JP2011036204A - Attention-deficit/hyperactivity disorder model non-human mammal - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、注意欠陥/多動性障害モデル非ヒト哺乳動物に関するものである。更に詳細には、この発明は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連する遺伝子と相同の遺伝子異常を有する注意欠陥/多動性障害モデル非ヒト哺乳動物であって、ヒトの注意欠陥/多動性障害に関連した行動障害を示す注意欠陥多動性障害モデル非ヒト動物に関するものである。また、この発明は、注意欠陥/多動性障害モデル非ヒト哺乳動物を使用した注意欠陥/多動性障害予防薬または治療薬のスクリーニング方法ならびに被験薬剤の注意欠陥/多動性障害に対する評価方法に関するものである。 The present invention relates to attention deficit / hyperactivity disorder model non-human mammals. More particularly, the invention relates to a attention deficit / hyperactivity disorder model non-human mammal having a genetic abnormality homologous to a gene associated with human autosomal dominant nocturnal frontal epilepsy, wherein the human attention deficit / hyperactivity This relates to a model of attention deficit / hyperactivity disorder model non-human animals showing behavioral disorders related to sexual disorders. The present invention also relates to a method for screening an attention deficit / hyperactivity disorder prophylactic or therapeutic drug using an attention deficit / hyperactivity disorder model non-human mammal, and a method for evaluating attention deficit / hyperactivity disorder of a test drug. It is about.
注意欠陥/多動性障害(Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder: AD/HD) は、多動性、不注意、衝動性を症状の特徴とする発達障害の一つと言われていて、注意力を維持しにくく、時間感覚がずれていて、かつ、様々な情報をまとめることが苦手などの特徴がある、主に幼児期から学齢期の児童の数パーセントに認められる精神疾患である。 Attention-Deficit / Hyperactivity Disorder (AD / HD) is one of the developmental disorders characterized by hyperactivity, inattention and impulsivity, and maintains attention. It is a mental illness mainly found in a few percent of children from infancy to school age, which is difficult to perform, has a sense of time, and is not good at collecting various information.
注意欠陥/多動性障害(AD/HD)の発症原因は不明であるが、現在、中枢神経刺激薬塩酸メチルフェニデートがAD/HDの第一選択薬として繁用されている。しかしながら、塩酸メチルフェニデートは、習慣性が強く、頭痛や不眠症等の副作用が報告されている。また、ニコチンスキンパッチ療法がAD/HD症状を減少することが報告されているが(非特許文献1)、ニコチンにも習慣性があるという欠点がある。さらに、ニコチン受容体アゴニストABT-418がAD/HDの不注意症状を改善することが報告されているが(非特許文献2)、適応を取得するには至っていない(例えば、特許文献1参照)。この他、ネフィラセタムは、脳卒中易発症高血圧自然発症ラット (SHRSP) の自発的交替行動を指標とした注意力の側面を包含する短期記憶処理効率の低下を改善し、注意欠陥多動性障害、特にその不注意症状の治療に有効であると記載されている (例えば、特許文献1参照)。しかしながら、今のところAD/HDの治療法は確立されていないのが現状である。 Although the cause of attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) is unknown, the central nervous system stimulant methylphenidate hydrochloride is now commonly used as the first-line drug for AD / HD. However, methylphenidate hydrochloride is highly addictive, and side effects such as headache and insomnia have been reported. Moreover, although it has been reported that nicotine skin patch therapy reduces AD / HD symptom (nonpatent literature 1), there exists a fault that nicotine also has addictive property. Furthermore, although it has been reported that the nicotine receptor agonist ABT-418 improves inattentive symptoms of AD / HD (Non-patent Document 2), it has not yet been obtained for adaptation (see, for example, Patent Document 1). . In addition, nefiracetam improves the short-term memory processing efficiency, including attentional aspects, using spontaneous alternation behavior as an index in stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP). It is described that it is effective in the treatment of the inattentive symptoms (for example, refer patent document 1). However, at present, there is no established treatment for AD / HD.
AD/HDの原因解明と予防・治療法の確立のためには、この疾患の動物モデルの樹立が急務であり、そのために各種の動物モデルが開発されている。かかるAD/HD動物モデルとしては、例えば、選択交配によって確立されたラット2系統(SHRとNHE)、ジーンターゲティングにより作製されたマウス1系統(DAT-KO)、中性子照射 (neutron irradiation) による染色体欠損で作製されたマウス1系統 (Coloboma mutant mouse)、脳梁離脱 (acallosal) の表現型を示す近交系マウス1系統 (I/LnJ)(例えば、非特許文献3参照)、肝炎・肝癌・ヒトWilson病モデルLEC ラットをWistar系WKAHラットに戻し交配することによって樹立したコンジェニック系統の多動性障害モデルラット(特許文献2)などが知られている。 In order to elucidate the cause of AD / HD and establish prevention and treatment methods, it is urgent to establish an animal model of this disease, and various animal models have been developed for this purpose. Such AD / HD animal models include, for example, two rat lines established by selective mating (SHR and NHE), one mouse line produced by gene targeting (DAT-KO), and chromosome deletion due to neutron irradiation. 1 mouse strain (Coloboma mutant mouse), 1 inbred mouse strain (I / LnJ) showing the phenotype of callosal (a / LnJ) (see Non-patent Document 3, for example), hepatitis, liver cancer, human A hypergenic disorder model rat (Patent Document 2) of a congenic strain established by backcrossing a Wilson disease model LEC rat to a Wistar WKAH rat is known.
上記各種動物モデルのうち、現在では、高血圧自然発症ラット(SHR)が最もよく利用されている(例えば、非特許文献4参照)。しかしながら、SHRにみられる多動性障害が、ヒトにおける多動性障害を必ずしも反映するものではなく、また遺伝性に関しても未だ不明である(例えば、非特許文献5参照)。また、SHRの後継種である脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)は、Y字迷路による自発的交替行動の障害を示し、不注意、多動性および衝動性といったADHDモデルとしての行動学的および薬理学的特徴を有しているとの報告がある (例えば、非特許文献6参照)。 Among the various animal models, at present, spontaneously hypertensive rats (SHR) are most frequently used (see, for example, Non-Patent Document 4). However, the hyperactivity disorder observed in SHR does not necessarily reflect the hyperactivity disorder in humans, and heritability is still unclear (for example, see Non-patent Document 5). In addition, SHR's successor, stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHRSP), shows impaired spontaneous alternation behavior due to the Y-maze, and behavioral behavior as an ADHD model such as inattention, hyperactivity and impulsivity In addition, there are reports of having pharmacological characteristics (see Non-Patent Document 6, for example).
上記のような先行技術の現状に鑑み、ヒトのAD/HDにより近似する行動障害を呈するAD/HD動物モデルの樹立が未だに求められている。そこで、本発明者らは、本発明者の一人である廣瀬伸一らがてんかんモデル動物として既に樹立したてんかんモデルラットである、夜間のてんかん発作を特徴とする家族性てんかんの1つである常染色体優性夜間前頭葉てんかんの原因遺伝子異常としてのニューロンアセチルコリン受容体のα4ならびにβ2サブユニットの遺伝子である CHRNA4 ならびに CHRNB2 の遺伝子の変異(例えば、非特許文献7〜14参照)を有するラットについて、その行動バターンを調べたところ、非常に驚いたことに、そのてんかんモデルラットがヒトのAD/HDにより近似する行動障害を呈することを見出して、この発明を完成した。 In view of the current state of the prior art as described above, there is still a need to establish an AD / HD animal model that exhibits behavioral disorders that approximate human AD / HD. Therefore, the present inventors are an autosomal chromosome that is one of the familial epilepsy characterized by an epileptic seizure at night, which is an epilepsy model rat established by Shinichi Hirose et al., One of the present inventors as an epilepsy model animal. Behavioral patterns of rats having mutations in the genes of CHRNA4 and CHRNB2, which are genes of α4 and β2 subunits of neuronal acetylcholine receptor as a causative gene abnormality of dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (see, for example, Non-Patent Documents 7 to 14) As a result, the present invention was completed by finding that the epilepsy model rat exhibits a behavioral disorder that more closely resembles human AD / HD.
したがって、この発明は、ヒトのAD/HDにより近似する注意欠陥/多動性障害に関連する行動障害を呈するAD/HDモデル非ヒト哺乳動物を提供することを目的としている。 Accordingly, an object of the present invention is to provide an AD / HD model non-human mammal exhibiting a behavioral disorder associated with attention deficit / hyperactivity disorder that approximates human AD / HD.
詳細には、この発明は、ヒトのてんかん遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有する非ヒト哺乳動物であって、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2の非ヒト哺乳動物のChrna4またはChrnb2に遺伝子変異が変異導入されている注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。 Specifically, the invention relates to a non-human mammal having the same genetic abnormality as a human epilepsy gene abnormality, the α4 subunit CHRNA4 or β2 subunit of the neuronal acetylcholine receptor gene associated with human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. An object of the present invention is to provide an attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal in which a gene mutation is mutated in Chrna4 or Chrnb2 of a non-human mammal of unit CHRNB2.
この発明は、その好ましい態様として、上記CHRNA4の遺伝子異常として、S284L、S280Fならびに291-292insL 、CHRNB2の遺伝子異常として、V287L、V287MならびにI312Mの遺伝子異常が導入されている注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供することを目的とする。 In a preferred embodiment of the present invention, attention defect / hyperactivity disorder in which, as the above-mentioned CHRNA4 gene abnormality, S284L, S280F and 291-292insL, and CHRNB2 gene abnormality, V287L, V287M and I312M gene abnormality are introduced. (AD / HD) An object is to provide a model non-human mammal.
この発明は、注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を使用して、被験物質の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を確認して注意欠陥/多動性障害(AD/HD)予防薬または治療薬をスクリーニングする注意欠陥/多動性障害(AD/HD)予防薬または治療薬のスクリーニング方法および被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を評価する被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する評価方法を提供することを目的としている。 The present invention uses attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammals to confirm the effectiveness of a test substance against attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD). / Attention deficit screening for prophylactic or therapeutic drug for hyperactivity disorder (AD / HD) / Method for screening prophylactic or therapeutic drug for hyperactivity disorder (AD / HD) and attention deficit / hyperactivity disorder of test drug ( The purpose of this study is to provide an evaluation method for attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) of a test drug that evaluates its effectiveness against (AD / HD).
上記目的を達成するために、この発明は、ヒトのAD/HDにより近似する注意欠陥/多動性障害に関連する行動障害を呈するAD/HDモデル非ヒト哺乳動物を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides an AD / HD model non-human mammal that exhibits behavioral disorders related to attention deficit / hyperactivity disorder that is more similar to human AD / HD.
この発明は、1つの好ましい態様として、ヒトのてんかん遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有する非ヒト哺乳動物であって、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2の非ヒト哺乳動物のChrna4またはChrnb2に遺伝子変異が変異導入されているとともに、元来の塩基配列とは異なる塩基配列を有するが、アミノ酸配列が同一になる塩基配列を有するプローブが導入された変異遺伝子を有する注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 In one preferred embodiment, the present invention provides a non-human mammal having the same gene abnormality as a human epilepsy gene abnormality, the α4 subunit CHRNA4 of the neuronal acetylcholine receptor gene associated with human autosomal dominant nocturnal frontal epilepsy or A probe having a nucleotide sequence that is different from the original nucleotide sequence but has the same amino acid sequence as the gene mutation is mutated in Chrna4 or Chrnb2 of non-human mammal of β2 subunit CHRNB2. An attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal having an introduced mutated gene is provided.
この発明は、別の好ましい態様として、上記変異遺伝子が前記変異導入により新たな制限酵素切断部位が出現している注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 As another preferred embodiment, the present invention provides an attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal in which a new restriction enzyme cleavage site has appeared by introducing the mutation into the mutant gene.
