときは、それらは一緒に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられた、同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。

「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要とされ得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。

タンパク質間の同一性は、好ましくはＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１のパラメータでのアファインギャップサーチを用いて実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムによって決定される。代表的に２つのタンパク質間の５０％以上の同一性が、機能的等価の指標と考えられる。

本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列が提供される核酸分子（または領域）の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは第２の単離体のゲノム中の本質的に同じ遺伝子座で生じ、かつ、例えば、変異または組換えにより生ずる天然のバリエーションに起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子（または領域）である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５、７５３、２３５号を参照のこと）。

（発現系）
ナイセリアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母について使用される発現系において発現され得る。

（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し得、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにその正しい部位においてＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれの方向にも作用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ．」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。

哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主域を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得る。

上記のプロモーターエレメントと組み合わされたエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結されたとき、転写を１００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で始まる。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流もしくは下流に、またはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿主域を有するため、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガロウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。

ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸は常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。

あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得るプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス３部構成リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。

通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら、（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を導き、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライス供与部位およびスプライス受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳動物レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用に哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用に原核生物の宿主内で、そのレプリコンが維持されることが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。

使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。

発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、新生仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。

（ｉｉ バキュロウイルス系）
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を含む転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。

転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでこのベクターとウイルスゲノムとを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。

タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター、リーダー（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間置換（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは調節エレメントの同じセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間置換構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。

現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。

そのプラスミドはまた通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、ならびに大腸菌においての選択および増殖のための複製起点を含む。

バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは存在する場合は、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は調節されるか、または構成的であるかのいずれかであり得る。

ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら、（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質または分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子（例えば、バキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ、７３：４０９））から誘導され得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されると思われるために、ヒトα−インターフェロン（Ｍａｅｄａら、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら、（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のリーダーのような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。

組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、または適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。

あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内へのトランスロケーションを指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードしている。

タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内へであり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子内に設計された制限酵素部位内へであり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化した場合、このＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列が５’および３’の両側に隣接しており、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。

新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％と約５％との間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定する方法が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別し得る視覚的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後の時期に、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染した細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスとを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。

組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら、（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。

細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、上記ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。

改変した昆虫細胞をさらに、適切な栄養培地で増殖させる。この培地は、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給しながら、栄養培地を連続的に循環させる必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切な場合、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中にまた分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じたあらゆる昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。

タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。

（ｉｉｉ 植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５、６９３、５０６号；米国特許第５、６５９、１２２号；および米国特許第５、６０８、１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら、Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモンジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｌｃｏｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編 １９８４ Ｐｉｔｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、２１−５２頁の中に見出され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献：Ｓｈｅｅｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。

代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で作動するように設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主域の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移入のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ、１１（２）：１６５−１８５に見られる。

植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にするＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他のＤＮＡ配列はまた、当該分野で公知であるように、そのベクターの中に存在し得る。

本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物の５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうかに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。

異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得るあらゆる配列を欠いている。たいてい、転写開始領域は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子についてのものであるから、トランスロケーションを与えるシグナルペプチドを使用することにより、また、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。このようにして、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過して、種子の胚乳内へと至る。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌されることは必要とされないが、このことは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。

所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのような、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構よりプロセシングされて除去される配列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコードとして遺伝的メッセージの一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１：９５−１０５（１９８５）。

ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７、７０−７３、１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ、１９９１、Ｐｌａｎｔａ、１８５：３３０−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の物体（ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の易融な脂肪表面体のいずれか）とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、１８５９−１８６３、１９８２）。

ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４、１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレートされる。高電界強度での電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、***し、植物カルスを形成する。

プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、移入した遺伝子を含む完全な植物が回収される。実際に、全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹および他の樹木、マメ科植物および野菜という全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞または組織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる：Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、およびＤａｔｕｒａ。

再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することもまた、特にコーンおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発達する。効率的な再生は培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これらの３つの変動要因が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。

いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または他の植物組織は、機械的に破壊されて細胞間および組織間のあらゆる分泌タンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁されて、可溶タンパク質が回収され得る。次いで、従来のタンパク質単離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量というパラメーターは、異種タンパク質の発現および回収を最適化するために慣用的な方法により調整される。

（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これは、ＲＮＡ合成が開始する、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質がこのオペレーターに結合し、それによって、特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、この配列は、通常、存在する場合には、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって、転写を増強するかまたは低下し得る。

