CN103052882A - 以细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与s100a9的结合的阻碍为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。

Description

以细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的阻碍为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法

技术领域

本发明提供以S100A9的新受体即细胞外基质金属蛋白酶诱导因子为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法。

背景技术

作为在过量增殖或银屑病中被向上调节的蛋白质已知有S100A8及S100A9。S100A8及S100A9属于由超过20的成员构成的EF-手钙结合S100蛋白质家族(非专利文献1：Marenholz I et al.,Biochem Biophys ResCommun(2004)322:1111-1122)。任一种蛋白质都通过中性粒细胞、活化单核细胞及巨噬细胞分泌，作为这些细胞的趋化性分子发挥功能，与关于炎症性细胞的递增的正反馈回路相关(非专利文献2：Roth J et al.,TrendsImmunol(2003)24:155-158)。S100A8及S100A9阳性骨髓细胞，是浸润于炎症区域内的最初的细胞(非专利文献3：Odink K et al.,Nature(1987)330:80-82)。在包含慢性类风湿性关节炎(非专利文献4：Liao H et al.,Arthritis Rheum(2004)50:3792-3803)、多发性硬化症(非专利文献5：Bogumil T et al.,Neurosci Lett(1998)247:195-197)、克罗恩病(Crohn’sdisease)(非专利文献6：Lugering N,et al.,Digestion(1995)56:406-414)及***疾病(非专利文献7：Kuruto R,et al.,J Biochem(Tokyo)(1990)108:650-653)的大量的人炎症性疾病中观察到高的S100A8及S100A9血清水平。因此，认为S100A8及S100A9在炎症的诱导及传播中承担重要的作用。

对于上皮细胞中S100A8和100A9所发挥的生物学的功能，本发明者在以前弄清楚了：通过外源性S100A8和S100A9形成复合体(S100A8/A9)(又名：钙卫蛋白)来刺激正常表皮角质形成细胞(NHEK)并产生在银屑病性病变等中表达增强的炎症性细胞因子，进而S100A8/A9诱导性细胞因子刺激NHEK中的S100A8及S100A9的产生及分泌(非专利文献8：J CellBiochem.2007Nov28,Epub ahead of print)。进而，还发现S100A8/A9本身增强NHEK的增殖。这些结果说明，S100A8/A9作为主要介质参与的NHEK的增殖和炎症的正反馈机制的存在。即，启示了：形成了S100A8/A9诱导炎症性细胞因子的产生而引起炎症性疾病，该炎症诱导细胞增殖，细胞增殖进一步诱导炎症这样的循环，从而成为增殖-炎症连锁的持续性皮肤炎症性疾病、例如特应性皮炎、银屑病等的原因。

为了阻止由S100A8/A9引起的慢性炎症的负循环形成，认为鉴定S100A8及A9的受体是必要的。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Biochem Biophys Res Commun(2004)322:1111-1122

非专利文献2：Trends Immunol(2003)24:155-158

非专利文献3：Nature(1987)330:80-82

非专利文献4：Arthritis Rheum(2004)50:3792-3803

非专利文献5：Neurosci Lett(1998)247:195-197

非专利文献6：Digestion(1995)56:406-414

非专利文献7：J Biochem(Tokyo)(1990)108:650-653

非专利文献8：J Cell Biochem.(2008)104:453-464

非专利文献9：Nature Cell Biol.(2006)8(12):1369-1375

非专利文献10：Hum Genet(2002)111:310-313

非专利文献11：Morrison TB et al.,Biotechniques(1998)24:954-958,960,962

发明内容

发明要解决的课题

本发明提供以S100A9的新受体为指标的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法。

用于解决课题的方法

本发明者们确认了，作为S100蛋白质家族的受体而已知的RAGE(晚期糖基化终末产物受体，Receptor for advanced glycation endoproducts)也与S100A9结合。但是，未能通过中和抗体、siRNA试验的任一者确认由两者的结合产生的信号***的存在。