この発明は、更に別の好ましい態様として、上記 Chrna4 が、上記変異導入によって、その cDNA の845番のC(シトシン) をT(チミン) (c.845 C>T ) および846番のG(グアニン)) をC(シトシン) (c.846G>C) に変異導入した配列番号9で表される塩基配列を有していること;もしくは、そのcDNA の856番の T(チミン)を C(シトシン)(c.856T>C) および/または857番のC(シトシン)をT(チミン) (c.857C>T) に変異導入した配列番号12で表される塩基配列を有すること;または上記 Chrnb2 が、変異導入によって、その cDNAの856番のG(グアニン) が C(シトシン)(c.856G>C)または A(アデニン)(c.856G>A)に変異導入した配列番号19または22でそれぞれ表される塩基配列を有すること;からなる注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 According to another preferred embodiment of the present invention, as described above, the above Chrna4 is modified so that the C-cytosine 845 of the cDNA is converted to T (thymine) (c.845 C> T) and G-guanine 846 by introducing the mutation. )) Having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 mutated to C (cytosine) (c.846G> C); or the T (thymine) at position 856 of the cDNA to C (cytosine) ) (C.856T> C) and / or having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 obtained by mutating C (cytosine) of No. 857 to T (thymine) (c.857C> T); or the above Chrnb2 In SEQ ID NO: 19 or 22, the 856th G (guanine) of the cDNA was mutated to C (cytosine) (c.856G> C) or A (adenine) (c.856G> A) by mutagenesis. Attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal each having a nucleotide sequence represented To provide.
この発明は、更に別の好ましい態様として、上記 Chrna4 が、上記変異導入によって、上記 Chrna4 の cDNA に c.845T>C および/または c.846G>A を変異導入して、前記α4サブユニットCHRNA4の p.282 番と相同のアミノ酸残基 Ser が Phe に置換されていること;もしくはc.856T>Cおよびc.857C>Tを変異導入して、前記α4サブユニットCHRNA4のp.286番と相同のアミノ酸残基SerがLeuに置換されていること;またはc.878-879insGCTまたはc.879-880insTTAが変異導入されて、前記α4サブユニットCHRNA4のp.293番と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入されていること;または上記Chrnb2にc.856G>Cまたはc.856G>Aが変異導入されて、前記β2サブユニットCHRNB2のp.286番と相同のアミノ酸残基Valがそれぞれ、LeuまたはMetに置換されていること;からなる注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 In another preferred embodiment of the present invention, as described above, the Chrna4 is mutated by c.845T> C and / or c.846G> A into the cDNA of Chrna4 by the mutation, and the α4 subunit CHRNA4 the amino acid residue Ser homologous to p.282 is substituted with Phe; or c.856T> C and c.857C> T are mutated to make homology with p.286 of the α4 subunit CHRNA4. Or c.878-879insGCT or c.879-880insTTA is mutated to introduce amino acid residue Leu that is homologous to p.293 of the α4 subunit CHRNA4. Leu is inserted between amino acid residue Ile homologous to p.294; or c.856G> C or c.856G> A is mutated to Chrnb2, and p of β2 subunit CHRNB2 is introduced. .Attention deficit consisting of amino acid residue Val homologous to No. 286, replaced with Leu or Met, respectively Providing dynamic disorder (AD / HD) models of non-human mammals.
この発明は、更に別の好ましい態様として、上記変異導入によって、上記遺伝子が、そのChrna4にc.878-879insGCTまたはc.879-880insTTAが変異導入された配列番号15または16でそれぞれ表される遺伝子であることからなる注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 In another preferred embodiment of the present invention, the gene is represented by SEQ ID NO: 15 or 16, respectively, wherein c.878-879insGCT or c.879-880insTTA is mutated in Chrna4 by introducing the mutation. An attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model comprising a non-human mammal is provided.
この発明は、更に別の好ましい態様として、上記特定のプローブが配列番号23または24で表される塩基配列からなる注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を提供する。 As yet another preferred embodiment, the present invention provides an attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal, wherein the specific probe comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 or 24.
この発明は、別の形態として、上記注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物を使用して、被験物質の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を確認して注意欠陥/多動性障害(AD/HD)予防薬または治療薬をスクリーニングする注意欠陥/多動性障害(AD/HD)予防薬または治療薬のスクリーニング方法、または被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を評価する被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する評価方法を提供する。 The present invention, as another form, uses the above attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal to test the effectiveness of the test substance against attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD). Screening for Attention Deficit / Hyperactivity Disorder (AD / HD) preventive or therapeutic drug and screening method for Attention Deficit / Hyperactivity Disorder (AD / HD) preventive or therapeutic drug, or Attention of test drug To provide an evaluation method for attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) of a test drug for evaluating the effectiveness against deficit / hyperactivity disorder (AD / HD).
この発明に係る注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、ヒトのAD/HDにより近似した注意欠陥/多動性障害に関連する行動障害を呈することから、被験物質の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を確認して注意欠陥/多動性障害(AD/HD)予防薬または治療薬をスクリーニングすることができるとともに、また被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)に対する有効性を評価することができる。 The attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal according to the present invention exhibits a behavioral disorder related to attention deficit / hyperactivity disorder approximated by human AD / HD. Can be screened for preventive or therapeutic agents for attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) by confirming their effectiveness against attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) Efficacy against deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) can be assessed.
この発明に係る注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、夜間のてんかん発作を特徴とする家族性てんかんの1つであるヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の遺伝子変異を遺伝子組換えし、該遺伝子の塩基配列の1部が、その塩基配列とは異なるが、アミノ酸配列が同一になるプローブを導入した変異遺伝子を有し、ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα4サブユニット CHRNA4 遺伝子もしくはβ2サブユニット CHRNB2 遺伝子の機能を欠失もしくは欠損している遺伝子組換え非ヒト哺乳動物であって、ヒトのAD/HDに非常に近似する行動障害を呈することを特徴としている。したがって、この発明に係るモデル哺乳動物は、注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデルとして使用することができる。なお、この注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、本発明者の一人である廣瀬伸一らがてんかんモデル動物として既に樹立したてんかんモデルラットであり、このてんかんモデルラットは既に特願2008−31002号として特許出願をしている。したがって、特願2008−31002号に記載事項は、本件特許出願の1部をも構成するものと見なすことができる。 The attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal according to the present invention is a neuron associated with human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, which is one of familial epilepsy characterized by nocturnal epileptic seizures Recombinant gene mutation of nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit (CHRNA4) gene or β2 subunit (CHRNB2) gene, part of the nucleotide sequence of the gene is different from the nucleotide sequence, but the amino acid sequence is It is a genetically modified non-human mammal that has a mutant gene into which an identical probe is introduced and that lacks or lacks the function of the α4 subunit CHRNA4 gene or β2 subunit CHRNB2 gene of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. It is characterized by exhibiting behavioral disorders that closely approximate human AD / HD. Therefore, the model mammal according to the present invention can be used as an attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model. This attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal is an epilepsy model rat that has been established as an epilepsy model animal by Shinichi Hirose, one of the inventors of the present invention. Has already filed a patent application as Japanese Patent Application No. 2008-31002. Therefore, the matters described in Japanese Patent Application No. 2008-31002 can be regarded as constituting part of the present patent application.
ここで、用語「非ヒト哺乳動物」とは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシなどのヒト以外の哺乳動物を意味しているが、ラットが抗てんかん薬の開発に永年使用されているという観点からしてより好ましいといえる。また、本明細書においては、説明を簡潔にするために、ラットを例にして説明するが、特にラットに限定されるものではない。 Here, the term “non-human mammal” means mammals other than humans such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, pigs, horses, cows, etc., but rats are used for the development of antiepileptic drugs. It can be said that it is more preferable from the viewpoint that it has been used for many years. Further, in this specification, for the sake of brevity, the description will be made with a rat as an example, but the present invention is not particularly limited to the rat.
現在では、一般的に、遺伝子異常を有する疾患モデル動物は当該技術分野で慣用されている組換え動物作出法で作出することができる。この発明においても、注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、夜間のてんかん発作を特徴とする家族性てんかんの1つであるヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに対するてんかんモデル動物(つまり、注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物)を当該技術分野で従来から使用されている組換え動物作出法で作出することができる。 At present, a disease model animal having a genetic abnormality can be generally produced by a recombinant animal production method commonly used in the art. In this invention, attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal is an epilepsy model for human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, which is one of familial epilepsy characterized by nocturnal epileptic seizures. Animals (ie, attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammals) can be produced by recombinant animal production methods conventionally used in the art.
そのためには、まず、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の相同遺伝子がラットなどからPCRクローニングなどの常法に従って単離される。なお、ラットChrna4のcDNAの塩基配列情報は、L31620ヒトCHRNA4 cDNAの塩基配列情報のNM_000744 (NCBI)として、またラットChrnb2のcDNAの塩基配列情報はNM_019297 (NCBI)として登録されている。 For this purpose, first, homologous genes of neuronal nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit (CHRNA4) gene or β2 subunit (CHRNB2) gene related to human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy are obtained from rats and other conventional methods such as PCR cloning. Isolated according to The nucleotide sequence information of rat Chrna4 cDNA is registered as NM_000744 (NCBI) of the nucleotide sequence information of L31620 human CHRNA4 cDNA, and the nucleotide sequence information of rat Chrnb2 cDNA is registered as NM_019297 (NCBI).
ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット (Chrna4) 遺伝子のcDNA(野生型)の塩基配列は下記の通りである。なお、下線部分は、この発明においてプローブと置換される部分を示している。また、対応するアミノ酸配列は配列番号30に示すとおりである。 The base sequence of cDNA (wild type) of rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit (Chrna4) gene is as follows. The underlined portion indicates a portion that is replaced with a probe in the present invention. The corresponding amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 30.
(配列番号1)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCCGGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTCGGCCAGTAGCCAATATCTCAGATGTGGTCCTCGTCCGCTTTGGCTTGTCCATTGCTCAGCTCATTGACGTGGACGAGAAGAACCAGATGATGACAACCAACGTGTGGGTGAAGCAGGAGTGGCACGACTACAAGCTGCGCTGGGACCCTGGTGACTACGAGAATGTCACCTCCATCCGCATCCCCTCTGAACTCATCTGGAGGCCTGACATCGTCCTCTACAACAATGCGGATGGAGACTTTGCAGTCACCCACCTGACCAAGGCCCACCTGTTCTATGACGGAAGGGTGCAGTGGACACCCCCAGCCATCTATAAGAGCTCCTGCAGCATCGACGTCACCTTCTTCCCCTTTGACCAGCAGAACTGTACCATGAAGTTTGGATCCTGGACCTACGACAAGGCCAAGATTGACTTAGTGAGCATGCATAGCCGTGTGGACCAACTGGACTTCTGGGAAAGTGGGGAGTGGGTCATCGTGGATGCTGTGGGCACCTACAACACCAGGAAGTACGAGTGCTGTGCCGAGATCTATCCTGACATCACCTATGCCTTCATCATCCGACGGCTGCCGCTATTCTACACCATCAACCTCATCATCCCGTGCCTGCTCATCTCCTGTCTCACCGTGCTGGTCTTCTATCTGCCTTCAGAGTGTGGCGAGAAGGTCACACTGTGCATCTCGGTGCTGCTTTCTCTCACCGTCTTCCTGCTGCTCATCACCGAGATCATCCCGTCCACCTCGCTGGTCATCCCGCTCATCGGCGAGTACCTCCTCTTCACCATGATCTTCGTCACCCTCTCCATCGTCATCACGGTCTTCGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCACGCACACACACGATGCCCGCCTGGGTGCGTAGAGTCTTCCTGGACATCGTGCCTCGCCTCCTCTTCATGAAGCGCCCCTCTGTGGTCAAAGACAACTGCCGGAGACTTATTGAGTCCATGCACAAGATGGCCAACGCCCCCCGCTTCTGGCCAGAGCCTGTGGGCGAGCCCGGCATCTTGAGTGACATCTGCAACCAAGGTCTGTCACCTGCCCCAACTTTCTGCAACCCCACGGACACAGCAGTCGAGACCCAGCCTACGTGCAGGTCACCCCCCCTTGAGGTCCCTGACTTGAAGACATCAGAGGTTGAGAAGGCCAGTCCCTGTCCATCGCCTGGCTCCTGTCCTCCACCCAAGAGCAGCAGTGGGGCTCCAATGCTCATCAAAGCCAGGTCCCTGAGTGTCCAGCATGTGCCCAGCTCCCAAGAAGCAGCAGAAGATGGCATCCGCTGCCGGTCTCGGAGTATCCAGTACTGTGTTTCCCAAGATGGAGCTGCCTCCCTGGCTGACAGCAAGCCCACCAGCTCCCCGACCTCCCTGAAGGCCCGTCCATCCCAGCTTCCCGTGTCAGACCAGGCCTCTCCATGCAAATGCACATGCAAGGAACCATCTCCTGTGTCCCCAGTCACTGTGCTCAAGGCGGGAGGCACCAAAGCACCTCCCCAACACCTGCCCCTGTCACCAGCCCTGACACGGGCAGTAGAAGGCGTCCAGTACATTGCAGACCACCTCAAGGCAGAAGACACTGACTTCTCGGTGAAGGAGGACTGGAAATACGTGGCCATGGTCATTGACCGAATCTTCCTCTGGATGTTCATCATTGTCTGCCTTCTGGGCACTGTGGGACTCTTCCTGCCTCCCTGGCTGGCTGCTTGCTGA
(SEQ ID NO: 1)
ATGGCCAATTCGGGCACCGGGGCGCCGCCGCCGCTGCTGCTACTGCGCTGCTGCTGCTCCTAGGGACCGGCCTCTTGCCTGCTAGCAGCCACATAGAGACCC GGGCCCATGCGGAGGAGCGGCTCCTGAAGAGACTCTTCTCCGGTTACAACAAGTGGTCTCGGTCAGCATTGTTGGCTCTTCCT
ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体β2サブユニット (Chrnb2) 遺伝子のcDNA(野生型)の塩基配列は下記の通りである。なお、下線部分は、この発明においてプローブと置換される部分を示している。また、対応するアミノ酸配列は配列番号31に示すとおりである。 The nucleotide sequence of the rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor β2 subunit (Chrnb2) gene cDNA (wild type) is as follows. The underlined portion indicates a portion that is replaced with a probe in the present invention. The corresponding amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 31.
