JP2011026236A - Elastic fiber regenerating agent, method for regenerating elastic fiber and screening method - Google Patents

Elastic fiber regenerating agent, method for regenerating elastic fiber and screening method Download PDF

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new elastic fiber regenerating agent having more improved regenerating ability of elastic fiber than a conventional one. <P>SOLUTION: The elastic fiber regenerating agent contains LTBP-4 (Latent TGFβ-binding protein-4). In a preferable embodiment, the elastic fiber regenerating agent further contains DANCE (developmental arteries and neural crest epidermal growth factor) and/or LTBP-4 expression enhancement factor. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、ＬＴＢＰ−４を含む弾性線維再生剤、当該弾性線維再生剤を用いた弾性線維の再生方法、およびＬＴＢＰ−４を指標として弾性線維再生剤をスクリーニングする方法に関するものである。   The present invention relates to an elastic fiber regenerating agent containing LTBP-4, an elastic fiber regenerating method using the elastic fiber regenerating agent, and a method for screening an elastic fiber regenerating agent using LTBP-4 as an index.

弾性（引き伸ばしても元に戻る性質）は、体の多くの組織に見られ、肺・動脈・皮膚などのような伸縮性組織に富む組織の機能に必須の性質である。これらの組織で弾性を担っているのが、弾性線維という細胞外線維である。弾性線維は、ミクロフィブリルという線維の周りにエラスチンタンパクが沈着・クロスリンクしてできると考えられている。弾性線維は、加齢によって、または炎症細胞から分泌されるプロテアーゼによって劣化・断裂し、皮膚のたるみや、高齢者の主要疾患である肺気腫、動脈中膜の硬化・大動脈瘤、加齢黄斑変性症などの直接的な原因となる。   Elasticity (property that returns to its original shape even when stretched) is found in many tissues of the body and is essential for the function of tissues rich in stretchable tissues such as lungs, arteries, and skin. It is extracellular fibers called elastic fibers that are responsible for elasticity in these tissues. Elastic fibers are thought to be formed by the deposition and cross-linking of elastin protein around microfibrils. Elastic fiber deteriorates or tears with age or with proteases secreted from inflammatory cells, sagging skin, emphysema that is a major disease of the elderly, arterial sclerosis / aortic aneurysm, age-related macular degeneration It becomes a direct cause.

弾性線維はターンオーバーが非常に遅く、弾性線維が劣化・断裂しても再生が十分起こらないことが知られている。弾性線維の再生が可能になれば、上記の皮膚のたるみや老化関連疾患の予防・治療に応用できると期待されるが、弾性線維形成の分子メカニズムは未だ十分に検討されていないのが実情である。   It is known that elastic fibers have a very slow turnover and that regeneration does not occur sufficiently even if the elastic fibers deteriorate or tear. If elastic fiber regeneration becomes possible, it is expected to be applicable to the prevention and treatment of the above-mentioned skin sagging and aging-related diseases, but the molecular mechanism of elastic fiber formation has not yet been fully studied. is there.

本発明者らは、弾性線維の形成機構と再生の研究を行なっており、これまでに、ＤＡＮＣＥ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；別名「ｆｉｂｕｌｉｎ−５」ともいう）及び／又はｆｉｂｕｌｉｎ−４という分泌タンパク質が弾性線維の形成に必須であり、これらの組換えタンパク質をヒト皮膚線維芽細胞の無血清培地に添加すると弾性線維の形成・再生が促進されること；また、ＤＡＮＣＥの産生を高めるＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β、非特許文献４を参照）を添加すると、弾性線維の形成・再生が促進されることを見出し、報告してきた（非特許文献１〜３、特許文献１および２）。   The present inventors have been studying the formation mechanism and regeneration of elastic fibers, and so far, DANCE (developmental arteries and neural epidermal growth factor (EGF) -like; also referred to as “fibulin-5”) and Secreted protein called fibulin-4 is essential for the formation of elastic fibers, and when these recombinant proteins are added to serum-free medium of human skin fibroblasts, the formation and regeneration of elastic fibers is promoted; It has been found and reported that addition of TGFβ that enhances the production of DANCE (Transforming growth factor β; see Non-Patent Document 4) promotes the formation and regeneration of elastic fibers (Non-Patent Documents 1 to 3, Patent Documents) 1 Beauty 2).

一方、非特許文献５および６には、ＬＴＢＰ−４（Ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦβ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−４）のノックアウトマウスで、肺と腸管に弾性線維形成の異常が見られたことが報告されている。しかし、上記文献では、ＬＴＢＰ−４が弾性線維の再生にどのように関与しているかの検討は全く行なっていない。   On the other hand, Non-Patent Documents 5 and 6 report that abnormalities of elastic fiber formation were observed in the lungs and intestinal tract in LTBP-4 (Lent TGFβ-binding protein-4) knockout mice. However, in the above-mentioned document, examination of how LTBP-4 is involved in the regeneration of elastic fibers is not performed at all.

国際公開第２００５／０９３０５７号パンフレットInternational Publication No. 2005/093057 Pamphlet 国際公開第２００６／０８２７６３号パンフレットInternational Publication No. 2006/082763 Pamphlet

Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＤＡＮＣＥ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＲＧＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ， ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，ａｎｄ ｂａｌｌｏｏｎ−ｉｎｊｕｒｅｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２４７６−８３（１９９９）Nakamura T et al. , DANCE, a novel secreted RGD protein expressed in developing, atherosclerotic, and ballon-injured arteries, J. Am. Biol. Chem. 274: 22476-83 (1999) Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｕｌｉｎ−５／ＤＡＮＣＥ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｅｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ ４１５：１７１−５（２００２）Nakamura, T et al. , Fibulin-5 / DANCE is essential for elastogenesis in vivo. Nature 415: 171-5 (2002) Ｈｉｒａｉ Ｍ，Ｏｈｂａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｏｋａｗａ Ｋ， Ｈａｇｉｗａｒａ Ａ，Ｋｉｔａ Ｔ，Ｃｈｉｅｎ ＫＲ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，Ｆｉｂｕｌｉｎ−５／ＤＡＮＣＥ ｈａｓ ａｎ ｅｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｚｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｉｓ ａｂｒｏｇａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７６：１０６１−１０７１（２００７）Hirai M, Ohbayashi T, Horiguchi M, Okawa K, Hagiwara A, Kita T, Chien KR, Nakamura T. , Fibulin-5 / DANCE has an elastogenic organic activity that is aggregated by proteolytic cleavage in vivo. J Cell Biol 176: 1061-1107 (2007) Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３０）：２７３６７−７７（２００２）Schiemann et al. , J Biol Chem 277 (30): 27367-77 (2002). Ｓｔｅｒｎｅｒ−Ｋｏｃｋ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｔｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４ （ＬＴＢＰ−４） ｃａｕｓｅｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｌｕｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ， ａｎｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２００２ Ｓｅｐ １；１６（１７）：２２６４−７３Sterner-Kock A et al. , Description of the gene encoding the latent transforming growth factor-beta binding protein 4 (LTBP-4), causal binary lumpedormetic development. Genes Dev. 2002 Sep 1; 16 (17): 2264-73 Ｄａｂｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＬＴＢＰ ｉｎ ｌｕｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ＬＴＢＰ−４ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｅｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ＴＧＦ−ｂｅｔａ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００９ Ａｐｒ；２１９（１）：１４−２２．Dabovic B et al. , Dual functions for LTBP in lunge development: LTBP-4 independent modulations and TGF-beta activity. J Cell Physiol. 2009 Apr; 219 (1): 14-22.

上述したように、ＤＡＮＣＥは弾性線維再生剤として有用であるが、ＤＡＮＣＥ単独では、特に血清存在下における弾性線維形成促進作用が充分でないという問題があった。本発明者らの検討結果によれば、血清存在下でのヒト皮膚線維芽細胞培養では、ＤＡＮＣＥを添加しなくても弾性線維は形成され、ここにＤＡＮＣＥを添加しても大きな変化は見られなかった。すなわち、血清存在下では、ＤＡＮＣＥ添加の有無によって弾性線維の形成は殆ど変わらなかった。生体内の組織は血液によって灌流されているので、血清存在下の培養と似た条件であると考えられる。よって、生体内での利用を考慮すると、無血清下だけでなく、血清存在下でも強い弾性線維再生作用を発揮し得る再生剤の提供が強く切望される。   As described above, DANCE is useful as an elastic fiber regenerating agent. However, DANCE alone has a problem that the elastic fiber formation promoting action is not sufficient particularly in the presence of serum. According to the results of the study by the present inventors, in human skin fibroblast culture in the presence of serum, elastic fibers are formed without addition of DANCE, and even if DANCE is added here, a large change is seen. There wasn't. That is, in the presence of serum, the formation of elastic fibers hardly changed depending on whether or not DANCE was added. Since the tissue in the living body is perfused with blood, it is considered that the conditions are similar to those in the culture in the presence of serum. Therefore, in consideration of utilization in vivo, there is a strong need to provide a regenerative agent capable of exerting a strong elastic fiber regeneration action not only in the absence of serum but also in the presence of serum.

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりも弾性線維の再生能が一層高められた新規な弾性線維再生剤および当該弾性線維再生剤を用いた弾性線維の再生方法を提供することにある。更に本発明の他の目的は、上記の弾性線維再生剤や、当該弾性線維再生剤を構成する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel elastic fiber regenerating agent having a higher ability to regenerate elastic fibers than before and regeneration of elastic fibers using the elastic fiber regenerating agent. It is to provide a method. Furthermore, another object of the present invention is to provide a method for screening the elastic fiber regenerating agent and a substance constituting the elastic fiber regenerating agent.

上記課題を解決し得た本発明の弾性線維再生剤は、ＬＴＢＰ−４を含有するところに要旨を有するものである。   The elastic fiber regenerative agent of the present invention that has solved the above problems has a gist in that it contains LTBP-4.

本発明の好ましい実施形態において、上記の弾性線維再生剤は、ＤＡＮＣＥを更に含有するものである。   In a preferred embodiment of the present invention, the elastic fiber regenerating agent further contains DANCE.

本発明の好ましい実施形態において、上記の弾性線維再生剤は、ＴＧＦβなどに代表されるＬＴＢＰ−４発現増強因子及び／又はＤＮＡＣＥ発現増強因子を更に含有するものである。   In a preferred embodiment of the present invention, the elastic fiber regeneration agent further contains an LTBP-4 expression enhancing factor and / or a DNACE expression enhancing factor typified by TGFβ and the like.

本発明には、上記の弾性線維再生剤を有効成分として含む医薬も包含される。   The present invention also includes a medicament containing the elastic fiber regenerating agent as an active ingredient.

また、上記課題を解決し得た本発明に係る弾性線維の再生方法は、上記のいずれかに記載の弾性線維再生剤を、線維再生能を有する細胞に接触させるところに要旨を有するものである。   In addition, the elastic fiber regeneration method according to the present invention that has solved the above-described problems has a gist in that the elastic fiber regeneration agent according to any one of the above is brought into contact with a cell having fiber regeneration ability. .

また、上記課題を解決し得た本発明に係るＬＴＢＰ−４発現増強因子のスクリーニング方法は、ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いるところに要旨を有するものである。   In addition, the LTBP-4 expression enhancing factor screening method according to the present invention that has solved the above problems has a gist in that the expression level of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 is used as an index. .

また、上記課題を解決し得た本発明に係る弾性線維再生剤のスクリーニング方法は、ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いるところに要旨を有するものである。上記スクリーニング方法は、好ましくは、更に、ＤＡＮＣＥ又はＤＡＮＣＥをコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いる。   The elastic fiber regenerative agent screening method according to the present invention that has solved the above problems has a gist in that the expression level of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 is used as an index. In the screening method, preferably, the expression level of DANCE or mRNA encoding DANCE is further used as an index.

本発明のＬＴＢＰ−４含有弾性線維再生剤を用いれば、従来のＤＡＮＣＥ含有再生剤に比べて同等またはそれ以上に再生能が高められる。本発明による弾性線維再生作用は、血清の存在の有無にかかわらず発揮され、無血清下では、特にＬＴＢＰ−４およびＤＡＮＣＥを両方含有する再生剤を用いると、ＬＴＢＰ−４単独またはＤＡＮＣＥ単独の再生剤を用いた場合に比べて、弾性線維の再生が飛躍的に促進された。また、従来のＤＡＮＣＥ含有再生剤は、血清存在下での作用が殆ど認められなかったのに対し、本発明のＬＴＢＰ−４含有弾性線維再生剤を用いれば、血清存在下における弾性線維の形成を著しく促進することができた。   When the LTBP-4-containing elastic fiber regenerating agent of the present invention is used, the regenerating ability is improved to the same level or higher as compared with the conventional DANCE-containing regenerating agent. The elastic fiber regeneration action according to the present invention is exhibited regardless of the presence or absence of serum. Under serum-free conditions, particularly when a regenerant containing both LTBP-4 and DANCE is used, LTBP-4 alone or DANCE alone is regenerated. Compared to the case of using the agent, the regeneration of the elastic fiber was dramatically accelerated. In addition, the conventional DANCE-containing regenerative agent showed almost no action in the presence of serum, whereas the LTBP-4-containing elastic fiber regenerative agent of the present invention can form elastic fibers in the presence of serum. It was possible to promote significantly.

