CZ20011369A3

CZ20011369A3 - Use of B 19 parvovirus empty, non-infectious, recombinant capsid particles in the inhibition of cell proliferation and migration, patient treatment methods and inhibition of fibrotic build up, kit, medicinal drug and use of the B 19 parvovirus capsids

Info

Publication number: CZ20011369A3
Application number: CZ20011369A
Authority: CZ
Inventors: Kristina Broliden; Magnus Westgren
Original assignee: Kristina Broliden; Magnus Westgren
Priority date: 1998-11-24
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2001-10-17
Also published as: WO2000030668A9; HUP0104298A2; IS5931A; KR20010080518A; AU2566600A; NO20012534D0; WO2000030668A3; SE9804022D0; WO2000030668A8; WO2000030668A2; EP1131085A2; CA2352043A1; SE9804022L; CN1328469A; SE520177C2; PL348640A1; JP2003516927A; MXPA01004949A; NO20012534L

Abstract

The invention described herein relates to the discovery of methods and compositions for the inhibition of growth and/or migration of cells that have the P antigen, including but not limited to, cells of hematopoietic origin and endothelial cells. More specifically, parvovirus capsid particles or fragments of parvovirus capsid proteins are used to manufacture medicaments that can be administered to a subject to inhibit hematopoietic progenitor cell growth (e.g., prior to stem cell transplantation), endothelial cell growth, (e.g., as an anti-tumorigenesis treatment or to prevent restenosis or fibrotic build up following prosthetic implantation), or to prevent disorders that involve the abnormal proliferation of cells that have the P antigen (e.g., polycytemia vera).

Description

(57) Anotace:(57)

Prostředky pro potlačení růstu a/nebo migraci buněk, které mají P antigen, zahrnující také buňky krvetvorného původu a endotelové buňky. Částice parvovirových kapsid nebo fragmenty parvovirových kapsidových proteinů jsou použity pro výrobu léků pro potlačení růstu krvetvorných mateřských buněk (např. před transplantací kmenových buněk), růstu endotelových buněk (např. jako protinádorová léčba nebo k předcházení restenózy nebo fibrotického zbytnění, následovaného protetickou metastázou) nebo k prevenci poruch, které zahrnují abnormální proliferaci buněk, které mají P antigen (např. pravé polycytemie).Means for inhibiting the growth and / or migration of cells having a P antigen, including cells of hematopoietic origin and endothelial cells. Parvovirus capsid particles or fragments of parvovirus capsid proteins are used for the manufacture of medicaments for suppressing the growth of hematopoietic maternal cells (eg, prior to stem cell transplantation), endothelial cell growth (eg, as anti-cancer treatment or to prevent restenosis or fibrotic enlargement followed by prosthetic metastasis). to prevent disorders that involve abnormal proliferation of cells having a P antigen (eg, true polycythemia).

(13) Druh dokumentu: A3 (51)Int. Cl.⁷;(13) Type of document: A3 (51) Int. Cl. ⁷ ;

A61K 39/23A61K 39/23

A 61 P 7/00A61P 7/00

A 61 P 9/14A 61 P 9/14

A61P 35/00A61P 35/00

A61P 41/00 • · 9 · 9 9 9 9 99 9 • · 9 9 9 999 9 99A61P 41/00 • 9 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 99

J ···· ·· ·· ·· a· aaa 'TYJ ···· ·· ·· ·· and · aaa 'TY

Použití prázdných, neinfekčních, rekombinantních kapsid parvoviru B 19, způsob potlačení růstu nebo migrace buňky, způsoby léčby pacienta a potlačení tkáňového vrůstání, kit, lékařský prostředek a použití kapsid parvoviru B 19.Use of empty, non-infectious, recombinant parvovirus B19 capsids, method of inhibiting cell growth or migration, methods of treating a patient and suppressing tissue ingrowth, kit, medical device and use of parvovirus B19 capsids.

OBLAST TECHNIKYTECHNICAL FIELD

Předkládaný vynález se vztahuje k objevu způsobů a prostředků pro potlačení růstu a migrace buněk. Přesněji kapsidy parvoviru B 19 nebo fragmenty proteinů kapsid parvoviru B 19 jsou použity pro výrobu léků, které mohou být podány pacientovi pro potlačení růstu a/nebo migrace buněk, které mají P antigen, zahrnující, ale nejsou na ně omezeny, buňky krvetvorného původu a endotelové buňky.The present invention relates to the discovery of methods and compositions for inhibiting cell growth and migration. More specifically, parvovirus B 19 capsids or parvovirus B 19 capsid protein fragments are used for the manufacture of medicaments that can be administered to a patient to suppress the growth and / or migration of cells having a P antigen, including but not limited to hematopoietic and endothelial cells cells.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKYBACKGROUND OF THE INVENTION

Parvovirus B 19 je lidský patogen, který může být spojen s různými klinickými stavy, od mírných symptomů (infekční erytém) do vážnějších nemocí u lidí, kteří mají poškozenou imunitu nebo trpí hemolytickou anémií. Vodnatelnost plodu a nitroděložní smrt plodu jsou velmi dobře známé komplikace infekce B 19 v průběhu těhotenství. (Anderson and Young, Monographs in Virology, 20 (1997)). Částice parvoviru B 19 mají ikosohedrální symetrii, průměr od 18 do 26 nm, a jsou složeny ze 60 kapsidových proteinů, přibližně 95 % z nich jsou majoritní kapsidové proteiny (VP 2), které mají molekulární hmotnost 58 kd. (Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott Raven Publishers, Philadelphia, Pa, p. 2202 (1996)). Přibližně 3 až 5 % kapsidových proteinů, které tvoří kapsidu parvovira B 19, se nazývá minoritní kapsidové proteiny (VP 1), které mají molekulární hmotnost 83 kd a liší se od VP 2 dodatečnými 227 aminokyselinami na amino konci. (Id ).Parvovirus B19 is a human pathogen that can be associated with a variety of clinical conditions, from mild symptoms (infectious erythema) to more serious diseases in people who have immunodeficiency or suffer from hemolytic anemia. Fetal availability and intrauterine fetal death are well known complications of B19 infection during pregnancy. (Anderson and Young, Monographs in Virology, 20 (1997)). The parvovirus B19 particles have icosohedral symmetry, diameter from 18 to 26 nm, and are composed of 60 capsid proteins, approximately 95% of which are major capsid proteins (VP 2) having a molecular weight of 58 kd. (Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott Raven Publishers, Philadelphia, Pa., P. 2202 (1996)). Approximately 3 to 5% of the capsid proteins that make up the parvovira B19 capsid are called minor capsid proteins (VP 1) having a molecular weight of 83 kd and differing from VP 2 by the additional 227 amino acids at the amino terminus. (Id).

Parvovirus B 19 mimořádně tíhne k lidským erythroidním buňkám a kulturám kostního morku. Parvovirus B 19 se váže například na lidské erythroidní mateřské buňky a potlačuje vytvoření kolonií krvetvorných buněk replikací v těchto buňkách. (Brown et al., Science, 262 : 114 (1993) and Mortimer et al., Nátuře, 302 : 426 (1983)). Potlačení krvetvorných buněk byla také pozorována ve vzorcích kostního morku z infikovaných jedinců, způsobujíce dočasnou anémii a, ve vzácných případech, dočasnou pancytopenii. (Saunders et al., Br J Haematol, 63 : 407 (1986)). Dále parvovirus B 19 je znám v případě potlačení kostního morku při přirozených a experimentálních lidských infekcí. (Anderson and Young, Monographs in Virology, 20 (1997)).Parvovirus B 19 is particularly prone to human erythroid cells and bone marrow cultures. For example, Parvovirus B19 binds to human erythroid maternal cells and suppresses colony formation of hematopoietic stem cells by replication in these cells. (Brown et al., Science, 262: 114 (1993) and Mortimer et al., Nature, 302: 426 (1983)). Suppression of hematopoietic stem cells was also observed in bone marrow samples from infected individuals, causing temporary anemia and, in rare cases, temporary pancytopenia. (Saunders et al., Br J Haematol 63: 407 (1986)). Furthermore, parvovirus B19 is known to suppress bone marrow in natural and experimental human infections. (Anderson and Young, Monographs in Virology, 20 (1997)).