(配列番号2)
ATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCTGTTCAGCTTCAGCCTTCTTTGGCTGTGCTCAGGGGTTTTGGGAACTGACACAGAGGAGCGGCTAGTGGAGCATCTCTTAGATCCCTCCCGCTATAACAAGCTGATTCGTCCAGCTACTAACGGCTCTGAGCTGGTGACTGTACAGCTCATGGTATCATTGGCTCAGCTCATTAGTGTGCACGAGCGGGAGCAGATCATGACCACCAATGTCTGGCTGACCCAGGAGTGGGAAGATTACCGCCTCACATGGAAGCCTGAGGACTTCGACAATATGAAGAAAGTCCGGCTCCCTTCCAAACACATCTGGCTCCCAGATGTGGTTCTATACAACAATGCTGACGGCATGTACGAAGTCTCCTTCTATTCCAATGCTGTGGTCTCCTATGATGGCAGCATCTTTTGGCTACCACCTGCCATCTACAAGAGTGCATGCAAGATTGAGGTGAAGCACTTCCCATTTGACCAGCAGAATTGCACCATGAAGTTTCGCTCATGGACCTACGACCGTACTGAGATTGACCTGGTGCTCAAAAGTGATGTGGCCAGTCTGGATGACTTCACACCCAGCGGGGAGTGGGACATCATCGCACTGCCAGGCCGACGCAACGAGAACCCAGACGACTCCACCTATGTGGACATCACCTATGACTTCATCATTCGTCGCAAACCACTCTTCTACACTATCAACCTCATCATCCCCTGCGTACTCATCACCTCGCTGGCCATCCTGGTCTTCTACCTGCCCTCAGACTGTGGTGAAAAGATGACACTTTGTATTTCTGTGCTGCTAGCACTCACGGTGTTCCTGCTGCTCATCTCCAAGATTGTGCCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTCAACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCCGGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
(SEQ ID NO: 2)
GTG CCTCCCACCTCCCTCGATGTACCGCTGGTGGGCAAGTACCTCATGTTTACCATGGTGCTAGTCACCTTCTCCATCGTCACCAGCGTGTGTGTGCTCAATGTGCACCACCGCTCGCCTACCACGCACACCATGGCCCCCTGGGTCAAGGTGGTCTTCCTGGAGAAGCTGCCCACCCTGCTCTTCCTGCAGCAGCCACGCCACCGCTGTGCACGTCAGCGTCTGCGCTTGAGGAGGCGCCAGCGAGAGCGTGAGGGCGCAGGCGCGCTTTTCTTCCGTGAAGGTCCTGCGGCTGACCCATGTACCTGCTTTGTC AACCCTGCATCAGTGCAGGGCTTGGCTGGGGCTTTCCGAGCTGAGCCCACTGCAGCCGGCCC GGGGCGCTCTGTGGGGCCATGCAGCTGTGGCCTCCGGGAAGCAGTGGATGGCGTACGCTTCATTGCGGACCACATGCGAAGTGAGGATGATGACCAGAGTGTGAGGGAGGACTGGAAATACGTTGCCATGGTGATCGACCGCCTGTTCCTGTGGATCTTTGTCTTTGTCTGTGTCTTTGGGACCGTCGGCATGTTCCTGCAGCCTCTCTTCCAGAACTACACTGCCACTACCTTCCTCCACCCTGACCACTCAGCTCCCAGCTCCAAGTGA
このようにして得られたcDNAクローンは既知の変異導入法により変異を導入することができる。この発明に使用できる変異導入法としては、当該技術分野で従来から汎用されている部位特異的突然変異導入法などの従来法を使用するのがよい。この部位特異的突然変異導入法は、cDNAに任意の変異を部位特異的に任意の部位に導入することができる。かかるcDNAの部位に部位特異的に導入できる変異としては、特に限定されるものではなく、その変異が欠失、欠損、置換または付加などの改変であってもよい。 Thus obtained cDNA clones can be mutated by known mutagenesis methods. As the mutagenesis method that can be used in the present invention, a conventional method such as a site-specific mutagenesis method that has been widely used in the art may be used. This site-directed mutagenesis method can introduce any mutation into cDNA at any site in a site-specific manner. The mutation that can be introduced into the cDNA site in a site-specific manner is not particularly limited, and the mutation may be a modification such as deletion, deletion, substitution or addition.
したがって、この発明においても、部位特異的突然変異導入法を利用して単離ラットChrna4またはChrnb2に所定の変異を導入することができ、その結果変異が導入されたラットの相同遺伝子Chrna4またはChrnb2は、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんの発作に関連する機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を保持している。 Therefore, also in this invention, the site-specific mutagenesis method can be used to introduce a predetermined mutation into isolated rat Chrna4 or Chrnb2, and as a result, the homologous gene Chrna4 or Chrnb2 of the rat into which the mutation has been introduced is It retains a base sequence encoding a protein having a function related to seizures of human autosomal dominant nighttime frontal epilepsy.
なお、本明細書で使用する「相同遺伝子」またはこれに関連する用語は、遺伝学的用語ではある遺伝子の塩基配列において, 祖先を同じくすると考えられる異種の動物での遺伝子で類似の塩基配列をもち、コードされる蛋白も類似した機能を有するものをいう。 As used herein, the term “homologous gene” or a related term is a genetic term that refers to a base sequence of a gene that is similar to that of a gene in a heterologous animal that is considered to have the same ancestor. In addition, the encoded protein also has a similar function.
この発明において、ラットのニューロンニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット遺伝子のcDNAは次のようにして調製することができる。 In this invention, the cDNA of rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit gene can be prepared as follows.
具体的には、ラットのcDNAクローンをテンプレートとして既存のラットChrna4 または Chrnb2 の cDNA 配列を基に2種類のプライマー、例えば、下記塩基配列を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを設計・作成する。 Specifically, using a rat cDNA clone as a template, based on the existing rat Chrna4 or Chrnb2 cDNA sequence, two types of primers, for example, a forward primer and a reverse primer having the following base sequences are designed and prepared.
ラットChrna4 の cDNA 配列を基にして作成されるフォワードプライマー(40mer)(配列番号3)とリバースプライマー(38mer)(配列番号4)は次の塩基配列を有する。
配列番号3:AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
配列番号4:AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
ラットChrnb2の cDNA 配列を基にして作成されるフォワードプライマー(41mer)(配列番号5)とリバースプライマー (40mer) (配列番号6)は次の塩基配列を有する。
配列番号5:AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
配列番号6:ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
The forward primer (40mer) (SEQ ID NO: 3) and reverse primer (38mer) (SEQ ID NO: 4) prepared based on the cDNA sequence of rat Chrna4 have the following base sequences.
Sequence number 3: AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG
Sequence number 4: AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA
The forward primer (41mer) (SEQ ID NO: 5) and reverse primer (40mer) (SEQ ID NO: 6) prepared based on the rat Chrnb2 cDNA sequence have the following base sequences.
Sequence number 5: AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT
Sequence number 6: ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA
これらのプライマーを用いてPCRを行って、得られたPCR産物を適切なベクターにサブクローニングする。得られるクローンをシークエンスし、Chrna4および Chrnb2 の cDNA の塩基配列を確認する。 PCR is performed using these primers, and the resulting PCR product is subcloned into an appropriate vector. Sequence the resulting clones and confirm the nucleotide sequences of the Chrna4 and Chrnb2 cDNAs.
つぎに、上記のようにして得られたcDNAクローンの任意の部位に変異を導入する。変異導入法としては種々の方法が知られていて、そのいずれもこの発明に適用することができる。特に、部位特異的突然変異導入法などの変異導入法を使用することによって任意の部位に任意の変異を導入することができる。 Next, a mutation is introduced into an arbitrary site of the cDNA clone obtained as described above. Various methods are known for introducing mutations, any of which can be applied to the present invention. In particular, any mutation can be introduced at any site by using a mutation introducing method such as site-directed mutagenesis.
前述したように、CHRNA4 遺伝子の遺伝子異常としては、S280F、S284Lならびに、291-2
92insLが報告されている。また、CHRNB2 遺伝子の遺伝子変異としては、V287L、V287MおよびI312Mが報告されている。
As described above, CH280 gene abnormalities include S280F, S284L, and 291-2.
92insL has been reported. Further, V287L, V287M and I312M have been reported as genetic mutations in the CHRNB2 gene.
そこで、この発明においては、上記のようにしてPCRクローニングで単離したラットChrna4(野生型)(配列番号1)およびラットChrnb2(野生型)(配列番号2)に対して、例えば、CHRNA4 遺伝子の遺伝子異常である、S280F、S284L、もしくは291-292insLまたはCHRNB2 の遺伝子変異であるV287LもしくはV287Mに相当する種特異的な相同遺伝子の変異を上記変異導入法によって変異導入することができる。 Therefore, in the present invention, for example, the CHRNA4 gene is isolated from rat Chrna4 (wild type) (SEQ ID NO: 1) and rat Chrnb2 (wild type) (SEQ ID NO: 2) isolated by PCR cloning as described above. A mutation of a species-specific homologous gene corresponding to V287L or V287M, which is a gene mutation of S280F, S284L, or 291-292insL or CHRNB2, which is a genetic abnormality, can be mutated by the above-described mutagenesis method.
つまり、変異導入は、適切なセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、市販のキットによって所定の変異を所定の変異導入部位に変異を導入することができる。この変異導入に使用することができるセンスプライマーとアンチセンスプライマーは、一般的には20mer〜40mer、好ましくは25mer〜35merであるのがよい。この場合、制限酵素切断部位が変異導入部位に新たに出現してくるように、プライマー、変異導入部位などを工夫して変異導入を行うのがよい。 That is, for the mutation introduction, a predetermined mutation can be introduced into a predetermined mutation introduction site by a commercially available kit using an appropriate sense primer and antisense primer. The sense primer and antisense primer that can be used for this mutagenesis are generally 20 mer to 40 mer, preferably 25 mer to 35 mer. In this case, it is preferable to introduce a mutation by devising a primer, a mutation introduction site, etc. so that a restriction enzyme cleavage site newly appears at the mutation introduction site.