図１は、精製した組換えヒトＬＴＢＰ−４（約１８０ｋＤ）と組換えヒトＤＡＮＣＥ（約５８ｋＤ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した後、ＣＢＢ染色した写真である。FIG. 1 is a photograph of purified recombinant human LTBP-4 (about 180 kD) and recombinant human DANCE (about 58 kD) developed by SDS-PAGE and then stained with CBB. 図２は、血清存在下でヒト皮膚線維芽細胞を培養したときの弾性線維を蛍光免疫染色した写真であり、上から順に、コントロール；ＬＴＢＰ−４をｓｉＲＮＡでノックダウンしたとき；そこに組換えＬＴＢＰ−４を添加したときの写真をそれぞれ示している。FIG. 2 is a photograph obtained by fluorescent immunostaining of elastic fibers when human skin fibroblasts are cultured in the presence of serum. From the top, control; when LTBP-4 is knocked down with siRNA; recombined there The photographs when LTBP-4 is added are shown. 図３は、無血清培地でヒト皮膚線維芽細胞を培養したときの弾性線維を蛍光免疫染色した写真であり、上から順に、タンパクの添加なし；組換えＤＡＮＣＥ添加；組換えＬＴＢＰ−４添加；これらを同時に添加したときの写真をそれぞれ示している。FIG. 3 is a photograph of fluorescent fibers stained with elastic fibers when human skin fibroblasts are cultured in a serum-free medium. From the top, no protein was added; recombinant DANCE was added; recombinant LTBP-4 was added; The photographs when these are added simultaneously are shown. 図４は、ＦＬＡＧ ｔａｇをつけたＤＡＮＣＥとＭｙｃ ｔａｇをつけたＬＴＢＰ−４を混ぜ、抗ＦＬＡＧ抗体アガロースで免疫沈降した結果を示す写真である。FIG. 4 is a photograph showing the results of immunoprecipitation with anti-FLAG antibody agarose after mixing DANCE with FLAG tag and LTBP-4 with Myc tag.

本発明者らは、従来のＤＡＮＣＥ含有弾性線維再生剤に比べ、弾性線維の再生能が一層高められた再生剤を提供するため、検討を重ねてきた。その結果、ＬＴＢＰ−４を含むＬＴＢＰ−４含有弾性線維再生剤を用いれば、血清の存在の有無にかかわらず、優れた作用が発揮されることを見出し、本発明を完成した。   The inventors of the present invention have made extensive studies in order to provide a regenerative agent having a higher ability to regenerate elastic fibers than conventional DANCE-containing elastic fiber regenerative agents. As a result, it was found that if an LTBP-4-containing elastic fiber regenerating agent including LTBP-4 was used, an excellent action was exhibited regardless of the presence or absence of serum, and the present invention was completed.

詳細には、ＬＴＢＰ−４はＤＡＮＣＥと結合すること；ヒト皮膚線維芽細胞培養におけるＬＴＢＰ−４遺伝子のノックダウンによって、血清存在下でも弾性線維が形成されなくなること；この培養系に組換えＬＴＢＰ−４を添加すると極めて多量の弾性線維が形成されること；ＬＴＢＰ−４による上記弾性線維形成作用は、ＤＡＮＣＥとの併用により相乗的に促進されることが判明した。血清存在下の線維芽細胞培養系において弾性線維形成の促進作用が確認されたのはＬＴＢＰ−４が初めてであり、従来のＤＡＮＣＥ含有弾性線維再生剤には見られなかった顕著な知見である。また、ＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥの併用により、血清存在下のみならず無血清存在下における弾性線維の形成が飛躍的に促進されたことは、従来の予想を遥かに超える知見である。   Specifically, LTBP-4 binds to DANCE; knockdown of the LTBP-4 gene in human dermal fibroblast cultures prevents elastic fibers from forming in the presence of serum; recombinant LTBP- It was found that when 4 is added, an extremely large amount of elastic fibers are formed; the above-mentioned elastic fiber forming action by LTBP-4 is synergistically promoted by the combined use with DANCE. LTBP-4 was the first to confirm the effect of promoting elastic fiber formation in a fibroblast culture system in the presence of serum, and is a remarkable finding not found in conventional DANCE-containing elastic fiber regenerative agents. In addition, the combined use of LTBP-4 and DANCE dramatically promoted the formation of elastic fibers not only in the presence of serum but also in the presence of serum, which is a finding that far surpasses conventional expectations.

本明細書において、「弾性線維再生剤」における「再生」には、弾性線維の劣化・断裂などによって失われた弾性線維を再生（新生）可能な状態にすることを意味し、再生には形成も含まれる。よって、弾性線維の形成が充分でないものの形成促進も含まれる。   In this specification, “regeneration” in the “elastic fiber regenerative agent” means that the elastic fiber lost due to degradation or tearing of the elastic fiber is brought into a regenerative (neoplastic) state. Is also included. Therefore, it includes formation promotion of elastic fibers that are not sufficiently formed.

（本発明の弾性線維再生剤）
本発明の弾性線維再生剤は、有効成分として少なくともＬＴＢＰ−４を含んでおり、好ましくは、ＤＡＮＣＥおよび／または公知のＬＴＢＰ−４発現増強因子若しくはＤＡＮＣＥ発現増強因子を更に含んでいる。特許文献２に記載のＤＡＮＣＥ含有弾性線維再生剤（従来例）は、ＬＴＢＰ−４を含んでいない点で、本発明のＬＴＢＰ−４含有弾性線維再生剤と相違する。本発明の再生剤は、以下に詳述するように、例えば、医薬、培養細胞用試薬、人工組織などに適用することができる。 (Elastic fiber regenerating agent of the present invention)
The elastic fiber regeneration agent of the present invention contains at least LTBP-4 as an active ingredient, and preferably further contains DANCE and / or a known LTBP-4 expression enhancer or DANCE expression enhancer. The DANCE-containing elastic fiber regenerating agent described in Patent Document 2 (conventional example) is different from the LTBP-4-containing elastic fiber regenerating agent of the present invention in that it does not contain LTBP-4. The regenerant of the present invention can be applied to, for example, pharmaceuticals, cultured cell reagents, artificial tissues and the like as described in detail below.

本発明に用いられるＬＴＢＰ−４は、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５１３４４）若しくはそのオルソログ、またはこれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）に由来するポリペプチドをいう。ＬＴＢＰ−４のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウスなどが挙げられる。ＬＴＢＰ−４は分泌タンパク質であり、プロセシングによりシグナル配列（例えば、MAGGVRLLWVSLLVLLAQLGPQPGLG）が除去され得る。本発明の方法では、ＬＴＢＰ−４としては、シグナル配列が除去されたもの、シグナル配列が除去されていないもののいずれでも使用できるが、シグナル配列が除去されたものが好ましい。また、ＬＴＢＰ−４変異体は、弾性線維の再生を可能とするものであれば特に限定されず、例えば、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つＬＴＢＰ−４をコードするＤＮＡに由来するポリペプチドが挙げられる。   LTBP-4 used in the present invention refers to a polypeptide derived from the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (GenBank accession number AF051344) or an ortholog thereof, or mutants thereof (including SNP and haplotype). The ortholog of LTBP-4 is not particularly limited, and may be derived from any animal, preferably a mammal. Examples of mammals include cattle, sheep, pigs, goats, monkeys, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs and mice. LTBP-4 is a secreted protein, and a signal sequence (eg, MAGGVRLLWVSLLVLLAQLGPQPGLG) can be removed by processing. In the method of the present invention, as LTBP-4, any of those from which the signal sequence has been removed and those from which the signal sequence has not been removed can be used, but those from which the signal sequence has been removed are preferred. The LTBP-4 mutant is not particularly limited as long as it can regenerate elastic fibers. For example, the LTBP-4 mutant is stringent with DNA having a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Examples include polypeptides derived from DNA that hybridizes and encodes LTBP-4.

本発明の再生剤は、ＤＡＮＣＥを更に含んでいても良い。後記する実施例で実証したように、無血清下で、ＬＴＢＰ−４およびＤＡＮＣＥを両方含有する再生剤を用いると、ＬＴＢＰ−４単独またはＤＡＮＣＥ単独の再生剤を用いた場合に比べて、弾性線維の再生が飛躍的に促進されたことから、ＤＡＮＣＥを更に含む上記再生剤は、弾性線維の再生に極めて有用である。本発明に用いられるＤＡＮＣＥについては、特許文献１および２に詳細に記載されており、特許文献１の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその均等物などが用いられる。あるいは、特許文献２に記載のように、プロセシングによりシグナル配列（特許文献２の配列番号１に記載のアミノ酸配列における１〜２３番目のアミノ酸配列に相当）が除去されたものを用いても良い。あるいは、ＤＡＮＣＥは特許文献１に記載のようにＤＡＮＣＥ特異的プロテアーゼによって切断されることが確認されており、特許文献２に記載のＤＡＮＣＥ変異体を用いることもできる。   The regenerant of the present invention may further contain DANCE. As demonstrated in the examples described later, when a regenerant containing both LTBP-4 and DANCE is used in the absence of serum, the elastic fiber is compared to the case using a regenerant of LTBP-4 alone or DANCE alone. Therefore, the regenerative agent further containing DANCE is extremely useful for elastic fiber regeneration. DANCE used in the present invention is described in detail in Patent Documents 1 and 2, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 of Patent Document 1 or an equivalent thereof is used. Alternatively, as described in Patent Document 2, a signal sequence (corresponding to the 1st to 23rd amino acid sequences in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of Patent Document 2) removed by processing may be used. Alternatively, DANCE has been confirmed to be cleaved by a DANCE-specific protease as described in Patent Document 1, and the DANCE mutant described in Patent Document 2 can also be used.

本発明の再生剤は、ＬＴＢＰ−４発現増強因子（ＬＴＢＰ−４誘導因子）及び／又はＤＡＮＣＥ発現増強因子（ＤＡＮＣＥ誘導因子）を更に含んでいてもよい。本発明では、ＬＴＢＰ−４の発現を増強することが知られている公知のＬＴＢＰ−４発現増強因子及び／又はＤＡＮＣＥ発現増強因子を用いることができ、例えば、ＴＧＦβなどのＬＴＢＰ−４発現増強因子；ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸及びその生理学的に許容される塩、並びにＬ−ヒドロキシプロリン及びその生理学的に許容される塩等のＤＡＮＣＥ発現増強因子；ＬＴＢＰ−４発現ベクター若しくはＤＡＮＣＥ発現ベクター、またはＬＴＢＰ−４誘導因子発現ベクター若しくはＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクター（詳細は後記する。）などが挙げられる。上記ＴＧＦβとしては、代表的にＴＧＦβ−１などが例示される。   The regenerative agent of the present invention may further contain an LTBP-4 expression enhancing factor (LTBP-4 inducer) and / or a DANCE expression enhancing factor (DANCE inducer). In the present invention, a known LTBP-4 expression enhancing factor and / or DANCE expression enhancing factor known to enhance the expression of LTBP-4 can be used. For example, an LTBP-4 expression enhancing factor such as TGFβ A DANCE expression enhancing factor such as Nanten quail extract, winged bean extract, phytic acid and physiologically acceptable salts thereof, and L-hydroxyproline and physiologically acceptable salts thereof; LTBP-4 expression vector or DANCE expression vector Or an LTBP-4 inducer expression vector or a DANCE inducer expression vector (details will be described later). A typical example of TGFβ is TGFβ-1.

本発明の再生剤は、上記有効成分のほか、薬学的に許容されるその塩を含んでいてもよい。具体的には、上記有効成分がカルボキシル基などの酸性基を有する場合には、上記有効成分の塩として、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。また、上記有効成分がアミノ基などの塩基性基を有する場合には、上記有効成分の塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。   The regenerant of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable salt thereof in addition to the above active ingredient. Specifically, when the active ingredient has an acidic group such as a carboxyl group, examples of the salt of the active ingredient include alkali metal and alkaline earth metal salts such as lithium, sodium, potassium, magnesium, and calcium; Ammonia, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, N, N-bis (hydroxyethyl) piperazine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, ethanolamine, N-methyl Examples include salts of amines such as glucamine and L-glucamine; or salts with basic amino acids such as lysine, δ-hydroxylysine and arginine. When the active ingredient has a basic group such as an amino group, examples of the salt of the active ingredient include salts of mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid; Acid, benzenesulfonic acid, paratoluenesulfonic acid, acetic acid, propionic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, cinnamic acid, lactic acid, glycolic acid , Salts with organic acids such as glucuronic acid, ascorbic acid, nicotinic acid and salicylic acid; or salts with acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid.

あるいは、本発明の再生剤は、上述した薬学的に許容される塩の溶媒和物または水和物を含んでいてもよい。   Alternatively, the regenerant of the present invention may contain a solvate or hydrate of the pharmaceutically acceptable salt described above.