Buněčný receptor pro parvovirus B 19 byl určen jako kulovitý nebo erytrocytní P antigen, tetrahexoceramid. Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott Raven Publishers, Philadelphia, Pa, p. 2204 (1996). P antigen byl nalezen ve zralých erythrocytech, mateřských erythroidech, megakaryocytech, endotheliu, v kůře ledvin, v placentě, v myokardu plodu (von dem Borne et al., Br J Hematol, 63 : 35 (1986)) a pronormobastu z jater plodu. (Morey and Fleming, Br J Haematol, 82 . 302 (1992)). Jedinci, kteří geneticky postrádají P antigen, nejsou citliví k infekci parvoviru B 19 a podávání buď přebytku P antigenu nebo monoklonálních protilátek přímo proti P antigenu může chránit mateřské erythroidy před infekcí parvovirem B 19. (Id.).The cellular receptor for parvovirus B19 was determined to be a spherical or erythrocyte P antigen, tetrahexoceramide. Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott Raven Publishers, Philadelphia, Pa., P. 2204 (1996). P antigen was found in mature erythrocytes, maternal erythroids, megakaryocytes, endothelium, kidney cortex, placenta, fetal myocardium (von dem Borne et al., Br J Hematol, 63: 35 (1986)) and fetal liver pronormobast. (Morey and Fleming, Br J Haematol, 82, 302 (1992)). Individuals genetically lacking P antigen are not susceptible to parvovirus B19 infection, and administration of either excess P antigen or monoclonal antibodies directly against P antigen may protect maternal erythroids from parvovirus B19 infection (Id.).

Dále byly připraveny neutralizační protilátky, které rozpoznávají několik oblastí částic parvoviru B 19, nebo příklad monoklonální protilátky proti epitopům VP 2, jak byly nalezeny v aminokyselinách 38 až 87, 253 až 272, 309 až 330, 328 až 344, 359 až 382, 449 až 468 a 491 až 515, a jedinečné oblasti VP 1, mohou neutralizovat parvovirus B 19. (Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott - Raven Publishers, Philadelphia, Pa, p. 2207 (1996)).In addition, neutralizing antibodies that recognize several regions of parvovirus B19 particles, or an example of a monoclonal antibody against VP 2 epitopes as found in amino acids 38-87, 253-272, 309-330, 328-343, 359-382, 449 were prepared. to 468 and 491 to 515, and unique regions of VP 1, can neutralize parvovirus B19. (Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., p. 2207 (1996)).

Také byl vyvinut geneticky připravený expresní systém pro produkci protilátek proti parvoviru B 19. (Kajigaya et al., Proč Nati Acad Sci USA, 86 : 7601 (1989); Kajigaya et al., Proč Nati Acad Sci USA, 88 : 4646 (1991); Brown et al., J Virol, 65 : 2702 (1991)). Jako přirozené částice jsou rekombinantní kapsidy parvoviru B 19, produkované v bakulovirovém systému, složeny z obou VP 1 a VP 2 a tyto kapsidové proteiny se sami sestaví do podoby částic podobných viru (VLPs). (Kajigaya et al., Proč Nati Acad Sci USA, 88 : 4646 (1991)). Analýza kapsid parvovira B 19 elektronovým mikroskopem ukázala, že VLPs jsou strukturálně podobné virionům, pocházejících z plasmy. (Kajigaya et al., Proč Nati Acad Sci USA, 88 . 4646 (1991)). B 19 VLPs jsou běžně hodnoceny jako možná očkovací látka proti infekci parvoviru B 19 a předběžné výsledky ukázaly dobrou neutralizující odpověď bez velkých vedlejších účinků. (Bostic et al., J. Infect. Dis., 179 : 619 (1999). Oproti mnoha pokusům prevence infekce parvoviru B 19 podáváním kapsid B 19, nebylo hledáno využití vlastností kapsidy parvoviru B 19, kapsidových proteinů B 19 nebo jejich fragmentů k vyvinutí nových léků, které potlačují buněčnou proliferaci nebo migraci.A genetically engineered expression system for the production of antibodies to parvovirus B 19 has also been developed (Kajigaya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 7601 (1989); Kajigaya et al. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 4646 (1991) Brown et al., J Virol, 65: 2702 (1991)). As natural particles, the recombinant parvovirus B19 capsids produced in the baculovirus system are composed of both VP1 and VP2, and these capsid proteins assemble themselves into virus-like particles (VLPs). (Kajigaya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 4646 (1991)). Electron microscope analysis of parvovira B19 capsids showed that VLPs are structurally similar to plasma-derived virions. (Kajigaya et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88, 4646 (1991)). B19 VLPs are routinely evaluated as a possible vaccine against parvovirus B19 infection, and preliminary results showed a good neutralizing response without major side effects. (Bostic et al., J. Infect. Dis., 179: 619 (1999).) Contrary to many attempts to prevent parvovirus B 19 infection by administering capsid B 19, the use of parvovirus B 19 capsid, B 19 capsid proteins or fragments thereof has not been sought. developing new drugs that suppress cell proliferation or migration.

PODSTATA VYNÁLEZUSUMMARY OF THE INVENTION

Ve vynálezu zde popsaném vynálezci zveřejňují objev, že kapsida parvoviru B 19, kapsidové proteiny parvoviru B 19, nebo jejich části potlačují růst a/nebo migraci buněk, které mají P antigen. Části vynálezu zahrnují léky, obsahující kapsidu parvoviru B 19, kapsidové proteiny parvoviru B 19, nebo jejich fragmenty, které mohou být podávány pacientům s potřebou činidel, které potlačuji buněčný růst a/nebo migraci. Způsoby léčby nemocí nebo stavů, spojených s proliferací nebo migrací krvetvorných nebo endotelových buněk, jsou také v rámci aspektů vynálezu.In the invention disclosed herein, the inventors disclose that parvovirus B19 capsid, parvovirus B19 capsid proteins, or portions thereof, suppress the growth and / or migration of cells having a P antigen. Parts of the invention include medicaments comprising parvovirus B19 capsid, parvovirus B19 capsid proteins, or fragments thereof, which can be administered to patients in need of agents that inhibit cell growth and / or migration. Methods of treating diseases or conditions associated with the proliferation or migration of hematopoietic or endothelial cells are also within aspects of the invention.

Jedna část například zahrnuje použití prázdných, neinfekčních kapsid rekombinantního parvoviru B 19, kapsidových proteinů B 19 nebo fragmenty kapsidových proteinů B 19 pro přípravu léku pro potlačení růstu nebo migrace buněk, které mají P antigen. Lék podle tohoto použití může být pro potlačení růstu krvetvorných buněk, růstu endotelových buněk nebo migrace endotelových buněk. Dále lék podle tohoto použití může být pro léčbu hematologických proliferačních poruch, angiogeneze, vzniku a vývoje nádorů nebo vrůstání endotelových buněk do implantovaného protetického prostředku. Dále lék podle tohoto použití může být pro léčbu pacienta před transplantací kmenových buněk a pacient může být plod.For example, one part involves the use of empty, non-infectious recombinant parvovirus B19 capsids, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments for the preparation of a medicament for suppressing the growth or migration of cells having a P antigen. The medicament of this use may be for inhibiting hematopoietic cell growth, endothelial cell growth, or endothelial cell migration. Further, the medicament of this use may be for the treatment of hematological proliferative disorders, angiogenesis, tumor formation and development, or ingrowth of endothelial cells into an implanted prosthetic device. Further, the medicament of this use may be for treating a patient prior to stem cell transplantation and the patient may be a fetus.

Jiná část zajišťuje způsob potlačení růstu nebo migrace buňky, která má P antigen. Tento způsob obsahuje kroky kontaktu buněk s kapsidovým činidlem, vybraným ze skupiny, sestávající se z kapsidy parvovira B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidových proteinů B 19 a měření potlačení buněčného růstu nebo buněčné migrace. V některých aspektech buňka může být buňkou krvetvorného původu nebo endotelovou buňkou.Another section provides a method of suppressing the growth or migration of a cell having a P antigen. The method comprises the steps of contacting cells with a capsid agent selected from the group consisting of parvovira B19 capsid, B19 capsid protein, and a B19 capsid protein fragment and measuring suppression of cell growth or cell migration. In some aspects, the cell may be a hematopoietic origin cell or an endothelial cell.