因此，本发明者们尝试了从培养角质形成细胞中分离与S100A8和/或A9结合的蛋白质并进行LC/MS/MS分析，从而鉴定S100A8/A9结合蛋白质，结果发现了大量S100A9的受体候选。其中，着眼于作为免疫球蛋白超家族的成员、且作为跨膜型的糖蛋白质的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Emmprin)(The extracellular matrix metalloproteinase inducer)(又名vacidin或CD147)，发现由于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达的抑制，而由S100A9产生的细胞因子诱导、基质金属蛋白酶诱导显著降低。另外，免疫染色的结果显示，S100A9及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在患有特应性皮炎、银屑病的患者的表皮以及浸润的黑色素瘤细胞中强烈表达。

因此发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子为S100A9的受体，并且通过阻碍它们之间的结合可以抑制慢性炎症，进而抑制癌的转移，从而完成了本发明。

因此，本申请包含以下的发明：

(1)一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。

(2)根据(1)所述的方法，其包括以下步骤：在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质的存在下，将细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9进行温育，选择阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的物质作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子被固相化于固体支持体。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，其中，所述结合的阻碍通过ELISA法来确定。

(5)一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其含有阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂。

(6)根据(6)所述的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。

(7)一种慢性炎症或癌转移的抑制方法，其包括以下步骤：将阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的药剂施与受试者。

(8)根据(9)所述的方法，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。

发明效果

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，诱导基质金属蛋白酶(MMP)从而诱导癌的转移。这样，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与恶性肿瘤的关系为人们所熟知。另外，对于S100A8/A9，也已知转移的多发部位与由癌细胞所产生的VEGF、TNF等因子等反应，分泌S100A8/A9，这诱导癌细胞的转移(非专利文献9：Nature Cell Biol.(2006)8(12):1369-1375)。本发明者们用S100A8/A9刺激培养角质形成细胞，结果确认了虽然参与癌的浸润的MMP由于该刺激而表达增强，但是在敲除了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的情况下，其表达显著地被抑制(结果未显示)。一直以来，认为MMP的表达增强是通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的自身分泌回路，但上述的结果显示，MMP的表达仅通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子并不被增强，必须经过S100A9刺激。

参与癌细胞的转移的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子作为S100A9的受体发挥功能，是由本发明者们首次发现的。实际上通过抑制细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达，从而由S100A9产生的细胞因子和/或MMP的表达增强低下(实施例)。因此，认为如果考虑细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的关系，则对于癌的转移和其恶性度可能给出新的解释。进而，因为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9同样地在特应性皮炎、银屑病的患者的表皮上层和/或黑色素瘤细胞的表皮中表达，所以预想两者与特应性皮炎、银屑病、癌等的慢性炎症都相关。因此，根据本发明，可以通过以细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的阻碍为指标，来探索慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。

附图说明

图1：细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的一级结构。

图2：通过使用了多维毛细管LC/MS/MS的蛋白质的综合分析法鉴定的S100A9的受体候选蛋白质。

图3：通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制效果。

图4：随着细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制的细胞因子的表达变化。

图5：随着细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制的MMP的表达变化。

图6：通过蛋白质印迹法进行的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合蛋白质的鉴定。箭头显示S100A9的带。

图7：通过可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子产生的MMP1的诱导效果。

图8A：显示人正常皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及S100蛋白质的定位的免疫染色图。

图8B：显示皮肤模型中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及S100蛋白质的定位的免疫染色图。

图8C：显示特应性皮肤疾病皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子及S100蛋白质的定位的免疫染色图。

图8D：使用S100A8抗体、27E10、Dapi进行免疫染色后的特应性皮炎及银屑病的皮肤的比较。

图8E：使用S100A9抗体、27E10、Dapi进行免疫染色后的特应性皮炎及银屑病的皮肤的比较。

图8F：显示黑色素瘤组织中的S100A9的定位的免疫染色图(上段为HE染色，中段为通过S100A9抗体的染色，下段为DAPI染色。左侧、中央、右侧的照片分别来自于不同的样品)。

图8G：显示恶性黑色素瘤中的S100A9的定位的免疫染色图。

图8H：显示黑色素瘤组织中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的定位的免疫染色图。

图9：通过PLA(邻位连接分析，Proximity Ligation Assay)法进行的特应性皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的相互作用的证明(200倍)。

图10：通过PLA法进行的特应性皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的相互作用的证明(400倍)。

图11：阻碍S100A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的结合的植物提取物的筛选结果。

图12：艾草提取物、野芝麻提取物、当归提取物的S100A9-细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合阻碍效果的比较。