本発明の再生剤は、上記の有効成分のみから構成されていても良いが、例えば、医薬などに用いる場合は医薬上許容される任意の担体（添加剤）を含んでいても良い。「医薬上許容される担体」は特に限定されず、常法のものであれば、無機物質若しくは有機物質、または固体若しくは液体の任意のものを用いることができる。ここで、医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤；クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤；カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、これらに限定する趣旨ではない。これらは、有効成分１００質量部に対し、おおむね、１質量部から９０質量部の割合で配合することができる。   The regenerative agent of the present invention may be composed of only the above-mentioned active ingredient, but for example, when used in medicine, it may contain any pharmaceutically acceptable carrier (additive). The “pharmaceutically acceptable carrier” is not particularly limited, and any inorganic or organic substance, or any solid or liquid substance can be used as long as it is a conventional method. Here, as a pharmaceutically acceptable carrier, for example, excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate; cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, Binders such as polypropylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch; starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol starch, sodium bicarbonate, calcium phosphate, calcium citrate and other disintegrants; Lubricants such as magnesium stearate, aerosil, talc, sodium lauryl sulfate; fragrances such as citric acid, menthol, glycyllysine / ammonium salt, glycine, orange powder; Preservatives such as sodium acid, sodium hydrogen sulfite, methyl paraben, propyl paraben; stabilizers such as citric acid, sodium citrate and acetic acid; suspending agents such as methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone and aluminum stearate; dispersants such as surfactants Diluents such as water, physiological saline and orange juice; base waxes such as cacao butter, polyethylene glycol and white kerosene, but are not limited to these. These can be blended at a ratio of about 1 to 90 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the active ingredient.

本発明に係る再生剤の投与形態は限定されず、治療目的などに応じて、経口投与および非経口投与のいずれかを任意に選択することができる。経口投与および非経口投与の投与形態は、医薬的に許容されるものであれば特に限定されない。   The administration form of the regenerative agent according to the present invention is not limited, and either oral administration or parenteral administration can be arbitrarily selected according to the purpose of treatment. The dosage form for oral administration and parenteral administration is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.

このうち、経口投与に好適な剤型としては、例えば、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤；有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）；サッシェ剤または錠剤；適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤；有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等が挙げられる。そのほか、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤等も挙げられる。これらは常法に従って製剤化される。また、錠剤や顆粒剤などは、周知の方法でコーティングされていても良い。   Among these, suitable dosage forms for oral administration include, for example, a solution in which an effective amount of a ligand is dissolved in a diluent such as water, physiological saline, or orange juice; Capsules (hard capsules, soft capsules); sachets or tablets; suspensions in which an effective amount of ligand is suspended in an appropriate dispersion medium; a solution in which an effective amount of ligand is dissolved is appropriately dispersed Examples include emulsions dispersed and emulsified in a medium. In addition, granule, fine granule, powder, syrup and the like can be mentioned. These are formulated according to conventional methods. Tablets and granules may be coated by a known method.

経口投与用の固形製剤を製造する方法は特に限定されず、常法を適用すれば良い。具体的には、例えば、有効成分と、賦形剤成分（例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸など）とを混合して散剤とするか、さらに必要に応じて、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて、湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする方法が挙げられる。また、錠剤を製造するには、これらの散剤又は顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの散剤、顆粒剤、又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸− メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤としても良いし、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、上記の散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。   The method for producing a solid preparation for oral administration is not particularly limited, and a conventional method may be applied. Specifically, for example, an active ingredient and an excipient component (for example, lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, anhydrous silicic acid, etc.) are mixed to form a powder, or, if necessary, sucrose, Examples thereof include a binder such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone; a disintegrant such as carboxymethylcellulose and carboxymethylcellulose calcium, and the like, and wet or dry granulation to form granules. In order to produce tablets, these powders or granules may be tableted as they are or after adding a lubricant such as magnesium stearate or talc. These powders, granules, or tablets may be coated with an enteric solvent base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, methacrylic acid-methyl methacrylate polymer, etc. to form an enteric solvent preparation, or ethyl cellulose, carnauba wax, hardened oil, etc. It can also be coated into a sustained-release preparation. In order to produce a capsule, the above powder or granule is filled into a hard capsule, or the active ingredient is directly or dissolved in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil, etc. can do.

一方、非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、例えば、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤、水性および非水性の無菌の懸濁液剤、点滴剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤等が挙げられる。これらの製剤は、常法の添加剤を含んでいても良い。例えば、注射液剤は、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤、保存剤等を含んでいても良く、懸濁液剤は、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等を含んでいても良い。   On the other hand, preparations suitable for parenteral administration (for example, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration, etc.) include, for example, aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, Aqueous and non-aqueous sterile suspensions, drops, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, drops, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents, nasal drops, etc. It is done. These preparations may contain conventional additives. For example, an injection solution may contain an antioxidant, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent, a preservative, etc., and a suspension agent is a suspension agent, a solubilizer, a thickener, a stable agent. Agents, preservatives and the like may be included.

これらは常法に従って製剤化される。例えば注射液剤は、上記の有効成分を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤などに溶解させてもよい。また、注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適切な水性媒体に溶解させて調製することもできる。あるいは、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。また、懸濁液剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。   These are formulated according to conventional methods. For example, an injection solution is prepared by dissolving the above active ingredient in water, and if necessary, hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, etc. You may make it melt | dissolve in tonicity agents, such as a pH adjuster, sodium chloride, and glucose. In addition, injections, infusions, and the like can be prepared as powdered dosage forms such as lyophilized forms and dissolved in an appropriate aqueous medium such as physiological saline at the time of use. Alternatively, a sustained-release preparation coated with a polymer or the like can be directly administered into the brain. The suspension can be enclosed in a container such as an ampoule or a vial at a unit dose or multiple doses. Alternatively, the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.

より詳細には、例えば、注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて上記の等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用時、溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させ、注射剤用乳剤とすることもできる。   More specifically, for example, in order to produce an injection, the active ingredient is dissolved in distilled water for injection together with the above-mentioned isotonic agent, if necessary, and sterile filtered and filled into ampoules, or mannitol, Dextrin, cyclodextrin, gelatin and the like may be added and lyophilized in vacuum to form a dissolved injection at the time of use. In addition, reticine, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, etc. may be added to the active ingredient and emulsified in water to give an emulsion for injection.

また、直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの坐剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか；あるいは、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。   In order to produce a rectal dosage form, the active ingredient is wetted and dissolved together with a suppository base material such as cacao butter, fatty acid tri, di and monoglycerides, polyethylene glycol, etc., poured into a mold and cooled; or The active ingredient may be dissolved in polyethylene glycol, soybean oil, etc. and then covered with a gelatin film.

また、皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加え、必要に応じて加湿して練合し、軟膏剤とするか；あるいは、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後、ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とすれば良い。   In order to produce an external preparation for skin, the active ingredient is added to white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol, etc., and humidified as necessary to knead to obtain an ointment; After kneading with an adhesive such as an alkyl acrylate polymer, it may be spread on a non-woven fabric such as polyalkyl to form a tape agent.

また、本発明の再生剤は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として用いることもできる。この徐放性製剤は、体内から速やかに除去されることを防止可能な、薬剤的に受容可能な公知の担体を用いて調製することができる。具体的には、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生物分解性または生物適合性ポリマーを用いることができる。これらのポリマーは公知であり、常法に基づき、当業者によって容易に調製することができる。あるいは、薬剤的に受容可能な他の担体として、リポソームの懸濁液なども使用することができる。上記リポソームは特に限定されず、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物などが挙げられる。これは、使用に適したサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製した後、逆相蒸発法によって精製して得られる。   In addition, the regenerative agent of the present invention can also be used as a sustained release preparation such as a delivery system encapsulated in implantable tablets and microcapsules. This sustained-release preparation can be prepared using a known pharmaceutically acceptable carrier that can be prevented from being rapidly removed from the body. Specifically, biodegradable or biocompatible polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydride, polyglycolic acid, collagen, polyorthoester, and polylactic acid can be used. These polymers are known and can be easily prepared by those skilled in the art based on conventional methods. Alternatively, liposome suspensions and the like can also be used as other pharmaceutically acceptable carriers. The liposome is not particularly limited, and examples thereof include a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derived phosphatidylethanol (PEG-PE). This is obtained by preparing through a filter having an appropriate pore size so as to have a size suitable for use and then purifying by a reverse phase evaporation method.

本発明に係る再生剤の投与量は、有効成分の種類や活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢などを考慮して適宜選択すれば良いが、通常、成人１日あたり有効成分の含有量として約０．０５〜約１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましい。   The dosage of the regenerant according to the present invention may be appropriately selected in consideration of the type and activity of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration subject, body weight, age, etc. Although it is good, it is usually preferable that the content of the active ingredient per day for an adult is about 0.05 to about 100 mg / kg.

なお、本発明の再生剤を医薬用途に用いる場合、キットの形態で用いても良い。具体的には、医薬組成物を構成する異種の構成成分を、予め、別々の容器またはパック中に包装しておき、使用直前に混合して使用する態様が挙げられる。これにより、各種構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵が可能になる。使用可能な容器としては、各種構成成分の活性を長期間有効に持続でき、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないようなものが挙げられる。上記容器としては、例えば、封着されたガラスアンプルが挙げられ、これは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。このガラスアンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は構成成分を保持するために通常用いられる他の適切な材料などから構成される。あるいは、他の適切な容器として、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトルや、内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材などが挙げられる。上記容器の形態は特に限定されず、例えば、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはこれらの類似物が挙げられる。上記容器は無菌のアクセスポートを有していても良く、例えば、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどが挙げられる。   In addition, when using the regenerant of this invention for a pharmaceutical use, you may use it with the form of a kit. Specifically, an embodiment in which different constituents constituting the pharmaceutical composition are packaged in advance in separate containers or packs and mixed immediately before use. Thereby, long-term storage becomes possible without losing the functions of various components. Usable containers include those that can effectively maintain the activity of various constituents for a long period of time, are not adsorbed by the material of the container, and do not undergo alteration. Such containers include, for example, sealed glass ampoules, which include a buffer packaged under a neutral and unreactive gas such as nitrogen gas. The glass ampoule is composed of glass, an organic polymer such as polycarbonate, polystyrene, ceramic, metal, or other suitable material commonly used to hold components. Alternatively, other suitable containers include simple bottles made from similar materials such as ampoules, and packaging materials that are lined with foil such as aluminum or alloy. The form of the container is not particularly limited, and examples thereof include a test tube, a vial, a flask, a bottle, a syringe, and the like. The container may have a sterile access port, for example, a bottle having a stopper that can be penetrated by a hypodermic needle.

上記のキットは、上記医薬を使用するための使用説明書（添付文書）を含んでいても良い。上記使用説明書の形態は限定されず、例えば、紙又は他の材質上に印刷されたものでも良いし、あるいは、ＦＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体であっても良い。使用説明書には、すべての詳細な説明が記載されている必要は必ずしもなく、例えば、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。   The kit may include an instruction manual (package insert) for using the medicine. The form of the above-mentioned instruction manual is not limited, for example, it may be printed on paper or other materials, or may be FD, CD-ROM, DVD-ROM, Zip disk, video tape, audio tape, etc. It may be an electrically or electromagnetically readable medium. The instruction manual does not necessarily need to include all the detailed explanations, and may be posted on a website designated by the manufacturer or distributor of the kit or notified by e-mail or the like. .

本発明の再生剤は、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患、例えば、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などの予防、治療又は改善に有用である。また、本発明の再生剤は、皮膚のたるみやしわの予防や改善といった美容目的のために有用である。また、本発明の再生剤は、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬などとしても有用である。   The regeneration agent of the present invention is a condition or disease in which regeneration of elastic fibers is desired, such as emphysema, vascular injury, skin laxity, wounds, elastic fiber degradation (for example, those caused by aging or ultraviolet rays), rough skin, It is useful for the prevention, treatment or improvement of arteriosclerosis, aortic aneurysm, age-related macular degeneration, perineal hernia, anal hernia, basilar aneurysm, gastrointestinal motility disorder, pressure ulcer and the like. The regenerative agent of the present invention is useful for cosmetic purposes such as prevention and improvement of skin sagging and wrinkles. The regenerative agent of the present invention is also useful as a reagent for culturing cells having the ability to regenerate elastic fibers.

