JP2022002472A - Parkinson's disease model non-human animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、パーキンソン病モデル非ヒト動物及びパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening Parkinson's disease model non-human animals and Parkinson's disease preventive and therapeutic agents.
パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン神経細胞の脱落・変性を主体とする進行性変性疾患であり、４大症状として、（１）安静時振戦、（２）筋強剛（筋固縮）、（３）無動・寡動、（４）姿勢反射障害を特徴とする。近年では、運動症状のみならず、精神症状などの非運動症状も注目されている。発症年齢は、５０〜６５歳に多いが、高齢になるほど発病率が増加する。４０歳以下で発病するものは若年性パーキンソン病と呼ばれる。 Parkinson's disease is a progressive degenerative disease mainly due to the loss and degeneration of dopamine nerve cells in the melanoma of the midbrain, and the four major symptoms are (1) resting tremor and (2) muscle rigidity (muscle rigidity). ), (3) Immobility / tremor, and (4) Postural instability. In recent years, not only motor symptoms but also non-motor symptoms such as mental symptoms have been attracting attention. The age of onset is often 50 to 65 years, but the incidence increases as the elderly get older. Those who develop the disease under the age of 40 are called juvenile Parkinson's disease.
高齢化社会に伴い、パーキンソン病の有病率は確実に上昇しており、病気の進行に伴う生活の質の激しい低下と付随する介護費用は大きな社会問題となっている。パーキンソン病治療薬としては、Ｌ−ｄｏｐａとドーパミンアゴニストが用いられるが、いまだ十分な効果が得られているとは言いがたく、新しい治療薬の開発が望まれている。新しい治療薬の開発には、新しいパーキンソン病のモデル動物が望まれる。
パーキンソン病のモデル動物として、パーキンをコードする遺伝子が不活化し、且つＩＲＰ２が神経細胞で特異的に発現しているモデルマウス（特許文献１）、ドーパミン神経においてatg7遺伝子が欠損したモデル非ヒト動物（特許文献２）、変異型ヒトαシヌクレインフィブリルを非ヒト動物の黒質内に投与して得られるモデル非ヒト動物（特許文献３）、プロサポシン遺伝子変異を有する非ヒトモデル動物（特許文献４）が報告されている。
With the aging of society, the prevalence of Parkinson's disease is steadily rising, and the sharp decline in quality of life associated with the progression of the disease and the associated long-term care costs have become major social problems. L-dopa and dopamine agonists are used as therapeutic agents for Parkinson's disease, but it cannot be said that sufficient effects have been obtained yet, and development of new therapeutic agents is desired. New model animals for Parkinson's disease are desired for the development of new therapeutic agents.
As a model animal for Parkinson's disease, a model mouse in which the gene encoding Parkin is inactivated and IRP2 is specifically expressed in nerve cells (Patent Document 1), and a model non-human animal in which the atg7 gene is deleted in the dopaminergic nerve. (Patent Document 2), a model non-human animal obtained by administering a mutant human α-synuclein fibril into the substantia nigra of a non-human animal (Patent Document 3), and a non-human model animal having a prosaposin gene mutation (Patent Document 4). Has been reported.
しかし、前記のモデル非ヒト動物は、いずれもパーキンソン病のいくつかの症状や病理学的特徴を呈するものの、パーキンソン病特有の病理学的特徴を広く有するものではなかった。
従って、本発明の課題は、パーキンソン病特有の病理学的特徴を呈する新たなパーキンソン病のモデル動物、その作出方法、及び当該モデル動物を用いるパーキンソン病予防治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
However, although all of the above-mentioned model non-human animals exhibit some symptoms and pathological features of Parkinson's disease, they do not have a wide range of pathological features peculiar to Parkinson's disease.
Therefore, an object of the present invention is to provide a new Parkinson's disease model animal exhibiting pathological features peculiar to Parkinson's disease, a method for producing the same, and a screening method for a Parkinson's disease preventive therapeutic agent using the model animal. ..
そこで本発明者らは、遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子の一つであるCHCHD2遺伝子欠損非ヒト動物を作製し、その病理学的特徴、運動障害の発生などを検討したところ、パーキンソン病類似の運動障害を呈し、中脳黒質ドーパミン細胞の脱落を生じると共に、多くのパーキンソン病患者にみられるタンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性を有するパーキンソン病モデル非ヒト動物が得られ、このモデル非ヒト動物を用いれば新たなパーキンソン病予防治療薬がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors prepared a non-human animal lacking the CHCHD2 gene, which is one of the causative genes of hereditary Parkinson's disease, and examined its pathological characteristics and the occurrence of motor disorders. A Parkinson's disease model non-human animal with impaired, shedding of mesencephalic dopamine cells, formation of protein aggregates and mitochondrial degeneration found in many Parkinson's disease patients was obtained, and this model non-human animal was obtained. We have found that a new Parkinson's disease preventive and therapeutic agent can be screened by using the above, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明［１］〜［５］を提供するものである。
［１］CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とするパーキンソン病モデル非ヒト動物。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
［２］中脳黒質ドーパミン細胞内にシヌクレインの蓄積を認める、［１］記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［３］５０週齢以降にドーパミン神経細胞死と運動障害を生じるマウスである［１］又は［２］記載のパーキンソン病モデル非ヒト動物。
［４］CHCHD２遺伝子を欠損させることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載のパーキンソンモデル非ヒト動物の作出方法。
［５］［１］〜［３］のいずれかに記載の非ヒト動物を用いてパーキンソン病予防治療薬をスクリーニングする方法。
That is, the present invention provides the following inventions [1] to [5].
[1] A Parkinson's disease model non-human animal in which the function of the CHCHD2 gene is deficient, which is characterized by having all the following properties (1) to (4).
(1) Exhibits motility disorders similar to Parkinson's disease with aging (2) Dopamine cells decrease in the substantia nigra dense area compared to the wild type (3) Form protein aggregates in the substantia nigra dopamine cells (4) The Parkinson's disease model non-human animal according to [1], wherein the mitochondria of the substantia nigra dopamine cells are degenerated. [2] Accumulation of sinucrane is observed in the substantia nigra dopamine cells.
[3] The Parkinson's disease model non-human animal according to [1] or [2], which is a mouse that causes dopaminergic neuronal cell death and movement disorder after 50 weeks of age.
[4] The method for producing a Parkinson's model non-human animal according to any one of [1] to [3], which comprises deleting the CHCHD2 gene.
[5] A method for screening a preventive and therapeutic agent for Parkinson's disease using the non-human animal according to any one of [1] to [3].
本発明のモデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損したパーキンソン病モデル非ヒト動物であって、（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する、（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する、（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する、及び（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性するという特性を有する。これらの特性は、多くのパーキンソン病患者が有する特性であることから、本発明の非ヒト動物は、パーキンソン病のモデル非ヒト動物として有用である。また、本発明のモデル非ヒト動物を用いれば、パーキンソン病予防治療薬のスクリーニングが可能である。 The model non-human animal of the present invention is a Parkinson's disease model non-human animal in which the function of the CHCHD2 gene is deficient, and (1) exhibits a motor disorder similar to Parkinson's disease with aging, and (2) in the substantia nigra dense region. It has the characteristics that the number of dopamine cells is reduced as compared with the wild type, (3) protein aggregates are formed in the substantia nigra dopamine cells, and (4) the mitochondria of the substantia nigra dopamine cells are degenerated. Since these characteristics are characteristics possessed by many Parkinson's disease patients, the non-human animal of the present invention is useful as a model non-human animal for Parkinson's disease. Further, by using the model non-human animal of the present invention, it is possible to screen a preventive and therapeutic agent for Parkinson's disease.