具体实施方式

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是具有2个Ig结构域的1次跨膜型的糖蛋白质，具有胶原酶(MMP-1)的表达增强作用。在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子缺失小鼠中，发现***形成、受精、感觉功能及记忆功能、以及混合淋巴细胞反应的缺损。图1显示细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的一级结构，另外序列号1显示细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的全长序列。被MMP-1切割的Ig结构域1诱导胶原的表达。

对本发明的筛选方法没有特别限定，包括以下步骤：在候选物质的存在下将细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9进行温育，选择显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的候选药剂作为由S100A9引起的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。作为其评价标准，例如，如果与使对照作用的情况相比，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9蛋白质的结合10％以上、或20％以上、或30％以上、或50％以上、或70％以上、或100％被阻碍，则判断为“显著地抑制”慢性炎症或癌转移。

S100A9如上所述有时与S100A8形成复合体，该复合体也有时与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合。因此，可以筛选阻碍S100A8/A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的结合的物质作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。

对检测细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合的阻碍的方法并没有特别限定，可以基于ELISA法来制作细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9(或S100A8/A9)的结合中的标准曲线，从而将阻碍该结合的分子、即吸光度降低的分子作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选药剂检测出来。从确保良好的检测灵敏度的观点出发，吸附于固体支持体的分子优选为分子量大的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子。

本说明书中使用的“慢性炎症”，除了特应性皮炎、银屑病以外，还包含癌等。另外，本说明书中使用“癌转移抑制”，是指抑制癌细胞由作为原发病灶的组织经由浸润、通过血中及***的迁移、向新的组织的附着从而开始增殖的过程中的任一或全部步骤，与癌细胞的增殖抑制不同。

S100A8及A9

S100A8及A9的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的DNA序列在例如Hum Genet(2002)111:310-313(非专利文献10)中公开。能够在本发明中使用的S100A8及A9通常是来自人的天然型、或者重组蛋白质，但只要有活性，就可以使用改变型、来自异种的、或者非纯化品。S100A8及A9的重组蛋白质可以按照本领域公知的方法来大量制备，所述本领域公知的方法例如，将分离的或通过PCR合成的S100A8或A9基因(cDNA)***例如质粒、病毒等来制备表达载体，将其导入宿主细胞例如微生物、动物细胞或植物细胞等培养细胞中，使其表达。

将S100A9溶解于水或培养基、例如适合表皮角质形成细胞的培养的培养基、例如上述EpiLife(注册商标)培养基中，添加于本发明的筛选体系中。添加量不能一概规定，为1ng/ml～1mg/ml左右，优选为10ng/ml～100μg/ml左右，更优选为100ng/ml~10μg/ml左右的浓度。S100A9或S100A8/A9的添加优选在氯化钙的存在下进行。对在S100A9或S100A8/A9的存在下的温育时间、温育温度等培养条件没有特别限制，优选为30～37℃、1～14小时，更优选为34～37℃、2～7小时，优选在CO₂5％的存在下进行温育。

本发明的慢性炎症抑制剂可以作为对起因于S100A8/A9的持续性皮肤炎症性疾病例如特应性皮炎、银屑病等的预防、治疗这样的改善等有效的药品或化妆品利用。

作为通过本发明的筛选方法得到的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，可举出选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。特别是艾草提取物被确认了显著地阻碍S100A9与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的结合(图12)，因此被预想为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的优选活性成分。这里，本发明中使用的各植物的植物体或其提取物，是将各个植物体的各种部位(花、花穗、果皮、果实、茎、叶、枝、枝叶、干、树皮、根茎、根皮、根、种子或全草等)直接或干燥后进行粉碎而作为干燥粉末得到的物质，或者直接或干燥和/或粉碎后用溶剂提取而得的物质。

在提取物的情况下，提取所使用的提取溶剂只要是通常提取所使用的溶剂即可，特别地可单独或者组合使用甲醇、乙醇或者1,3-丁二醇等醇类、含水醇类、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，其中特别优选醇类、含水醇类，特别优选甲醇、乙醇、1,3-丁二醇、含水乙醇或含水1,3-丁二醇。另外上述溶剂优选在室温至溶剂的沸点以下的温度使用。