本発明の再生剤を用いれば、ＬＴＢＰ−４、好ましくはＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥの両方を含む人工弾性線維を提供することができる。ここで、「人工弾性線維」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて再生された弾性線維を意味する。上記の人工弾性線維は、培養に使用されたＬＴＢＰ−４、および／または培養に使用された弾性線維再生能を有する細胞が由来する動物に対して異種動物由来の成分を含まないものであっても良い。すなわち、上記の人工弾性線維は、動物由来の生体成分について、単一の動物種に由来する成分のみからなるものであり得る。本発明の方法によって、このような人工弾性線維を提供することが初めて可能となった。従って、本発明の人工弾性線維は、同種異系移植などの同種移植で好適に用いられ得る。また、弾性線維再生能を有する細胞として、移植が所望される個体由来の細胞を用い、且つ異種動物由来成分が一切混入していない培地を用いることで、同種同系移植に好適に用いられる弾性線維が得られる。   By using the regenerant of the present invention, it is possible to provide an artificial elastic fiber containing LTBP-4, preferably both LTBP-4 and DANCE. Here, the “artificial elastic fiber” means an elastic fiber regenerated in vitro. The artificial elastic fiber described above does not contain a component derived from a heterogeneous animal with respect to an animal from which LTBP-4 used for culture and / or cells having elastic fiber regeneration ability used for culture are derived. Also good. That is, said artificial elastic fiber can consist only of components derived from a single animal species with respect to animal-derived biological components. The method of the present invention has made it possible for the first time to provide such artificial elastic fibers. Therefore, the artificial elastic fiber of the present invention can be suitably used for allogeneic transplantation such as allogeneic transplantation. In addition, by using cells derived from individuals desired to be transplanted as cells having the ability to regenerate elastic fibers, and using a medium that is not mixed with any heterologous animal-derived components, elastic fibers that are suitably used for allogeneic syngeneic transplantation Is obtained.

上記の人工弾性線維はまた、ＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥ以外の弾性線維構成成分（例えば、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２）、並びにその他の成分（例えば、ｂｅｔａｉｇ−ｈ３、６７ｋＤエラスチン結合タンパク質）を含み得る。   The above artificial elastic fibers are also elastic fiber components other than LTBP-4 and DANCE (for example, elastin, lysyl oxidase (LOX), lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1-4), LTBP2, fibrillin 1-3, EMILIN1 And 2, MAGP 1 and 2), as well as other components (eg betaig-h3, 67 kD elastin binding protein).

また、本発明の再生剤を用いれば、弾性線維を含む人工組織を提供することができる。弾性線維を含む人工組織としては、例えば人工皮膚、人工血管（例えば、人工動脈）、人工肺、人工子宮、人工腸管などが挙げられるが、人工皮膚及び人工血管が好ましい。これらの人工組織は、公知の方法により作製することができる（例えば、Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｍａｔｒｉｘ ｂｉｏｌｏｇｙ２２（４）：３３９−５０、Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ ９３（３）：５３７−４４を参照）。   Moreover, if the regenerative agent of the present invention is used, an artificial tissue containing elastic fibers can be provided. Examples of the artificial tissue containing elastic fibers include artificial skin, artificial blood vessels (for example, artificial arteries), artificial lungs, artificial uterus, artificial intestine, and the like, and artificial skin and artificial blood vessels are preferable. These artificial tissues can be prepared by known methods (for example, Long, JL et al. (2003), Matrix biology 22 (4): 339-50, Muraguchi, T. et al., ( 1994), Plastic and Reconstructive Surgery 93 (3): 537-44).

（弾性線維の再生方法）
本発明に係る弾性線維の再生方法は、上記の弾性線維再生剤を、線維再生能を有する細胞に接触させて弾性線維を再生するところに特徴がある。接触方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏの両方が含まれる。本発明の再生方法は、ＬＴＢＰ−４を含有する弾性線維再生剤を用いたこと以外は、前述した特許文献２に記載の再生方法と実質的に同じである。詳細には以下のとおりである。 (Regeneration method of elastic fiber)
The elastic fiber regeneration method according to the present invention is characterized in that the elastic fiber regeneration agent is regenerated by bringing the elastic fiber regeneration agent into contact with a cell having fiber regeneration ability. Contact methods include both in vitro and in vivo. The regeneration method of the present invention is substantially the same as the regeneration method described in Patent Document 2 described above except that an elastic fiber regeneration agent containing LTBP-4 is used. Details are as follows.

上記「弾性線維再生能を有する細胞」とは、弾性線維構成成分を分泌し、且つＬＴＢＰ−４の存在下で培養されることによって弾性線維の再生（新生、形成）を可能とする細胞をいう。上記「弾性線維再生能を有する細胞」は、任意の動物に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物に由来するものである。哺乳動物としては、前述した、ＬＴＢＰ−４のオルソログが由来するものと同様のものが挙げられる。   The above-mentioned “cell having elastic fiber regeneration ability” refers to a cell that secretes elastic fiber components and enables regeneration (neogenesis and formation) of elastic fibers by being cultured in the presence of LTBP-4. . The “cells having the ability to regenerate elastic fibers” are cells derived from any animal, and are preferably derived from mammals. Examples of the mammal include the same ones from which the ortholog of LTBP-4 described above is derived.

上記「弾性線維再生能を有する細胞」は、遺伝子非導入細胞又は遺伝子導入細胞のいずれであっても良い。このうち「遺伝子非導入細胞」としては、弾性線維が存在する組織、例えば皮膚、血管（例、動脈）、肺、子宮、心臓、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、小腸、結腸、軟骨組織に由来する細胞が挙げられる。「遺伝子非導入細胞」はまた、線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞などの細胞であり得る。好ましくは、皮膚線維芽細胞又は血管平滑筋細胞が用いられる。「遺伝子非導入細胞」はまた、初代培養細胞、初代培養細胞から誘導された細胞株、幹細胞などの未分化細胞の培養によって得られる細胞であっても良い。このような細胞は、公知の方法により調製できる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）；機能細胞の分離と培養，丸善書店（１９８７）などを参照することができる。   The “cell having the ability to regenerate elastic fibers” may be either a non-gene-transferred cell or a gene-transferred cell. Among these, “non-transgenic cells” are derived from tissues in which elastic fibers are present, such as skin, blood vessels (eg, arteries), lungs, uterus, heart, kidney, pancreas, testis, ovary, small intestine, colon, and cartilage tissue. Cell to do. “Non-transgenic cells” can also be cells such as fibroblasts, smooth muscle cells, epithelial cells, endothelial cells. Preferably, dermal fibroblasts or vascular smooth muscle cells are used. The “gene non-transfected cell” may also be a cell obtained by culturing an undifferentiated cell such as a primary cultured cell, a cell line derived from the primary cultured cell, or a stem cell. Such cells can be prepared by known methods. See, eg, Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); Separation and culture of functional cells, Maruzen Shoten (1987), etc. can be referred to.

また、上記「遺伝子導入細胞」としては、１又は２以上の遺伝子がその発現が可能なように導入されたものが挙げられる。導入対象である細胞が、弾性線維再生能を有していない、あるいは十分に有していない細胞の場合、弾性線維構成成分及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子を発現可能なベクターを上記細胞に導入することにより、弾性線維再生能を獲得した細胞、あるいは弾性線維再生能が改善された細胞が作製できる。勿論、前述した「弾性線維構成成分」及び／又は弾性線維の形成を促進する「他の因子」を発現可能なベクターを導入し、その弾性線維再生能をより向上させてもよい。上記の「弾性線維構成成分」や「他の因子」は特に限定されず、細胞の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。具体的には、「弾性線維構成成分」としては、例えば、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２及び４、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２などが挙げられ、また、弾性線維の形成を促進する「他の因子」としては、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）Ｖ３、ヒアルロニダーゼなどが挙げられる。なお、上記「他の因子」を発現可能なベクター及び該ベクターの細胞への導入方法としては、後述するＬＴＢＰ−４発現ベクターおよびＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターと同様のものを用いることができる。   Examples of the “gene-introduced cell” include those into which one or two or more genes have been introduced so that their expression is possible. A vector capable of expressing elastic fiber constituents and / or other factors that promote the formation of elastic fibers when the cells to be introduced are cells that do not have or do not have sufficient ability to regenerate elastic fibers Is introduced into the above cells, so that cells that have acquired the ability to regenerate elastic fibers or cells that have improved the ability to regenerate elastic fibers can be produced. Of course, a vector capable of expressing the above-mentioned “elastic fiber constituents” and / or “other factors” that promote the formation of elastic fibers may be introduced to further improve the elastic fiber regeneration ability. The above-mentioned “elastic fiber constituents” and “other factors” are not particularly limited, and can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the cell type. Specifically, examples of the “elastic fiber component” include elastin, lysyl oxidase (LOX), lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1-4), LTBP2 and 4, fibrillin 1-3, EMILIN1 and 2, and MAGP1. In addition, “other factors” that promote the formation of elastic fibers include versican V3, hyaluronidase, and the like. In addition, as a vector capable of expressing the “other factors” and a method for introducing the vector into cells, the same LTBP-4 expression vector and DANCE inducer expression vector described later can be used.

本発明の再生方法は、細胞との接触方法がｉｎ ｖｉｔｒｏである場合、上述した「弾性線維再生能を有する細胞」（以下、単に「細胞」と略記する場合がある。）に本発明の弾性線維再生剤を接触させて培養を行う工程を含む。培養培地中に播種する上記細胞の密度は特に限定されず、サブコンフルエント又はコンフルエントになるように播種すれば良い。   In the regeneration method of the present invention, when the method of contacting with cells is in vitro, the elasticity of the present invention is applied to the above-mentioned “cells having the ability to regenerate elastic fibers” (hereinafter sometimes simply referred to as “cells”). A step of culturing by contacting the fiber regeneration agent. The density of the cells to be seeded in the culture medium is not particularly limited, and may be seeded so as to be subconfluent or confluent.

培養方法は、ＬＴＢＰ−４の存在下で上記細胞を培養できる方法であれば特に限定されず、例えば、（１）ＬＴＢＰ−４を添加した培地での培養、（２）ＬＴＢＰ−４誘導因子を添加した培地での培養、（３）ＬＴＢＰ−４発現ベクターおよび／またはＬＴＢＰ−４誘導因子発現ベクターを導入した細胞の培養、（４）ＬＴＢＰ−４発現細胞および／またはＬＴＢＰ−４誘導因子発現細胞と、上記「弾性線維再生能を有する細胞」との共培養などが挙げられる。   The culture method is not particularly limited as long as the cells can be cultured in the presence of LTBP-4. For example, (1) culture in a medium supplemented with LTBP-4, (2) LTBP-4 inducer Culture in an added medium, (3) culture of a cell into which an LTBP-4 expression vector and / or an LTBP-4 inducer expression vector has been introduced, (4) an LTBP-4 expression cell and / or an LTBP-4 inducer expression cell And the above-mentioned “cells having the ability to regenerate elastic fibers”.

上記（１）の場合、培地に添加されるＬＴＢＰ−４は、天然タンパク質又は組換えタンパク質のいずれであっても良い。ＬＴＢＰ−４は、公知の方法によって調製・精製することができる。   In the case of (1) above, LTBP-4 added to the medium may be either a natural protein or a recombinant protein. LTBP-4 can be prepared and purified by a known method.

代表的なＬＴＢＰ−４の調製方法としては、例えば、（ａ）ＬＴＢＰ−４含有する生体試料（例えば、血液）からＬＴＢＰ−４を回収する方法、(ｂ）宿主細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＬＴＢＰ−４発現ベクターを導入することによって形質転換体を作製し、当該形質転換体によって産生されるＬＴＢＰ−４を回収する方法、（ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどを用いる無細胞系によりＬＴＢＰ−４を合成する方法、などが挙げられる。   As a typical method for preparing LTBP-4, for example, (a) a method for recovering LTBP-4 from a biological sample (for example, blood) containing LTBP-4, (b) a host cell (for example, Escherichia, A method for producing a transformant by introducing an LTBP-4 expression vector into a genus Bacillus, yeast, insect cell, insect, animal cell) and recovering LTBP-4 produced by the transformant (c) And a method of synthesizing LTBP-4 by a cell-free system using rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate, and the like.

また、代表的なＬＴＢＰ−４の精製方法としては、例えば、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、抗LTBP-4抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法、などが挙げられる。   Moreover, as a typical purification method of LTBP-4, for example, a method using solubility such as salting out or solvent precipitation method; dialysis method, ultrafiltration method, gel filtration method, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis Method utilizing mainly molecular weight difference such as method; Method utilizing charge difference such as ion exchange chromatography; Method utilizing specific affinity such as affinity chromatography and use of anti-LTBP-4 antibody; Reverse phase Examples include a method using a difference in hydrophobicity such as high performance liquid chromatography; a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing method; a method combining these, and the like.

培地に添加されるＬＴＢＰ−４の量は、弾性線維の再生を可能とする限り特に限定されないが、例えば培養培地中での最終濃度が、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜５０μｇ／ｍＬ、更に好ましくは１〜２０μｇ／ｍＬとなるように添加することが推奨される。   The amount of LTBP-4 added to the medium is not particularly limited as long as elastic fibers can be regenerated. For example, the final concentration in the culture medium is preferably 0.1 to 100 μg / mL, more preferably 0. It is recommended to add so as to be 5 to 50 μg / mL, more preferably 1 to 20 μg / mL.