代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４、７３８、９２１号；ＥＰＯ公開番号０３６ ７７６および１２１ ７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４、６８９、４０６号）プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。

さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する（米国特許第４、５５１、４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列、およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌プロモーターには、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合しそして転写を開始させる能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼが結合され、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現をもたらし得る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開番号２６７ ８５１）。

機能性プロモーター配列に加え、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そしてこれは、開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成により、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには、ＳＤ配列と真核生物遺伝子のＡＴＧとの間の距離を最適化することが、しばしば、必要とされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。

ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、そのＤＮＡ分子と直接的に連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これは、ＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、あるいは細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボインキュベーションまたはインビトロインキュベーションのいずれかによって、タンパク質から切断され得る（ＥＰＯ公開番号２１９ ２３７）。

融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内在性の細菌タンパク質あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列を、異種コード配列の５’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、その２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され得、そして細菌において発現され得る。この生じた融合タンパク質は、好ましくは、このバクテリオファージタンパク質をこの外来遺伝子から切断するためのプロセシング酵素（Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰＯ公開番号３２４ ６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。この２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８）。

あるいは、外来タンパク質はまた、細菌において外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４、３３６、３３６号）。このシグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）またはペリプラズム空間（細胞の内膜と外膜との間に位置する）（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、プロセシング部位が存在する。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰＯ公開番号２４４ ０４２）。

通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指向し、このｍＲＮＡが、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列は、頻繁には、ステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含み、この構造が、転写の終結を補助する。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。

通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）が、発現構築物へと組み立てられる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば、細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは、複製系を有し、従って、これが、このレプリコンを、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００、そして通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、そしてより好ましくは、少なくとも約２０個のプラスミドを含む。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌ゲノム内に組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、このベクターにおける相同なＤＮＡと細菌染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡで構築した組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（欧州特許公開番号１２７ ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。

通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、この細菌宿主において発現され得、そしてこれらには、薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリン）に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれ得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。

あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるかまたは組み込みベクターへと展開されるかのいずれかの、選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。

発現ベクターまたは形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも）は、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６ ２５９および欧州特許公開番号０６３ ９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許公開番号０３６ ７７６、欧州特許公開番号１３６ ８２９および欧州特許公開番号１３６ ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４、７４５、０５６）。

外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ_２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと：［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６ ２５９および欧州特許公開番号０６３ ９５３；ＷＯ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ Ｃｏ１Ｅ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの使用］、［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］。

（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し得そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。このＵＡＳは、調節された（誘導性）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それによって、転写を増強または減少させ得る。

酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許公開番号２８４ ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許公開番号３２９ ２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。

さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列（米国特許第４、８７６、１９７号および同第４、８８０、７３４号）が挙げられる。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＧＡＰまたはＰｙＫのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる（欧州特許公開番号１６４ ５５６）。さらに、酵母プロモーターには、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合しそして転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。

ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、この組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これが、ＡＴＧ開始コドンによってコードされている。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、このタンパク質から切断され得る。

融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系においての、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列を、異種コード配列の５’末端に融合する。発現に際して、この構築物は、この２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子を、外来遺伝子の５’末端に連結し、そして酵母において発現させ得る。この２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、欧州特許公開番号１９６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。

あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質の遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号０１２ ８７３；日本国公開公報６２、０９６、０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許４、５８８、６８４））由来であり得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（欧州特許公開番号０６０ ０５７）。

好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。使用され得るこの型のα因子フラグメントは、完全長のプレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許４、５４６、０８３および４、８７０、００８；欧州特許公開番号３２４ ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては、第１の酵母のプレ配列および第２の酵母α因子からのプロ領域を用いて作製される、ハイブリッドα因子リーダーが挙げられる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。

通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指向し、このｍＲＮＡが、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。

通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコード配列および転写終結配列を含む）を、発現構築物に組み立てる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいて維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、これが、例えば、発現のために酵母中で維持され、そしてクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中で維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００、そして通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、そしてより好ましくは、少なくとも約２０個を有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。

あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するための適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、これが、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与える（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメントとして存在し得るか（これは、ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメントとして存在し得る（これは、発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）。

通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、その形質転換された酵母株の選択を可能にする、選択マーカーを含み得る。選択マーカーとしては、、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７）ならびにＧ４１８耐性遺伝子が含まれ得、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）。

あるいは、上記成分のうちのいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるかまたは組み込みベクターに展開される、選択マーカーから構成される。

発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する発現ベクターおよび方法は、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４、８３７、１４８号および同第４、９２９、５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。