Způsob ošetření pacienta před transplantací kmenových buněk je také obsažen ve vynálezu. Tento způsob je proveden určením pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje růst krvetvorné buňky, a zajištěním uvedeného pacienta účinným množstvím kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, sestávající se z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidového proteinu B 19. Podobně se vztahující část týká způsobu ošetření pacienta s poruchou proliferace krvetvorných buněk, obsahující kroky identifikace pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje poruchu proliferace krvetvorných buněk, a zajištění uvedeného pacienta účinným množstvím kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, sestávající se • · ♦ ♦ · · · ··· ♦ · · · · ♦«· · · z kapsidy parvovira B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidového proteinu B 19.A method of treating a patient prior to stem cell transplantation is also included in the invention. The method is performed by identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses hematopoietic cell growth and providing said patient with an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of parvovirus B19 capsid, capsid protein B19 and a capsid protein B19 fragment. relates to a method of treating a patient with a hematopoietic cell proliferative disorder comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses a hematopoietic cell proliferative disorder and providing said patient with an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of The parvovirus B19 capsid, the B19 capsid protein, and the B19 capsid protein fragment.

Také je zajištěn způsob potlačení vrůstání tkáně do implantovaného orgánu. Tento přístup obsahuje kroky identifikace pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje vrůstání tkáně do implantovaného orgánu, a zajištění uvedeného pacienta účinným množstvím kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, sestávající se z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidového proteinu B 19. Jiná část zahrnuje způsob ošetření nebo prevence vzniku a vývoje nádoru a způsob obsahuje kroky identifikace pacienta, který potřebuje kapsidové činidlo, které potlačuje růst krvetvorných buněk, a zajištění uvedeného pacienta účinným množstvím kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, sestávající se z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidového proteinu B 19.Also provided is a method of suppressing tissue ingrowth into an implanted organ. The approach comprises the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses tissue ingrowth into an implanted organ, and providing said patient with an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of parvovirus B19 capsid, B19 capsid protein and B19 capsid protein fragment. Another section comprises a method of treating or preventing the formation and development of a tumor and the method comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses the growth of hematopoietic cells and providing said patient with an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of parvovirus B19 capsid. , a B19 capsid protein, and a B19 capsid protein fragment.

Kit, mající kapsidové činidlo, je také část vynálezu a jeden takový kit obsahuje kapsidové činidlo, vybrané ze skupiny, sestávající se z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu B 19 a fragmentu kapsidového proteinu B 19 a instrukce pro dávkování a podávání pacientovi pro potlačení růstu mateřských krvetvorných buněk, potlačení růstu endotelových buněk nebo léčbu hematologické proliferace.A kit having a capsid agent is also part of the invention and one such kit comprises a capsid agent selected from the group consisting of a parvovirus B19 capsid, a B19 capsid protein and a B19 capsid protein fragment, and instructions for dosing and administering to a patient to inhibit growth maternal hematopoietic cells, suppressing endothelial cell growth, or treating hematological proliferation.

Ve zde popsaném vynálezu vynálezci zveřejňují objev, že kapsida parvoviru B 19, kapsidové proteiny parvoviru B 19, nebo jejich fragmenty potlačují růst a/nebo migraci buněk, které mají P antigen. Použitím testů tvorby kolonií vynálezci ukázali, že kapsidy parvovira B 19, složené z VP 1 a VP 2 nebo právě pouze z VP 2, mohou potlačovat růst několika různých typů buněk krvetvorného původu, zahrnujících lidské buňky z jater plodu, lidské buňky z krve z pupeční šňůry a buňky z kostního morku dospělých. Vynálezci dále objevili, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst buněk kostního morku z paviánů a makaků. Dále prostřednictvím neutralizačního testu s použitím monoklonálních protilátek proti P antigenu, s monoklonálními protilátkami potlačujícími infekci parvoviru B 19, a B 19 IgG pozitivního séra, získaného od dvou asymptomatických jedinců, vynálezci ukázali, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorné buňky prostřednictvím interakce, zahrnující P antigen. Dále vynálezci objevili, že kapsidy parvoviru B 19 byly pohlceny do buněk, které měli P antigen, po inkubaci s buňkami, které měli P antigen, imunoznačením kapsid parvoviru B 19.In the invention described herein, the inventors disclose that the parvovirus B19 capsid, the parvovirus B19 capsid proteins, or fragments thereof, suppress the growth and / or migration of cells having a P antigen. Using colony formation tests, the inventors have shown that parvovirus B19 capsids, composed of VP1 and VP2 or VP2 only, can suppress the growth of several different types of hematopoietic cells, including human fetal liver cells, human umbilical cord blood cells. cords and cells from adult bone marrow. The inventors have further discovered that parvovirus B19 capsids suppress the growth of bone marrow cells from baboons and macaques. Furthermore, through a neutralization assay using monoclonal antibodies against P antigen, monoclonal antibodies suppressing infection with parvovirus B 19, and B 19 IgG positive serum obtained from two asymptomatic individuals, the inventors have shown that parvovirus B 19 capsids suppress hematopoietic cell growth through an interaction involving P antigen. Further, the inventors discovered that parvovirus B19 capsids were absorbed into cells that had P antigen after incubation with cells that had P antigen by immunostaining parvovirus B19 capsids.

Vynálezci také objevili, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují proliferaci a migraci endotelových buněk. Měření proliferace endotelových buněk bylo provedeno kontaktem lidských endotelových buněk z pupeční žíly (HUVEC) s fibroplastovým růstovým • · · · · · « · · · ·· · · · · · · · · faktorem v přítomnosti kapsid parvoviru B 19. Buněčná proliferace byla sledována barvením krystalovou violetí a výsledky ukázaly, že kapsidy parvoviru B 19 účinně snižují proliferaci endotelových buněk. Použitím Boydenova komorového měření („Boyden chamber assay“) vynálezci dále předvedli, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují migraci buněk HUVEC.The inventors have also discovered that parvovirus B19 capsids inhibit endothelial cell proliferation and migration. Measurement of endothelial cell proliferation was performed by contacting human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with fibroplastic growth factor in the presence of parvovirus B 19 capsids. Cell proliferation was followed by crystal violet staining and the results showed that parvovirus B19 capsids efficiently reduce endothelial cell proliferation. Using Boyden chamber assay, the inventors have further demonstrated that parvovirus B19 capsids suppress the migration of HUVEC cells.

Několik částí vynálezu zahrnuje přípravu modifikovaných kapsid parvoviru B 19. Vynálezci zveřejnili mnoho přístupů k přípravě kapsid parvoviru B 19, které mají méně než 5 % VP 1 a kapsid parvoviru B 19, které mají pouze VP 2. Dále vynálezci uvádějí přípravu fragmentů B 19 kapsidových proteinů a peptidomimetických látek, podobajících se těmto peptidům, které mohou být použity pro potlačení růstu a/nebo migraci buněk, které mají P antigen. Fragmenty peptidů podle vynálezu mohou být dlouhé alespoň 3 aminokyseliny až do 780 aminokyselin a mohou obsahovat konzervativní aminokyselinové substituce. Dále kapsidy parvoviru B 19, proteiny kapsidy B 19 nebo fragmenty B 19 kapsidových proteinů mohou být změněny zahrnutím substituentů, které nejsou přirozeně nalézány vB 19 kapsidových proteinech, zahrnutím mutací nebo prostřednictvím vytvoření fúzních proteinů. Změněné nebo syntetické B 19 kapsidové proteiny jsou také uvedeny. Dále vynálezci uvádějí přístupy k navržení a přípravě kapsid parvoviru B 19, B 19 kapsidových proteinů nebo fragmentů B 19 kapsidových proteinů, které indukují minimální imunitní odpověď u pacienta tak, že to umožňuje dlouhodobé léčebné postupy. Dále vynálezci popisují přípravu profilů léků na základě různých kapsid B 19, které zahrnují informace jako jsou sekvence, místa mutací nebo modifikací, předvedení znalostí ve funkčních testech, a terapeutickou informaci, zahrnující indikace nemocí, klinické měření a podobně.Several aspects of the invention involve the preparation of modified parvovirus B 19 capsids. The inventors have disclosed many approaches to preparing parvovirus B 19 capsids having less than 5% VP 1 and parvovirus B 19 capsids having VP 2 only. proteins and peptidomimetic substances similar to these peptides, which can be used to inhibit the growth and / or migration of cells having a P antigen. The peptide fragments of the invention may be at least 3 amino acids in length up to 780 amino acids and may contain conservative amino acid substitutions. Further, parvovirus B19 capsids, capsid B19 proteins, or fragments of B19 capsid proteins can be altered by including substituents not naturally found in the B19 capsid proteins, by including mutations, or by creating fusion proteins. Altered or synthetic B19 capsid proteins are also disclosed. Further, the present inventors disclose approaches to designing and preparing parvovirus B19 capsules, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments that induce a minimal immune response in a patient such that long-term therapies allow. Further, the inventors disclose the preparation of drug profiles based on various capsid B19, which include information such as sequences, mutation or modification sites, demonstration of knowledge in functional assays, and therapeutic information, including disease indications, clinical measurements, and the like.