上記（２）の場合、培地に添加されるＬＴＢＰ−４誘導因子は、ＬＴＢＰ−４の発現を誘導できるものである限り限定されないが、例えばＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）などが挙げられる。ＬＴＢＰ−４誘導因子がタンパク質である場合、天然タンパク質又は組換えタンパク質（ＬＴＢＰ−４と同様に調製可能）を使用できる。培地に添加されるＬＴＢＰ−４誘導因子の量は、弾性線維の再生を可能とする程度の量のＬＴＢＰ−４を誘導するものである限り特に限定されないが、例えばＬＴＢＰ−４誘導因子としてＴＧＦβを用いた場合、培養培地中での最終濃度が、好ましくは０．５〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ、更に好ましくは５〜４０ｎｇ／ｍＬとなるように添加することが推奨される。   In the case of (2) above, the LTBP-4 inducing factor added to the medium is not limited as long as it can induce the expression of LTBP-4, and examples thereof include TGFβ (for example, TGFβ1). When the LTBP-4 inducer is a protein, a natural protein or a recombinant protein (which can be prepared in the same manner as LTBP-4) can be used. The amount of the LTBP-4 inducer added to the medium is not particularly limited as long as it induces LTBP-4 in an amount sufficient to regenerate elastic fibers. For example, TGFβ is used as the LTBP-4 inducer. When used, it is recommended to add such that the final concentration in the culture medium is preferably 0.5 to 1000 ng / mL, more preferably 1 to 100 ng / mL, and even more preferably 5 to 40 ng / mL. The

上記（３）の場合、上記細胞に導入される発現ベクターは、ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子を発現可能なベクターであっても良い。これらの発現ベクターは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、目的とする細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、目的の細胞で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーターなどのウイルスプロモーター；およびβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーターなどの哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。プロモーターはまた、線維芽細胞特異的プロモーター（例えば、コラーゲンプロモーター）、平滑筋細胞特異的プロモーター（例えば、ＳＭ２２プロモーター、α−平滑筋アクチンプロモーター）などの、弾性線維再生能を有する細胞に特異的なプロモーターであってもよい。   In the case of (3) above, the expression vector introduced into the cell may be a vector capable of expressing LTBP-4 or an LTBP-4 inducer. In these expression vectors, the polynucleotide encoding the target protein must be operably linked to a promoter capable of exhibiting promoter activity in the target cell. The promoter used is not particularly limited as long as it can function in the target cell. For example, SV40-derived early promoter, cytomegalovirus LTR, Rous sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR, adenovirus-derived early promoter, etc. And a mammalian constituent protein gene promoter such as β-actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter, and the like. Promoters are also specific for cells that have the ability to regenerate elastic fibers, such as fibroblast-specific promoters (eg, collagen promoters), smooth muscle cell-specific promoters (eg, SM22 promoter, α-smooth muscle actin promoter). It may be a promoter.

発現ベクターは、好ましくは目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。発現ベクターは、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシンなどの薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子など）を更に含有することもできる。発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、並びにレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターが挙げられる。   The expression vector preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of the polynucleotide encoding the target protein. Expression vectors contain selectable marker genes for selection of transformed cells (such as genes that confer resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, and genes that complement auxotrophic mutations). Further, it can be contained. The basic backbone vector used as the expression vector is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors and viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and Sendai viruses.

発現ベクターの上記細胞への導入方法は特に限定されず、公知の方法、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、リポソーム、陽イオン性脂質などの脂質を使用する方法などによって行われ得る。また、発現ベクターの一部又は全てが、弾性線維の形成能を有する細胞のゲノムに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい。発現ベクターの細胞内ゲノムへの組込みは特に限定されず、公知の方法、例えばレトロウイルスを使用する方法、相同組換えを可能とするターゲティングベクターを使用する方法などが用いられ得る。   The method for introducing the expression vector into the cells is not particularly limited, and may be performed by a known method such as electroporation, calcium phosphate precipitation, microinjection, liposome, cationic lipid, or the like. obtain. Further, part or all of the expression vector may or may not be integrated into the genome of a cell having the ability to form elastic fibers. The integration of the expression vector into the intracellular genome is not particularly limited, and a known method such as a method using a retrovirus, a method using a targeting vector that enables homologous recombination, or the like can be used.

上記（４）の場合、培地中で上記「弾性線維再生能を有する細胞」と共存させる細胞は、ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子を発現可能な発現細胞である限り特に限定されない。この発現細胞としては、例えば、ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子の発現ベクターの宿主細胞への導入により得られる細胞、ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子を発現する天然細胞が挙げられる。ＬＴＢＰ−４を発現する天然細胞としては、ＬＴＢＰ−４発現組織（例えば、心臓、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、小腸、結腸、軟骨、動脈、肺、子宮、皮膚）由来の細胞を使用できる。ＬＴＢＰ−４誘導因子を発現する天然細胞としては、例えば、ＬＴＢＰ−４誘導因子としてＴＧＦβを意図する場合には、白血球、骨、胎盤、脾臓、小腸、結腸、肝臓、腎臓、心臓、脳、骨髄、軟骨などの組織由来の細胞を使用できる。ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子の発現細胞はまた、初代培養細胞、初代培養細胞から誘導された細胞株、幹細胞などの未分化細胞の培養により得られる細胞（例えば、分化細胞）、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などであり得る。ＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子の発現細胞はまた、弾性線維再生能を有する細胞と同種動物由来の細胞であっても良い。   In the case of the above (4), the cells coexisting with the “cells having elastic fiber regeneration ability” in the medium are not particularly limited as long as they are expressing cells capable of expressing LTBP-4 or an LTBP-4 inducer. Examples of the expression cells include cells obtained by introducing an LTBP-4 or LTBP-4 inducer expression vector into a host cell, and natural cells that express the LTBP-4 or LTBP-4 inducer. As natural cells that express LTBP-4, cells derived from an LTBP-4 expressing tissue (for example, heart, kidney, pancreas, testis, ovary, small intestine, colon, cartilage, artery, lung, uterus, skin) can be used. Examples of natural cells expressing an LTBP-4 inducer include leukocytes, bone, placenta, spleen, small intestine, colon, liver, kidney, heart, brain, bone marrow, when TGFβ is intended as an LTBP-4 inducer. Cells derived from tissues such as cartilage can be used. LTBP-4 or an LTBP-4 inducer-expressing cell may also be a primary cultured cell, a cell line derived from the primary cultured cell, a cell obtained by culturing an undifferentiated cell such as a stem cell (eg, a differentiated cell), a commercially available cell It can be a cell line, a cell line available from a cell bank, or the like. The cells expressing LTBP-4 or the LTBP-4 inducer may also be cells derived from the same species as the cells having the ability to regenerate elastic fibers.

共培養の方法としては、例えば、上記「弾性線維再生能を有する細胞」とＬＴＢＰ−４またはＬＴＢＰ−４誘導因子の発現細胞とを物理的に接触させて培養する方法が挙げられる。あるいは、これら細胞が同じ培養系に存在するが物質の行き来が可能な隔壁により隔てられて細胞自体の物理的接触ができない状態で培養しても良く、このような方法も包含される。具体的には、例えば、通常の細胞培養に用いられるフィルター（例えば、カルチャーインサート）を用いて両細胞を隔てて培養する方法が挙げられる。   Examples of the co-culture method include a method in which the above-mentioned “cells having elastic fiber regeneration ability” and cells expressing LTBP-4 or an LTBP-4 inducer are brought into physical contact and cultured. Alternatively, the cells may be cultured in a state where the cells exist in the same culture system but are separated from each other by a partition wall through which a substance can pass and cannot physically contact the cells themselves, and such a method is also included. Specifically, for example, a method of culturing both cells separately using a filter (for example, culture insert) used for normal cell culture can be mentioned.

本発明の再生方法に用いられる培地は特に限定されず、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などを使用できる。培地には、アミノ酸、ビタミン、脂質、抗生物質、緩衝剤などの、培地に通常添加される成分を更に添加してもよい。培地の好ましいｐＨは、例えば約６〜８であり、より好ましくは約６．５〜７．５である。好ましい培養温度は、例えば約３０〜４０℃であり、より好ましくは約３７℃である。好ましい培養期間も特に限定されず、培地などの培養条件に応じて充分な量の弾性線維が得られるように適宜調整すれば良い。   The medium used in the regeneration method of the present invention is not particularly limited, and MEM medium, DMEM medium, RPMI 1640 medium, and the like can be used. Components that are usually added to the medium, such as amino acids, vitamins, lipids, antibiotics, and buffering agents, may be further added to the medium. The preferred pH of the medium is, for example, about 6-8, more preferably about 6.5-7.5. A preferable culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C, more preferably about 37 ° C. A preferable culture period is not particularly limited, and may be appropriately adjusted so as to obtain a sufficient amount of elastic fibers according to culture conditions such as a medium.

上記培養は、無血清培地中、および血清培地（例えば５％以下、３％以下又は１％以下の血清を含有）中のいずれで行なっても良い。例えば、未同定成分の混入の防止、感染リスクの軽減などを考慮すれば、無血清培地で行うことが好ましい。また、異種動物由来成分を除去し、アレルギー反応を抑制するなどの観点から、培養に用いられるＬＴＢＰ−４、弾性線維再生能を有する細胞、および必要に応じて添加される他の成分は、同種動物に由来するもので統一することが好ましい。   The culture may be performed either in a serum-free medium or in a serum medium (for example, containing 5% or less, 3% or less, or 1% or less of serum). For example, it is preferable to use a serum-free medium in consideration of prevention of contamination of unidentified components and reduction of infection risk. In addition, from the viewpoint of removing heterogeneous animal-derived components and suppressing allergic reactions, LTBP-4 used for culture, cells having the ability to regenerate elastic fibers, and other components added as necessary are the same. It is preferable to unify them with those derived from animals.

上記培養で用いられる培地はまた、弾性線維を効率的に形成させるため、ＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥ以外の弾性線維構成成分（例えば、エラスチン、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）、リシルオキシダーゼ様１−４（ＬＯＸＬ１−４）、ＬＴＢＰ２、フィブリリン１−３、ＥＭＩＬＩＮ１及び２、ＭＡＧＰ１及び２）、及び／又は弾性線維の形成を促進する他の因子（例えば、バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）Ｖ３、ヒアルロニダーゼ）、並びに／あるいはその他の成分（例えば、ｂｅｔａｉｇ−ｈ３、６７ｋＤエラスチン結合タンパク質）を含むことができる。   The medium used in the above culture also has elastic fiber components other than LTBP-4 and DANCE (for example, elastin, lysyl oxidase (LOX), lysyl oxidase-like 1-4 (LOXL1- 4), LTBP2, fibrillin 1-3, EMILIN1 and 2, MAGP1 and 2), and / or other factors that promote the formation of elastic fibers (eg, versican V3, hyaluronidase), and / or other components (Eg betaig-h3, 67 kD elastin binding protein).

培養は、二次元培養または三次元培養で行っても良い。二次元培養または三次元培養は、公知の方法により行うことができる。例えば、三次元培養に関する技術については、Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｍａｔｒｉｘ ｂｉｏｌｏｇｙ ２２（４）：３３９−５０、Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ ９３（３）：５３７−４４を参照することができる。   The culture may be performed by two-dimensional culture or three-dimensional culture. Two-dimensional culture or three-dimensional culture can be performed by a known method. For example, see Long, J. et al. L. et al. (2003), Matrix biology 22 (4): 339-50, Muraguchi, T .; et al. (1994) Plastic and Reconstructive Surgical 93 (3): 537-44.

弾性線維が再生されたか否かは、公知の方法によって確認することができる。例えば、培養物の一部を採取し、抗ＬＴＢＰ−４抗体、抗エラスチン抗体などの弾性線維構成成分に対する抗体を用いて免疫染色することにより確認することができる。   Whether or not the elastic fiber has been regenerated can be confirmed by a known method. For example, a part of the culture can be collected and confirmed by immunostaining with an antibody against elastic fiber components such as anti-LTBP-4 antibody and anti-elastin antibody.

（ＬＴＢＰ−４発現増強因子又は弾性線維再生剤のスクリーニング方法）
本発明には、ＬＴＢＰ−４を指標として用い、ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現状況を解析することによって、ＬＴＢＰ−４発現増強因子又は弾性線維再生剤をスクリーニングする方法も包含される。すなわち、ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現の有無や発現量を公知の方法によって測定することにより、弾性線維再生の有無や弾性線維再生能を間接的に評価することができる。 (Method for screening LTBP-4 expression enhancing factor or elastic fiber regenerative agent)
The present invention also includes a method for screening an LTBP-4 expression enhancing factor or an elastic fiber regenerating agent by analyzing the expression status of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 using LTBP-4 as an index. Is done. That is, the presence / absence and expression level of elastic fiber regeneration can be indirectly evaluated by measuring the presence / absence and expression level of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 by a known method.

本発明のスクリーニング方法は、例えば、被験物質のＬＴＢＰ−４発現増強能や弾性線維再生能を評価するのに好適に用いられる。具体的には、被験物質と細胞を接触させ、必要に応じて培養後、被験物質と接触させた試験群のＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量と、被験物質と接触させていない対照群（コントロール）のＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量とを比較検討し、対照群に比べてＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現が有意に認められたり、発現量が増加していれば、当該被験物質はＬＴＢＰ−４発現増強能や弾性線維の再生能ありと評価することができる。   The screening method of the present invention is suitably used for evaluating, for example, the ability to enhance LTBP-4 expression and the ability to regenerate elastic fibers of a test substance. Specifically, the test substance and cells are brought into contact, cultured as necessary, and contacted with the test substance and the expression level of LTBP-4 or mRNA encoding LTBP-4 in the test group contacted with the test substance. The expression level of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 in the control group (control) not compared was examined, and the expression of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 was significantly observed compared to the control group If the expression level is increased or the expression level is increased, the test substance can be evaluated as having an ability to enhance LTBP-4 expression or to regenerate elastic fibers.