对提取方法没有特别限制，通常只要是在由常温至常压下的溶剂的沸点的范围即可，提取后过滤或使用离子交换树脂进行吸附、脱色、纯化制成溶液状、糊状、凝胶状、粉末状即可。进而在大多数情况下，可在原有的状态下利用，如果必要，在对其效果没有影响的范围内可进一步施加脱味、脱色等纯化处理，作为脱味和/或脱色等纯化处理方法，可使用活性碳柱等，根据提取物质不同任意选择一般采用的通常方法来进行即可。

作为植物体的提取部位，在艾草的情况下考虑叶，在当归的情况下考虑根，在野芝麻的情况下考虑茎、叶、花，但提取部位并不限定于这些部位。

可以将上述用溶剂进行提取得到的提取物直接使用，或者使用例如通过冷冻干燥等浓缩而得的提取物，另外根据需要还可以使用利用吸附法、例如使用离子交换树脂除去杂质后的物质，和/或以多孔聚合物(例如安珀莱特(Amberlite)XAD-2)柱吸附后用所需的溶剂溶出并进一步浓缩而得的物质。

本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂优选包含上述植物体或其提取物的一种或二种以上，在不损害本发明的效果的范围内，可含有其他的各种成分。另外，本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂可根据其使用目的适当确定用量、用法、剂型。例如，本发明的慢性炎症抑制剂的施与方式可以是经口、非经口、外用等。作为剂型，例如可举出片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、浸膏剂、糖浆剂等经口施与剂、或注射剂、点滴剂或栓剂等非经口施与剂软膏、乳膏、乳液、洗剂、面膜、沐浴用剂等外用剂。

本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的上述提取物成分的配合量可根据用途适当确定，通常在阻碍剂总量中，作为干燥物为0.0001～20.0质量％，优选为0.0001～10.0质量％。认为艾草提取物、野芝麻提取物、当归提取物浓度依赖性地抑制慢性炎症或癌转移。

另外，在慢性炎症抑制剂中或癌转移抑制剂中，除了上述药剂以外，可根据需要适当配合例如通常的食品或药品中使用的赋形剂、防潮剂、防腐剂、强化剂、增稠剂、乳化剂、抗氧化剂、甜味料、酸味料、调味料、着色料、香料等，化妆品等中通常使用的美白剂、保湿剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。

进而，将本发明的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂作为皮肤外用剂使用的情况下，也可适当配合皮肤外用剂中惯用的助剂，例如乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等金属封闭剂、咖啡因、单宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡萄糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类、视黄酸、维生素A、乙酸维生素A、棕榈酸维生素A等维生素A类等。

以下，举出具体例，更具体地说明本发明。另外，本发明不限定于此。实施例

1.新S100A9受体候选的筛选

将由培养角质形成细胞回收的蛋白质混合物与GST融合S100A9或S100A8/A9蛋白质混合后，对于该样品进行通过毛细管LC/MS/MS的蛋白质的综合分析法。

LC/MS/MS分析

为了保持填充剂，在内径100μm、长度120mm的未填充的毛细管柱(New Objetive社制)的圆锥状的出口侧的端部制作二氧化硅制的烧结。在得到的毛细管柱中，填充平均粒径为5μm的十八烷基化二氧化硅型填充剂Aqua C18(Phenomenex社制)使其高度为100mm，得到分析用逆相毛细管柱。

为了保持填充剂，在内径250μm、长度150mm的未填充的毛细管柱(Agilent社制)的出口侧的端部制作二氧化硅制的烧结。在得到的毛细管柱的出口侧填充将平均粒径为5μm的阳离子交换树脂型填充剂PartisphereSCX resins(Whatman社制)和平均粒径为5μm的阴离子交换树脂型填充剂PolyWAX LP(PolyLC社制)以质量比2:1混合而得的物质使其高度为25mm，在入口侧填充平均粒径为5μm的十八烷基化二氧化硅型填充剂Aqua C18(Phenomenex社制)使其高度为25mm，得到包含阱用逆相毛细管柱及SCX-WAX混合毛细管柱的二相型毛细管柱。