Jiné části vynálezu zahrnují multimerní prostředky z kapsid parvoviru B 19, B 19 kapsidových proteinů nebo fragmentů B 19 kapsidových proteinů. Tyto multimerní činidla byla vytvořena spojením parvovirových kapsid, B 19 kapsidových proteinů nebo fragmentů B 19 kapsidových proteinů s nosičem, což může být korálek, pryskyřice, plastiková miska a přednostně lékařský prostředek, jako je stent, chlopeň nebo jiný protetický prostředek. Tyto multimerní prostředky mohou výhodně zajistit silné činidlo, které potlačuje proliferaci a/nebo migraci buněk, které mají P antigen (např. restenóza následující metastázy). Vynálezci také uvádějí přípravu mnoha různých léků a lékařských prostředků, které obsahují kapsidy parvoviru B 19, B 19 kapsidových proteinů nebo fragmentů B 19 kapsidových proteinů. Tyto léky mohou být vytvořeny ···· ·♦·· ·· · • · · ♦ · · ·· ··· ♦ ·· ····· · · · • · ··· ·· « ·· · · • ·· · · · ··· · • ··· · · · · ·« · · ··· s dalšími přísadami, nosiči nebo masťovými základy tak, že dovolují podávání mnoha způsoby.Other aspects of the invention include multimeric compositions of parvovirus B19 capsids, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments. These multimeric agents have been formed by combining parvovirus capsids, B19 capsid proteins or B19 capsid protein fragments with a carrier, which can be a bead, resin, plastic tray, and preferably a medical device such as a stent, valve or other prosthetic device. These multimeric compositions may advantageously provide a potent agent that suppresses the proliferation and / or migration of cells having a P antigen (eg restenosis following metastasis). The present inventors also disclose the preparation of many different drugs and medical compositions comprising parvovirus B19 capsids, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments. These medications can be created by the medicines. With other ingredients, carriers or ointment bases so as to allow administration in a variety of ways.

Léčebné a profylaktické způsoby jsou také podstatou vynálezu. V několika částech vynálezci uvádějí cesty k potlačení proliferace a/nebo migrace buněk, které mají P antigen, zahrnující nejenom buňky krvetvorného původu a endotelové buňky, podáváním léku, obsahujícím kapsidy parvoviru B 19, B 19 kapsidové proteiny nebo fragmentů B 19 kapsidových proteinů. V jednom aspektu je zajištěn způsob potlačení krvetvorby u pacienta před transplantací kmenových buněk v děloze. Ve vztahujícím se způsobu vynálezci uvádějí přístup k potlačení krvetvorby u pacienta před transplantací kmenových buněk po narození (např. nový přístup k nemyeloblativní terapii). Jiné způsoby podle vynálezu zahrnují přístup k potlačení buněčné proliferace u pacienta trpícího nemocí hematologické proliferace, jako je pravá polycytemie. Dále jsou části, které zahrnují způsoby prevence angiogeneze, vzniku a vývoje nádorů nebo rakoviny, a způsoby přípravy lékařských prostředků, jako je stent nebo chlopně, které zabraňují fibrotickému zbytnění nebo restenóze nebo jinému zpoždění růstu endotelových buněk. Kity, obsahující kapsidy parvoviru B 19, B 19 kapsidové proteiny nebo fragmenty B 19 kapsidových proteinů, jsou také podstatou vynálezu. V následující části vynálezci popisují pokusy, které poskytly důkaz, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorných buněk.Therapeutic and prophylactic methods are also the subject of the invention. In several sections, the inventors disclose ways to suppress the proliferation and / or migration of cells having a P antigen, including not only hematopoietic cells and endothelial cells, by administering a medicament comprising parvovirus B19 capsids, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments. In one aspect, a method of suppressing hematopoiesis in a patient prior to stem cell transplantation in the uterus is provided. In a related method, the inventors disclose an approach to suppress hematopoiesis in a patient prior to stem cell transplantation after birth (eg, a novel approach to non-myeloblative therapy). Other methods of the invention include an approach to suppress cell proliferation in a patient suffering from a hematologic proliferative disease, such as true polycythemia. Further, there are parts that include methods of preventing angiogenesis, the formation and development of tumors or cancer, and methods of preparing medical devices, such as stents or valves, that prevent fibrotic overgrowth or restenosis or other delay in endothelial cell growth. Kits containing parvovirus B19 capsids, B19 capsid proteins, or B19 capsid protein fragments are also within the scope of the invention. In the following, the inventors describe experiments that have provided evidence that parvovirus B19 capsids suppress the growth of hematopoietic cells.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH obrázek 1 Tento obrázek ukazuje grafické znázornění výsledků testů tvorby kolonií, provedené na buňkách z dřeňové krve, které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (VP 1 / 2).BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 This figure shows a graphical representation of the results of colony formation assays performed on marrow blood cells that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsid (VP 1/2).

obrázek 2 Tento obrázek ukazuje grafické znázornění výsledků testů tvorby kolonií, provedené na buňkách z opičího (paviáního a makačího) kostního morku, které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (VP 1 / 2).Figure 2 This figure shows a graphical representation of the results of colony formation assays performed on monkey (baboon and cynomolgus) bone marrow cells that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsid (VP 1/2).

obrázek 3 Tento obrázek ukazuje grafické znázornění výsledků testů tvorby kolonií, provedené na buňkách z jater plodu, které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (BacVP 1 / 2), kapsid parvoviru B 19, mající pouze VP 2 (pouzeFigure 3 This figure shows a graphical representation of the results of colony formation tests performed on fetal liver cells that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsid (BacVP 1/2), parvovirus B19 capsid having VP2 only (only

BacVP 2), nebo kontrolního antigenu (Bac kontrolní antigen).BacVP 2), or a control antigen (Bac control antigen).

obrázek 4 Tento obrázek ukazuje sloupcový graf, který znázorňuje výsledky testů buněčné proliferace, provedené na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly • · * · ··· · ·· · • · · · ·*♦· · ·· • · · · · · · ··· ·· ·········· / ♦··· ·· ·· ·· ·· ··· (HUVEC), které byly kontaktovány různými koncentracemi kontrolního antigenu (KYVTGIN) (SEQ. ID. NO. 1). Na „ose x“ jsou vzrůstající koncentrace kontrolního antigenu (zleva doprava), 0 pg / ml, 0,01 pg / ml, 0,1 pg / ml, 1,0 pg / ml a 10,0 pg / / ml. Na „ose y“ jsou ukázány hodnoty spektrofotometrické absorbance při 540 nm (A540).Figure 4 This figure shows a bar graph depicting the results of cell proliferation assays performed on human umbilical vein endothelial cells. (HUVEC) which were contacted with different concentrations of control antigen (KYVTGIN) (SEQ. 1). On the "x-axis" are increasing concentrations of control antigen (from left to right), 0 pg / ml, 0.01 pg / ml, 0.1 pg / ml, 1.0 pg / ml and 10.0 pg / ml. The "y-axis" shows spectrophotometric absorbance at 540 nm (A540).

obrázek 5 Tento obrázek ukazuje sloupcový graf, který znázorňuje výsledky testů buněčné proliferace, provedené na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly (HUVEC), které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19, složených pouze z VP 1. Na „ose x“ vzrůstá koncentrace kapsid parvoviru B 19 (VP 1) (zleva doprava), 0 pg / ml, 0,01 pg / ml, 0,1 pg / ml, 1,0 pg / ml a 10,0 pg / ml. Na „ose y“ jsou ukázány hodnoty spektrofotometrické absorbance při 540 nm (A540).Figure 5 This figure shows a bar graph depicting the results of cell proliferation assays performed on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsids composed only of VP 1. The concentration increases on the "x-axis" parvovirus B19 capsid (VP 1) (left to right), 0 pg / ml, 0.01 pg / ml, 0.1 pg / ml, 1.0 pg / ml and 10.0 pg / ml. The "y-axis" shows spectrophotometric absorbance at 540 nm (A540).