あるいは、上記のスクリーニング方法は、更にＤＡＮＣＥ又はＤＡＮＣＥをコードするｍＲＮＡの発現の有無や発現量を公知の方法によって測定する工程を、更に包含しても良い。本発明の弾性線維再生剤は、好ましくはＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥの両方を含むものだからである。このようにＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥの両方を指標として用いることにより、両方の発現増強能を有する物質のスクリーニングや、ＬＴＢＰ-４発現増強因子とＤＡＮＣＥ発現増強因子とを含む弾性線維再生剤のスクリーニングを有効に行なうことができる。   Alternatively, the screening method may further include a step of measuring the presence or absence and expression level of DANCE or mRNA encoding DANCE by a known method. This is because the elastic fiber regenerating agent of the present invention preferably contains both LTBP-4 and DANCE. Thus, by using both LTBP-4 and DANCE as indicators, screening of substances having both expression enhancing ability and screening of elastic fiber regenerative agent containing LTBP-4 expression enhancing factor and DANCE expression enhancing factor are possible. It can be done effectively.

ＬＴＢＰ−４若しくはＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡ、またはＤＡＮＣＥ若しくはＤＡＮＣＥをコードするｍＲＮＡの発現状況を解析する方法は特に限定されず、常法を用いることができる。例えば、ＬＴＢＰ−４またはＤＡＮＣＥに特異的な抗体を使用し、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的測定法によりＬＴＢＰ−４またはＤＡＮＣＥの存在又は量を測定する方法；リアルタイムＰＣＲ法やコンペティティブＰＣＲ法などの方法を用いて細胞内の特定ｍＲＮＡ量を定量する方法などが代表的に例示される。上記方法に用いられる抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれでも良く、市販品を用いることができる。   The method for analyzing the expression status of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4, or mRNA encoding DANCE or DANCE is not particularly limited, and conventional methods can be used. For example, using an antibody specific for LTBP-4 or DANCE and measuring the presence or amount of LTBP-4 or DANCE by an immunoassay such as ELISA; a method such as real-time PCR or competitive PCR A typical example is a method for quantifying the amount of specific mRNA in a cell. The antibody used in the above method may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and a commercially available product can be used.

以下、ＬＴＢＰ−４を例に挙げ、代表的な解析方法を記載するが、これに限定する趣旨ではない。   Hereinafter, although LTBP-4 is mentioned as an example and a typical analysis method is described, it is not the meaning limited to this.

＜リアルタイムＰＣＲ法＞
線維芽細胞を６ウエルプレートに播種し、サブコンフレントの状態まで培養した後、被験物質を溶解させた培地を各ウエルに添加する。添加後４８時間培養し、線維芽細胞を溶解し、細胞内全ＲＮＡの抽出・精製を行なう。その後、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を逆転写酵素を用いて合成し、このｃＤＮＡを鋳型として目的領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する。上記方法に用いられるＬＴＢＰ−４に特異的なプライマーとしては、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから提供される２８種のプライマーが挙げられる。具体的には、ヒトの肺細胞を用いた場合、下記２種類のプライマーＡまたはプラマーＢを用いることができる。
プライマーＡ：
フォワード：５’−ＴＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧ−３
リバース：５’−ＣＡＧＡＣＴＡＡＧＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’
フォワード：５’−ＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧ−３’
リバース：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧ−３’
プライマーＢ：
フォワード：５’−ＣＣＣＧＣＴＣＣＧＴＴＴＡＴＡＣＡＡＴＧ−３
リバース：５’−ＡＧＧＡＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＡＣ−３’ <Real-time PCR method>
After fibroblasts are seeded in a 6-well plate and cultured to a sub-confluent state, a medium in which a test substance is dissolved is added to each well. After the addition, the cells are cultured for 48 hours, the fibroblasts are lysed, and intracellular total RNA is extracted and purified. Subsequently, DNA complementary to mRNA (cDNA) is synthesized using reverse transcriptase, the target region is amplified by PCR using this cDNA as a template, and the production process of the amplified product is monitored in real time using a reagent for real-time monitoring. And analyze. Examples of primers specific to LTBP-4 used in the above method include 28 kinds of primers provided by Applied Biosystems. Specifically, when human lung cells are used, the following two types of primers A or plumer B can be used.
Primer A:
Forward: 5'-TGGCTGAGCCCTACGAGG-3
Reverse: 5'-CAGACTAAGCGGGCTGCAG-3 '
Forward: 5'-GTGGAGCTGCCCTGTGTG-3 '
Reverse: 5'-CCTGGTCTCGGAAGAGCTG-3 '
Primer B:
Forward: 5'-CCCGCTCCGTTTATACAATG-3
Reverse: 5'-AGGAAAACCGTCCGGAC-3 '

＜ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（ＰＡＮＯＭＩＣＳ社製）を用いる方法＞
線維芽細胞を培養プレートなどに播種し、サブコンフレントの状態まで培養した後、被験物質を溶解させた培地を各ウエルに添加する。その後、培養した細胞のライセートを回収し、ＬＴＢＰ−４のｍＲＮＡに相補的な配列を持つキャプチャープローブを固定相とするウエルに添加する。反応後、非特異的な結合を洗浄し、固定相プローブに結合した目的遺伝子のｍＲＮＡに対し、更に相補的配列を有するプローブとそれに対するラベルプローブを反応させ、基質を用いて発色反応させる。遺伝子発現量は、発色強度や発色の有無により評価する。 <Method using Quantene Gene (manufactured by PANOMICS)>
After inoculating fibroblasts on a culture plate or the like and culturing them to a subconfluent state, a medium in which a test substance is dissolved is added to each well. Thereafter, the lysate of the cultured cells is collected, and a capture probe having a sequence complementary to the mRNA of LTBP-4 is added to a well serving as a stationary phase. After the reaction, non-specific binding is washed, and the target gene mRNA bound to the stationary phase probe is further reacted with a probe having a complementary sequence and the label probe thereto, and a color reaction is carried out using the substrate. The gene expression level is evaluated based on the color intensity or the presence or absence of color development.

＜Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｐｌｅｘを用いる方法＞
この方法は、蛍光色素で標識したマイクロビーズを担体として使用し、これらのマイクロビーズにｍＲＮＡに相補的な配列を持つキャプチャープローブを固定して蛍光色素の配合比率を読み取ることによって当該プローブを特定する方法である。 <Method using Quantigen Plex>
In this method, microbeads labeled with a fluorescent dye are used as a carrier, a capture probe having a sequence complementary to mRNA is immobilized on these microbeads, and the probe is identified by reading the mixing ratio of the fluorescent dye. Is the method.

具体的には、線維芽細胞を培養プレートなどに播種し、サブコンフレントの状態まで培養した後、被験物質を溶解させた培地を各ウエルに添加する。その後、培養した細胞のライセートを回収し、ＬＴＢＰ−４のｍＲＮＡに相補的な配列を持つキャプチャープローブを固定した蛍光マイクロビーズと反応させる。反応後、非特異的な結合を洗浄し、キャプチャープローブに結合した目的遺伝子のｍＲＮＡに対し、更に相補的配列を有するプローブとそれに対するラベルプローブを反応させ、蛍光基質を用いて発色反応させる。その後、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００にて、蛍光マイクロビーズに結合したラベルプローブの蛍光強度、またはラベルプローブに結合した蛍光マイクロビーズの蛍光強度を測定する。   Specifically, fibroblasts are seeded on a culture plate or the like, cultured to a subconfined state, and then a medium in which a test substance is dissolved is added to each well. Thereafter, the lysate of the cultured cells is collected and reacted with fluorescent microbeads to which a capture probe having a sequence complementary to LTBP-4 mRNA is immobilized. After the reaction, non-specific binding is washed, and the target gene mRNA bound to the capture probe is further reacted with a probe having a complementary sequence and the label probe thereto, and a color reaction is carried out using a fluorescent substrate. Thereafter, the Luminex 100 measures the fluorescence intensity of the label probe bound to the fluorescent microbead or the fluorescence intensity of the fluorescent microbead bound to the label probe.

＜ＥＬＩＳＡ法＞
ＥＬＩＳＡ法は、直接吸着法とサンドイッチ法のいずれも適用することができる。直接吸着法は、ＬＴＢＰ−４に対する抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか一方のみしかない場合に有用であり、一方、ＬＴＢＰ−４に対する抗体が複数ある場合は、より特異的なサンドイッチ法が有用である。 <ELISA method>
As the ELISA method, either a direct adsorption method or a sandwich method can be applied. The direct adsorption method is useful when the antibody against LTBP-4 has only one of a monoclonal antibody and a polyclonal antibody, whereas when there are multiple antibodies against LTBP-4, a more specific sandwich method is useful. It is.

このうち直接吸着法（ダイレクトＥＬＩＳＡ法）は、例えば以下のようにして行なう。まず、被験物質を溶解させた培地中で培養した線維芽細胞の上清（または細胞溶解物）をＰＢＳで希釈し、この懸濁液をウエルに添加し、４℃で一晩固定相に吸着させる。その後、ＰＢＳなどを用いてウエルを洗浄し、抗ＬＴＢＰ−４抗体溶液を各ウエルに添加し、室温で１時間反応させる。その後、ＰＢＳなどを用いてウエルを洗浄し、二次抗体溶液を添加して室温で１時間反応させ、反応後の蛍光強度または発色強度を測定する。   Among these, the direct adsorption method (direct ELISA method) is performed as follows, for example. First, the supernatant (or cell lysate) of fibroblasts cultured in a medium in which the test substance is dissolved is diluted with PBS, this suspension is added to the well, and adsorbed to the stationary phase overnight at 4 ° C. Let Thereafter, the wells are washed with PBS or the like, and an anti-LTBP-4 antibody solution is added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Thereafter, the well is washed with PBS or the like, a secondary antibody solution is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour, and the fluorescence intensity or color development intensity after the reaction is measured.

また、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば以下のようにして行なう。まず、抗ＬＴＢＰ−４モノクローナル抗体溶液を各ｗｅｌｌに添加し、４℃で一晩固定相に吸着させる。その後、ＰＢＳなどを用いてウエルを洗浄し、被験物質を溶解させた培地中で培養した線維芽細胞の上清（または細胞溶解物）をＰＢＳで希釈し、この懸濁液を各ウエルに添加し、室温で１時間反応させる。その後、ＰＢＳなどを用いてウエルを洗浄し、抗ＬＴＢＰ−４ポリクローナル抗体溶液を各ウエルに添加し、室温で１時間反応させる。その後、ＰＢＳなどを用いてウエルを洗浄し、二次抗体溶液を添加して室温で１時間反応させ、反応後の蛍光強度または発色強度を測定する。   The sandwich ELISA method is performed as follows, for example. First, an anti-LTBP-4 monoclonal antibody solution is added to each well and adsorbed to the stationary phase overnight at 4 ° C. Then, the wells are washed with PBS or the like, and the supernatant (or cell lysate) of fibroblasts cultured in a medium in which the test substance is dissolved is diluted with PBS, and this suspension is added to each well. And allowed to react for 1 hour at room temperature. Thereafter, the wells are washed with PBS or the like, and an anti-LTBP-4 polyclonal antibody solution is added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Thereafter, the well is washed with PBS or the like, a secondary antibody solution is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour, and the fluorescence intensity or color development intensity after the reaction is measured.

＜Ｌｕｍｉｎｅｘ１００を用いる方法＞
この方法は、２種類の蛍光色素で標識したマイクロビーズを担体として使用し、これらのマイクロビーズにプローブを固定して蛍光色素の配合比率を読み取ることによって当該プローブを特定する方法である。上記方法の原理は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法と同じである。 <Method using Luminex 100>
In this method, microbeads labeled with two kinds of fluorescent dyes are used as a carrier, the probes are specified by fixing the probes to these microbeads and reading the blending ratio of the fluorescent dyes. The principle of the above method is the same as that of the sandwich ELISA method.

具体的には、ＬＴＢＰ−４に特異的なモノまたはポリクローナル抗体を結合させた蛍光ビーズ（ビーズ１）を、被験物質を溶解させた培地中で培養した線維芽細胞の上清（または細胞溶解物）と反応させる。反応後、ＰＢＳなどを用いて洗浄し、上記のビーズとは異なる、ＬＴＢＰ−４に特異的なモノまたはポリクローナル抗体を結合させた蛍光ビーズ（ビーズ２）と更に反応させる。反応後洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００にて、ビーズ１に結合したビーズ２の蛍光強度、またはビーズ２に結合したビーズ１の蛍光強度を測定する。   Specifically, a supernatant (or cell lysate) of fibroblasts obtained by culturing fluorescent beads (beads 1) to which a mono- or polyclonal antibody specific to LTBP-4 is bound in a medium in which a test substance is dissolved. ). After the reaction, it is washed with PBS or the like, and further reacted with fluorescent beads (beads 2), which are different from the above beads and bound with a mono- or polyclonal antibody specific to LTBP-4. After the reaction, washing is performed, and the fluorescence intensity of the beads 2 bound to the beads 1 or the fluorescence intensity of the beads 1 bound to the beads 2 is measured with a Luminex 100.