具体的には、例えば、野生型ラットChrna4にS282F(ヒトではS280F)の変異導入をするには、下記のセンスプライマー(29mer)とアンチセンスプライマー(29mer)を用いて、cDNAの塩基配列845番の C を T (c.845C>T) に、また846番の G を C (c.846G>C) に変異導入することができる。この変異導入によって、CHRNA4の p.282 番と相同のアミノ酸残基SerがPheに置換される。 Specifically, for example, to introduce a mutation of S282F (S280F in humans) into wild-type rat Chrna4, using the following sense primer (29mer) and antisense primer (29mer), cDNA nucleotide sequence # 845 C can be mutated to T (c.845C> T) and G at position 846 to C (c.846G> C). By this mutagenesis, the amino acid residue Ser homologous to the p.282 of CHRNA4 is replaced with Phe.
使用できるセンスプライマー(配列番号7)およびアンチセンスプライマー(配列番号8)の塩基配列は次の通りである。
配列番号7: CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
配列番号8:GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
上記変異導入により生成された変異導入ラットcDNAの塩基配列は下記の通りである。
The base sequences of the sense primer (SEQ ID NO: 7) and the antisense primer (SEQ ID NO: 8) that can be used are as follows.
SEQ ID NO: 7: CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC
Sequence number 8: GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG
The base sequence of the mutagenized rat cDNA generated by the mutagenesis is as follows.
(配列番号9)
(SEQ ID NO: 9)
同様に、野生型ラットChrna4にS286L(ヒトではS284L)の変異導入をするには、下記のセンスプライマー(29mer)とアンチセンスプライマー(29mer)を用いて、cDNAの塩基配列856番の T を C (c.856T>C) に、また857番の C を T (c.857C>T) に変異導入することができる。この変異導入によって、CHRNA4の p.286 番と相同のアミノ酸残基SerがLeuに置換される。 Similarly, in order to introduce a mutation of S286L (S284L in humans) into wild-type rat Chrna4, the T of the nucleotide sequence 856 of cDNA is changed to C using the following sense primer (29mer) and antisense primer (29mer). (c.856T> C) and 857 C can be mutated to T (c.857C> T). This mutagenesis replaces the amino acid residue Ser homologous to p.286 of CHRNA4 with Leu.
使用できるセンスプライマー(配列番号10)およびアンチセンスプライマー(配列番号11)の塩基配列は次の通りである。
配列番号10:CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
配列番号11:CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
The base sequences of the sense primer (SEQ ID NO: 10) and the antisense primer (SEQ ID NO: 11) that can be used are as follows.
Sequence number 10: CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG
Sequence number 11: CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。 The base sequence of the mutagenized cDNA generated by the mutagenesis is as follows.
(配列番号12)
(SEQ ID NO: 12)
同様に、野生型ラットChrna4のcDNAの塩基配列878番と879番の間にGCT (c.878-879insGCT) を挿入することによって、下記センスプライマー(30mer)とアンチセンスプライマー(30mer)を用いて、CHRNA4のp.293番(ヒトでは291番)と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番(ヒトでは292番)と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入される。 Similarly, by inserting GCT (c.878-879insGCT) between nucleotide sequences 878 and 879 of the cDNA of wild type rat Chrna4, using the following sense primer (30mer) and antisense primer (30mer) Leu is inserted between amino acid residue Leu homologous to p.293 (CH.291 in humans) of CHRNA4 and amino acid residue Ile homologous to p.294 (# 292 in humans).
使用できるセンスプライマー(配列番号13)およびアンチセンスプライマー(配列番号14)の塩基配列は次の通りである。
配列番号13:GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
配列番号14:GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
The base sequences of the sense primer (SEQ ID NO: 13) and the antisense primer (SEQ ID NO: 14) that can be used are as follows.
Sequence number 13: GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC
Sequence number 14: GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。 The base sequence of the mutagenized cDNA generated by the mutagenesis is as follows.
(配列番号15)
(SEQ ID NO: 15)
上記c.878-879insGCTの場合と同様にして、野生型ラットChrna4のcDNAの塩基配列879と880番の間に TTA (c.879-880insTTA) を挿入することによって、CHRNA4のp.293番(ヒトでは291番)と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番(ヒトでは292番)と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入される。 In the same manner as in the case of c.878-879insGCT above, by inserting TTA (c.879-880insTTA) between the nucleotide sequence 879 and 880 of the wild-type rat Chrna4 cDNA, Leu is inserted between amino acid residue Leu which is homologous to human and the amino acid residue Ile which is homologous to p.294 (human and 292).
(配列番号16)
(SEQ ID NO: 16)
同様に、例えば、野生型ラットChrnb2にV287Lの変異導入をすることによって、ラット相同遺伝子Chrnb2のcDNAには、配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号17で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、c.856 番目のGがCに (c.856G>C) 置換され、ヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuに置換される。 Similarly, for example, by introducing a mutation of V287L into wild type rat Chrnb2, the cDNA of the rat homologous gene Chrnb2 has a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and the base represented by SEQ ID NO: 17. Using the reverse primer consisting of the sequence, c.856th G was replaced with C (c.856G> C), and Val of amino acid residue p.286 homologous to human neuronal acetylcholine receptor β2 subunit CHRNB2 Is replaced by Leu.
使用できるセンスプライマー(30mer)(配列番号17)およびアンチセンスプライマー(30mer)(配列番号18)の塩基配列は次の通りである。
配列番号17:CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
配列番号18:GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
The base sequences of the sense primer (30mer) (SEQ ID NO: 17) and the antisense primer (30mer) (SEQ ID NO: 18) that can be used are as follows.
Sequence number 17: CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC
Sequence number 18: GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。 The base sequence of the mutagenized cDNA generated by the mutagenesis is as follows.
(配列番号19)
(SEQ ID NO: 19)
同様にして、野生型ラットChrnb2にV287Mの変異導入をすることによって、ラット相同遺伝子Chrnb2のcDNAには、配列番号20で表される塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号21で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、c.856 番目のGがAに (c.856G>A) 置換され、ヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがMetに置換される。 Similarly, by introducing a mutation of V287M into wild-type rat Chrnb2, the cDNA of the rat homologous gene Chrnb2 has a forward primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21. Using the reverse primer consisting of: c.856th G is replaced with A (c.856G> A), and the Val of amino acid residue p.286 homologous to human neuronal acetylcholine receptor β2 subunit CHRNB2 is Replaced by Met.
使用できるセンスプライマー(30mer)(配列番号20)およびアンチセンスプライマー(30mer)(配列番号21)の塩基配列は次の通りである。
配列番号20:CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
配列番号21:GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
上記変異導入により生成された変異導入cDNAの塩基配列は下記の通りである。
The base sequences of the sense primer (30mer) (SEQ ID NO: 20) and the antisense primer (30mer) (SEQ ID NO: 21) that can be used are as follows.
Sequence number 20: CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC
Sequence number 21: GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG
The base sequence of the mutagenized cDNA generated by the mutagenesis is as follows.
(配列番号22)
(SEQ ID NO: 22)
この発明において、上記のように変異導入する変異の種類を、その変異導入部位に位置するコドンの塩基配列に対応するように工夫することによって、その変異導入部位に新たに酵素部位を出現させることができる。 In this invention, by devising the type of mutation to be mutated as described above so as to correspond to the base sequence of the codon located at the mutation introduction site, a new enzyme site appears at the mutation introduction site. Can do.
例えば、Chrna4については、879-880insTTAを変異導入することにより、制限酵素 Tru9 I (MseI) による切断部位 (T↓TAA) が出現する。また、Chrnb2については、V287LもしくはV287Mを導入することにより、制限酵素 Hinf If による切断部位 (G↓ANTG) が出現する。なお、矢印(↓)は切断箇所を示している。ただし、制限酵素の種類や切断部位などはこれらに限定されるものではなく、変異導入を変えることにより適宜選択することができる。 For example, for Chrna4, a cleavage site (T ↓ TAA) by restriction enzyme Tru9 I (MseI) appears by mutating 879-880insTTA. As for Chrnb2, a cleavage site (G ↓ ANTG) by the restriction enzyme Hinf If appears by introducing V287L or V287M. In addition, the arrow (↓) has shown the cutting | disconnection location. However, the types of restriction enzymes and cleavage sites are not limited to these, and can be appropriately selected by changing the mutation introduction.
この発明において、上記のcDNAに所定の塩基配列からなるヌクレオチドがプローブとして導入される。導入するプローブは、元の塩基配列とは塩基配列は全くもしくはほぼ全て異なるが、元のアミノ酸配列が同一になるように工夫したヌクレオチドであって、その塩基の数は、一般的には、約30bp〜200bp、好ましくは約50bp〜150bp、より好ましくは約60bp〜120bpであるのがよい。これらヌクレオチドは、DNA合成法などの当該技術分野で慣用されている常法に従って調製することができる。 In the present invention, nucleotides having a predetermined base sequence are introduced into the cDNA as a probe. The probe to be introduced is a nucleotide that is devised so that the original amino acid sequence is the same, although the base sequence is completely or almost completely different from the original base sequence, and the number of bases is generally about 30 bp to 200 bp, preferably about 50 bp to 150 bp, more preferably about 60 bp to 120 bp. These nucleotides can be prepared according to a conventional method commonly used in the art, such as a DNA synthesis method.
具体的には、例えば、Chrna4 遺伝子の変異導入cDNAに対しては、そのcDNAのc.104 番目から第 c.221 番目までの塩基配列と、その塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になるように、下記塩基配列 (118 bp) を有するヌクレオチドをプローブとして作成することができる。 Specifically, for example, for a mutated cDNA of the Chrna4 gene, the base sequence from the c.104th to the c.221st of the cDNA is different, but the amino acid sequence is the same. Thus, a nucleotide having the following base sequence (118 bp) can be prepared as a probe.
(配列番号23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
(SEQ ID NO: 23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
同様にして、例えば、Chrnb2 の変異導入cDNAに対しては、そのcDNAのc.1171 番目から第 c.1232 番目までの塩基配列と、その塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になるように、下記塩基配列 (62 bp) を有するヌクレオチドをプローブとして作成することができる。 Similarly, for example, for a mutated cDNA of Chrnb2, the base sequence from c.1171 to c.1232 of the cDNA is different from the base sequence, but the amino acid sequence is the same. A nucleotide having the following base sequence (62 bp) can be prepared as a probe.
(配列番号24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
(SEQ ID NO: 24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
次に、上記のように作成したヌクレオチドプローブをハイブリダイゼイションした後、プローブを制限酵素部位を用いて常法に従って導入する。例えば、配列番号22で表されるプローブを上記塩基配列を有するChrna4の変異導入 cDNA の所定の部位に、pCRII-TOPO ベクター等の適当なベクターのSma IとBpu1102 I (別名Esp I または Cel II)部位に当該技術分野において慣用されているプローブ導入法によって挿入することができる。また、例えば、配列番号22で表されるプローブを、上記塩基配列を有するChrnb2の変異導入 cDNA の所定の部位に、pCRII-TOPO ベクター等の適当なベクターの制限酵素部位の Hinc I とSma Iに当該技術分野において慣用されているプローブ導入法によって挿入することができる。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認を行った。 Next, after hybridization of the nucleotide probe prepared as described above, the probe is introduced according to a conventional method using a restriction enzyme site. For example, an appropriate vector such as pCRII-TOPO vector Sma I and Bpu1102 I (also known as Esp I or Cel II) is inserted into a predetermined site of the Chrna4 mutation-introduced cDNA having the above-mentioned base sequence. The site can be inserted by a probe introduction method commonly used in the art. In addition, for example, the probe represented by SEQ ID NO: 22 is added to a predetermined site of the Chrnb2 mutation-introduced cDNA having the above base sequence, to the restriction enzyme sites Hinc I and Sma I of an appropriate vector such as pCRII-TOPO vector. It can be inserted by a probe introduction method commonly used in the art. Sequencing was performed at each step, and the base sequence was confirmed.