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損し、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とする。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
The Parkinson's disease model non-human animal of the present invention is characterized in that the function of the CHCHD2 gene is deleted and all of the following properties (1) to (4) are possessed.
(1) Exhibits motility disorders similar to Parkinson's disease with aging (2) Dopamine cells decrease in the substantia nigra pars compacta compared to the wild type (3) Form protein aggregates in the midbrain substantia nigra dopamine cells (4) Midbrain substantia nigra dopamine cell mitochondria degenerate
本発明のモデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損している。
CHCHD2遺伝子から作られるタンパク質は、ミトコンドリアにあるタンパク質であり、パーキンソン病家系ではCHCHD2の特定のアミノ酸変異が共通して見つかっており、CHCHD2遺伝子は、パーキンソン病の原因遺伝子の一つとして同定されている（非特許文献１）。しかし、CHCHD2遺伝子の機能を欠損した非ヒト動物は、いまだ報告されていない。
The model non-human animal of the present invention lacks the function of the CHCHD2 gene.
The protein made from the CHCHD2 gene is a protein found in mitochondria, and specific amino acid mutations in CHCHD2 have been commonly found in Parkinson's disease families, and the CHCHD2 gene has been identified as one of the causative genes for Parkinson's disease. (Non-Patent Document 1). However, non-human animals lacking the function of the CHCHD2 gene have not yet been reported.
本発明において、CHCHD2遺伝子の機能が欠損しているには、CHCHD2遺伝子全体が欠損している場合だけでなく、CHCHD2遺伝子の塩基配列の少なくとも一部が欠損又は他の遺伝子と置換していることにより、CHCHD２が作られなくなった状態が含まれる。 In the present invention, the function of the CHCHD2 gene is deficient not only when the entire CHCHD2 gene is deficient, but also at least a part of the base sequence of the CHCHD2 gene is deficient or replaced with another gene. Therefore, the state in which CHCHD2 is no longer produced is included.
非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であればよいが、通常、実験動物として使用される動物であれば制限されず、非ヒト脊椎動物が好ましく、非ヒト哺乳動物がより好ましく、げっ歯類が特に好ましい。実験動物としては、例えば、サル、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。このうち、マウスが特に好ましく、マウスとしては雑種でも、系統種でもよい。 The non-human animal may be a non-human animal, but is not usually limited as long as it is an animal used as an experimental animal, a non-human vertebrate is preferable, a non-human mammal is more preferable, and a rodent. Is particularly preferable. Examples of the experimental animals include monkeys, dogs, cats, chickens, rabbits, pigs, cows, mice, rats, guinea pigs, hamsters and the like. Of these, mice are particularly preferable, and the mice may be hybrids or strains.
ドーパミン細胞において染色体上のCHCHD2遺伝子をノックアウトするには、通常染色体上の遺伝子をノックアウトするのに用いられている方法を適用することができ、好ましくは、コンディショナルノックアウト法を用いることができる。コンディショナルノックアウト法は、標的遺伝子の不活化を組織又は時期特異的にコントロールする方法で、例えば、標的遺伝子の全部又は一部をＤＮＡ組換え酵素であるリコンビナーゼの標的配列で挟んだ遺伝子座を有する非ヒト動物を、当該標的配列を認識するリコンビナーゼを組織又は時期特異的に発現する非ヒト動物と交配させることで、標的遺伝子が組織又は時期特異的に不活化された非ヒト動物を得ることができる。
リコンビナーゼと標的配列の組み合わせとしては、ＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰ配列（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）又はＦＬＰリコンビナーゼとＦＲＴ配列（ＦＬＰ−ＦＲＴシステム）等が挙げられる。このうち、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、バクテリオファージＰ１の有する部位特異的組換えシステムを利用したもので、ｌｏｘＰ配列と称されるバクテリオファージＰ１のゲノム由来の３４塩基からなるＤＮＡ配列に対し、ＤＮＡ組換え酵素であるＣｒｅリコンビナーゼが働き、ｌｏｘＰ配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。ＦＬＰ−ＦＲＴシステムは、出芽酵母由来のＦＲＴ配列にＦＬＰリコンビナーゼが働き、ＦＲＴ配列同士の間で部位特異的組換えを生じる。Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼを発現するためのプロモーターを選択することにより、標的遺伝子の改変を組織又は時期特異的にコントロールできるため、これらシステムはコンディショナルノックアウト法に好適に利用される。
To knock out the CHCHD2 gene on the chromosome in dopamine cells, the method normally used for knocking out the gene on the chromosome can be applied, preferably the conditional knockout method. The conditional knockout method is a method for controlling inactivation of a target gene in a tissue or time-specific manner, and has, for example, a locus in which all or part of the target gene is sandwiched between target sequences of recombinase, which is a DNA recombinant enzyme. By crossing a non-human animal with a non-human animal that expresses a recombinase that recognizes the target sequence in a tissue or time-specific manner, it is possible to obtain a non-human animal in which the target gene is tissue- or time-specifically inactivated. can.
Examples of the combination of the recombinase and the target sequence include Cre recombinase and the loxP sequence (Cre-loxP system), FLP recombinase and the FRT sequence (FLP-FRT system), and the like. Of these, the Cre-loxP system utilizes the site-specific recombination system possessed by Bacterophage P1, and is a DNA set for a DNA sequence consisting of 34 bases derived from the genome of Bacterophage P1, which is called a loxP sequence. Cre recombinase, a recombinase, acts to cause site-specific recombination between loxP sequences. In the FLP-FRT system, FLP recombinase acts on FRT sequences derived from Saccharomyces cerevisiae to cause site-specific recombination between FRT sequences. By selecting a promoter for expressing Cre recombinase or FLP recombinase, modification of the target gene can be controlled tissue- or time-specifically, and thus these systems are suitably used for the conditional knockout method.
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、例えば、リコンビナーゼ標的配列に前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有する非ヒト動物を作製し、これとドーパミン細胞特異的に当該標的配列を認識するリコンビナーゼを発現する非ヒト動物とを交配することで得ることができる。以下に、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物の代表的な作製方法について、マウスを例にとり詳細に説明するが、これに限定されるものではなく、また他の非ヒト動物でも同様にして作製し得る。 The Parkinson's disease model non-human animal of the present invention is, for example, prepared as a non-human animal having the CHCHD2 gene homozygously sandwiched between the recombinase target sequence and the dopamine cell-specific recognition of the target sequence. It can be obtained by mating with a non-human animal expressing the recombinase. Hereinafter, a typical method for producing a Parkinson's disease model non-human animal of the present invention will be described in detail using a mouse as an example, but the present invention is not limited to this, and other non-human animals are similarly produced. Can be.