另外，制作分析用逆相毛细管柱及二相型毛细管柱时，使用高压氮气及加压型填充容器，通过匀浆填充法来填充填充剂。

接着，通过6步的MudPIT型分析(二维HPLC/ESI MS/MS)，来分析上述蛋白质混合物。

首先，将含有约4μg肽的上清通过加压法上样到二相型毛细管柱后，使用试样溶液的10倍以上的体积的移动相A(水、乙腈及甲酸的体积比95:5:0.1的混合液；pH值～2.6)，进行洗涤、脱盐。将该二相型毛细管柱10，通过贯通孔型接头(Upchurch Scientific社制)(不图示)与分析用逆相毛细管柱20连接。接着，连接于使用内径为100μm的毛细管作为配管的Nanospace SI-2型HPLC装置(资生堂社制)上。此时，阱用逆相毛细管柱11配置于SCX-WAX混合毛细管柱12及分析用逆相毛细管柱20的上游侧。

作为移动相，使用移动相A、移动相B(水、乙腈及甲酸的体积比20:80:0.1的混合液)、移动相C(含有500mm的乙酸铵的移动相A；pH值～6.8)，肽的溶出法，是使以矩形加入的移动相C的体积％每步骤递增的共计6步的梯度溶出法。

步骤1的梯度曲线是，流入移动相A5分钟，接着的5分钟使移动相B的比率由0体积％增加至15体积％，接着的60分钟使移动相B的比率增加至45体积％，接着的10分钟使移动相B的比率增加至75体积％，然后以该比率流入5分钟。

步骤2～6的梯度曲线是，流入移动相A1分钟，接着将4分钟使移动相C的比率为X[体积％]流入，接着的5分钟使移动相C的比率由0体积％增加至15体积％，接着的60分钟使移动相C的比率增加至45体积％，接着的10分钟使移动相C的比率增加至75体积％，然后以该比率流入5分钟。此时，泵的送液的流速为250μL/分钟，通过利用抵抗型毛细管的分流，将柱的流速调整为300～400nL/分钟。

另外，测定ESI MS/MS时，使用离子阱型质量分析计LCQ-Deca(THERMO FiSHER SCiENTiFiC社制)。此时，由分析用逆相毛细管柱溶出的肽不分流，直接导入质量分析计。

另外，将质荷比(m/z)为400～1400的全扫描MS谱测定1次、数据依赖型MS/MS谱测定3次，通过各步骤重复进行。此时，标准化裂解能为35％。另外，微扫描在MS谱测定及MS/MS测定都为3。进而，变动排除设定为，重复计算1、重复时间0.50分钟、排除列表大小25、排除时间10.00分钟。

得到的MS/MS谱通过在Bioworks软件(Thermo Fisher Scientific社制)上运行的SEQUEST计算程序，相对于非冗长人数据库(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/fasta/nr.gz，2007/2/8版)进行检索。

其结果是鉴定了如图2所列的受体候选蛋白质。从这些蛋白质中，将Vacidin(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子)作为S100A9的新受体进行以下的实验。

2.通过siRNA的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制

为了抑制细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达，使用RNAiMax，使细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA(Santa Cruz:sc-35298)以终浓度成为40nM或80nM转染增殖期的培养角质形成细胞(图3中的“BSG”)。作为对照，使用什么也不添加的物质(图3中的“NT”(无处理对照，non-treated control))及与人基因的任一部分不具有同源性的对照siRNA-A(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,sc-3707)(图3中的“LF”)。另外，转染在将培养培养基交换成不含有增殖因子的基础培养基之后进行。由转染开始24小时后用S100A9刺激增殖角质形成细胞，再过24小时后提取RNA。其结果如图3所示，在转染了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA的情况下，在24、48、72小时后，与使用上述对照的情况下的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达量相比，表达被抑制到1～3％。

3.由细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制引起的细胞因子及MMP的表达变化

已经清楚IL-8(CXCL-8)、TNFα、IL1-F9、CXCL-1通过S100A8/A9的添加而在角质形成细胞中的表达被增强(上述J Cell Biochem.(2008)104:453-464)(非专利文献8)。对于是否通过S100A9的添加IL-8(CXCL-8)、TNFα、IL1-F9及CXCL-1的表达也被增强，以及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达抑制对这些细胞因子的表达有怎样的影响，通过实时定量PCR来研究。通过同样的方法，对于S100A9刺激对MMP-1及MMP-10的表达的影响也进行研究。