外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの形質転換またはアルカリ陽イオンで処理したインタクトな酵母細胞の形質転換が含まれる。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４、８３７、１４８号および同第４、９２９、５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。

（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これが、抗体と抗原の結合を可能にする。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。

本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａのタンパク質の識別／同定に有用である。

本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来の方法によって調製され得る。一般に、このタンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理的食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下、または筋肉内に）注射することによって、行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理的食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いて）中のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１、０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、採血１回につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、（非特異的付着細胞の回収後）タンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへ細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落とされない。得られるＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されたＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。

所望の場合、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に^３２Ｐおよび^１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青い色素へ変換するその能力（分光光度計を用いて定量可能）によって、検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド結合体を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、^１２５Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして^１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の並べ替えおよび可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で等価であると考えられる。

（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。

本明細書において使用される場合、用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。

本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。

薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく、ゆっくり代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。

薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて入手可能である。

治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。

（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。

その組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔、静脈内、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間隙空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。

（ワクチン）
ワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリアは、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生をそれ自体は誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来の毒素）と結合体化され得る。

この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニウム塩（「ミョウバン」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を含むか含まない）を含むが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてμ未満の粒子へと処方された、ＭＦ５９^ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の第１０章）；（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有する、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激剤として作用する他の物質を含むが、それらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９^ＴＭが好ましい。

上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを含むが、それらに限定されない。

免疫原性組成物（例えば、免疫抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、このようなビヒクルにおいて存在し得る。

代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、個体へのその量の投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、医療的状況の処置する医師の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲にあり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。

免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）に投与される（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンが使用され得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６１７−６４８；本明細書以下を参照のこと）。

（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは外因性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。

本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８−１５３を参照のこと。

レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。

レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。

これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによる、宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。

上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。

レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、エーベルソン（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、グラフィー、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、カーステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）肉腫ウイルス、ならびにラッシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。

本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、同第４，９８０，２８９号、同第４，７７７，１２７号、同第５，５９１，６２４号に記載されるものが挙げられる。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １もまた参照のこと。

ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものが挙げられる。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａの米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅの米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎのＷＯ９４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、および同第５，２５２，４７９号に記載される。

本発明の配列を含む遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターとしては、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ ７１３４、２ＲＨ １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ ＶＲ−２６０として寄託されたものが挙げられる。

本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）および米国特許第５，０９１，３０９号、同第５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルスは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたαウイルスベクターを使用する（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照のこと）。

ＤＮＡベクター系（例えば、真核生物層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現に有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。

本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、以下に由来するものが挙げられる：ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ １：１１５に記載されるもの）；リノウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌ４０１に記載されるもの）；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの）；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ Ｍｅｄ ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）；ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）；チクングニヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）；ムカン（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）；ヌヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）；ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）；トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｙ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）；ユナ（Ｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）；ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）；オニョンニョンウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）；西部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２１：１９０に記載のもの。

本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したポリカチオン性縮合ＤＮＡかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１５８１−１５８５に記載される。

粒子媒介遺伝子移入が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。

裸のＤＮＡもまた、宿主細胞を形質転換するために使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。

遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手動の遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）が挙げられる。

例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７６：４２０に記載されるものである。

ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクル（この用語は上記に定義されるとおりである）を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。

（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接）；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。

この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）もしくは経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、静脈内、または筋肉内の注射によって、あるいは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、腫瘍または病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと。

エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。

一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。

（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。

（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られる熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。

（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。

（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥ−デキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。

脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るかまたは核酸を捕捉および維持し得る、リポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。

本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）調製物、アニオン性（負に荷電した）調製物および中性調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。

カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１、２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。

同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡ出発物質およびＤＯＴＡＰ出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。

このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）、または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を参照のこと。

（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドと共に含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、カイロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。

天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。

１つのリポタンパク質は、１つより多くのアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するカイロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥから構成され、時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。

これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；およびＵｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５：２３２に記載されている。

リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、カイロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するように選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。

天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロ方法によってかまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現により組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６５にて見い出され得る。

（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを含む組成物中に、リポタンパク質を伴ってかまたはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。

ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ適用、エキソビボ適用、およびインビボ適用のいずれも有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。

以下は、ポリカチオン性薬剤として有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例としては、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）が挙げられる。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。

有機ポリカチオン性薬剤としては、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）が挙げられる。

ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から推定されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。

有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンが挙げられる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ^ＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。