ラットChrana4 の変異cDNA (S282F)(なお、ヒトではS280Fである。)に配列番号2で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S282FPB) の塩基配列(配列番号25)は下記の通りである。なお、c.845C>T と c.846G>Cの変異により、下線したように844番目から846番目のTCG が TTC に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、その塩基数が118 bpで、104番目から221番目に位置している。 The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 25) of the probe-introduced mutant gene cDNA (S282FPB) obtained by introducing the probe represented by SEQ ID NO: 2 into the rat Chrana4 mutant cDNA (S282F) (S280F in humans) is as follows: It is. In addition, due to mutations of c.845C> T and c.846G> C, the 844th to 846th TCG is mutated to TTC as underlined, and the probe portion has a base number of 118 as shown by the underline. It is located from 104th to 221th in bp.
(配列番号25)
(SEQ ID NO: 25)
ラットChrna4 の変異cDNA (S286L)(なお、ヒトではS284Lである。)に配列番号23で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S284LPB) の塩基配列(配列番号26)は下記の通りである。なお、c.856T>C と c.857C>Tの変異により、下線を引いた856番目から858番目のTCT が CTT に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、塩基数が118 bpで、104番目から221番目に位置している。 The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 26) of the probe-introduced mutant gene cDNA (S284LPB) obtained by introducing the probe represented by SEQ ID NO: 23 into the rat Chrna4 mutant cDNA (S286L) (in the human, S284L) is as follows. It is. The underlined 856th to 858th TCT was mutated to CTT due to mutations of c.856T> C and c.857C> T, and the probe portion had a base number of 118 bp as shown by the underline. And it is located from 104th to 221th.
(配列番号26)
(SEQ ID NO: 26)
ラットChrana4の変異cDNA (879-880insL)に配列番号23で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (S282FPB) の塩基配列(配列番号27)は下記の通りである。なお、c.845C>T と c.846G>Cの変異により、四角(□)で囲ったように844番目から846番目のTCG が TTC に変異され、またプローブ部分は、下線で示すように、118 bpで、104番目から221番目に位置している。ただし、ヒトではS280Fである。 The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 27) of the probe-introduced mutant gene cDNA (S282FPB) obtained by introducing the probe represented by SEQ ID NO: 23 into the mutant cDNA of rat Chrana4 (879-880insL) is as follows. As a result of c.845C> T and c.846G> C mutations, the 844th to 846th TCGs are mutated to TTC as enclosed by squares (□), and the probe part is underlined, 118 bp, located from 104th to 221st. However, it is S280F in humans.
(配列番号27)
(SEQ ID NO: 27)
ラットChrnb2 の変異cDNA に配列番号24で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (V286L) の塩基配列(配列番号28)は下記の通りである。 The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 28) of the probe-introduced mutant gene cDNA (V286L) obtained by introducing the probe represented by SEQ ID NO: 24 into the rat Chrnb2 mutant cDNA is as follows.
(配列番号28)
(SEQ ID NO: 28)
ラットChrnb2の変異cDNA に配列番号24で表されるプローブを導入したプローブ導入変異遺伝子cDNA (V286M) の塩基配列(配列番号29)は下記の通りである。 The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 29) of the probe-introduced mutant gene cDNA (V286M) obtained by introducing the probe represented by SEQ ID NO: 24 into the rat Chrnb2 mutant cDNA is as follows.
(配列番号29)
(SEQ ID NO: 29)
上記のようにして作製したラット上記変異とプローブを導入したラットChrna4またはChrb2のcDNAを用いて、この発明に係るてんかん非ヒト哺乳動物はそれ自体公知の非ヒト哺乳動物作出方法によって常法に従って作出することができる。かかる非ヒト哺乳動物の作出方法としては、目的遺伝子を動物個体に導入するトランスジェニック動物の作出方法、標的遺伝子と目的導入遺伝子とを組換えた遺伝子置換動物の作出方法、目的遺伝子を改変した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法などが挙げられる。
本明細書では、目的遺伝子である上記変異遺伝子のcDNAを、例としてラットなどの動物個体の受精卵に導入するトランスジェニック動物の作出方法を挙げて説明する。
Using the rat Chrna4 or Chrb2 cDNA introduced with the above mutation and probe prepared as described above, the epilepsy non-human mammal according to the present invention is produced according to a conventional method by a known non-human mammal production method. can do. Such a non-human mammal production method includes a method for producing a transgenic animal in which a target gene is introduced into an animal individual, a method for producing a gene-substituted animal in which a target gene and a target transgene are recombined, and a cell in which the target gene is modified. And a method for producing a clone individual using the nucleus of.
In this specification, a method for producing a transgenic animal in which the cDNA of the mutant gene, which is the target gene, is introduced into a fertilized egg of an animal individual such as a rat will be described as an example.
先ず、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα4サブユニット (CHRNA4) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (CHRNB2) 遺伝子の相同遺伝子に該変異を持った変異遺伝子をコードするDNAを有する発現ベクターを作製する。 First, a DNA encoding a mutant gene having the mutation in the homologous gene of α4 subunit (CHRNA4) gene or β2 subunit (CHRNB2) gene of neuronal nicotinic acetylcholine receptor related to human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy An expression vector is prepared.
つまり、非ヒト哺乳動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット (Chrna4) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (Chrnb2) 遺伝子を含むDNAを単離し、このDNA断片に外来遺伝子などを挿入することによって発現ベクターを構築することができる。かかる外来遺伝子としては、マーカー遺伝子が好ましく、特に、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには発現ベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくこともできる。これにより、非相同組換えを起こした細胞株を排除することができる。また、発現ベクターにジフテリアトキシンAフラグメント(DT-A)遺伝子などを結合させると、非相同的な組換えを起こした細胞株を排除することができる。発現ベクターとしては、例えば、pCI-neo、pMCIneo、pXT1、pSG5、pcDNA3.neo、pLITMUS28、pcDNAIamp、pcDNA3などが使用される。 In other words, non-human mammalian neuronal nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit (Chrna4) gene or β2 subunit (Chrnb2) gene containing DNA is isolated, and an exogenous gene is inserted into this DNA fragment. Can be built. As such a foreign gene, a marker gene is preferable, and an antibiotic resistance gene such as a neomycin resistance gene is particularly preferable. When an antibiotic resistance gene is inserted, cell lines that have undergone homologous recombination can be selected simply by culturing in a medium containing the antibiotic. In order to perform more efficient selection, a thymidine kinase gene or the like can be bound to an expression vector. Thereby, a cell line in which non-homologous recombination has occurred can be excluded. In addition, when a diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or the like is bound to an expression vector, a cell line in which non-homologous recombination has occurred can be eliminated. As the expression vector, for example, pCI-neo, pMCIneo, pXT1, pSG5, pcDNA3.neo, pLITMUS28, pcDNAIamp, pcDNA3 and the like are used.
上記DNAは、そのDNAを適当なプロモーターの下流に連結した発現ベクターを導入遺伝子として非ヒト哺乳動物に導入するのが好ましい。またプロモーターとしては、上記受容体サブユニットをコードするDNAを導入する非ヒト哺乳動物の細胞内で転写を開始することができるプロモーターであればいずれも用いることができ、例えば、シミアンウイルス40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、ヒトサイトメガロウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来遺伝子などのプロモーターが挙げられる。 The DNA is preferably introduced into a non-human mammal using an expression vector in which the DNA is linked downstream of a suitable promoter as a transgene. As the promoter, any promoter can be used as long as it can initiate transcription in a non-human mammal cell into which the DNA encoding the receptor subunit is introduced. Examples include promoters such as genes derived from viruses such as Omavirus, adenovirus 2, human cytomegalovirus, and retrovirus.
また、この発明で使用する発現ベクターは、非ヒト動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα4サブユニット (Chrna2) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (Chrnb2) の変異遺伝子をコードするDNAの下流に、mRNAの3’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルを有していることが好ましい。ポリアデニル化シグナルとしては、例えば、上記のウィルス由来等の各遺伝子に含まれるSV40の後期遺伝子または初期遺伝子等のポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。その他、発現ベクターには、目的遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結してもよい。 In addition, the expression vector used in the present invention is an mRNA 3 downstream of the DNA encoding the mutant gene of α4 subunit (Chrna2) gene or β2 subunit (Chrnb2) of neuronal nicotinic acetylcholine receptor of non-human animals. It preferably has a polyadenylation signal necessary for terminal polyadenylation. Examples of the polyadenylation signal include a polyadenylation signal such as a late gene or early gene of SV40 contained in each gene derived from the above viruses and the like. In addition, in order to achieve higher expression of the target gene, the expression vector includes a splicing signal of each gene, an enhancer region, and a part of the intron 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ of the translation region. You may connect downstream.
この発明においては、例えば、上記変異とプローブを導入したラット変異Chrna4またはChrnb2のcDNAを発現ベクターに制限酵素部位XhoIとNotIを用いて移行させた後、制限酵素SnaBIとNaeIで切断することができる。例えば、ラット変異Chrna4のcDNAをpCI-neoベクター由来のPDGFプロモーターを持つ発現ベクターに移行する場合には、制限酵素部位X hoI とNot I を用いて移行させ、制限酵素SnaBIとNae Iで切断することができ、また、ラットChrb2のcDNAを移行する場合には、制限酵素部位Xho IとSal Iを用いて移行させ、制限酵素SnaBIとDraIIIで切断することができる。これによって、PDGFプロモーター、ラット変異Chrna4 またはChrnb2のcDNAならびにpoly A部分からなる断片をDNA構築物としてゲル切り出しにより単離・精製することができる。 In this invention, for example, the cDNA of the rat mutation Chrna4 or Chrnb2 introduced with the above mutation and probe can be transferred to an expression vector using restriction enzyme sites XhoI and NotI, and then cleaved with restriction enzymes SnaBI and NaeI. . For example, when transferring the cDNA of rat mutant Chrna4 to an expression vector with PDGF promoter derived from pCI-neo vector, transfer using restriction enzyme sites XhoI and NotI, and cleave with restriction enzymes SnaBI and NaeI. In addition, when transferring rat Chrb2 cDNA, it can be transferred using restriction enzyme sites Xho I and Sal I and cleaved with restriction enzymes SnaBI and DraIII. As a result, a fragment comprising the PDGF promoter, rat mutant Chrna4 or Chrnb2 cDNA, and poly A portion can be isolated and purified by gel cutting as a DNA construct.
この発明においては、例えば、上記のようにして単離・精製したDNA構築物などを非ヒト哺乳動物の分化全能性細胞に導入することによって非ヒト哺乳動物を作出することができる。使用できる分化全能性細胞としては、例えば、受精卵、初期胚、胚性幹細胞などが使用できる。DNA構築物を導入する受精卵は、例えば、性腺刺激ホルモン(PMS)など***誘発剤を腹腔内投与し、雌動物に過剰***を誘発させてDNA構築物の導入可能な受精卵を回収し、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配させた偽妊娠雌動物の卵管を摘出して、顕微鏡下で採取することによって得ることができる。 In this invention, for example, a non-human mammal can be produced by introducing a DNA construct or the like isolated and purified as described above into a totipotent cell of a non-human mammal. Examples of the totipotent cells that can be used include fertilized eggs, early embryos, embryonic stem cells, and the like. For fertilized eggs into which DNA constructs are introduced, for example, ovulation-inducing agents such as gonadotropin (PMS) are administered intraperitoneally to induce superovulation in female animals, and fertilized eggs into which DNA constructs can be introduced are collected. It can be obtained by removing the fallopian tube of a pseudopregnant female animal mated with a male mouse castrated by ligation or the like and collecting it under a microscope.