obrázek 6 Tento obrázek ukazuje sloupcový graf, který znázorňuje výsledky testů buněčné proliferace, provedené na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly (HUVEC), které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (VP 1 / 2). Na „ose x“ vzrůstá koncentrace kapsid parvoviru B 19 (VP 1/2) (zleva doprava), 0 pg / ml, 0,01 pg / ml, 0,1 pg / ml, 1,0 pg / ml a 10,0 pg / ml. Na „ose y“ jsou ukázány hodnoty spektrofotometrické absorbance při 540 nm (A540).Figure 6 This figure shows a bar graph depicting the results of cell proliferation assays performed on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsid (VP 1/2). On the "x-axis" the concentration of parvovirus B 19 capsules (VP 1/2) (left to right) increases, 0 pg / ml, 0.01 pg / ml, 0.1 pg / ml, 1.0 pg / ml and 10, 0 pg / ml. The "y-axis" shows spectrophotometric absorbance at 540 nm (A540).

obrázek 7 Tento obrázek ukazuje sloupcový graf, který znázorňuje výsledky testů buněčné proliferace, provedené na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly (HUVEC), které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (VP 2). Na „ose x“ vzrůstá koncentrace kapsid parvoviru B 19 (VP 1) (zleva doprava), 0 pg / ml, 0,01 pg / ml, 0,1 pg / ml, 1,0 pg / ml a 10,0 pg / ml. Na „ose y“ jsou ukázány hodnoty spektrofotometrické absorbance při 540 nm (A540).Figure 7 This figure shows a bar graph depicting the results of cell proliferation assays performed on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that were contacted with various concentrations of parvovirus B19 capsid (VP 2). On the x-axis, the concentration of parvovirus B 19 capsules (VP 1) (left to right) increases, 0 pg / ml, 0.01 pg / ml, 0.1 pg / ml, 1.0 pg / ml and 10.0 pg / ml. The "y-axis" shows spectrophotometric absorbance at 540 nm (A540).

obrázek 8 Tento obrázek ukazuje sloupcový graf, který znázorňuje výsledky testů buněčné proliferace, provedené na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly (HUVEC), které byly kontaktovány různými koncentracemi kapsid parvoviru B 19 (VP 1 / 2), kapsid parvoviru B 19, majících pouze VP 1 (pouze VP 1), kapsid parvoviru B 19, majících pouze VP 2 (pouze VP 2), nebo kontrolního antigenu (kontrolní antigen).Figure 8 This figure shows a bar graph depicting the results of cell proliferation assays performed on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that were contacted with various concentrations of parvovirus B 19 capsules (VP 1/2), parvovirus B 19 capsids having only VP 1 (VP 1 only), a parvovirus B 19 capsid having VP 2 only (VP 2 only), or a control antigen (control antigen).

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZUEXAMPLES OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION

Příklad 1 : Kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorných buněkExample 1: Parvovirus B19 capsids suppress the growth of hematopoietic stem cells

V první sadě pokusů vynálezci objevili, že rekombinantní kapsidy parvoviru B 19 mohou být použity k potlačení růstu krvetvorných buněk, jak je patrné ze snížení tvorby • · ♦ · • · ♦ · kolonií čerstvých lidských buněk z jater plodu, buněk z krve z pupeční šňůry a buněk kostního morku. Popis těchto pokusů je uveden níže.In a first set of experiments, the inventors discovered that recombinant parvovirus B19 capsids can be used to inhibit the growth of hematopoietic stem cells, as evidenced by reduced colony formation of fresh human fetal liver cells, umbilical cord blood cells. and bone marrow cells. A description of these experiments is given below.

Pro získání kultury z jater plodu byly získány z legálních potratů lidské plody 6 až 12 týdnů staré; pacientky se k darování zárodečné tkáně přihlásily dobrovolně. Stáří plodu bylo odhadnuto podle specifických anatomických znaků a je udáno jako menstruační stáří. Potraty byly provedeny vakuovým odsátím. Játra plodu byla za sterilních podmínek rozřezána, umístěna ve sterilní zkumavce, obsahující RPMI1640, a dezintegrována protlačováním přes vinylové síto do vytvoření suspenze jednotlivých buněk. Jaderné buňky byly pak třikrát promyty, spočítány a převedeny do živného media.To obtain a fetal liver culture, human fetuses 6-12 weeks old were obtained from legal abortions; patients volunteered to donate germ. Fetal age was estimated by specific anatomical features and is reported as menstrual age. Abortions were performed by vacuum suction. The fetal liver was dissected under sterile conditions, placed in a sterile tube containing RPMI1640, and disintegrated by passing through a vinyl screen to form a single cell suspension. Nuclear cells were then washed three times, counted and transferred to nutrient medium.

Komerční kit - „CFU kit na kmenové buňky“ („Stem cell CFU kit“) (GIBCO BRL, Life Technology lne., NY, USA) - byl použit k provedení testů tvorby kolonií. Kit poskytuje polopevný podklad, který napodobuje extracelulární matrici produkovanou dřeňovými buňkami. Jinými složkami, zahrnutými v kitu, jsou : Iscovovo upravené Dulbeccovo medium („Iscove's modifíed Dulbecco s medium“), upravené zárodečné hovězí sérum, metylcelulóza, 2-merkaptoethanol, medium na udržení vhodných podmínek a erythropoietin. Kolonie, které se vytvořily, byly identifikovány jako BFU-E (částice tvořící progenitory červené řady - erythroidní buňky) („burst forming unit - erythroid cells“) s kompaktně vyplněnými hemoglobinovánými buňkami, CFU-GM (částice tvořící kolonie - granulocyty, makrofágy) s uspořádáním z nehemoglobinovanými buňkami a CFU-GEMM (částice tvořící kolonie - granulocyty, erythroidy, makrofágy, megakaryocyty) s hemoglobinovanými buňkami a malými a velkými periferními buňkami.A commercial kit - the "Stem cell CFU kit" (GIBCO BRL, Life Technology Inc, NY, USA) - was used to perform colony formation assays. The kit provides a semisolid support that mimics the extracellular matrix produced by the marrow cells. Other ingredients included in the kit are: Iscove's Modified Dulbecco's Medium ("Iscove's Modified Dulbecco's Medium"), Modified Bovine Serum, Methylcellulose, 2-mercaptoethanol, medium to maintain suitable conditions, and erythropoietin. The colonies that formed were identified as burst forming unit (erythroid cells) with compactly filled hemoglobin cells, CFU-GM (granulocyte-forming macrophage) with an arrangement of non-hemoglobinized cells and CFU-GEMM (colony forming particles - granulocytes, erythroids, macrophages, megakaryocytes) with hemoglobinated cells and small and large peripheral cells.

Části prázdných kapsid rekombinantního parvoviru B 19 (Kajiga et al., Proč Nati Acad Sci USA, 88:4646 (1991)) byl dar od Medlmmune (Gaithersburg, MD, USA) a byly připraveny v expresním systému rekombinantní bakulovirus - hmyzí buňka (Spodofera frugiperdď). (Kajigay et al., Proč Nati Acad Sci USA, 88:4646 (1991)). Kapsidy byly ředěny pufrem (20 mM Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,5) a 30 μΐ každého ředění bylo přidáno k 25x10³ buňkám (50x10³ při postnatálních buňkách) ve 100 μΐ živného media a inkubovány 1 h při 4 °C. Směsy pak byly převedeny do inkubačních misek a živné medium bylo přidáno do konečného objemu 0,5 ml na jamku. Buňky byly inkubovány 11 dní ve vlhké atmosféře s 5 % CO₂ a pak byly hodnoceny jako BFU-E, CFU-E a CFU-GEMM odvozené tvoření kolonií při měření tvorby kolonií.Portions of empty capsids of recombinant parvovirus B19 (Kajiga et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 4646 (1991)) were donated by Medlmmune (Gaithersburg, MD, USA) and were prepared in a recombinant baculovirus-insect cell expression system (Spodofera). frugiperdď). (Kajigay et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 4646 (1991)). Capsids were diluted with buffer (20 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 8.5) and 30 μΐ of each dilution was added to 25x10 ³ cells (50x10 ³ for postnatal cells) in 100 μΐ nutrient medium and incubated for 1 h at 4 ° C. The mixtures were then transferred to incubation dishes and the nutrient medium was added to a final volume of 0.5 ml per well. Cells were incubated for 11 days in a humidified atmosphere with 5% CO ₂ and then evaluated as BFU-E, CFU-E and CFU-GEMM derived colony formation as measured by colony formation.