（免疫診断アッセイ）
本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭｅｎＢ抗原またはその抗原性フラグメントは、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る）。十分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭｅｎＢタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイは公知である；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。

免疫診断に適切であり、かつ適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびにアッセイの説明書の適切なセットと共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。

（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いに対する会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子としては以下が挙げられる：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。

「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。

例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については１０^−９〜１０^−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０^８ｃｐｍ／μｇを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０^８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる。

いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、ハイブリダイズする配列の長さおよび全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ_１０Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、そして塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。

ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。

一般的に、５０％ホルムアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。

（髄膜炎菌の（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）８０〜８５ｋＤａのタンパク質の同定）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の種々の外膜の小胞調製物は、約８０〜８５ｋＤａの成分を含んでいたことが観察された。このタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから精製し、そしてＮ末端を配列決定した（配列番号１）。

抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製した５０より多くの様々な血清型および血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株における等価のタンパク質と交差反応したタンパク質に対して惹起させた。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉａ、およびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａとの交差反応もまた、観察した。ワクチン接種された患者由来の免疫後血清もまた、このタンパク質と反応した。

完全な遺伝子を、血清型ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（配列番号２）からクローン化し、そしてコードされたタンパク質を、推定した（配列番号３）。上記のＮ末端の配列決定との比較により、シグナルペプチド（配列番号４）および成熟配列（配列番号５）を推定する。

（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型ＡおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおける対応する遺伝子の同定）
血清型ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ配列に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型ＡおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の対応する遺伝子をクローン化し、そして配列決定した（「ＯＲＦ」と称される）。

血清型ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の完全な遺伝子を、配列番号６に示し、このコードされたタンパク質を配列番号７に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号８および配列番号９である。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の完全な遺伝子を、配列番号１０に示し、このコードされたタンパク質を配列番号１１に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号１２および配列番号１３である。

（配列比較）
これらのタンパク質の配列を比較した。これらの配列は、高度に相同である。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂの配列およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの配列は、７９７ａａの重複において、９５．４％の同一性を示す：

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａの配列およびＢの配列は、７９７ａａの重複において、９９．９％の同一性を示す：

この高度な保存は、単一のタンパク質が、種々のＮｅｓｓｅｒｉａｅ種に対する免疫応答を誘導し得ることを、示唆する。

（ワクチン）
上記のように同定されたこれらのタンパク質を発現させ、そして免疫化のために使用する。良好な免疫応答が、このタンパク質に対して観察される。

（配合ワクチン）
さらに、このタンパク質を、他の病原性生物に対する抗原とそれぞれ配合し（例えば、血清型Ｃのｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓに対してカイロンポリサッカリドワクチン）、そして免疫化のために使用した。良好な免疫応答が観察された。

（さらなるＮｍＢ成分）
ノルウェーＯＭＶワクチン（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ ＯＭＶ ｖａｃｃｉｎｅ）によって誘導される防御は、効果的であるが、そのワクチンを作製するために用いられた株に限定される。このワクチンについての臨床試験は、１０代のヒトにおいて２９月後では５７．２％の有効性を獲得したのみであったが、ＩｇＧ応答は、ほぼ１００％の患者で観察された［例えば、Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４６４２−４６５２］。

驚くべきことに、ノルウェーＯＭＶワクチンへの、さらなる規定された成分の添加が、その効果を有意に拡大することが見出された。

ノルウェーワクチンは、ＮｍＢ株２９９６に対する防御を誘導しない。２９９６株由来の規定されたタンパク質をノルウェーワクチンに添加し、そしてそのワクチンの効果が、驚くべき程度まで増大されたことを示した。さらに、ＮｍＣ多糖類結合抗原［例えば、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ １０：６９１−６９８］の添加は、非常に有意な結果を与えた。

この配合物の殺菌活性を、以下の表に示す：

２９９６株（グループ１）に対するノルウェーＯＭＶワクチンの無効性が、２９９６株由来の規定された抗原を添加することによって克服され得ることは、容易に判断され得る。ＮｍＢタンパク質「２８７」を用いた結果は、特に有効であった。従って、ノルウェーワクチンは、多数の異なる株由来のＯＭＶを調製することを必要とせずに改善され得る。

このワクチンはまた、異種ＭｅｎＢ株に対する防御もまた提供し得る。２９９６株タンパク質を用いて調製された同じワクチンを、５つの他の株に対して試験した。力価は、以下の通りであった。