（１）リコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有するマウスの作製
まず、マウスCHCHD2遺伝子の機能を欠損させるための相同組換え用ターゲティングベクターを作製する。ターゲティングベクターは、データベース等より得た塩基配列情報をもとに、欠失させるCHCHD2遺伝子の領域を決め、その上流及び下流にリコンビナーゼ標的配列を同じ向きで挿入し、さらにその上流及び下流に欠失させる領域の両端のゲノム領域（１〜８ｋｂ程度）を相同組換えに必要な相同領域として配置して設計すればよい。欠失させるCHCHD2遺伝子の領域は、特に制限されず、CHCHD2遺伝子の全部でも一部でもよいが、一部を用いる場合、機能ドメインを含むエキソン等、その領域が失われると機能する遺伝子産物が得られなくなる領域が好ましい。例えば、活性部位のシステイン残基が存在するエキソン１４を含む領域が挙げられる。このとき、リコンビナーゼを発現しない細胞では、正常な遺伝子産物が得られるようにする点に留意する。相同領域については、相同組換え効率、相同組換えを起こした細胞の同定方法等を考慮して設計するのが好ましい。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用する場合、ターゲティングベクターは、例えば、同じ向きのｌｏｘＰ配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子の全部又は一部を含み、その上流及び下流に相同領域を含む。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現下では、染色体上のｌｏｘＰ配列で挟まれたCHCHD2遺伝子は切り出され、正常な遺伝子産物が得られなくなる。
(1) Preparation of a mouse having the CHCHD2 gene sandwiched between the front and back by the recombinase target sequence in a homozygous manner First, a targeting vector for homologous recombination for deleting the function of the mouse CHCHD2 gene is prepared. In the targeting vector, the region of the CHCHD2 gene to be deleted is determined based on the base sequence information obtained from a database or the like, the recombinase target sequence is inserted upstream and downstream thereof in the same direction, and the deletion is further upstream and downstream thereof. The genomic regions (about 1 to 8 kb) at both ends of the region to be subjected to the region may be arranged and designed as homologous regions required for homologous recombination. The region of the CHCHD2 gene to be deleted is not particularly limited and may be all or part of the CHCHD2 gene, but when a part of the CHCHD2 gene is used, a gene product that functions when the region is lost, such as an exon containing a functional domain, is obtained. The region where it cannot be prevented is preferable. For example, a region containing exon 14 in which a cysteine residue in the active site is present can be mentioned. At this time, it should be noted that a normal gene product can be obtained in cells that do not express recombinase. It is preferable to design the homologous region in consideration of the homologous recombination efficiency, the method for identifying the cells that have undergone homologous recombination, and the like.
When utilizing the Cre-loxP system, the targeting vector contains, for example, all or part of the CHCHD2 gene flanked by loxP sequences in the same orientation, including homologous regions upstream and downstream thereof. Under Cre recombinase expression, the CHCHD2 gene sandwiched between loxP sequences on the chromosome is excised, and a normal gene product cannot be obtained.
また、ターゲティングベクターには、ベクターが取り込まれた細胞や目的とする相同組換えの起こっている可能性の高い細胞を選択するためのマーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）等の薬剤選択に通常用いられる遺伝子が挿入されていることが好ましい。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより相同組換えが生じた細胞の選抜を可能にするポジティブ選択用マーカー遺伝子である。また、目的細胞を選抜するためのネガティブ選択に用いるマーカー遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（選択剤としてガンシクロビル等を用い、それに対する感受性により非相同組換え体を選抜除去する）、ジフテリアトキシンＡフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体を選抜除去する）等をポジティブ選択用マーカー遺伝子と共に用いることもできる。ターゲティングベクターにおいて、ポジティブ選択用マーカー遺伝子は、上流と下流の相同領域に挟まれた領域に位置するのが好ましく、リコンビナーゼ存在下でマーカー遺伝子が切り出されることからリコンビナーゼ標的配列に挟まれた領域に位置するのがさらに好ましい。また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を、CHCHD2遺伝子の切り出しに用いるのとは異なるリコンビナーゼ標的配列で挟んでおけば、後で当該リコンビナーゼによりマーカー遺伝子のみを除去することもできる。ネガティブ選択用マーカー遺伝子は、上流又は下流の相同領域の外側の領域に位置するのが好ましい。 In addition, the targeting vector includes a marker gene for selecting a cell into which the vector has been taken up or a cell having a high possibility of homologous recombination of interest, such as a neomycin resistance gene (neo) or a hyglomycin resistance gene ( It is preferable that genes usually used for drug selection such as hyg), herpesvirus thymidine kinase gene (HSV-tk), diphtheria toxin A fragment gene (DT-A), and thymidine kinase gene (tk) are inserted. For example, the neomycin resistance gene is a positive selection marker gene that enables selection of cells in which homologous recombination has occurred by using the neomycin analog G418. In addition, a marker gene used for negative selection for selecting target cells, for example, a thymidine kinase gene (using cancercyclovir or the like as a selection agent and selecting and removing a non-homologous recombinant depending on its sensitivity), a diphtheria toxin A fragment gene ( (Selection and removal of non-homologous recombinants by diphtheria toxin expressed by DT-A) and the like can also be used together with a marker gene for positive selection. In the targeting vector, the marker gene for positive selection is preferably located in the region sandwiched between the upstream and downstream homologous regions, and since the marker gene is excised in the presence of recombinase, it is located in the region sandwiched between the recombinase target sequences. It is more preferable to do so. Further, if the marker gene for positive selection is sandwiched between a recombinase target sequence different from that used for excision of the CHCHD2 gene, only the marker gene can be removed later by the recombinase. The marker gene for negative selection is preferably located in the region outside the homologous region upstream or downstream.
斯かるターゲティングベクターの調製は、通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例えば、常法に従ってクローニングしたCHCHD2遺伝子やＢＡＣクローンを利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断片、又はＰＣＲ法などにより増幅して調製したＤＮＡ断片等を、合成されたリンカーＤＮＡやレポーター遺伝子、薬剤耐性マーカー遺伝子を含む断片等と、前記のような設計に従って適当な順序で結合させればよい。 The preparation of such a targeting vector can be carried out by a conventional DNA recombination technique. For example, a fragment obtained by using a CHCHD2 gene or a BAC clone cloned according to a conventional method and cleaving it with an appropriate restriction enzyme. , DNA fragments prepared by amplification by the PCR method or the like may be bound to synthesized linker DNA, reporter genes, fragments containing drug resistance marker genes, etc. in an appropriate order according to the above design. ..
次に、調製した相同組換え用ターゲティングベクターを、通常キメラ動物の作出に用いられる適当な細胞に導入する。ここで用いる細胞は、例えば卵細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられるが、生体のあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有している点でＥＳ細胞が好ましい。 Next, the prepared targeting vector for homologous recombination is introduced into suitable cells usually used for producing chimeric animals. Examples of the cells used here include egg cells and embryonic stem cells (ES cells), and ES cells are preferable because they have pluripotency capable of differentiating into all types of cells in the living body.