·· 99 ·· ··9 • · · · · · » · · ·· 9 9 9 ♦ 9 ··· 9 99 • · · 9··· 9 ·999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 9999«9999 99 99 99

Při měření tvorby kolonií 11 dnů vynálezci objevili, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorných buněk, o čemž svědčí snížení tvorby kolonií čerstvých buněk lidského plodu, buněk z krve z pupeční šňůry a buněk z kostního morku dospělých. Tedy, snížení tvorby kolonií BFU-E (částice tvořící progenitory červené řady - erythroidy) („burst forming unit - erythroid“), CFU-GM (částice tvořící kolonie - granulocyty, makrofágy) a CFU-GEMM (částice tvořící kolonie - granulocyty, erythroidy, monocyty, megakaryocyty) buněk bylo pozorováno, když buňky z jater lidského plodu, buňky z krve z pupeční šňůry a buňky z kostního morku dospělých byly inkubovány s kapsidami parvoviru B 19. (viz tabulka 1).When measuring colony formation over 11 days, the inventors discovered that parvovirus B19 capsids suppressed the growth of hematopoietic cells, as evidenced by a decrease in colony formation of fresh human fetal cells, umbilical cord blood cells and adult bone marrow cells. Thus, decreased colony formation of BFU-E (burst forming unit - erythroid), CFU-GM (colony forming particles - granulocytes, macrophages) and CFU-GEMM (colony forming particles - granulocytes), erythroids, monocytes, megakaryocytes) of cells were observed when human fetal liver cells, umbilical cord blood cells and adult bone marrow cells were incubated with parvovirus B19 capsids (see Table 1).

tabulka 1. Test částic tvořících kolonie z buněk z jater plodu*.Table 1. Colony forming test from fetal liver cells *.

počet kolonií number of colonies (% kontrolního (% control) media) media) ředění kapsid parvoviru B 19 (pg / ml) dilution of parvovirus B19 capsids (pg / ml) BFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GM CFU-GEMM CFU-GEMM 70,0 70.0 22 % 22% 14 % 14% 31 % 31% 0,7 0.7 39% 39% 54% 54% 63 % 63% 0,007 0.007 79% 79% 95 % 95% 94 % 94% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 95 95 37 37 16 16 *buňky byly předinkubovány s ředěními * cells were preincubated with dilutions capsid parvoviru B 19 předem do 11-ti denní capsid parvovirus B 19 in advance to 11 days

kultury.culture.

Jak je ukázáno v tabulce 1, potlačení růstu krvetvorných buněk bylo pozorováno jako nízké při 0,007 pg / ml kapsid parvoviru B 19 a značné potlačení růstu krvetvorných buněk bylo pozorováno při 70,0 pg / ml kapsid parvoviru B 19.As shown in Table 1, suppression of hematopoietic cell growth was observed to be low at 0.007 pg / ml parvovirus B19 capsid and significant suppression of hematopoietic cell growth was observed at 70.0 pg / ml parvovirus B 19 capsid.

Kapsidy rekombinantního papillomaviru (papillomavirus králíka Cottontail a lidský papillomavirus typu 6) byly zahrnuty při testech tvorby kolonií jako kontroly. Tyto kapsidy jsou strukturálně podobné kapsidám parvoviru B 19, ale neinteragují s P antigenem. Kapsidy rekombinantního lidského papillomaviru (HPV6) a kapsidy papillomaviru králíka Cottontail (CRPV) byly dar od Dr. J. Dillnera, Karolinský Ústav, Stockholm, Švédsko. Zatímco kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorných buněk, kapsidy papillomaviru (testovány v rozmezí 0,01 až 100 pg / ml) neměly vliv na tvorbu kolonií.Recombinant papillomavirus capsids (rabbit papillomavirus Cottontail and human papillomavirus type 6) were included in the colony formation tests as controls. These capsids are structurally similar to parvovirus B19 capsids but do not interact with the P antigen. Recombinant human papillomavirus capsules (HPV6) and rabbit Cottontail papillomavirus capsules (CRPV) were a gift from Dr. J. Dillner, Caroline Institute, Stockholm, Sweden. While parvovirus B19 capsids suppress the growth of hematopoietic stem cells, papillomavirus capsids (tested in the range of 0.01 to 100 pg / ml) had no effect on colony formation.

V druhé sadě pokusů vynálezci objevili, že tvorba kolonií krvetvorných buněk může být chráněna inkubací parvoviru B 19 s monoklonálními protilátkami proti B 19 nebo s lidskými séry pozitivními na IgG proti parvoviru B 19, která předchází přidání směsi ·· ·« ♦ * ··9 * · · · · · · « «9 9 • ♦ · · ♦ ··· 9 99 • ·· 9 9 9 9 9 99In a second set of experiments, the inventors have discovered that hematopoietic colony formation can be protected by incubating parvovirus B 19 with monoclonal antibodies against B 19 or with human sera positive for IgG against parvovirus B 19, which precedes the addition of the mixture. * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9999 99 99 99 99999 k buňkám. Monoklonální protilátka proti B 19 (MAB8292), která je protilátkou třídy IgG, byla koupena (Cehmicon AB, Malmo, Švédsko) a séra pozitivní na IgG proti parvoviru B 19 (negativní na IgM proti parvoviru B 19) byla získána od dvou asymptomatických jedinců. Při jednom neutralizačním pokusu byly kapsidy parvoviru B 19 inkubovány s monoklonální protilátkou proti B 19 (MAB8292) před přidáním směsi k buňkám z jater plodu. Přibližně 25 μΐ monoklonální protilátky proti parvoviru B 19 (MAB8292) bylo inkubováno s 25 μΐ kapsid parvoviru B 19 2 hodiny při 4 °C. Směs byla pak přidána k buňkám a bylo provedeno měření tvorby kolonií 11 dnů, jak je popsáno výše, na „neutralizované“ směsi kapsidy/buňky.9999 99 99 99 99999 to cells. The anti-B19 monoclonal antibody (MAB8292), which is an IgG class antibody, was purchased (Cehmicon AB, Malmo, Sweden) and sera positive for parvovirus B 19 IgG (IgM against parvovirus B 19) were obtained from two asymptomatic individuals. In one neutralization experiment, parvovirus B19 capsids were incubated with anti-B19 monoclonal antibody (MAB8292) before adding the mixture to fetal liver cells. Approximately 25 μΐ of parvovirus B 19 monoclonal antibody (MAB8292) was incubated with 25 μΐ of parvovirus B 19 capsids for 2 hours at 4 ° C. The mixture was then added to the cells and colony formation was measured for 11 days, as described above, on the "neutralized" capsid / cell mixture.

Ačkoliv byla použita relativně vysoká koncentrace kapsid parvoviru B 19 (7 pg / ml, ke srovnání s hodnotami v tabulce 1), tak nízká koncentrace monoklonální protilátky proti B 19, jako je 0,02 pg / ml, snižuje schopnost kapsid parvoviru B 19 potlačovat růst buněk z jater plodu, a koncentrace 20,0 pg / ml monoklonální protilátky proti B 19 zcela blokuje potlačení na BFU-E tvorby kolonií a drasticky snižuje vliv na CFU-GM a CFU-GEMM tvorbu kolonií (viz tabulka 2).Although a relatively high concentration of parvovirus B19 capsid (7 pg / ml, compared to the values in Table 1) was used, a low concentration of anti-B19 monoclonal antibody, such as 0.02 pg / ml, reduces the ability of parvovirus B19 capsids to suppress fetal liver cell growth, and a concentration of 20.0 µg / ml anti-B19 monoclonal antibody completely blocks suppression of BFU-E colony formation and drastically reduces the effect on CFU-GM and CFU-GEMM colony formation (see Table 2).

tabulka 2 - Neutralizační test s použitím monoklonální protilátky proti parvoviru B 19*.Table 2 - Neutralization assay using monoclonal antibody against parvovirus B19 *.

počet kolonií number of colonies (% kontrolního (% control) media) media) kapsidy parvoviru B 19 (7 pg / ml) + ředění Mab proti parvoviru B 19 (pg / ml) parvovirus B 19 capsids (7 pg / ml) + Mab dilution against parvovirus B 19 (pg / ml) BFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GM CFU-GEMM CFU-GEMM 20,0 20.0 > 100 % > 100% 74% 74% 67 % 67% 2,0 2,0 69% 69% 35 % 35% 45 % 45% 0,2 0.2 52 % 52% 21 % 21% 19% 19% 0,02 0.02 52% 52% 30% 30% 21 % 21% pouze kapsidy only capsids 43 % 43% 30 % 30% 21 % 21% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 114 114 66 66 42 42

Buňky byly předinkubovány s činidly předem na 11 dní starou kulturu.Cells were preincubated with reagents in advance for an 11 day old culture.