第２の研究は、「ノルウェー」ＯＭＶに、以下のＮｍＢ株２９９６由来のタンパク質を補充した：
−任意の融合パートナーなしにＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた、タンパク質９１９
−Ｈｉｓタグ融合体としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた、ＯＲＦ１
−ＧＳＴ融合体としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた、タンパク質２８７
−これら３つのタンパク質の混合物（必要に応じてＮｍＣ結合体を有する）。

調製物を、Ａｌ（ＯＨ）_３をと共にアジュバント化し、そして殺菌アッセイを用いて、同種株に対して試験した。結果は、以下の通りであった。

（抗原２８７を用いたさらなる研究）
ノルウェーＯＭＶと抗原２８７との配合物を、さらに調査した。２０μｇの抗原２８７をノルウェーＯＭＰワクチン（１５μｇ ＯＭＰ＋Ａｌ（ＯＨ）_３）と配合し、そしてマウスを免疫するために用いた。抗体を殺菌アッセイにおいて試験した。そして、この抗体は、試験された全ての株に対して有効であった。この結果は、以下の通りであった。

従って、ほぼ全ての場合において、ＯＭＶ＋タンパク質２８７の配合物は、驚くべきことにＯＭＶ単独の結果よりも良好な結果を与えた。

（組み換えＯＭＶ）
Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＯＲＦ１、ＯＲＦ４０、およびＯＲＦ４６を発現させた。組み換えＥ．ｃｏｌｉから調製されたＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する殺菌性抗体を誘導し得た。

ＯＲＦ１、ＯＲＦ４０、およびＯＲＦ４６（２９９６株）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＨｉｓタグ融合体として発現させ、そして純粋なタンパク質、またはＯＭＶの形態のいずれかで調製した。両方の調製物に対する殺菌性力価を、２９９６株をチャレンジに用いて試験した。

異種チャレンジ株を用いる殺菌性力価もまた測定した。ＯＲＦ４６は、純粋形態で４０９６のＭＣ５８株に対する力価を与えるが、ＯＭＶ形態の場合、この力価は、３２０００に上昇する。ＯＲＦ１は、純粋形態で１２８のＮｍＡ株Ｆ６１２４に対する力価を与えるが、ＯＭＶ形態の場合、この力価は、５１２に上昇する。ＯＲＦ４０は、純粋形態で５１２のＭＣ５８株に対する力価を与えるが、ＯＭＶ形態の場合、２倍になる。

これらのデータは、ＮｍＢ抗原が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＯＭＶとして調製される場合、免疫原性を保持することを示し、そしてさらに、この免疫原性は、実際に増強され得る。

本出願は、例示のみの目的によって本発明を記載し、そして本発明の範囲および精神の中に維持される限り、改変がなされ得ることが理解される。

Claims (12)

1. （ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ外膜調製物と、（ｂ）免疫原性成分とを含む、組成物であって、該成分（ｂ）が、（ｉ）ＷＯ９９／５７２８０に開示される配列番号１２０２
   

   

   のアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）該配列番号１２０２に対して９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、組成物。
2. 請求項１に記載の組成物であって、前記成分（ｂ）がＮｍＢタンパク質である、組成物。
3. 請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記成分（ｂ）が、前記成分（ａ）が由来する株とは異なるＮｍＢ株に由来するタンパク質を含む、組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物であって、前記成分の１つ以上がＡｌ（ＯＨ）_３に吸着される、組成物。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記成分（ａ）がＯＭＶを含む、組成物。
6. 請求項５に記載の組成物であって、前記ＯＭＶが、ＮｍＢ由来のデオキシコレート抽出物である、組成物。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物であって、前記成分（ａ）がＡｌ（ＯＨ）_３に吸着される、組成物。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物が、以下の成分の１つ以上をさらに含む、組成物：
   ・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａに対する防御抗原；
   ・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃに対する防御抗原；
   ・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｙに対する防御抗原；
   ・Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｗに対する防御抗原；
   ・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する防御抗原；
   ・ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに対する防御抗原；
   ・ジフテリアに対する防御抗原；
   ・破傷風に対する防御抗原；
   ・百日咳に対する防御抗原；
   ・Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する防御抗原；
   ・ポリオに対する防御抗原；および／または
   ・Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御抗原。
9. 前記組成物がワクチンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 医薬品として使用されるための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. （ｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に起因する感染の処置または防止；（ｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌の存在またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対して惹起された抗体の存在の検出；および（ｉｉｉ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に対する抗体の惹起からなる群より選択される目的のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 患者の処置のための組成物であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の治療有効量を含む、組成物。