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖・培養可能な細胞株であり、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、マウスについては確立されている（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８（１９８８））。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、例えばマウスの場合、ＴＴ２、Ｃ５７ＢＬ／６等のマウス系統由来のＥＳ細胞が挙げられる。あるいは、新たに樹立したものを用いてもよい。ＥＳ細胞は、常法に従って継代培養すればよい。 ES cells are cell lines established from the inner cell mass (ICM) of blastocysts and capable of proliferation and culturing while maintaining an undifferentiated state, and a method for gene transfer using ES cells has been established for mice. (Mansour, SL et al., Nature 336: 348 (1988)). As the ES cells, an already established cell line may be used. For example, in the case of mice, ES cells derived from mouse strains such as TT2 and C57BL / 6 can be mentioned. Alternatively, a newly established one may be used. ES cells may be subcultured according to a conventional method.
ターゲティングベクターの細胞への導入は、通常の方法、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等によって行うことができる。このうち、簡便で多数の細胞を処理できることから、エレクトロポレーション法が好適に用いられる。エレクトロポレーション法による遺伝子導入の条件は、通常の動物細胞への遺伝子導入の条件を用いればよい。 The introduction of the targeting vector into cells can be carried out by a usual method, for example, an electroporation method, a microinjection method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a DEAE-dextran method, or the like. Of these, the electroporation method is preferably used because it can easily treat a large number of cells. As the conditions for gene transfer by the electroporation method, the conditions for gene transfer into normal animal cells may be used.
ターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞は、常法に従い、フィーダー細胞上で培養することで、単一細胞由来のコロニーを得ることができる。このとき、相同組換えが生じたＥＳ細胞では、ベクター中のCHCHD2遺伝子とともにマーカー遺伝子も染色体に組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現に基づいて、例えば適当な期間薬剤存在下で培養することにより、目的のＥＳ細胞を選択することができる。また、当該コロニーから抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーション法等により、相同組換えが生じたＥＳ細胞を選択することもできる。ＰＣＲ法の場合は、例えば、相同領域の外側に設計したプライマーと、マーカー遺伝子内に設計したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、所望の長さのバンドが得られるかどうかで判断することができる。サザンハイブリダイゼーション法の場合は、例えば、相同組換えによる切断パターンの変化を観察しやすい制限酵素でゲノムＤＮＡを消化したＤＮＡ断片と、相同領域の外側に設計したプローブ及びマーカー遺伝子に設計したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、目的の位置にバンドが得られるかどうかで判断することができる。 ES cells into which a targeting vector has been introduced can be cultured on feeder cells according to a conventional method to obtain colonies derived from a single cell. At this time, in ES cells in which homologous recombination has occurred, the marker gene is integrated into the chromosome together with the CHCHD2 gene in the vector. Therefore, based on the expression of the marker gene, for example, by culturing in the presence of a drug for an appropriate period of time. , The desired ES cell can be selected. Further, using the genomic DNA extracted from the colony, ES cells in which homologous recombination has occurred can be selected by a PCR method, a Southern hybridization method, or the like. In the case of the PCR method, for example, using a primer designed outside the homology region and a primer designed inside the marker gene, PCR is performed using genomic DNA as a template, and it is determined whether or not a band of a desired length can be obtained. can do. In the case of the Southern hybridization method, for example, a DNA fragment obtained by digesting genomic DNA with a restriction enzyme that makes it easy to observe changes in the cleavage pattern due to homologous recombination, a probe designed outside the homologous region, and a probe designed as a marker gene are used. Southern hybridization can be performed using this to determine whether or not a band can be obtained at the desired position.
次に、相同組換えを生じたＥＳ細胞を用いて、インジェクション法又はアグリゲーション法等の通常のキメラ動物の作出に用いられる方法に従い、キメラ動物を作製する。具体的には、相同組換えを生じたＥＳ細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば８細胞期の胚又は胚盤胞に注入し、得られた胚を偽妊娠状態の雌の仮親の子宮内に移植することにより、正常なCHCHD2遺伝子座をもつ細胞とＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ細胞とから構成されるキメラ動物が得られる。宿主胚をどのような系統の動物から得るのかの選択は、常法に従い毛色等の表現型によりＥＳ細胞由来の細胞と宿主胚由来の細胞とを区別することができるように行えばよい。 Next, using the ES cells that have undergone homologous recombination, a chimeric animal is produced according to a method used for producing a normal chimeric animal such as an injection method or an aggregation method. Specifically, ES cells that have undergone homologous recombination are injected into embryos or blastocysts at an appropriate early stage of embryogenesis, such as 8-cell stage embryos or blastocysts, and the resulting embryos are used in pseudopregnant female foster mothers. By transplanting into the uterus, a chimeric animal composed of cells having a normal CHCHD2 locus and cells having a CHCHD2 locus derived from ES cells can be obtained. The selection of the strain of the animal from which the host embryo is obtained may be made so that the cells derived from ES cells and the cells derived from the host embryo can be distinguished by a phenotype such as hair color according to a conventional method.
キメラ動物の生殖細胞の一部がＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ場合には、キメラ個体を正常個体と交配することにより得られた個体群より、全ての組織がＥＳ細胞由来のCHCHD2遺伝子座をもつ細胞で構成された個体（CHCHD2 Ｆ／＋）を毛色等の判別法により選別することができる。
例えば、Ｊ１株のマウスＥＳ細胞とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系の宿主胚を用いて得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系と交配する場合は、娩出される産仔は、キメラマウスの生殖細胞が相同組換えＥＳ細胞に由来していれば該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色（アグーチ）を呈し、宿主胚に由来していれば該宿主胚が由来するマウスと同じ黒色を呈する。
When some of the germ cells of the chimeric animal have the CHCHD2 loci derived from ES cells, all the tissues from the population obtained by mating the chimeric individual with the normal individual have the CHCHD2 loci derived from ES cells. Individuals (CHCHD2 F / +) composed of cells having a gene can be selected by a method for discriminating hair color or the like.
For example, when a chimeric mouse obtained by using a J1 strain mouse ES cell and a C57BL / 6J system host embryo is mated with a C57BL / 6J system, the germ cells of the chimeric mouse are homologous to the delivered offspring. If it is derived from a replacement ES cell, it exhibits the same wild color (agout) as the mouse from which the ES cell is derived, and if it is derived from a host embryo, it exhibits the same black color as the mouse from which the host embryo is derived.
かくして得られた個体は、相同組換えＥＳ細胞由来CHCHD2遺伝子座を一方の相同染色体に有するヘテロ接合型である（CHCHD2 Ｆ／＋）。このＦ１ヘテロ接合型の個体同士を交配すれば、Ｆ２ヘテロ接合型及びＦ２ホモ接合型（CHCHD2 Ｆ／Ｆ）の個体を得ることができる。CHCHD2遺伝子の機能を組織特異的に欠損させるには、ホモ接合型を用いることが好ましい。 The individual thus obtained is a heterozygous type having a homologous recombinant ES cell-derived CHCHD2 locus on one homologous chromosome (CHCHD2 F / +). By mating these F1 heterozygous individuals with each other, F2 heterozygous and F2 homozygous (CHCHD2 F / F) individuals can be obtained. In order to delete the function of the CHCHD2 gene in a tissue-specific manner, it is preferable to use a homozygous type.