Podobně dvě části sér pozitivních na IgG proti parvoviru B 19 byly analyzovány na schopnost neutralizovat kapsidy parvovira B 19. Přibližně 25 μΐ séra pozitivního na IgG proti parvoviru B 19 bylo inkubováno s 25 μΐ kapsid parvoviru B 19 2 hodiny při 4 °C, pak byla směs přidána k jaterním buňkám plodu. Následně byl proveden test tvorby kolonií, popsaný výše, na séru, neutralizovaném směsí kapsidy B 19 / buňky. Jak je «« 9999Similarly, two portions of parvovirus B 19 IgG-positive sera were analyzed for the ability to neutralize parvovirus B 19 capsid. Approximately 25 μΐ of parvovirus B 19 IgG-positive serum was incubated with 25 μv parvovirus B 19 capsid for 2 hours at 4 ° C. mixture added to fetal liver cells. Subsequently, the colony formation assay described above was performed on serum neutralized capsid B19 / cell mixture. How is «« 9999

9 9 9 999

9 999 99 ·· · 9 99 ukázáno v tabulce 3, v nepřítomnosti sér kapsidy parvoviru B 19 (0,14 pg / ml) významně potlačují tvorbu kolonií buněk z jater plodu, zatímco tak nízké ředění jako 1 : 100 séra 1 snižuje schopnost kapsid parvoviru B 19 potlačovat růst jaterních buněk plodu.9,999,999 ·· · 9,999 shown in Table 3, in the absence of sera, parvovirus B19 capsids (0.14 pg / ml) significantly suppress fetal liver cell colony formation, while as low as 1: 100 serum 1 dilution decreases capsid capability parvovirus B19 suppress the growth of fetal liver cells.

tabulka 3 - Neutralizační test s použitím lidských sér pozitivních na IgG proti parvoviru B 19*.Table 3 - Neutralization test using human IgG-positive sera against parvovirus B 19 *.

počet kolonií (% kontrolního media) colony count (% of control media) kapsidy parvoviru B 19 (0,14 pg / ml) + ředění dvou lidských sér pozitivních na IgG proti parvoviru B 19 parvovirus B 19 capsids (0.14 pg / ml) + dilution of two human IgG-positive sera against parvovirus B 19 BFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GM CFU-GEMM CFU-GEMM sérum 1, 1 : 10 serum 1, 1: 10 70% 70% 78 % 78% 90 % 90% sérum 1, 1 : 100 serum 1, 1: 100 25 % 25% 23 % 23% 40 % 40% sérum 2, 1 : 10 serum 2, 1: 10 48 % 48% 57 % 57% 57% 57% sérum 2, 1 : 100 serum 2, 1: 100 17% 17% 27 % 27% 67 % 67% pouze kapsidy only capsids 18 % 18% 17% 17% 63 % 63% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 157 157 81 81 30 30

Další důkaz, že kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst krvetvorných buněk, byl získán provedením neutralizačních testů s použitím monoklonálních protilátek proti P antigenu. Anti-P monoklonální protilátka (CLB-ery-2), myší protilátka třídy IgM, byla dar od Dr. de Jonga a Dr. von dem Bornea (Centrální laboratoř Stanice krevní transfuze nizozemského Červeného kříže, Amsterdam, Nizozemsko), (viz von dem Borne et al., Br J Hematol, 63 : 35 (1986)). V těchto měřeních přibližně 2,5xl0⁴ jaterních buněk plodu bylo suspendováno ve 100 μΐ media a bylo pak inkubováno s buď 25 μΐ anti-P monoklonální protilátky (CLB-ery-2) nebo 25 μΐ anti-Pi (Seraclone), kontrolní monoklonální protilátky. Buňky a monoklonální protilátka byly inkubovány 1 hodinu při 4 °C. Směsi buňky / protilátka byly před přidáním kapsid parvoviru B 19 dvakrát promyty studeným živným mediem a následně testy tvorby kolonií byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve.Further evidence that parvovirus B19 capsids suppress the growth of hematopoietic stem cells was obtained by conducting neutralization assays using monoclonal antibodies against P antigen. The anti-β monoclonal antibody (CLB-ery-2), a murine IgM antibody, was a gift from Dr. de Jonga and Dr. von dem Borneo (Central Laboratory of the Dutch Red Cross Blood Transfusion Station, Amsterdam, The Netherlands), (see von dem Borne et al., Br J Hematol, 63: 35 (1986)). In these measurements, approximately 2.5x10 ⁴ fetal liver cells were suspended in 100 μΐ medium and were then incubated with either 25 μΐ anti-P monoclonal antibody (CLB-ery-2) or 25 μΐ anti-Pi (Seraclone), control monoclonal antibody . Cells and monoclonal antibody were incubated for 1 hour at 4 ° C. The cell / antibody mixtures were washed twice with cold nutrient medium before the addition of parvovirus B19 capsids and subsequently colony formation assays were performed as described previously.

V souladu s důkazem z předcházejících pokusů a studií, provedených s nativními virálními částicemi (viz Brown et al., Science, 262 : 114 (1993)) vynálezci objevili, že monoklonální protilátky proti P antigenu mohou vrátit růst čerstvým jaterním buňkám ·♦ 99 99 99· ···· 9 9 9 9 999 • · · · · ··· · t9 ♦ · 9 9 9 · · 9 9 9 ·* • · 9 9 9 9 9 9 ·* ·♦·· ·· 99 99 99999 plodu, inkubovaným v přítomnosti kapsid parvoviru B 19. Jak je ukázáno v tabulce 4, inhibiční vliv kapsid parvoviru B 19 byl snížen o alespoň 25 %, když buňky byly inkubovány v přítomnosti CLB-ery-2. Naopak anti-P (Seraclone) monoklonální protilátka (Labdesign, Stockholm, Švédsko), která neinteraguje s P antigenem, neměla žádný vliv na tvorbu kolonií ve srovnání s kontrolou kapsid parvoviru B 19.Consistent with evidence from previous experiments and studies conducted with native viral particles (see Brown et al., Science, 262: 114 (1993)), the inventors have discovered that monoclonal antibodies against P antigen can return growth to fresh liver cells · ♦ 99 99 99 9 9 9 999 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99,9999 fetus incubated in the presence of parvovirus B19 capsids. As shown in Table 4, the inhibitory effect of parvovirus B19 capsids was reduced by at least 25% when cells were incubated in the presence of CLB-ery-2. In contrast, the anti-P (Seraclone) monoclonal antibody (Labdesign, Stockholm, Sweden), which does not interact with the P antigen, had no effect on colony formation compared to the control of parvovirus B19 capsids.

tabulka 4 - Neutralizační test s použitím anti - P nebo anti - Pi monoklonálních protilátek*.Table 4 - Neutralization test using anti - P or anti - Pi monoclonal antibodies *.

počet kolonií (% kontrolního media) colony count (% of control media) kapsidy parvoviru B 19 (0,14 μg / ml) + anti-P Mab (titr) parvovirus B19 capsids (0.14 µg / ml) + anti-P Mab (titer) BFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GM CFU-GEMM CFU-GEMM 1 : 5 1: 5 51 % 51% 39 % 39% 93 % 93% 1 : 500 1: 500 23 % 23% 10% 10% 43 % 43% pouze kapsidy only capsids 18 % 18% 17 % 17% 63 % 63% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 157 157 81 81 30 30 kapsidy parvoviru B 19 (0,14 μg / ml) + anti-Pi Mab (pg / ml) parvovirus B19 capsids (0.14 μg / ml) + anti-Pi Mab (pg / ml) 400,0 400.0 25 % 25% 20 % 20% 50% 50% 4,0 4.0 17 % 17% 22 % 22% 47 % 47% pouze kapsidy only capsids 18 % 18% 17 % 17% 63 % 63% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 157 157 81 81 30 30