次に、得られた受精卵にDNA構築物を導入する。構築物を受精卵に導入する手段としては、種々の方法が知られているが、トランスジェニック動物個体の作出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、マイクロインジェクション法が好ましい。このように変異遺伝子を注入した受精卵は、仮親の卵管に移植し、個体まで発生させ、体の一部(例えば、尾部先端等)の体細胞からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入した遺伝子の存在を確認する。このように体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。 Next, a DNA construct is introduced into the obtained fertilized egg. Various methods are known as means for introducing a construct into a fertilized egg, but the microinjection method is preferable in consideration of the production efficiency of a transgenic animal individual and the transgene transfer efficiency to the next generation. The fertilized egg injected with the mutated gene is transplanted into the oviduct of the foster parent, generated to the individual, DNA is extracted from somatic cells of a part of the body (for example, the tip of the tail), Southern analysis and PCR method. To confirm the presence of the introduced gene. Thus, the target transgenic animal can be produced by selecting the individual into which the transgene is incorporated into the genome of the somatic cell.
上記によって導入遺伝子の存在が確認された個体(ヘテロ接合体)を初代(Founder:F0)とすれば、導入遺伝子はその子(F1)の50%に伝達される。さらに、このF1個体の雌雄を交配させることにより、2倍体染色体の両方に導入遺伝子を有する個体(F2)を作出することができる。 If the individual (heterozygote) in which the presence of the transgene is confirmed as described above is the first generation (Founder: F0), the transgene is transmitted to 50% of its offspring (F1). Furthermore, an individual (F2) having a transgene on both diploid chromosomes can be created by mating the male and female of this F1 individual.
これに対して、この発明において注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物の作出に用いるトランスジェニック方法は、内在性遺伝子(Chrna4遺伝子またはChrnb2遺伝子)は正常のままの状態で、新たにその染色体DNAの任意の位置に変異型Chrna4またはChrnb2をコードする変異遺伝子を導入する。このため、この発明のAD/HDモデル動物では、正常なChrna4またはChrnb2と変異型Chrna4またはChrnb2とがそれぞれ共に産生されている。ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体は、イオンチャンネル(αサブユニット2個、βサブユニット3個)として機能するタンパク質であるが、このようなイオンチャンネルはいずれかのサブユニットが変異していればチャンネル機能が変更される。 In contrast, in the present invention, the endogenous method (Chrna4 gene or Chrnb2 gene) remains normal in the transgenic method used to produce attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammals. Then, a mutant gene encoding mutant Chrna4 or Chrnb2 is newly introduced at an arbitrary position of the chromosomal DNA. Therefore, in the AD / HD model animal of the present invention, normal Chrna4 or Chrnb2 and mutant Chrna4 or Chrnb2 are produced together. The neuronal nicotinic acetylcholine receptor is a protein that functions as an ion channel (two α subunits and three β subunits). Such an ion channel functions as long as one of the subunits is mutated. Is changed.
この発明の注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、後記の実施例に示すように、ヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんと同様に、睡眠中にてんかん発作を自然発症するという優れた特性を有している。 The attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal of this invention spontaneously develops an epileptic seizure during sleep, similar to human chromosome dominant nocturnal frontal epilepsy, as shown in the Examples below. It has excellent characteristics.
なお、目的遺伝子が全ての細胞の染色体上に組み込まれた個体の選択は、通常は、個体を構成する血液組織、上皮組織などの組織の一部からDNAを調製し、そのDNAをシークエンスして、その導入遺伝子が存在することをDNAレベルで確認することによって行われる。しかし、このようにDNAをシークエンスしてかかる組換え個体の選択をするには、手間も時間も、また費用も掛かる繁雑な仕事を行う必要がある。 In addition, selection of individuals in which the target gene has been integrated on the chromosomes of all cells is usually done by preparing DNA from a part of the tissue such as blood tissue or epithelial tissue constituting the individual, and sequencing the DNA. , By confirming the presence of the transgene at the DNA level. However, in order to select such a recombinant individual by sequencing DNA in this way, it is necessary to perform a complicated task that is laborious, time consuming and expensive.
つまり、遺伝子異常を有する疾患モデル動物を作出する場合、相同組換え体を正確に判別する必要がある。従来の疾患モデル動物の作出法では、組換え体を判別するために、その個体の遺伝子の1部をシークエンスする必要があり、かつその導入遺伝子のmRNAを発現する必要があった。しかしながら、その導入遺伝子のmRNAをRT-PCRやin situ hybridizationなどで発現させるのは容易ではない。 That is, when producing a disease model animal having a genetic abnormality, it is necessary to accurately identify homologous recombinants. In a conventional method for producing a disease model animal, in order to discriminate a recombinant, it is necessary to sequence a part of the gene of the individual and to express the mRNA of the transgene. However, it is not easy to express the mRNA of the transgene by RT-PCR or in situ hybridization.
そこで、この発明においては、上記のように変異遺伝子を変異導入するとともに、その変異遺伝子の1部をプローブと置換することによって組換え体の識別を容易に行うことができるように工夫をしている。また、上記変異導入によって新たな制限酵素切断部位を出現させる場合にも、組換え体の識別を容易に行うことができる。なお、このアプローチは、下記に説明する具体的態様に限定的に適用されるばかりではなく、遺伝子変異や制限酵素などの種類に関係なくあらゆる変異導入に包括的に適用できるものと理解さるべきである。また、この発明においては、このcDNAクローンの部位に部位特異的に導入する変異の種類は特に限定されるものではない。 Thus, in the present invention, the mutant gene is mutated as described above, and the recombinant gene can be easily identified by replacing a part of the mutant gene with a probe. Yes. In addition, even when a new restriction enzyme cleavage site appears by introducing the mutation, the recombinant can be easily identified. It should be understood that this approach is not limited to the specific embodiments described below, but can be applied comprehensively to all types of mutation introduction regardless of the type of gene mutation or restriction enzyme. is there. In the present invention, the type of mutation to be introduced site-specifically into the cDNA clone site is not particularly limited.
つまり、この発明では、かかる組換え個体の選択を容易に行えるように、前述したように、非ヒト動物のニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のα4サブユニット (Chrna4) 遺伝子もしくはβ2サブユニット (Chrnb2) 遺伝子をコードするDNAに、例えば、S280L、S284L、S291-292L、V287L、V287M などの変異を導入して新しく制限酵素切断部位を出現させている。このように新しい制限酵素切断部位を出現させることによって、組換え体の作出に際して、組換え体の識別を容易にすることができる。 That is, in the present invention, as described above, the α4 subunit (Chrna4) gene or the β2 subunit (Chrnb2) gene of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor of a non-human animal can be easily selected. For example, mutations such as S280L, S284L, S291-292L, V287L, V287M and the like are introduced into the DNA coding for a new restriction enzyme cleavage site. By making a new restriction enzyme cleavage site appear in this way, it is possible to facilitate identification of the recombinant when producing the recombinant.
この発明においては、作成した変異導入 cDNA の1部の塩基配列を、その塩基配列とは実質的には全く異なるが、アミノ酸配列が同一になる塩基配列からなるプローブで置換して元の塩基配列と同一の部位に導入しているので、その導入したプローブの制限酵素を用いることによって、組換え個体を容易に識別することができるばかりではなく、組換え遺伝子から発現する mRNA をラット本来の Chrna4 mRNA または Chrnb2 mRNA と区別して、RT-PCR や in situ hybridization などによって容易に検出することができる。 In the present invention, the base sequence of a part of the prepared mutagenesis cDNA is replaced with a probe consisting of a base sequence that is substantially completely different from the base sequence, but has the same amino acid sequence. Therefore, by using the restriction enzyme of the introduced probe, it is possible not only to easily identify recombinant individuals, but also to express mRNA expressed from the recombinant gene in the original Chrna4 of the rat. Differentiated from mRNA or Chrnb2 mRNA, it can be easily detected by RT-PCR or in situ hybridization.
また、例えば、ニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNB2の相同遺伝子Chrnb2に対して変異 (c.856G>C)または(c.856G>A) 導入することによって、制限酵素切断部位Hinf Ifが出現することから、この切断部位を含む領域を制限酵素Hinf Ifを用いてPCR-RFLP(制限酵素断片長多型)法などにより判別することができる。つまり、目的とする相同組換えが起こっていない個体は、Hinf If部位を有していないことになるから、制限酵素Hinf Ifでは切断が起こらないのに対して、目的とする相同組換えが起こっている個体は、Hinf If部位を有しているから、制限酵素Hinf Ifで切断されることになる。したがって、この発明において、ニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4の相同遺伝子Chrna4またはβ4サブユニットCHRNB2の相同遺伝子Chrnb2に対して制限酵素切断部位を出現させるように変異導入することにより、組換え体を容易に識別することができる。 In addition, for example, by introducing a mutation (c.856G> C) or (c.856G> A) into the homologous gene Chrnb2 of the α4 subunit CHRNB2 of the neuronal acetylcholine receptor gene, a restriction enzyme cleavage site Hinf If appears. Therefore, the region containing this cleavage site can be discriminated by PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) method using the restriction enzyme Hinf If. In other words, individuals who have not undergone the desired homologous recombination do not have the Hinf If site, so that the restriction enzyme Hinf If does not cleave, whereas the desired homologous recombination occurs. Since the individual has a Hinf If site, it is cleaved by the restriction enzyme Hinf If. Therefore, in the present invention, a recombinant is obtained by introducing a mutation so that a restriction enzyme cleavage site appears in the homologous gene Chrnb2 of the α4 subunit CHRNA4 of the neuronal acetylcholine receptor gene or the homologous gene Chrnb2 of the β4 subunit CHRNB2. Can be easily identified.
なお、ここで使用されるPCR-RFLP法は、それ自体周知の手法であって、この方法によって、対象となる部位をPCRにより増幅し、増幅産物を所定の制限酵素、例えば、True9IやHinf Ifなどの制限酵素で消化し、消化後のDNA断片のサイズを電気泳動等により、その制限酵素の切断部位の存否を調べることができる。 The PCR-RFLP method used here is a method known per se. By this method, a target site is amplified by PCR, and the amplified product is amplified with a predetermined restriction enzyme such as True9I or Hinf If. It is possible to examine the presence or absence of a cleavage site of the restriction enzyme by electrophoresis or the like by digesting with a restriction enzyme such as.
上記のようにして作出されるてんかんモデル非ヒト哺乳動物は、この発明に係る注意欠陥/多動性障害モデル非ヒト哺乳動物としても適用することができる。注意欠陥/多動性障害モデル非ヒト哺乳動物として適用できるかどうかの評価は、例えば、オープンフィールド装置を用いた自発運動量の測定ならびに高架式十字迷路装置を用いた不安様行動の測定などによって行うことができる。 The epilepsy model non-human mammal produced as described above can also be applied as the attention deficit / hyperactivity disorder model non-human mammal according to the present invention. Attention deficit / hyperactivity disorder model Evaluation of whether it can be applied as a non-human mammal is performed by measuring spontaneous momentum using an open field device and anxiety-like behavior using an elevated plus maze device, for example. be able to.
この発明において、オープンフィールド装置を使用した自発運動量の測定は、オープンフィールド装置底面の中心に光点が当たるようにデスクライトを設置し、実験動物をケージごと実験環境に置いて馴化させた後、オープンフィールド装置底面の中心に実験動物を置き、その実験動物の腰部が区画の境界を横切った回数ならびに立ち上がり回数(壁面を支えにした場合を含む)を所定時間観察して判定した。 In this invention, the measurement of the spontaneous momentum using the open field device, after setting the desk light so that the light spot hits the center of the bottom of the open field device, and acclimating the experimental animal with the cage in the experimental environment, An experimental animal was placed at the center of the bottom of the open field apparatus, and the number of times that the lumbar part of the experimental animal crossed the boundary of the compartment and the number of risings (including the case where the wall surface was supported) were determined by observing for a predetermined time.