实时定量PCR

将在EpiLife(商标)-KG2(Cascade Biologies社)中培养的增殖期的NHEK，置换成含有或不含有2mM的氯化钙、S100A8或S100A9(各10μg/ml)的相同培养基，曝露3小时，使用MagNA(商标)Pure mRNA提取试剂盒及MagNA Pure(商标)仪器(Roche Diagnostics社，日本，东京都)提取mRNA。得到的mRNA使用SuperScript(商标)II(InvitrogenCorporation社，美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德)使其逆转录。实时定量PCR，按照制造商的操作说明书使用LightCycler FastStart DNA masterSYBR green I试剂盒(Roche Diagnostics社)在LightCycler高速热循环仪***上实施。典型的反应条件是，10分钟的活化步骤、接着由95℃变性15秒、60℃退火10秒、72℃延伸10秒组成的循环40次。使用的引物示于下述的表1。各引物的最终浓度在20μl的总反应体积中为0.2～0.25μm。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为对照基因使用。通过融解曲线分析来确认扩增的片段的特异性。各基因的表达水平使用LightCycler分析用软件进行定量分析(非专利文献11：Morrison TB et al.,Biotechniques(1998)24:954-958,960,962)。目的的mRNA量，作为相对于A8/对照siRNA-A(santa Cruz:sc-37007)(A8/LF)的mRNA的量的比率来表示。

如图4所示，添加了S100A9的试样(A9/LF)诱导全部的细胞因子的表达。另一方面，对于添加了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA的试样(A9/siRNA)，全部的细胞因子表达量显著地降低。这明确显示，在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达被细胞外基质金属蛋白酶诱导因子siRNA抑制的情况下，即使用S100A9刺激细胞因子的表达，细胞因子的表达也被抑制。

对于MMP也明确了，在添加了S100A9的情况下表达被增强，与此相对，在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子被敲除的情况下，即使添加S100A9表达也显著地被抑制(图5)。

4.细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100蛋白质的结合试验

1)细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域的制作

[方法]

细胞：人胎儿肾细胞株(HEK293)使用由ATCC社购入的细胞株，培养人正常成纤维细胞OUMS-24使用由难波正义博士分离的细胞。HEK293和OUMS-24使用Gibco社的DMEM/F12培养基(添加胎牛血清使得最终浓度为10%)进行培养。

2)细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域表达构建体：

构建导入了CMV内含子启动子(CMVi)的PDNR1r载体(无启动子供体载体；Clontech社)，在CMVi的下游***编码人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域(在C末端添加了myc-HA-Flag-6His标签)的cDNA(pCMVi-exEmmp:细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域表达供体载体)。***cDNA的碱基序列已通过DNA测序仪确认正确。

3)细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域向细胞外的分泌：

将pCMVi-exEmmp，使用FuGENE-HD(Roche社)转染试剂导入HEK293，48小时后回收培养上清。在培养上清中添加Sigma社的抗HA标签抗体共价结合载体，在4℃下振荡混合3小时。其后，进行5000转/分钟、1分钟的离心分离，将沉淀的载体结合蛋白质通过酸性缓冲液溶出。使用12%的SDS-PAGE将溶出样品进行电泳后，电转印至PVDF膜，使用CST社的抗HA标签抗体进行蛋白质印迹，确认细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域被分泌出。

4)表达细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域的腺病毒(Ad-exEmmp)：

pCMVi-exEmmp向腺病毒载体的转换使用腺病毒制作试剂盒(Adeno-X-expression system:Clontech社)来进行。

5)细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域的大量纯化：

使培养人正常成纤维细胞OUMS-24(10cm平板×20)感染Ad-exEmmp(20MOI)。感染的时期是OUMS-24成为高密度状态时。这是因为，在由于高密度培养而引起接触抑制的细胞中不发生细胞***，存在于细胞内的来自腺病毒的附加体含量降低被抑制，其结果是利用腺病毒目标基因表达极长时间(2-3周)地持续。而且，OUMS-24可无血清培养，从而可以长期将分泌于培养上清中的重组蛋白质以不含有血清的状态回收。感染操作后，培养24小时而置换成无血清培养基DMEM/F12(不含酚红)。以3天的间隔进行换液，每次换液时回收培养上清并在4℃下保存(根据蛋白质的稳定性改变保存条件)。将该操作进行30天。对于约2L的回收培养上清，将80％饱和硫酸铵条件下得到的沉淀溶解于50ml的纯水，然后通过对纯水进行透析来除去硫酸铵。透析后，使用抗HA标签抗体共价结合载体填充柱(sigma社)来回收目的的重组蛋白质。