（２）ドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスの作製
ドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスは、例えば、ドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターの下流にリコンビナーゼをコードする遺伝子を発現可能に連結したトランスジーンを用いて、公知のトランスジェニックマウスを作製する方法により作製することができる。
(2) Preparation of mice expressing recombinase specifically for dopamine cells In mice expressing recombinase specifically for dopamine cells, for example, a gene encoding recombinase can be ligated downstream of a promoter that acts specifically for dopamine cells. It can be produced by a method for producing a known transgenic mouse using the above-mentioned transgene.
まず、ドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターにリコンビナーゼをコードする遺伝子を発現可能に連結したトランスジーンを含む発現ベクターを作製する。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いる場合、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするｃｒｅ遺伝子を用いればよい。ｃｒｅ遺伝子としては、ｌｏｘＰ配列を認識してｌｏｘＰ配列に挟まれたＤＮＡ配列を切り出すことができるタンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されないが、好ましくはバクテリオファージＰ１由来のｃｒｅ遺伝子が用いられる（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ０３４５３）。
First, an expression vector containing a transgene in which a gene encoding a recombinase is expressively linked to a promoter that acts specifically on dopamine cells is prepared.
When the Cre-loxP system is used, the gene encoding the recombinase may be the cr gene encoding the Cre recombinase. The cre gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding a protein capable of recognizing a loxP sequence and excising a DNA sequence sandwiched between the loxP sequences, but a cre gene derived from bacteriophage P1 is preferably used (preferably, a cre gene derived from bacteriophage P1 is used. GenBank accession No. X03453).
ｃｒｅ遺伝子の発現を制御するプロモーターとしては、ドーパミン細胞特異的に機能し得るプロモーターであればよく、例えばチロシン水酸化酵素（ＴＨ）プロモーターが挙げられる。当該プロモーターにより、Ｃｒｅリコンビナーゼがドーパミン細胞特異的に発現される。なお、「ドーパミン細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現する」とは、ドーパミン細胞においてそれ以外の組織と比較してＣｒｅリコンビナーゼを顕著に多く発現することをいう。 The promoter that controls the expression of the cre gene may be any promoter that can function specifically for dopamine cells, and examples thereof include a tyrosine hydroxylase (TH) promoter. Cre recombinase is expressed specifically in dopamine cells by the promoter. In addition, "expressing Cre recombinase specifically for dopamine cells" means that Cre recombinase is significantly expressed in dopamine cells as compared with other tissues.
発現ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターには、ｃｒｅ遺伝子の下流にポリＡシグナルを含むことが好ましく、また、トランスジーンが導入された細胞の選抜のため、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含むことが好ましい。 Examples of the expression vector include viral vectors such as plasmids, bacteriophages, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retroviral vectors, and lentiviral vectors. The expression vector preferably contains a poly A signal downstream of the cr gene, and is a marker gene such as a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene for selection of cells into which a transgene has been introduced. Is preferably included.
斯かる発現ベクターの調製は、通常のＤＮＡ組換え技術により行うことができ、例えば、常法に従いクローニングしたＴＨプロモーター及びｃｒｅ遺伝子を利用して、これを適当な制限酵素で切断して得られる断片、又はＰＣＲ法などにより増幅して調製したＤＮＡ断片等を、合成されたリンカーＤＮＡや薬剤耐性マーカー遺伝子を含む断片等と、前記のような設計に従って適当な順序で結合させればよい。 The preparation of such an expression vector can be carried out by a conventional DNA recombination technique, for example, a fragment obtained by cleaving the TH promoter and the cr gene cloned according to a conventional method with an appropriate restriction enzyme. , DNA fragments prepared by amplification by the PCR method or the like may be bound to the synthesized linker DNA, fragments containing the drug resistance marker gene, etc. in an appropriate order according to the above design.
次に、発現ベクターを公知の手段を用いてマウスに導入する。発現ベクターを動物細胞又は動物個体に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、導入細胞種、発現効率などを考慮して適宜選択すればよい。例えば、受精卵を用いる場合には、直鎖状にした発現ベクターＤＮＡをマウスの前核期受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、当該受精卵を偽妊娠状態の雌の仮親に移植し、うまれた子の中から目的遺伝子を発現している個体をＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法等により確認し、選抜することができる。 Next, the expression vector is introduced into mice using known means. Examples of the method for introducing an expression vector into an animal cell or an individual animal include, but are not limited to, a lipofection method, an electroporation method, a microinjection method, and a method using a viral vector. It may be appropriately selected in consideration of the introduced cell type, expression efficiency and the like. For example, when a fertilized egg is used, a linearized expression vector DNA is introduced into the pronuclear stage fertilized egg of a mouse by a microinjection method, and the fertilized egg is transplanted to a foster parent of a pseudopregnant female. Individuals expressing the target gene can be confirmed and selected from the pups by the PCR method, Southern hybridization method, or the like.
かくして得られたＦ０動物は、ｃｒｅ遺伝子を相同染色体の一方にのみ有するヘテロ接合型（ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−））である。本発明においては、当該ヘテロ接合型の個体を用いればよい。以下、ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）マウスをＴＨ−Ｃｒｅマウスとも称す。 The F0 animal thus obtained is a heterozygous type (TH-Cre (+/-)) having the cr gene on only one of the homologous chromosomes. In the present invention, the heterozygous individual may be used. Hereinafter, the TH-Cre (+/-) mouse is also referred to as a TH-Cre mouse.
ＴＨ−Ｃｒｅマウスは上述の方法等により作製できるが、内在性のドーパミン細胞特異的に作用するプロモーターの下流にｃｒｅ遺伝子が発現可能に挿入されるように設計したターゲティングベクターを作製し、これを上記同様の相同組換えによりＥＳ細胞に導入し、ノックインマウスを作製することでも得ることができる。あるいは、既存のＴＨ−Ｃｒｅマウスを用いてもよく、例えば、Savitt et al., The Journal of Neuroscience, Vol.25, No. 29, 2005, 6721-6728に記載のマウスが挙げられる。 TH-Cre mice can be produced by the above-mentioned method or the like, but a targeting vector designed so that the cr gene can be expressively inserted downstream of a promoter that acts specifically on endogenous dopamine cells is produced, and the above-mentioned targeting vector is prepared. It can also be obtained by introducing into ES cells by the same homologous recombination and producing a knock-in mouse. Alternatively, existing TH-Cre mice may be used, and examples thereof include the mice described in Savitt et al., The Journal of Neuroscience, Vol.25, No. 29, 2005, 6721-6728.