＜直接的な測定＞
セルカルチャーまたは培養プレートなどに線維芽細胞を播種した後、被験物質を添加して培養する。その後、細胞を固定化し、ＢＳＡなどのブロッキング剤を用いてブロッキングを行う。その後、ＰＢＳなどを用いて洗浄した後、ＬＴＢＰ−４に特異的なモノまたはポリクローナル抗体を一定時間反応させ、ＰＢＳなどを用いて洗浄を行う。次に二次抗体反応後、蛍光強度または発色強度を顕微鏡またはＩＮ ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（セルファンクションイメージャー）などの機械を用いて測定する。 <Direct measurement>
After seeding fibroblasts in cell culture or a culture plate, a test substance is added and cultured. Thereafter, the cells are fixed and blocked using a blocking agent such as BSA. Thereafter, after washing with PBS or the like, a mono or polyclonal antibody specific for LTBP-4 is reacted for a certain period of time, and washing is carried out with PBS or the like. Next, after the secondary antibody reaction, the fluorescence intensity or color development intensity is measured using a microscope or a machine such as an IN cell Analyzer (cell function imager).

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限を受けず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適切に改変を行なって実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited by the following examples, and should be implemented with appropriate modifications within a range that can meet the purpose described above and below. Are all possible and are within the scope of the present invention.

１．組換えＬＴＢＰ−４、および組換えＤＡＮＣＥの作成
ヒトＬＴＢＰ−４ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０５１３４４）の全コーディング領域をＰＣＲ法によってクローニングし、カルボキシル末端にＦＬＡＧタグと６ｘＨｉｓタグをつけてｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にサブクローニングした。この発現ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子をマーカーとしてヒトＬＴＢＰ−４安定発現細胞株を作成した。上記ＬＴＢＰ−４安定発現細胞株の無血清培養上清からＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組換えＬＴＢＰ−４を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開してＣｏｏｍａｓｉｅ−Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）で染色した後、透析によって脱塩した。 1. Production of recombinant LTBP-4 and recombinant DANCE The entire coding region of human LTBP-4 cDNA (GenBank accession number: AF051344) was cloned by the PCR method, and the pEF6 vector (with FLAG tag and 6xHis tag at the carboxyl terminus) Sub-cloning into Invitrogen). This expression vector was transfected into 293T cells, and a human LTBP-4 stable expression cell line was prepared using the Blasticidin resistance gene as a marker. Recombinant LTBP-4 was purified from the serum-free culture supernatant of the LTBP-4 stable expression cell line using Ni-NTA agarose (Qiagen), developed with SDS-PAGE, and stained with Coomasie-Blue (CBB). Thereafter, it was desalted by dialysis.

上記と同様にして組換えＤＡＮＣＥを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開してＣＢＢで染色した後、透析によって脱塩した。ここでは、ヒトＤＡＮＣＥ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１１２１５２）の全コーディング領域をＰＣＲ法によってクローニングした。   Recombinant DANCE was purified as described above, developed with SDS-PAGE, stained with CBB, and desalted by dialysis. Here, the entire coding region of human DANCE cDNA (GenBank accession number: AF112152) was cloned by PCR.

図１に、精製した組換えＬＴＢＰ−４（約１８０ｋＤ）および組換えＤＡＮＣＥ（約５８ｋＤ）をＣＢＢ染色した写真を示す。   FIG. 1 shows a photograph of purified recombinant LTBP-4 (about 180 kD) and recombinant DANCE (about 58 kD) stained with CBB.

２．血清存在下での実験
（１）まず、ＬＴＢＰ−４が血清存在下におけるヒト皮膚線維芽細胞による弾性線維の形成に必須であることを実証するため、以下の実験を行なった。 2. Experiments in the presence of serum (1) First, the following experiment was performed to demonstrate that LTBP-4 is essential for the formation of elastic fibers by human skin fibroblasts in the presence of serum.

（実験材料）
継代用培地として、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用いた。なお、弾性線維の形成に当たっては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを弾性線維形成培地として用いた。 (Experimental material)
As a subculture medium, DMEM (purchased from Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen), 10% fetal calf serum (FBS, purchased from JRH Bioscience), 2 mM glutamine, 100 units / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin It was. For the formation of elastic fibers, DMEM / F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's Nutrient Mixture F12, purchased from Invitrogen), 10% FBS, 2 mM glutamine, 100 units / g penicillin, 100 units / ml mL of streptomycin was used as elastic fiber formation medium.

ヒト皮膚線維芽細胞は、前述した特許文献２と同様、京都大学附属病院形成外科から提供されたものを用いた。   The human skin fibroblasts used were those provided by Plastic Surgery, Kyoto University Hospital, as in Patent Document 2 described above.

弾性線維の蛍光免疫染色には、１次抗体として抗エラスチンポリクローナル抗体（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙから購入）と抗ＤＡＮＣＥモノクローナル抗体１０Ａ（ＤＡＮＣＥ遺伝子欠損マウスに組換えＤＡＮＣＥを免疫して作製したもの）を用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８−抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）、Ａｌｅｘａ５４６−抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用いた。   For fluorescent immunostaining of elastic fibers, an anti-elastin polyclonal antibody (purchased from Elastin Products Company) and an anti-DANCE monoclonal antibody 10A (produced by immunizing a DANCE gene-deficient mouse with recombinant DANCE) were used as primary antibodies. As secondary antibodies, Alexa488-anti-rabbit IgG antibody (purchased from Invitrogen) and Alexa546-anti-mouse IgG antibody (purchased from Invitrogen) were used.

（実験方法）
２４ウエルプレートの底にＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｃｏｖｅｒ Ｇｌａｓｓ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄから購入）を置き、その上にヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、上記の継代用培地にて３７℃、５％ＣＯ2で培養した。培養３日目にＰＢＳで洗浄した後、培地を上記の弾性線維形成培地に換え、引き続き、３７℃、５％ＣＯ2で２週間培養した。 (experimental method)
A Microscope Cover Glass (purchased from Fisherbrand) is placed on the bottom of a 24-well plate, and 7.5 × 10 4 human fibroblasts are seeded per well on the plate, and 37 ° C., 5% in the above passage medium. Cultivated with CO 2 . After washing with PBS on the third day of culture, the medium was changed to the elastic fiber formation medium described above, followed by culturing at 37 ° C., 5% CO 2 for 2 weeks.

２週間の培養後、弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。詳細には、１ｍＬのＰＢＳを用いて３回洗浄した後、１００％メタノールを用い、−２０℃で３０分間固定した。更にＰＢＳを用いて洗浄した後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳを用い、室温で３０分間ブロッキングした後、上記の１次抗体と室温で１時間以上インキュベートした。次いで、ＰＢＳで洗浄し、上記の２次抗体と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定し、再びＰＢＳで洗浄した後、ＤＡＰＩ含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓから購入）にてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は蛍光顕微鏡ＤＭＩＲＥ２（Ｌｅｉｃａ）を用いて行った。   After culturing for 2 weeks, fluorescent immunostaining of elastic fibers was performed. Specifically, after washing with 1 mL of PBS three times, 100% methanol was used and fixed at −20 ° C. for 30 minutes. Further, the plate was washed with PBS, blocked with PBS containing 2% BSA for 30 minutes at room temperature, and then incubated with the above primary antibody at room temperature for 1 hour or more. Subsequently, it was washed with PBS and incubated with the above secondary antibody for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, the sample was fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes, washed again with PBS, and then mounted on a slide glass with DAPI-containing Vectashield (purchased from Vector laboratories). The observation was performed using a fluorescence microscope DMIRE2 (Leica).

これらの蛍光免疫染色写真を図２（最上段、コントロールを参照）に示す。図２の最右欄には、参考のため、抗エラスチンポリクローナル抗体および抗ＤＡＮＣＥモノクローナル抗体１０Ａの染色結果を合成したものを示している。図２より、いずれの抗体を用いたときも弾性線維の形成が確認された。すなわち、血清存在下でヒト皮膚線維芽細胞を培養すると、抗エラスチン抗体および抗ＤＡＮＣＥ抗体の両方で染色される弾性線維が形成されることが分かった。   These fluorescent immunostaining photographs are shown in FIG. 2 (see the top, control). In the rightmost column of FIG. 2, the result of synthesizing the anti-elastin polyclonal antibody and the anti-DANCE monoclonal antibody 10A is shown for reference. From FIG. 2, the formation of elastic fibers was confirmed when any antibody was used. That is, it was found that when human dermal fibroblasts were cultured in the presence of serum, elastic fibers stained with both anti-elastin antibody and anti-DANCE antibody were formed.

次に、ＲＮＡ干渉を用いた遺伝子ノックダウンによりＬＴＢＰ−４をノックダウンした細胞を用い、上記と同様にして蛍光免疫染色を行なって弾性線維の形成を調べた。遺伝子ノックダウンは、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）のプロトコールに従い、ＬＴＢＰ−４遺伝子に対するＳｔｅａｌｔｈ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をヒト皮膚線維芽細胞培養に導入して行なった。次いで、上記と同様にして２週間培養を行い、弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。   Next, using cells in which LTBP-4 was knocked down by gene knockdown using RNA interference, fluorescent immunostaining was performed in the same manner as described above to examine the formation of elastic fibers. The gene knockdown was performed by introducing Stealth Select siRNA (purchased from Invitrogen) for the LTBP-4 gene into human skin fibroblast cultures according to the protocol of RNAiMAX (purchased from Invitrogen). Subsequently, the cells were cultured for 2 weeks in the same manner as described above, and fluorescent immunostaining of elastic fibers was performed.

これらの蛍光免疫染色写真を図２（ＬＴＢＰ−４ノックダウンを参照）に示す。図２より、いずれの抗体を用いたときにも弾性線維の形成は殆ど確認できず、エラスチンのみならず、ＤＡＮＣＥの線維状沈着も消失した。すなわち、ＬＴＢＰ−４をｓｉＲＮＡでノックダウンすると弾性線維の形成が見られなくなることが分かった。   These fluorescent immunostaining photographs are shown in FIG. 2 (see LTBP-4 knockdown). 2. From FIG. 2, almost no elastic fiber formation was confirmed when any of the antibodies was used, and not only elastin but also DANCE fibrous deposits disappeared. That is, it was found that when LTBP-4 was knocked down with siRNA, formation of elastic fibers was not observed.

以上の実験結果より、ＬＴＢＰ−４は、血清存在下でのヒト線維芽細胞による弾性線維の形成に必須であることが確認された。   From the above experimental results, it was confirmed that LTBP-4 is essential for the formation of elastic fibers by human fibroblasts in the presence of serum.

（２）次に、組換えＬＴＢＰ−４は、血清存在下におけるヒト皮膚線維芽細胞による弾性線維の再生能を有することを調べた。   (2) Next, it was examined that recombinant LTBP-4 has the ability to regenerate elastic fibers by human skin fibroblasts in the presence of serum.

上記（１）の方法でＬＴＢＰ−４をｓｉＲＮＡでノックダウンした後、組換えＬＴＢＰ−４を１０μｇ／ｍＬの濃度で弾性線維形成培地に加え、２週間培養した。培養後、上記（１）と同様にして弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。   After LTBP-4 was knocked down with siRNA by the method of (1) above, recombinant LTBP-4 was added to the elastic fiber formation medium at a concentration of 10 μg / mL and cultured for 2 weeks. After culturing, fluorescent immunostaining of elastic fibers was performed in the same manner as (1) above.

これらの蛍光免疫染色写真を図２（ＬＴＢＰ−４ノックダウン＋リコンビナントＬＴＢＰ−４を参照）に示す。図２より、ＬＴＢＰ−４をｓｉＲＮＡでノックダウンした後に組換えＬＴＢＰ−４を加えると、いずれの抗体を用いたときにも、ノックダウンした場合に比べて多くの弾性線維が形成された。すなわち、ＬＴＢＰ−４ノックダウンによって抑制されていた弾性線維の再生能が、組換えＬＴＢＰ−４の添加によって回復することが分かった。   These fluorescent immunostaining photographs are shown in FIG. 2 (see LTBP-4 knockdown + recombinant LTBP-4). From FIG. 2, when LTBP-4 was knocked down with siRNA and then recombinant LTBP-4 was added, more elastic fibers were formed when either antibody was used than when knocked down. That is, it was found that the regeneration ability of elastic fibers that was suppressed by LTBP-4 knockdown was restored by the addition of recombinant LTBP-4.