6)细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合蛋白质的鉴定：

为了确认细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是S100蛋白质的新受体，通过免疫沉淀及蛋白质印迹来进行细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合蛋白质的鉴定。在本实验中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子使用在C末端添加了myc-HA-Flag-6His标签的物质。另外，作为S100蛋白质使用S100A8及S100A9蛋白质。将编码这些蛋白质的质粒(在C末端添加了HA标签)分别转染HEK293细胞，由其培养上清分离各个蛋白质来使用。

为了进行细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A8及S100A9蛋白质的结合分析，混合含有各个蛋白质的培养上清使其反应后，使用HA抗体及Myc抗体进行免疫沉淀。将蛋白质印迹的结果示于图6。对于混合了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A8的试样，在32KDA附近确认仅有细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的带(“Emprin+S100A8”)。另一方面，混合了细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9蛋白质的试样(“Emprin+S100A9”)，在47.5KDA附近确认表示它们的结合的带。由以上的结果明确了，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是S100A9蛋白质的新受体候选。

5.可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子对MMP表达的影响

一直以来，认为MMP的表达增强是由于如下的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的自身分泌(自分泌)：细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的细胞外结构域被MMP分解，所放出的可溶性的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与作为存在于细胞表面的受体的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子结合，促进MMP的产生。因此，对于可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是否实际上使MMP的表达增强进行了研究。

作为可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(sol.Emp)使用通过上述方法纯化的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域，将其添加于角质形成细胞，结果在0.025、0.25、2.5μm的任一浓度几乎没有发现MMP-1诱导效果。另外，单独使用S100A9的情况下MMP-1的表达显著地增强，与此相对，在将可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(sol.Emp)与S100A9一起添加于角质形成细胞的情况下，通过S100A9的MMP1表达增强效果被显著地抑制。将结果示于图7。认为在可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(sol.Emp)与S100A9共存的情况下MMP的表达被抑制，是由于诱导MMP产生的S100A9被可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子捕捉，两者形成结合体。由这些结果考虑，根据一直以来倡导的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的自身分泌的机制，S100A9刺激通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子使MMP的表达增强这样的机制是合理的。结果未显示，但可溶性细胞外基质金属蛋白酶诱导因子也显著地抑制MMP-10、TNFα、L-8的表达。

6.表皮中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的定位

1)免疫染色

对于细胞外基质金属蛋白酶诱导因子是否存在于人表皮，以及是否显示与S100蛋白质相同的定位，通过免疫染色来确认。将结果示于图8A～C。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在正常表皮、皮肤模型、特应性皮炎(AD)的皮肤的任一者中均在颗粒层大量表达。另外，S100蛋白质也在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子附近表达。

进而明确了，在特应性皮炎的皮肤中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子高表达，S100A8及S100A9蛋白质的表达也被增强。另外，使用特异性结合S100A8/A9复合体的27E10抗体的免疫染色的结果显示，与银屑病(PSO)的皮肤相比，特应性皮肤疾病的皮肤的颗粒层中S100A8/A9复合体高表达(图8D及图8E)。

根据免疫染色的结果，在正常表皮中，S100A8、A9、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子几乎不表达。但是，对于黑色素瘤组织中的S100A9的表达通过免疫染色进行确认，结果任一样品都在表皮侧发现S100A9的强表达(图8F，左侧、中央、右侧的照片)。另外，相对于在正常部位几乎没有发现S100A9的表达，在恶性黑色素瘤(Clark’s level III(克拉克氏水准III))中，确认在基底层正上方的表皮中S100A9与黑色素瘤细胞的浸润对应地表达(图8G)。另一方面，即使是相同的肿瘤块，胎记组织没有在表皮侧发现S100A9的表达。

对于使用S100A9抗体和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147)抗体进行了免疫染色的部位，使用黑色素瘤特异性抗体(HMB45)来代替细胞外基质金属蛋白酶诱导因子抗体进行染色，结果被黑色素瘤特异性抗体所染色的部位与被细胞外基质金属蛋白酶诱导因子抗体染色的部位重复(图8H)。由该结果确认，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在浸润的黑色素瘤细胞中表达。