（３）ドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損したマウスの作製
本発明のドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損したマウスは、（１）で得られたリコンビナーゼ標的配列で前後を挟まれたCHCHD2遺伝子をホモ接合型で有するマウスと、（２）で得られたドーパミン細胞特異的にリコンビナーゼを発現するマウスを交配することで得ることができる。例えば、（１）のCHCHD2 Ｆ／Ｆマウスと（２）のＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）マウスを交配する場合、得られるＦ１動物はCHCHD2 Ｆ／＋：ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）、あるいはCHCHD2 Ｆ／＋：ＴＨ−Ｃｒｅ（−／−）である。このＦ１動物同士を交配すれば、Ｆ２動物の一部がCHCHD2 Ｆ／Ｆ：ＴＨ−Ｃｒｅ（＋／−）となる。
CHCHD2 Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅ（＋／−）マウスは、ＴＨプロモーターの働きにより、ドーパミン細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現し、当該Ｃｒｅリコンビナーゼにより染色体上のCHCHD2遺伝子が切り出されるため、ドーパミン神経においてａｔｇ７遺伝子の機能が欠損したマウスとなる。当該マウスは、ドーパミン神経特異的にオートファジーを欠損する。以下、CHCHD2 Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅ（＋／−）マウスをCHCHD2 Ｆ／Ｆ：ＴＨ−ｃｒｅマウスとも称す。
(3) Preparation of a mouse lacking the function of the CHCHD2 gene in the dopamine nerve The mouse lacking the function of the CHCHD2 gene in the dopamine nerve of the present invention has the CHCHD2 gene sandwiched between the recombinase target sequence obtained in (1). It can be obtained by mating a mouse having a homozygous form with a mouse expressing the dopamine cell-specific recombinase obtained in (2). For example, when the CHCHD2 F / F mouse of (1) and the TH-Cre (+/-) mouse of (2) are mated, the obtained F1 animal is CHCHD2 F / +: TH-Cre (+/-), or CHCHD2 F / +: TH-Cre (-/-). When these F1 animals are mated with each other, a part of the F2 animals becomes CHCHD2 F / F: TH-Cre (+/-).
CHCHD2 F / F: TH-cre (+/-) mice express Cre recombinase specifically for dopamine cells by the action of the TH promoter, and the Cre recombinase excises the CHCHD2 gene on the chromosome in the dopaminergic nerve. The mouse is deficient in the function of the atg7 gene. The mouse is dopaminergic nerve-specifically deficient in autophagy. Hereinafter, the CHCHD2 F / F: TH-cre (+/-) mouse is also referred to as a CHCHD2 F / F: TH-cre mouse.
CHCHD2遺伝子を欠損させる手段としては、ゲノム編集技術も挙げられる。ゲノム編集技術としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａs９が挙げられ、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９を用いるのが特に好ましい。 Genome editing technology can also be mentioned as a means for deleting the CHCHD2 gene. Examples of the genome editing technique include ZFN, TALEN, and CRISPR / Cas9, and it is particularly preferable to use CRISPR / Cas9.
得られた非ヒト動物が、CHCHD2遺伝子を欠損しているかどうかは、非ヒト動物から採取したＤＮＡについて、２段階ＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物に対してＴ７Ｅ１アッセイを行えばよい。ＰＣＲ産物でミスマッチのＤＮＡがあれば、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１が特異的に認識し、切断するので、変異陽性の非ヒト動物を同定することができる。その後、ＰＣＲ産物を用いてダイレクトシークエンスあるいはＴＡクローニング後にシークエンス解析を行う。 Whether or not the obtained non-human animal lacks the CHCHD2 gene may be determined by performing a two-step PCR on DNA collected from the non-human animal and performing a T7E1 assay on the PCR product. If there is mismatched DNA in the PCR product, T7 endonuclease 1 specifically recognizes and cleaves it, so that mutation-positive non-human animals can be identified. Then, using the PCR product, direct sequence or TA cloning and then sequence analysis are performed.
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、CHCHD2遺伝子の機能が欠損し、下記の（１）〜（４）のすべての性質を有することを特徴とする。
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する
この（１）〜（４）の性質はパーキンソン病に特徴的な運動障害と３つの病理像を再現するものであることから、本発明の非ヒト動物は、パーキンソン病モデル非ヒト動物として有用である。
As shown in Examples below, the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention is characterized in that the function of the CHCHD2 gene is deleted and all of the following properties (1) to (4) are possessed.
(1) Parkinson's disease-like motor disorders are exhibited with aging (2) Dopamine cells decrease in the substantia nigra pars compacta compared to the wild type (3) Protein aggregates are formed in the substantia nigra dopamine cells (4) Degeneration of mitochondria in substantia nigra dopamine cells The properties of (1) to (4) of the present invention reproduce the motor disorders and three pathological images characteristic of Parkinson's disease. Non-human animals are useful as Parkinson's disease model non-human animals.
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、野生型動物に比べて、加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する。
運動障害の有無は、常法に従い、ロータロッド試験、ビーム課題等により評価することができ、例えば、ロータロッド試験では転倒又は落下潜時の短縮がみられ、ビーム課題では頻繁に滑り、後肢がビームから外れるような運動症状がみられる。
ここで、「野生型動物」とは、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物と同系統、かつドーパミン神経においてCHCHD2遺伝子の機能が欠損していない非ヒト動物のことであり、例えば、遺伝子改変を行っていない非ヒト動物、CHCHD2 Ｆ／Ｆ非ヒト動物等が挙げられる。野生型動物に比した運動機能の低下が生じる週齢は、動物種により異なり得るが、マウスの場合、１００週以降、好ましくは１１０週以降、更に好ましくは１１５週以降である。例えば、本発明のパーキンソン病モデルマウスを用いれば、従来寿命内では困難とされた運動障害の観察が可能となる。
As shown in Examples below, the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention exhibits a Parkinson's disease-like movement disorder with aging as compared with a wild-type animal.
The presence or absence of dyskinesia can be evaluated by a rotarod test, a beam task, etc. according to a conventional method. There are motor symptoms that seem to deviate from the beam.
Here, the "wild-type animal" is a non-human animal having the same strain as the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention and having no defect in the function of the CHCHD2 gene in the dopaminergic nerve. Examples include non-human animals that have not been treated, CHCHD2 F / F non-human animals, and the like. The age at which the decline in motor function occurs as compared with wild-type animals may vary depending on the animal species, but in the case of mice, it is 100 weeks or later, preferably 110 weeks or later, and more preferably 115 weeks or later. For example, by using the Parkinson's disease model mouse of the present invention, it is possible to observe a movement disorder that has been difficult in the conventional life.
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、黒質緻密部において、野生型動物に比してドーパミン細胞が減少している。「野生型動物」については、上述の通りである。野生型動物に比したドーパミン細胞の減少が生じる週齢は、動物種により異なり得るが、マウスの場合、特に限定されず、好ましくは１００週以降、更に好ましくは１１０週以降、更に好ましくは１１５週以降である。ドーパミン細胞の減少は、例えば、免疫染色法により検出することができる。黒質緻密部におけるドーパミン細胞の減少も、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴をも再現することができる。 As shown in Examples below, the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention has a decrease in dopamine cells in the substantia nigra pars compacta as compared with the wild-type animal. The "wild-type animals" are as described above. The age at which the decrease in dopamine cells occurs as compared with wild-type animals may vary depending on the animal species, but in the case of mice, it is not particularly limited, and is preferably 100 weeks or later, more preferably 110 weeks or later, still more preferably 115 weeks. After that. Decrease in dopamine cells can be detected, for example, by immunostaining. The decrease in dopamine cells in the substantia nigra pars compacta is also one of the pathological features characteristic of Parkinson's disease, and the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention can reproduce this characteristic as well.