更に非常に興味深いことに、組換えＬＴＢＰ−４を添加すると、ノックダウンしないコントロールに比べても、遥かに多くの弾性線維が形成された。このとき、細胞由来のＤＡＮＣＥもエラスチンと同様に線維状沈着が回復していることも確認された。このようにＬＴＢＰ−４の弾性線維再生作用は、血清自体による作用を遥かに超える、極めて強いものであることが判明したことから、本発明のＬＴＢＰ−４含有再生剤は、弾性線維の再生に極めて有用であるこが強く示唆された。   Even more interestingly, the addition of recombinant LTBP-4 formed far more elastic fibers than controls that did not knock down. At this time, it was also confirmed that the cell-derived DANCE was recovered from the fibrous deposit as in the case of elastin. Thus, it has been found that the elastic fiber regeneration action of LTBP-4 is extremely strong, far exceeding the action of serum itself. Therefore, the LTBP-4-containing regenerative agent of the present invention is suitable for elastic fiber regeneration. It was strongly suggested that it was extremely useful.

３．無血清存在下での実験
以下では、組換えＬＴＢＰ−４単独、組換えＤＡＮＣＥ単独、およびこれらの両方を用い、無血清培地でヒト皮膚線維芽細胞を培養したときの弾性線維の形成能を比較検討した。 3. Experiments in the presence of serum-free The following is a comparison of the ability to form elastic fibers when human skin fibroblasts are cultured in serum-free medium using recombinant LTBP-4 alone, recombinant DANCE alone, or both investigated.

ここでは、血清を含まない上記弾性線維形成培地、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用い、ヒト線維芽細胞を１ウエルあたり７．５×１０4個播種し、上記の無血清培地にて３７℃、５％ＣＯ2で２週間培養した。その後、上記（１）と同様にして、抗エラスチン抗体を用いて蛍光免疫染色を行なった。その結果、無血清培地下では、弾性線維の形成は殆ど見られなかった（図３の「Ｎｏ ｐｒｏｔｅｉｎ」を参照）。 Here, the elastic fibrosis medium without serum, that is, DMEM / F12, 2 mM glutamine, 100 units / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin was used, and human fibroblasts were added at 7.5 × 10 5 per well. Four seeds were seeded and cultured in the above serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 weeks. Thereafter, fluorescent immunostaining was performed using an anti-elastin antibody in the same manner as (1) above. As a result, the formation of elastic fibers was hardly observed in the serum-free medium (see “No protein” in FIG. 3).

次に、上記の無血清培地に組換えＤＡＮＣＥを２μｇ／ｍＬの濃度で添加し、上記と同様にして２週間培養し、蛍光免疫染色を行った。その結果、組換えＤＡＮＣＥの添加により、弾性線維の形成が若干観察された（図３の「ＤＡＮＣＥ ２μｇ／ｍＬ」を参照）。   Next, recombinant DANCE was added to the above serum-free medium at a concentration of 2 μg / mL, and cultured for 2 weeks in the same manner as described above, followed by fluorescent immunostaining. As a result, the formation of elastic fibers was slightly observed by the addition of recombinant DANCE (see “DANCE 2 μg / mL” in FIG. 3).

同様に、上記の無血清培地に組換えＬＴＢＰ−４を２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、上記と同様にして培養し、蛍光免疫染色を行った。その結果、組換えＬＴＢＰ−４の添加により、やはり、弾性線維の形成が若干観察された（図３の「ＬＴＢＰ−４Ｓ ２０μｇ／ｍＬ」を参照）。   Similarly, recombinant LTBP-4 was added to the above serum-free medium at a concentration of 20 μg / mL, cultured in the same manner as described above, and fluorescent immunostaining was performed. As a result, the formation of elastic fibers was also slightly observed by addition of recombinant LTBP-4 (see “LTBP-4S 20 μg / mL” in FIG. 3).

次に、上記の無血清培地に組換えＤＡＮＣＥ２μｇ／ｍＬと組換えＬＴＢＰ−４２０μｇ／ｍＬを同時に加え、上記と同様にして培養し、蛍光免疫染色を行った。その結果、これらを同時に添加すると、それぞれを単独で添加した場合に比べ、遥かに多くの弾性線維が形成された（図３の「ＤＡＮＣＥ ２μｇ／ｍＬ＋ＬＴＢＰ−４Ｓ ２０μｇ／ｍＬ」を参照）。   Next, recombinant DANCE 2 μg / mL and recombinant LTBP-420 μg / mL were simultaneously added to the above serum-free medium, cultured in the same manner as described above, and fluorescent immunostaining was performed. As a result, when these were added simultaneously, far more elastic fibers were formed than when each was added alone (see “DANCE 2 μg / mL + LTBP-4S 20 μg / mL” in FIG. 3).

以上の実験結果より、無血清培地下では、ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ−４は協調的に働いて弾性線維の形成を促進することが確認された。   From the above experimental results, it was confirmed that DANCE and LTBP-4 work cooperatively and promote the formation of elastic fibers in a serum-free medium.

４．ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ−４との結合
ここでは、ＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ−４の相互作用を調べるため、以下の共免疫沈降実験を行なった。 4). Binding of DANCE and LTBP-4 Here, the following co-immunoprecipitation experiment was conducted to examine the interaction between DANCE and LTBP-4.

まず、全長ＤＡＮＣＥのカルボキシル末端にＦＬＡＧタグをつけたＤＡＮＣＥと、全長ＬＴＢＰ−４のカルボキシル末端にＭｙｃタグをつけたＬＴＢＰ−４を、それぞれｐＥＦ６ベクターに組み込んだ。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を用い、これらを別々に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、無血清培地で２日間培養し、上清中にＤＡＮＣＥ−ＦＬＡＧとＬＴＢＰ−４−Ｍｙｃを分泌させた。このようにして得られた培養上清を混合して氷上に１時間静置し、抗ＦＬＡＧアガロース（Ｓｉｇｍａから購入）で免疫沈降（ＩＰ）した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗Ｍｙｃ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットで検出した。   First, DANCE with a FLAG tag attached to the carboxyl terminus of full-length DANCE and LTBP-4 with a Myc tag attached to the carboxyl terminus of full-length LTBP-4 were each incorporated into a pEF6 vector. Using Lipofectamine Plus (purchased from Invitrogen), these were separately transfected into 293T cells, then cultured in serum-free medium for 2 days, and DANCE-FLAG and LTBP-4-Myc were secreted into the supernatant. The culture supernatant thus obtained was mixed, allowed to stand on ice for 1 hour, and immunoprecipitated (IP) with anti-FLAG agarose (purchased from Sigma). Immunoprecipitates were developed by SDS-PAGE and detected by Western blot using anti-Myc antibody and anti-FLAG antibody.

その結果を図４に示す。図４中、上図は抗Ｍｙｃ抗体で検出した結果を；中図は抗ＦＬＡＧ抗体で検出した結果を示し；下図は、免疫沈降前の溶液を抗Ｍｙｃ抗体で検出した結果を示している。図４より、抗ＦＬＡＧアガロースで免疫沈降したＤＡＮＣＥ−ＦＬＡＧには、ＬＴＢＰ−４−Ｍｙｃが結合した。なお、ベクターレーンではＬＴＢＰ−４−Ｍｙｃが検出されないことから、抗ＦＬＡＧアガロースへのＬＴＢＰ−４−Ｍｙｃの結合はDANCE-FLAGを介した特異的結合であることが分かる。上記の実験結果より、ＬＴＢＰ−４はＤＡＮＣＥと直接結合して弾性線維再生能を発揮することが強く示唆された。   The result is shown in FIG. In FIG. 4, the upper figure shows the result detected with the anti-Myc antibody; the middle figure shows the result detected with the anti-FLAG antibody; the lower figure shows the result detected with the anti-Myc antibody. From FIG. 4, LTBP-4-Myc was bound to DANCE-FLAG immunoprecipitated with anti-FLAG agarose. Since LTBP-4-Myc is not detected in the vector lane, it can be seen that the binding of LTBP-4-Myc to anti-FLAG agarose is specific binding via DANCE-FLAG. The above experimental results strongly suggested that LTBP-4 directly binds to DANCE and exhibits elastic fiber regeneration ability.

（分子メカニズムの考察）
上述した一連の実験結果（特に、ＬＴＢＰ−４のノックダウンによりエラスチンのみならずＤＡＮＣＥの線維状沈着も消失したのに対し、これに組換えＬＴＢＰ−４を添加すると、エラスチンのみならずＤＡＮＣＥの線維状沈着も増加したという実験結果）は、ＤＡＮＣＥが、弾性線維を構成するミクロフィブリル上に沈着するためにはＬＴＢＰ−４が必須であることを強く示唆している。すなわち、ＬＴＢＰ−４による弾性線維再生の分子メカニズムとしては、まず、ミクロフィブリルにＬＴＢＰ−４が沈着し、このＬＴＢＰ−４を目印にしてＤＡＮＣＥが誘導され、ＬＴＢＰ−４の上にＤＡＮＣＥが結合し、更にＤＡＮＣＥにエラスチンが結合しているというモデルが考えられる。上述したＤＡＮＣＥとエラスチンの直接結合、およびここで示したＤＡＮＣＥとＬＴＢＰ−４の直接結合はこのモデルを強く支持するものである。 (Consideration of molecular mechanism)
As a result of the above-described series of experiments (particularly, when LTBP-4 was knocked down, not only elastin but also DANCE's fibrous deposits disappeared. When recombinant LTBP-4 was added thereto, not only elastin but also DANCE's fibers. The experimental results show that the deposits also increased) strongly suggest that LTBP-4 is essential for DANCE to deposit on the microfibrils that make up the elastic fibers. That is, as a molecular mechanism of elastic fiber regeneration by LTBP-4, first, LTBP-4 is deposited on microfibrils, DANCE is induced using LTBP-4 as a mark, and DANCE is bound on LTBP-4. Furthermore, a model in which elastin is bound to DANCE can be considered. The direct binding of DANCE and elastin described above and the direct binding of DANCE and LTBP-4 shown here strongly support this model.

このモデルに従えば、ＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥのいずれか一方が不足する領域では、弾性線維の形成が制限される。実際のところ、ヒト皮膚線維芽細胞の無血清培養では、組換えＬＴＢＰ−４の単独添加、または組換えＤＡＮＣＥの単独添加では弾性線維再生作用は僅かしか見られなかったのに対し、これらを両方添加すると、相乗的に多くの弾性線維が形成された。弾性線維再生への応用においては、投与部位によってはＬＴＢＰ−４とＤＡＮＣＥの両方が不足していることもあり得るため、組換えＬＴＢＰ−４単独よりも、組換えＬＴＢＰ−４と組換えＤＡＮＣＥのカクテルの方が治療的効果を期待できることが示唆される。   According to this model, the formation of elastic fibers is limited in the region where either LTBP-4 or DANCE is insufficient. In fact, in serum-free cultures of human skin fibroblasts, the addition of recombinant LTBP-4 alone or the addition of recombinant DANCE alone showed little elastic fiber regeneration, whereas both When added, many elastic fibers were formed synergistically. In application to elastic fiber regeneration, both LTBP-4 and DANCE may be deficient depending on the administration site. Therefore, recombinant LTBP-4 and recombinant DANCE are more effective than recombinant LTBP-4 alone. It is suggested that the cocktail can be expected to have a therapeutic effect.

Claims (8)

ＬＴＢＰ−４を含有することを特徴とする弾性線維再生剤。   An elastic fiber regenerative agent containing LTBP-4. ＤＡＮＣＥを更に含有するものである請求項１に記載の弾性線維再生剤。   The elastic fiber regeneration agent according to claim 1, further comprising DANCE. ＬＴＢＰ−４発現増強因子及び／又はＤＡＮＣＥ発現増強因子を更に含有するものである請求項１または２に記載の弾性線維再生剤。   The elastic fiber regeneration agent according to claim 1 or 2, further comprising an LTBP-4 expression enhancing factor and / or a DANCE expression enhancing factor. 請求項１〜３のいずれかに記載の弾性線維再生剤を有効成分として含有する医薬。   The pharmaceutical which contains the elastic fiber regeneration agent in any one of Claims 1-3 as an active ingredient. 請求項１〜３のいずれかに記載の弾性線維再生剤を、線維再生能を有する細胞に接触させることを特徴とする弾性線維の再生方法。   A method for regenerating an elastic fiber, comprising contacting the elastic fiber regenerating agent according to any one of claims 1 to 3 with a cell having a fiber regenerating ability. ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いることを特徴とするＬＴＢＰ−４発現増強因子のスクリーニング方法。   A screening method for an LTBP-4 expression enhancing factor, wherein the expression level of mRNA encoding LTBP-4 or LTBP-4 is used as an index. ＬＴＢＰ−４又はＬＴＢＰ−４をコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いることを特徴とする弾性線維再生剤のスクリーニング方法。   A screening method for an elastic fiber regenerative agent, wherein the expression level of LTBP-4 or mRNA encoding LTBP-4 is used as an index. 更に、ＤＡＮＣＥ又はＤＡＮＣＥをコードするｍＲＮＡの発現量を指標として用いる請求項７に記載の弾性線維再生剤のスクリーニング方法。   Furthermore, the screening method of the elastic fiber regeneration agent of Claim 7 using the expression level of mRNA which codes DANCE or DANCE as a parameter | index.
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