この発明において、高架式十字迷路装置を用いた不安様行動の測定は、高架式十字迷路装置のオープンアームの交点の中心に実験動物を置き、実験動物のオープンアームへの進入回数と進入時の滞在時間を測定した。実験動物がオープンアームに侵入したか否かの判定は、実験動物の腰部が完全にオープンアームに入ったときとした。 In this invention, the measurement of anxiety-like behavior using the elevated plus maze device is performed by placing an experimental animal at the center of the intersection of the open arms of the elevated plus maze device and the number of times the experimental animal has entered the open arm and Residence time was measured. Whether or not the experimental animal entered the open arm was determined when the lumbar part of the experimental animal completely entered the open arm.
次に、この発明を実施例により更に詳細に説明するが、この発明は下記実施例によって一切限定されるものではなく、また下記実施例はこの発明を具体的に説明するためにだけ例示的に記載するものであって、この発明をいかなる意味においても限定する意図で記載するものではないと理解されるべきである。 EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited to the following examples, and the following examples are illustrative only for specifically explaining the present invention. It should be understood that the description is not intended to limit the invention in any way.
[実施例1]
まず、Rat Brain QUICK-Clone cDNA (CLONTECH; Mountain View, CA) をテンプレートとして既存のラット Chrna4 の cDNA 配列を元に設計した2つのプライマー、つまり、フォワードプライマー (BN-Rat CHRNA4 cDNA-F):
AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG (40mer)(配列番号3)と、リバースプライマー (Rat CHRNA4 cDNA-BX-R):
AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA (38mer) (配列番号4)
とによりPCRを行った。得られたPCR産物を精製し、pCRII-TOPOベクター(Invitorogen; Carlsbad , CA ) にサブクローニングした。得られたクローンをシークエンスし、Chrna4の cDNA の塩基配列を確認した。なお、ラット塩基配列情報はアクセッション番号L31620 (NCBI) として登録されている。
[Example 1]
First, two primers designed based on the existing rat Chrna4 cDNA sequence using Rat Brain QUICK-Clone cDNA (CLONTECH; Mountain View, CA) as a template, ie, forward primer (BN-Rat CHRNA4 cDNA-F):
AGATCTCGCGAAGCTTCACCATGGCCAATTCGGGCACCGG (40mer) (SEQ ID NO: 3) and reverse primer (Rat CHRNA4 cDNA-BX-R):
AGATCTAGATCAGCAAGCAGCCAGCCAGGGAGGCAGGA (38mer) (SEQ ID NO: 4)
PCR was performed. The resulting PCR product was purified and subcloned into the pCRII-TOPO vector (Invitorogen; Carlsbad, CA). The obtained clone was sequenced and the nucleotide sequence of the Chrna4 cDNA was confirmed. Rat base sequence information is registered as accession number L31620 (NCBI).
得られたクローンにQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit ( STRATAGENE; La Jolla, CA ) を用いて変異の導入を行った。まず、r845T846C-sen:
CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC (29mer) (配列番号7)とr845T846C-ant:
GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG (29mer) (配列番号8)を用いて、cDNA 塩基配列845番のCをTに、また846番のGをCに変異させた。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号9に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α4サブユニットと相同のアミノ酸残基p.282番のSerがPheに変異した。
このように作成した変異導入のcDNAの c.104からc.221に、この部位と同じアミノ酸配列となるが、元の塩基配列とは全く異なる下記塩基配列を有する118bpのヌクレオチドからなるプローブ(配列番号23)を作成し導入した。
Mutations were introduced into the obtained clones using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE; La Jolla, CA). First, r845T846C-sen:
CACACTGTGCATCTTCGTGCTGCTTTCTC (29mer) (SEQ ID NO: 7) and r845T846C-ant:
Using GAGAAAGCAGCACGAAGATGCACAGTGTG (29mer) (SEQ ID NO: 8), C of the cDNA base sequence 845 was mutated to T, and G of 846 was mutated to C. The base sequence of the obtained mutant cDNA is as shown in SEQ ID NO: 9. As a result, Ser at amino acid residue p.282 homologous to the human neuronal acetylcholine receptor α4 subunit was mutated to Phe.
A probe (sequence) consisting of 118 bp nucleotide having the following amino acid sequence that is the same amino acid sequence as that of this site, but is completely different from the original nucleotide sequence, in c.104 to c.221 of the mutagenized cDNA thus prepared. No. 23) was created and introduced.
(配列番号23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
(SEQ ID NO: 23)
GGGCTCACGCCGAAGAACGCCTGCTCAAAAGGCTGTTTTCTGGCTATAATAAATGGTCCCGCCCCGTGGCTAACATTTCCGACGTCGTGCTGGTGCGGTTCGGATTATCTATCGCTCA
上記のようにしてプローブを導入した変異導入cDNAをハイブリダイゼイションの後、pCRII-TOPO ベクターに挿入中の Chrna4 の cDNA を制限酵素部位のSmaIとBpu1102Iを用いて挿入を行った。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認をおこなった。 After hybridization of the mutagenized cDNA into which the probe was introduced as described above, the cDNA of Chrna4 being inserted into the pCRII-TOPO vector was inserted using the restriction enzyme sites SmaI and Bpu1102I. Sequencing was performed at each step, and the base sequence was confirmed.
さらに、該当変異(S286L)を有したラット Chrna4 のcDNAを、pCI-neo ベクター由来のPDGF プロモーターを持つ発現ベクターに制限酵素部位XhoIとNotIを用いて移行させたのち、制限酵素SnaBIとNaeIで切断した。PDGF プロモーターとラット Chrna4 のcDNAならびにpoly A部分を有す断端をゲル切り出しにより単離、精製した。この単離・精製したDNAを受精卵に顕微注入し、状態の良好な200個以上の卵を受胚雌動物の卵管に移植し、自然分娩する方法によって組換え体を作出した。 Furthermore, rat Chrna4 cDNA with the relevant mutation (S286L) was transferred to an expression vector with PDGF promoter derived from pCI-neo vector using restriction enzyme sites XhoI and NotI, and then cleaved with restriction enzymes SnaBI and NaeI. did. The PDGF promoter, rat Chrna4 cDNA and the stump having the poly A portion were isolated and purified by gel excision. The isolated and purified DNA was microinjected into a fertilized egg, and 200 or more eggs in good condition were transplanted into the oviduct of a fertilized female animal, and a recombinant was produced by a method of natural delivery.
[実施例2]
実施例1と同様にして、r856C857T-sen:CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG (29mer) (配列番号10)とr856C857T-ant:
CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG (29mer) (配列番号11)を用いて、cDNA塩基配列856番のTをCに, 857番のCをTに変異させた。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号12に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α4サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のSerがLeuに変異した。
[Example 2]
In the same manner as in Example 1, r856C857T-sen: CGGTGCTGCTTCTTCTCACCGTCTTCCTG (29mer) (SEQ ID NO: 10) and r856C857T-ant:
CAGGAAGACGGTGAGAAGAAGCAGCACCG (29mer) (SEQ ID NO: 11) was used to mutate T of the cDNA base sequence 856 to C and C of 857 to T. The base sequence of the obtained mutant cDNA is as shown in SEQ ID NO: 12. As a result, Ser at amino acid residue p.286 homologous to the human neuron acetylcholine receptor α4 subunit was mutated to Leu.
このように作成した変異導入の cDNA の c.104からc.221に、実施例1と同様に、配列番号23で表される118bpのヌクレオチドからなるプローブを作成し導入した。 In the same manner as in Example 1, a probe consisting of 118 bp nucleotide represented by SEQ ID NO: 23 was prepared and introduced into c.104 to c.221 of the mutagenized cDNA thus prepared.
上記のようにしてプローブを導入した変異導入cDNAを使用して、実施例1と同様にして組換え体を作出した。 Using the mutation-introduced cDNA into which the probe was introduced as described above, a recombinant was produced in the same manner as in Example 1.
[実施例3]
実施例1と同様にして、センスプライマーとしてのrCHRNA-878insGCT-sen:
GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC (30mer) (配列番号13)
とアンチセンスプライマーとしてのrCHRNA-878insGCT -ant:
GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC (30mer) (配列番号14)を用いて、cDNA塩基配列878番と879番目の間にGCTを挿入した。得られた変異cDNAの塩基配列は配列番号15に表されるとおりである。これによりヒトニューロンアセチルコリン受容体α4サブユニットと相同のアミノ酸残基p.293番のLeuとp.294番のIleの間にLeuが挿入された。
[Example 3]
As in Example 1, rCHRNA-878insGCT-sen as a sense primer:
GTCTTCCTGCTGCTGCTCATCACCGAGATC (30mer) (SEQ ID NO: 13)
And rCHRNA-878insGCT-ant as antisense primer:
GCT was inserted between the 878th and 879th cDNA nucleotide sequences using GATCTCGGTGATGAGCAGCAGCAGGAAGAC (30mer) (SEQ ID NO: 14). The base sequence of the obtained mutant cDNA is as shown in SEQ ID NO: 15. As a result, Leu was inserted between Leu at the amino acid residue p.293 and homologous to the human neuronal acetylcholine receptor α4 subunit and Ile at p.294.
このようにして作成した変異導入の cDNAを使用して、実施例1と同様にして、組換え体を作出した。 Using the mutation-introduced cDNA thus prepared, a recombinant was produced in the same manner as in Example 1.
[実施例4]
PCRクローニングで単離したラットChrnb2に、変異導入法により、c.856G>Cとc.856G>Aを導入した。つまり、Rat Brain QUICK-Clone cDNA ( CLONTECH Mountain View,CA) をテンプレートとして既存のラットChrnb2のcDNA配列を元に設計した二つのプライマー(BN-Rat CHRNB2 cDNA-F:
AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT ( 41mer )(配列番号5)とRat CHRNB2 cDNA-CB-R:
ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA ( 40mer ) (配列番号6)
とによりPCRを行った。得られたPCR産物を生成しpCRII-TOPO ベクター(Invitorogen Carlsbad , CA) にサブクローニングした。得られたクローンをシークエンスし、Chrnb2のcDNAの塩基配列を確認した。このラット塩基配列情報はアクセッション番号NM_019297 (NCBI)として登録されている。
得られたクローンにQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE、 La Jolla, CA)を用いて変異の導入を行った。まず、Rat CHRNB2 m286V/M-F:
CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC (30mer)(配列番号17)
とRat CHRNB2 m286V/M-R:GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG (30mer)(配列番号18)を用いて、cDNA塩基配列856番のGをCに変異させた。これによりヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuに変異した。
この変異導入の際に、c.856G>Cの導入により、制限酵素切断部位がHinf Ifが出現し、組換え体作出時、組換え体の識別を容易にできるよう考案した。
作成した変異導入のcDNAのc.1171からc.1232に、この部位とおなじアミノ酸配列となるが、基の塩基配列とは全く異なるプローブ(配列番号24)を導入した。
[Example 4]
C.856G> C and c.856G> A were introduced into rat Chrnb2 isolated by PCR cloning by mutagenesis. In other words, two primers (BN-Rat CHRNB2 cDNA-F) designed based on the existing rat Chrnb2 cDNA sequence using Rat Brain QUICK-Clone cDNA (CLONTECH Mountain View, CA) as a template.
AGATCTCGCGACATGGCCGGGCACTCCAACTCAATGGCGCT (41mer) (SEQ ID NO: 5) and Rat CHRNB2 cDNA-CB-R:
ATCGATGGATCCTCACTTGGAGCTGGGAGCTGAGTGGTCA (40mer) (SEQ ID NO: 6)
PCR was performed. The resulting PCR product was generated and subcloned into the pCRII-TOPO vector (Invitorogen Carlsbad, CA). The obtained clone was sequenced, and the nucleotide sequence of the Chrnb2 cDNA was confirmed. This rat base sequence information is registered under the accession number NM_019297 (NCBI).
Mutations were introduced into the obtained clones using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE, La Jolla, CA). First, Rat CHRNB2 m286V / MF:
CTCATCTCCAAGATTATGCCTCCCACCTCC (30mer) (SEQ ID NO: 17)
And Rat CHRNB2 m286V / MR: GGAGGTGGGAGGCATAATCTTGGAGATGAG (30mer) (SEQ ID NO: 18), G of cDNA base sequence 856 was mutated to C. As a result, Val at amino acid residue p.286 homologous to the human neuronal acetylcholine receptor β2 subunit was mutated to Leu.