後記実施例に示す通り、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する。当該凝集体の存在は、例えば、ドーパミン細胞を電子顕微鏡で観察することで確認することができる。また、当該凝集体には、レビー小体の主要構成成分であるα−シヌクレインの他、ｐ６２が含まれることが、免疫染色により確認できる。タンパク質凝集体の形成は、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴を再現することができる。 As shown in Examples below, the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention forms protein aggregates in midbrain substantia nigra dopamine cells. The presence of the aggregate can be confirmed, for example, by observing the dopamine cells with an electron microscope. Further, it can be confirmed by immunostaining that the aggregate contains p62 in addition to α-synuclein, which is a main component of Lewy bodies. The formation of protein aggregates is one of the pathological features characteristic of Parkinson's disease, and the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention can reproduce the characteristics.
後記実施例に示すとおり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する。ミトコンドリアの変性は、例えば、ドーパミン細胞を電子顕微鏡で観察することで確認することができる。ミトコンドリアの変性は、パーキンソン病に特徴的な病理像の１つであり、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、当該特徴を再現することができる。また、タンパク質凝集体の形成とミトコンドリアの変性という、パーキンソン病に特徴的な病理像を示すモデル非ヒト動物は報告がない。 As shown in Examples below, the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention degenerates the mitochondria of midbrain substantia nigra dopamine cells. Mitochondrial degeneration can be confirmed, for example, by observing dopamine cells with an electron microscope. Mitochondrial degeneration is one of the pathological features characteristic of Parkinson's disease, and the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention can reproduce the characteristic. In addition, there are no reports of model non-human animals showing the pathological features characteristic of Parkinson's disease, such as the formation of protein aggregates and the degeneration of mitochondria.
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物は、加齢に伴い運動障害を生じるというパーキンソン病による運動障害を再現し、タンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性及びドーパミン細胞の減少というパーキンソン病に特徴的な病理像をあわせもつ。従って、当該モデル非ヒト動物を用いれば、パーキンソン病治療薬をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、運動機能、タンパク質凝集体、ミトコンドリアの変性及び黒質緻密部のドーパミン細胞から選ばれる１以上を測定すれば、パーキンソン病治療薬をスクリーニングすることができる。測定項目としては、上記のいずれか１以上を測定すればよく、タンパク質凝集体の形成、ミトコンドリアの変性及び黒質緻密部のドーパミン細胞を測定することが好ましく、全てを測定するのがさらに好ましい。
本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、野生型非ヒト動物と比較した時の運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される及び／又は野生型非ヒト動物と比較した時のドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。「野生型非ヒト動物」は、上述の通りである。
あるいは、本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物に被験物質を投与した場合に、被験物質を投与していない本発明のパーキンソン病モデル非ヒト動物と比較して、運動機能低下が改善される、凝集体形成が抑制される、ミトコンドリアの変性が観察される及び／又はドーパミン細胞減少が抑制されれば、その被験物質はパーキンソン病治療薬である。比較の明確さの点で、被験物質を投与していないパーキンソン病モデル非ヒト動物をコントロールとするのが好ましい。
The Parkinson's disease model non-human animal of the present invention reproduces the movement disorder caused by Parkinson's disease, which causes movement disorder with aging, and is characteristic of Parkinson's disease of formation of protein aggregates, degeneration of mitochondria, and reduction of dopamine cells. It also has a pathological image. Therefore, the model non-human animal can be used to screen for a therapeutic agent for Parkinson's disease. That is, if the test substance is administered to a non-human animal model of Parkinson's disease of the present invention and one or more selected from motor function, protein aggregates, degeneration of mitochondria and dopamine cells in the substantia nigra pars compacta are measured, the therapeutic agent for Parkinson's disease Can be screened. As a measurement item, any one or more of the above may be measured, and it is preferable to measure protein aggregate formation, mitochondrial degeneration and dopamine cells in the substantia nigra pars compacta, and it is more preferable to measure all of them.
When the test substance is administered to a Parkinson's disease model non-human animal of the present invention, the decrease in motor function when compared with the wild-type non-human animal is improved, aggregate formation is suppressed, and / or the wild-type non-human. If dopamine cell depletion is suppressed when compared to animals, the test substance is a Parkinson's disease drug. The "wild-type non-human animal" is as described above.
Alternatively, when the test substance is administered to the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention, the hypokinesia is improved as compared with the Parkinson's disease model non-human animal of the present invention to which the test substance is not administered. If aggregate formation is suppressed, mitochondrial degeneration is observed and / or dopamine cell depletion is suppressed, the test substance is a Parkinson's disease therapeutic agent. From the point of view of comparison clarity, it is preferable to control Parkinson's disease model non-human animals to which the test substance has not been administered.
本発明における被験物質は、パーキンソン病に対する治療効果を予測したい薬物であればよく、特に限定されない。被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、投与される動物種や被験物質の特性に応じて適宜選択すればよい。例えば、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与等が挙げられる。被験物質の投与量も、投与される動物種や被験物質の特性に応じて適宜設定すればよい。 The test substance in the present invention is not particularly limited as long as it is a drug for which a therapeutic effect on Parkinson's disease is to be predicted. The method for administering the test substance is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the animal species to be administered and the characteristics of the test substance. For example, oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration and the like can be mentioned. The dose of the test substance may also be appropriately set according to the animal species to be administered and the characteristics of the test substance.
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
実施例1
CHCHD2遺伝子欠損マウスの作製
CHCHD2の機能を知るために、CHCHCHD2ノックアウトマウスを作製した。ターゲッティングベクターは、1.5 kb及び7 kbのDNAフラグメントを5 '及び3'の相同配列とし、C57BL / 6に ES細胞を用いてトランスフェクトした（図１参照）。 G418を選択後、サザンブロッティングにより相同組換えについてクローンをスクリーニングした。 5 'の外部プローブとneo配列に特異的なプローブを使用して、クローンが目的の相同組換えを持つことを確認し、これらのクローンに由来するES細胞をC57BL / 6胚に注入した。キメラの子孫をC57BL / 6マウスと交配させ、生殖系列伝達を得た。次に、ヘテロ接合性マウスを交配させて、ホモ接合性ノックアウト及び野生型対照マウスを得た。続いて、野生型と標的とされた対立遺伝子に特異的なプライマーを用いたPCRにより、マウスの遺伝子型を決定した。
Example 1
Preparation of CHCHD2 gene-deficient mice
In order to know the function of CHCHD2, CHCHCHD2 knockout mice were generated. Targeting vectors were 1.5 kb and 7 kb DNA fragments with 5'and 3'homologous sequences and transfected into C57BL / 6 using ES cells (see Figure 1). After selecting G418, clones were screened for homologous recombination by Southern blotting. Using a 5'external probe and a probe specific for the neo sequence, we confirmed that the clones had the desired homologous recombination and injected ES cells from these clones into C57BL / 6 embryos. Chimeric offspring were mated with C57BL / 6 mice to obtain germline transmission. Heterozygous mice were then mated to obtain homozygous knockouts and wild-type control mice. Subsequently, mouse genotypes were determined by PCR using primers specific for the wild-type and targeted alleles.