2)特应性皮肤中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的相互作用的证明

通过PLA(邻位连接分析，Proximity Ligation Assay)法确认细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9蛋白质不仅结合，而且实际地相互作用。根据PLA法，使用以DNA探针标记的2种抗体，与标记了荧光色素的互补DNA杂交，从而可以清楚这些蛋白质是否相互作用。PLA法远比通常的免疫染色灵敏度高。

使用Olink社的Duolink in situ PLA试剂盒进行相互作用试验。将由特应性患者得到的患部皮肤组织，用4％低聚甲醛固定后，通过通常的方法包埋于石蜡中。以4μm细切后，经过二甲苯处理、乙醇处理以PBS洗涤，封闭后，与一抗(参照以下的表1)在4℃下反应一夜。用PBS洗涤后，与PLA探针(参照以下的表1)在37℃下反应2小时。

洗涤后，与DNA探针进行杂交，用TBS-T进行洗涤，添加连接酶并在37℃温育15分钟，使探针融合。添加聚合酶，在37℃温育90分钟，进行连接的DNA探针的扩增。使用Detection kit613(Olink社)标记荧光色素，进行显微镜观察。将结果示于图9及图10。

使用细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9抗体进行PLA法的情况下，在从有棘层到颗粒层附近发现强的阳性反应(图9)。这显示细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9相互作用。另一方面，对于S100A8，也在颗粒层附近发现阳性反应，但认为这是由与S100A9形成二聚体的结果产生的(结果未显示)。

7.阻碍S100A8、S100A9蛋白质与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域结合的药剂的筛选

1)重组体S100A8、S100A9的制备和生物素化：

使人S100A8、S100A9作为GST融合蛋白质在大肠杆菌中产生，通过利用谷胱甘肽共价结合载体的亲和色谱进行纯化。其后，切割除去GST。对于纯化的S100A8、S100A9蛋白质的生物素化采用以下的方法。相对于各纯化蛋白质浓度混合3倍摩尔量的Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu(Dojindo社)。室温下反应2小时后，通过Nap-5(GE Healthcare社)除去未反应的生物素化试剂。

2)阻碍S100A8、S100A9蛋白质与细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域结合的药剂的筛选：

使重组体细胞外基质金属蛋白酶诱导因子细胞外结构域(相当于由图1中的从信号肽之后到跨膜结构域之前)结合于96孔板(Pierce社)的孔上。将孔洗涤后，为了抑制非特异性吸附，将各孔用5%BSA其他的封闭剂处理。接着将试验的药剂(作为对象，仅为溶剂)添加于孔内并在室温下温育1小时。将孔洗涤后，添加重组体S100A9w(细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的全长序列)在室温下温育1小时。进而将HRP标记的抗S100A9抗体添加于相同孔内使其反应。再次洗涤，添加显色底物(邻苯二胺)用酶标仪(ELISA Reader)测定吸光度(O.D.492nm)。通过该操作，首先制作细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9(或S100A8/A9)的结合中的标准曲线。接着筛选阻碍该结合的分子。在上述的分析***中添加药剂，将吸光度降低的药剂作为候选药剂。

将各种植物提取物用于上述筛选方法，结果明确了，艾草提取物、当归提取物、野芝麻提取物与对照相比显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9的结合(图11)。其中，艾草提取物显示强的阻碍效果(图12)。

Claims (10)

1.一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的筛选方法，其中，在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质显著地阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的情况下，评价该候选物质显著地抑制慢性炎症或癌转移。

2.根据权利要求1所述的方法，其是筛选慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：在慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂的候选物质的存在下，将细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9进行温育，选择阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的物质作为慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，细胞外基质金属蛋白酶诱导因子被固相化于固体支持体。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，其中，所述结合的阻碍通过ELISA法来确定。

5.一种慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其含有阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂。

6.根据权利要求5所述的慢性炎症抑制剂或癌转移抑制剂，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。

7.一种慢性炎症或癌转移的抑制方法，其包括以下步骤：将阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂，施与需要治疗慢性炎症或癌转移的受试者。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻中的植物体或其提取物。

9.阻碍细胞外基质金属蛋白酶诱导因子与S100A9或S100A8/A9的结合的药剂用于抑制慢性炎症或癌转移的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述药剂含有一种或二种以上的选自艾草、当归及野芝麻的植物体或其提取物。

Images