At the time of this mutagenesis, by introducing c.856G> C, Hinf If appeared as a restriction enzyme cleavage site, and it was devised to make it easy to identify the recombinant when producing the recombinant.
A probe (SEQ ID NO: 24) having the same amino acid sequence as that of this site but completely different from the base sequence was introduced into c.1171 to c.1232 of the introduced cDNA for mutation introduction.
(配列番号24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
(SEQ ID NO: 24)
AACCCCGCCTCCGTCCAAGGACTCGCCGGCGCCTTTAGGGCCGAACCTACCGCCGCTGGCCC
なお、この62 bpのヌクレオチドを作成し、ハイブリダイゼイションののち、pCRII-TOPOベクターに挿入中のChrnb2のcDNAを制限酵素部位のHinc IIとSma Iを用いて挿入を行った。各ステップでシークエンスを行い、塩基配列の確認をおこなった。
さらに、該当変異とプローブを有したラットChrnb2のcDNA二種類を、pCI -neo ベクター由来のPDGFプロモーターを持つ発現ベクターに制限酵素部位Xho IとSal Iを用いて移行させたのち、制限酵素SnaBIとDraIIIで切断した。PDGFプロモーターとラットChrnb2のcDNA並びにpoly A部分を有す断端をゲル切り出しにより単離、精製した。この単離したDNAを受精卵に顕微注入し、状態の良好な200個以上の卵を受胚雌動物の卵管に移植し、自然分娩する方法によって組換え体を作出した。
The 62 bp nucleotide was prepared, and after hybridization, the Chrnb2 cDNA being inserted into the pCRII-TOPO vector was inserted using the restriction enzyme sites Hinc II and Sma I. Sequencing was performed at each step, and the base sequence was confirmed.
Furthermore, two types of rat Chrnb2 cDNAs with the relevant mutations and probes were transferred to an expression vector with a PDGF promoter derived from the pCI-neo vector using restriction enzyme sites Xho I and Sal I, and then the restriction enzymes SnaBI and Cut with DraIII. The PDGF promoter, rat Chrnb2 cDNA and the stump having the poly A portion were isolated and purified by gel excision. The isolated DNA was microinjected into a fertilized egg, and 200 or more eggs in good condition were transplanted into the oviduct of a fertilized female animal, and a recombinant was produced by a method of natural delivery.
[実施例5]
実施例4と同様に、Rat CHRNB2 m286V/L-F:
CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC (30mer)
(配列番号20)とRat CHRNB2 m286V/L-R:
GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG (30mer)(配列番号21)を用いて、cDNA塩基配列856番のGをAに変異させた。これによりヒトのニューロンアセチルコリン受容体β2サブユニットと相同のアミノ酸残基p.286番のValがMetに変異した。このようにして得られた変異導入cDNAを用いて、実施例4と同様にして組換え体を作出した。
[Example 5]
As in Example 4, Rat CHRNB2 m286V / LF:
CTCATCTCCAAGATTCTGCCTCCCACCTCC (30mer)
(SEQ ID NO: 20) and Rat CHRNB2 m286V / LR:
Using GGAGGTGGGAGGCAGAATCTTGGAGATGAG (30mer) (SEQ ID NO: 21), G of cDNA base sequence 856 was mutated to A. This mutated the Val at amino acid residue p.286 homologous to the human neuronal acetylcholine receptor β2 subunit to Met. Using the mutation-introduced cDNA thus obtained, a recombinant was produced in the same manner as in Example 4.
[実施例6]
てんかんモデルラットの脳波(electroencephalogram: EEG) 測定
8-10週齢のトランスジェニックラット(Chrnb2 V287L)に対して脳波(EEG)を測定した。ラットをnembutal(大日本住友製薬株式会社)で麻酔し、脳定位固定装置 (SR-5、成重)に固定し、電極をラットの頭蓋骨のbregma からArterial: 2.5 mm, Lateral: 1.5 mmとArterial: -2.5 mm, Lateral: 2.5 mmに、不関電極はラット鼻骨付近の骨の厚い部分に装着し、歯科用セメントで固定した。脳波測定用のテフロン (登録商標) 被覆ステンレス電極を左右大脳半球の前頭葉 (ブレグマよりA= 3. mm、L=0.8 mm) に装着し、歯科用セメントで固定した。不関電極は、小脳部位の上部に埋め込んだ。脳波(EEG) はVideoOption (キッセイコムテック) を用いて、数日間ラットをチャンバー内に入れて自由運動条件下で測定を行い、脳波解析はSleepSign (キッセイコムテック)を用いて行った。
脳波測定結果を図5に示す。図中、異常脳波部分を記号Aおよび記号Bで示し、その記号Aで示した異常脳波部分の拡大図を図6、また記号Bで示した異常脳波部分を図7に示す。この結果から、このラットはてんかんモデルラットとして利用できることが確認された。
[Example 6]
Electroencephalogram (EEG) measurement in epilepsy model rats
Electroencephalograms (EEG) were measured on 8-10 week old transgenic rats (Chrnb2 V287L). Rats were anesthetized with nembutal (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), fixed to a stereotaxic device (SR-5, adult weight), and the electrodes were arterial: 2.5 mm, Lateral: 1.5 mm and Arterial from bregma of rat skull : -2.5 mm, Lateral: At 2.5 mm, the indifferent electrode was attached to the thick part of the bone near the rat nasal bone and fixed with dental cement. A Teflon (registered trademark) -coated stainless steel electrode for EEG measurement was attached to the frontal lobe (A = 3 mm, L = 0.8 mm from Bregma) of the left and right cerebral hemispheres, and fixed with dental cement. The indifferent electrode was embedded above the cerebellar region. Electroencephalogram (EEG) was measured using VideoOption (Kissei Comtech) for several days in a chamber with free motion, and electroencephalogram analysis was performed using SleepSign (Kissei Comtech).
The electroencephalogram measurement results are shown in FIG. In the figure, the abnormal electroencephalogram portion is indicated by symbol A and symbol B, an enlarged view of the abnormal electroencephalogram portion indicated by symbol A is shown in FIG. 6, and the abnormal electroencephalogram portion indicated by symbol B is shown in FIG. From this result, it was confirmed that this rat can be used as an epilepsy model rat.
[実施例7]
オープンフィールド装置を使用した自発運動量の測定
被験動物として4−5ヶ月齢のTgラット(V287M)と、コントロールとしてnonTgラットを各5例ずつ実験に用いた。ラットを、オープンフィールド装置(図10:底面直径60 cm x 高さ50 cm x 入口直径80 cm)を使用して自発運動量の測定を行った。実験は、先ず、実験室の照明を消し、オープンフィールド装置底面の中心に光点が当たるようにデスクライトを設置し、ラットをケージごと実験環境に少なくとも30分間置いて馴化させた。その後、ラットをオープンフィールド装置底面の中心に実験動物を置き、その実験動物の腰部が区画の境界を横切った回数ならびに立ち上がり回数(壁面を支えにした場合を含む)を2分間観察した。その結果を図11および図12にそれぞれ示す。
[Example 7]
Measurement of Spontaneous Momentum Using Open Field Device Four to five month old Tg rats (V287M) were used as test animals and five non-Tg rats were used for experiments as controls. Rats were measured for locomotor activity using an open field device (Figure 10: bottom diameter 60 cm x height 50 cm x inlet diameter 80 cm). In the experiment, first, the laboratory light was turned off, a desk light was placed so that the light spot was in the center of the bottom of the open field device, and the rat was allowed to acclimate by placing it in the experimental environment for at least 30 minutes. Thereafter, an experimental animal was placed in the center of the bottom of the open field apparatus, and the number of times that the lumbar part of the experimental animal crossed the boundary of the compartment and the number of rising (including the case where the wall was supported) were observed for 2 minutes. The results are shown in FIGS. 11 and 12, respectively.
図11に示すように、Tgラット(V287M)の2分間の自動運動量は、コントロールとしてのnonTgラットの2分間の自動運動量に比べて、有意に高かった。この自発運動量の増加は、測定開始から1分間、および1分後から1分間のどの観察時間帯においても観察された。
他方、立ち上がり回数については、図12に示すように、Tgラット(V287M)の立ち上がり回数は、nonTgラットのそれに比べて、測定開始から1分間の回数は有意に増加したが、その後の回数は大差はなかった。また、2分間の総立ち上がり回数は、Tgラット(V287M)とnonTgラットとの間では大した差はなかった。
As shown in FIG. 11, the 2-minute automatic momentum of the Tg rat (V287M) was significantly higher than the 2-minute automatic momentum of the nonTg rat as a control. This increase in the amount of spontaneous exercise was observed in any observation time period of 1 minute from the start of measurement and 1 minute after 1 minute.
On the other hand, as for the number of rises, as shown in FIG. 12, the number of rises in the Tg rat (V287M) was significantly increased in the number of one minute from the start of measurement compared with that in the nonTg rat, but the number of rises after that was greatly different. There was no. In addition, the total number of rises in 2 minutes was not significantly different between Tg rats (V287M) and nonTg rats.
[実施例8]
高架式十字迷路装置を用いた不安様行動の測定
実験に使用した高架式十字迷路装置は図13に示すとおりである。実験動物としては、Tgラット(V287M)と、コントロールとしてのnonTgラットとを使用した。実験は、まず、実験室の照明を消して、高架式十字迷路装置のオープンアームに光点が当たるようにデスクライトを設置し、ラットをケージごとオープンアームに少なくとも30分間置いて訓化させた。その後、ラットをオープンアームの交点の中心に置き、オープンアームへの進入回数と進入時の滞在時間を10分間測定した。実験動物がオープンアームに侵入したか否かの判定は、実験動物の腰部が完全にオープンアームに入ったときとした。その結果を図14にそれぞれ示す。
[Example 8]
Measurement of anxiety-like behavior using an elevated plus-maze device The elevated plus-maze device used in the experiment is as shown in FIG. As experimental animals, Tg rats (V287M) and nonTg rats as controls were used. In the experiment, first, the laboratory lights were turned off, a desk light was placed so that a light spot was applied to the open arm of the elevated plus-maze device, and the rats were trained with the cage on the open arm for at least 30 minutes. . Thereafter, the rat was placed at the center of the intersection of the open arms, and the number of times of entry into the open arms and the staying time at the time of entry were measured for 10 minutes. Whether or not the experimental animal entered the open arm was determined when the lumbar part of the experimental animal completely entered the open arm. The results are shown in FIG.
図14に示すように、Tgラットの10分間のオープンアーム滞在時間は、nonTgラットのそれと比較して、有意に増加した。また、Tgラットのアームを横切った回数もnonTgラットと比較して、有意に増加した。 As shown in FIG. 14, the 10 minute open arm residence time of Tg rats was significantly increased compared to that of nonTg rats. In addition, the number of times the arm of the Tg rat was crossed significantly increased compared to the nonTg rat.
この発明に係る注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) モデル非ヒト哺乳動物は、ヒトの注意欠陥/多動性障害 (AD/HD) に酷似する行動障害を惹起することから、被験物質のAD/HDに対する有効性を確認してAD/HD予防薬または治療薬をスクリーニングすることができるとともに、被験薬剤のAD/HDに対する有効性を評価することができる。したがって、この発明の被験薬剤の注意欠陥/多動性障害(AD/HD)モデル非ヒト哺乳動物は、AD/HD予防薬または治療薬の研究開発に大いに寄与することができる。 The attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal according to the present invention causes behavioral disorders that closely resemble human attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD). It is possible to confirm the effectiveness of AD / HD against AD / HD and to screen for AD / HD preventive or therapeutic agents, and to evaluate the effectiveness of the test agent against AD / HD. Therefore, the attention deficit / hyperactivity disorder (AD / HD) model non-human mammal of the test drug of the present invention can greatly contribute to the research and development of AD / HD preventive or therapeutic agents.
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