実施例２
中脳黒質ドーパミン細胞内に凝集体の形成及びミトコンドリアの変性を観察
（１）１２０週齢のCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞を免疫染色して、凝集体の形成を観察した。
４％パラホルムアルデヒド（PFA）で灌流固定後、脳を取り出し４℃で３６時間浸透固定した。固定サンプルを２０％スクロースで凍結し、凍結ミクロトームでスライスして厚さ４０μmの極薄切片を作製する。シヌクレイン（赤）とｐ６２（緑）の二重免疫蛍光染色では、極薄切片をウサギ・シヌクレイン抗体（AB5038P；ミリポア）とモルモット・ｐ62抗体（PROGEN Biotechnik, GmbH）でインキュベートした。次に、Alexa Fluor546抗ウサギIgG及びAlexa Fluor488抗モルモットIgGとインキュベートした。蛍光シグナルは、LSM780共焦点顕微鏡（Zeiss）で観察した。
蛍光染色によるｐ62、シヌクレイン陽性細胞内封入体を観察した結果を図２に示す。図２より、CHCHD2遺伝子欠損マウスは、ｐ62陽性及びシヌクレイン陽性タンパク質凝集体を形成していた。
Example 2
Observation of aggregate formation and mitochondrial degeneration in midbrain substantia nigra dopamine cells (1) Dopamine cells of 120-week-old CHCHD2 gene-deficient mice were immunostained and aggregate formation was observed.
After perfusion fixation with 4% paraformaldehyde (PFA), the brain was taken out and permeated and fixed at 4 ° C. for 36 hours. The fixed sample is frozen in 20% sucrose and sliced in a frozen microtome to make ultrathin sections with a thickness of 40 μm. For double immunofluorescent staining of synuclein (red) and p62 (green), ultrathin sections were incubated with rabbit synuclein antibody (AB5038P; millipore) and guinea pig p62 antibody (PROGEN Biotechnik, GmbH). It was then incubated with Alexa Fluor 546 anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 anti-guinea pig IgG. The fluorescence signal was observed with an LSM780 confocal microscope (Zeiss).
FIG. 2 shows the results of observing p62 and synuclein-positive intracellular inclusion bodies by fluorescent staining. From FIG. 2, the CHCHD2 gene-deficient mice formed p62-positive and synuclein-positive protein aggregates.
（２）１２０週齢のCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞の電子顕微鏡観察により、ミトコンドリアの変性の有無を検討した。
２．５％グルタルアルデヒド/(0.1 mol / L) PB（pH 7.2）で灌流固定後、脳を取り出し４℃で３６時間浸透固定した。 脳スライスをエポキシ樹脂に埋め込み、超薄切片（７０ nm）を作製し、HT7700電子顕微鏡（HITACHI）で観察した。 これらの電子顕微鏡データを使用して、ドーパミン作動性ニューロン内のミトコンドリアの数と面積を「CellSens」分析ソフトウェア（Olympus）を使用し計測した。
ミトコンドリアの変性を示す電顕写真及びミトコンドリア面積比を図３に示す。図３より、CHCHD2遺伝子欠損マウスは、ドーパミン細胞のミトコンドリア変性が認められた。
(2) The presence or absence of mitochondrial degeneration was examined by electron microscopic observation of dopamine cells of 120-week-old CHCHD2 gene-deficient mice.
After perfusion fixation with 2.5% glutaraldehyde / (0.1 mol / L) PB (pH 7.2), the brain was taken out and permeated and fixed at 4 ° C. for 36 hours. Brain slices were embedded in epoxy resin to prepare ultrathin sections (70 nm), which were observed with an HT7700 electron microscope (HITACHI). Using these electron microscopic data, the number and area of mitochondria in dopaminergic neurons was measured using "CellSens" analysis software (Olympus).
An electron micrograph showing mitochondrial degeneration and a mitochondrial area ratio are shown in FIG. From FIG. 3, mitochondrial degeneration of dopamine cells was observed in CHCHD2 gene-deficient mice.
実施例３
加齢により運動障害が生じる
CHCHD2遺伝子欠損マウスは、出生時に生存可能で、同腹子と外観が区別できず、正常な生存率だった。これらのマウスはまだ生涯にわたる観察は実施していないが、１１５週間で運動行動障害を示し始めた。これらの臨床異常は、ビーム試験、ロータロッド試験で観察できた。ビーム試験では、野生型マウスは巧妙な動きを示し、前肢または後肢がビームから脱落することはなかった。対照的に、CHCHD2欠損マウスは頻繁に滑っていた。特に、CHCHD2欠損マウスの後肢は、しばしばビームから外れた(図４)。さらに、ロータロッド試験では、CHCHD2欠損マウスで転倒潜時が短縮された（図５）。CHCHD2欠損による体重と寿命への影響はなかった。歩行障害が進行し、末期（１２０週間を超える）になるとマウスの大部分は無動となった。
Example 3
Movement disorders occur with aging
CHCHD2 gene-deficient mice were viable at birth, indistinguishable from littermate in appearance, and had normal survival rates. These mice had not yet undergone lifelong observations, but began to exhibit motor behavioral disorders at 115 weeks. These clinical abnormalities could be observed in the beam test and the rotarod test. In the beam test, wild-type mice showed clever movements, with no forelimbs or hindlimbs falling out of the beam. In contrast, CHCHD2-deficient mice slipped frequently. In particular, the hind limbs of CHCHD2-deficient mice often deviated from the beam (Fig. 4). Furthermore, in the rotarod test, the fall latency was shortened in CHCHD2-deficient mice (Fig. 5). CHCHD2 deficiency had no effect on body weight or longevity. Most of the mice became akinetic at the end of the period (more than 120 weeks) as gait disturbance progressed.
実施例４
ドーパミン細胞の脱落
運動症状を呈するCHCHD2遺伝子欠損マウスのドーパミン細胞を計測した結果、黒質緻密部の神経細胞死の減少が認められた。また、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）によるドーパミン細胞の定量を行ったところCHCHD2遺伝子欠損マウスでドーパミンの減少が認められた（図６）。
Example 4
Dopamine cell shedding As a result of measuring dopamine cells in CHCHD2 gene-deficient mice exhibiting motor symptoms, a decrease in neuronal cell death in the substantia nigra pars compacta was observed. In addition, when quantification of dopamine cells by high performance liquid chromatography (HPLC), a decrease in dopamine was observed in CHCHD2 gene-deficient mice (Fig. 6).
Claims (5)
（１）加齢に伴いパーキンソン病類似の運動障害を呈する
（２）黒質緻密部において野生型に比べてドーパミン細胞が減少する
（３）中脳黒質ドーパミン細胞内にタンパク質凝集体を形成する
（４）中脳黒質ドーパミン細胞のミトコンドリアが変性する A Parkinson's disease model non-human animal in which the function of the CHCHD2 gene is deficient, which is characterized by having all the following properties (1) to (4).
(1) Exhibits motility disorders similar to Parkinson's disease with aging (2) Dopamine cells decrease in the substantia nigra pars compacta compared to the wild type (3) Form protein aggregates in the midbrain substantia nigra dopamine cells (4) Midbrain substantia nigra dopamine cell mitochondria degenerate
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