Inhibiční vliv kapsid parvoviru B 19 na tvorbu kolonií byl také testován s použitím čerstvých kmenových buněk, pocházející z dřeňové krve a ze vzorků kostního morku dospělých. Testy tvorby kolonií v přítomnosti kapsid parvoviru B 19 byly provedeny na buňkách, získaných z krve z pupeční šňůry a kostního morku postupem, popsaným výše. Vzorky krve z pupeční šňůry byly získány ihned po vaginálním porodu od normálních ptáků. Vzorky kostního morku dospělých byly získány od zdravých alogenetických dárců. Suspenze čerstvých buněk byly heparinizovány a zředěny 0,9 % NaCl a odstřeďovány na Lymfoprepu (Nycomed, Parma, Oslo, Norsko) pro gradientovou centrifugaci při 2000 rpm 20 minut. Buňky byly opatrně odebrány ·· ♦ * <·· 9999The inhibitory effect of parvovirus B19 capsids on colony formation was also tested using fresh stem cells derived from marrow blood and adult bone marrow samples. Colony formation assays in the presence of parvovirus B19 capsids were performed on cells obtained from umbilical cord blood and bone marrow blood as described above. Umbilical cord blood samples were obtained immediately after vaginal delivery from normal birds. Adult bone marrow samples were obtained from healthy allogeneic donors. Fresh cell suspensions were heparinized and diluted with 0.9% NaCl and centrifuged on Lymfoprep (Nycomed, Parma, Oslo, Norway) for gradient centrifugation at 2000 rpm for 20 minutes. Cells were carefully harvested ·· ♦ * <·· 9999

9 9 9 9 · 9 9 99 • ♦ * 9 9 9 99 «·9 9 9 9 · 9 9 99 • ♦ * 9 9 9 99

Pastorovou pipetou, promyty třikrát v 0,9 % NaCl, spočítány a při přípravě měření tvorby kolonií ředěny živným mediem.Using a pastor pipette, washed three times in 0.9% NaCl, counted and diluted with nutrient medium to prepare colony formation measurements.

Schopnost kapsid parvoviru B 19 potlačovat krvetvorné buňky, získané z dřeňové krve a kostního morku, byla přirovnatelná k té ukázané s jaterními buňkami plodu (viz tabulka 5). Jak je ukázáno například na obrázku 1, růst buněk, získaných z lidské dřeňové krve, klesá tak, jak vzrůstá koncentrace kapsid parvoviru B 19, Dále neutralizační testy s použitím buněk, získaných z dřeňové krve nebo kostního morku, a kapsid parvoviru B 19 také ukazují výsledky podobné těm, zjištěným s jaterními buňkami lidského plodu. Tedy že kapsidy parvoviru B 19, které byly inkubovány s monoklonální protilátkou proti parvoviru B 19 (Mab8292) před kontaktem s buňkami, získanými z dřeňové krve a kostního morku, vykázaly sníženou schopnost potlačovat růst buněk, jak je patrné ze vzrůstu tvorby kolonií.The ability of parvovirus B19 capsids to suppress hematopoietic stem cells derived from marrow blood and bone marrow was comparable to that shown with fetal liver cells (see Table 5). For example, as shown in Figure 1, the growth of cells derived from human marrow blood decreases as the concentration of parvovirus B 19 capsules increases. Furthermore, neutralization tests using cells derived from marrow blood or bone marrow, and parvovirus B 19 capsids also show results similar to those found with human fetal liver cells. Thus, parvovirus B19 capsids that were incubated with the anti-parvovirus B19 monoclonal antibody (Mab8292) prior to contact with cells derived from marrow blood and bone marrow showed a reduced ability to suppress cell growth as evidenced by the increase in colony formation.

tabulka 5 - Test tvorby kolonií na buňkách z dřeňové krve a kostního morku dospělých.Table 5 - Colony formation assay on marrow blood and bone marrow cells of adults.

počet kolonií (% kontrolního media) colony count (% of control media) kapsidy parvoviru B 19 (μβ / ml) buňkv z dřeňové krve parvovirus B19 capsids (μβ / ml) marrow blood cells BFU-E BFU-E CFU-GM CFU-GM CFU-GEMM CFU-GEMM 7,0 7.0 10% 10% 54 % 54% 43 % 43% 0,7 0.7 33 % 33% 62 % 62 43% 43% 0,07 0.07 49 % 49% 72 % 72% 50 % 50% 0,007 0.007 57 % 57% 67 % 67% 70 % 70% 0,0007 0.0007 84 % 84% 79 % 79% 93 % 93% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 134 134 39 39 30 30 buňkv z kostního morku bone marrow cells 7,0 7.0 18 % 18% 36 % 36% 6% 6% 0,7 0.7 43 % 43% 45 % 45% 28% 28% 0,07 0.07 63 % 63% 41 % 41% 44% 44% 0,007 0.007 76 % 76% 80% 80% 78 % 78% 0,0007 0.0007 86 % 86% 77 % 77% 78 % 78% medium (= 100 %), počet medium (= 100%), count 134 134 39 39 30 30 *Buňky byly předinkubovány s ředěními * Cells were preincubated with dilutions capsid B 19 (pg / ml) předem na 11 dní starou capsid B 19 (pg / ml) in advance for 11 days old

kulturu.culture.

• · • * · ♦·♦· · t i ·· · · ·♦ ·-» · * ·* « · *· * T t t i - - - - - - - - - - -

Dále testy tvorby kolonií v přítomnosti buněk parvoviru B 19 byly provedeny, jak je popsáno výše, s použitím krvetvorných buněk, získaných z kostního morku opic (paviánů a makaků). Jak je ukázáno na obrázku 2, růst krvetvorných buněk primátů klesal ve shodě se růstem koncentrace kapsid parvoviru B 19. Výsledky z tohoto pokusu neukázaly pouze, že krvetvorné buňky primátů mají P antigen, který interaguje s kapsidy parvoviru B 19, ale také objasnily, že paviáni a makakové jsou vhodní pro in vivo studium léčebných a profylaktických částí vynálezu. V následující části vynálezci popsali objev, že modifikované kapsidy parvoviru B 19 a peptidy, ze kterých jsou složeny kapsidy parvoviru B 19, mohou být použity k potlačení růstu krvetvorných buněk.In addition, colony formation assays in the presence of parvovirus B19 cells were performed as described above using hematopoietic cells derived from the bone marrow of monkeys (baboons and macaques). As shown in Figure 2, the growth of primate hematopoietic cells decreased in agreement with the growth of parvovirus B19 capsid concentration. Results from this experiment not only showed that primate hematopoietic cells have a P antigen that interacts with parvovirus B19 capsids, but also clarified that baboons and cynomolgus monkeys are suitable for the in vivo study of therapeutic and prophylactic parts of the invention. In the following, the inventors have described the discovery that modified parvovirus B19 capsids and the peptides of which parvovirus B19 capsids are composed can be used to suppress the growth of hematopoietic cells.

Příklad 2 : Modifikované kapsidy parvoviru B 19 a peptidy, ze kterých jsou složeny kapsidy parvoviru B 19, potlačují růstu krvetvorných buněkExample 2: Modified parvovirus B19 capsids and peptides of which parvovirus B19 capsids are composed suppress the growth of hematopoietic stem cells

V této části vynálezci popisují, jak připravili modifikované kapsidy B 19, které mají různé poměry proteinů VP1 a VP2 nebo pouze VP2, které mohou být použity při dlouhodobých léčebných postupech k potlačení růstu krvetvorných buněk. Při pokusu zjistit oblasti kapsidy parvoviru B 19, které se podílí na potlačení buněčného růstu, vynálezci objevili, že po navázání P antigenu kapsida fúzuje s buňkami, které mají P antigen, a nastává internalizace. Při pokusu, který poskytl důkaz internalizace kapsidy parvoviru B 19, vynálezci inkubovali jaterní buňky plodu s kapsidami parvoviru B 19 a buňky ošetřené kapsidami byly fixovány na sklíčka BioRad, značeny anti-B 19 monoklonální protilátkou (Mab8292) a detekovány fluorescenční sekundární protilátkou. Jaterní buňky plodu byly tedy promyty PBS a byla připravena suspenze s koncentrací 2x10⁶ / ml. Frakce suspenze byla inkubována s nativními kasidami B19 (0,35 pg kapsid / ml buněčné susp.) při 37 °C 1 hodinu. Přibližně 20 μΐ kapiček (přibližně 40 000 buněk) suspenze buněk / kapsidy bylo pak umístěno na dvě sklíčka BioRad, 10 jamek na každém sklíčku. Ve dvou jamkách na každém sklíčku byly buňky, které nebyly ošetřeny kapsidami, použity jako kontrola. Dále buňky na jednom ze dvou sklíček BioRad® byly permeabilizovány saponinem, což dovolilo proniknutí protilátky. Následně byla přidána primární anti-B 19 monoklonální IgG protilátka, po navázání a odstranění primární protilátky promytím PBS byla přidána sekundární fluorescenční anti - IgG protilátka, navázala se a nenavázaná sekundární byla odstraněna promytím PBS. Pro analýzu byl použit mikroskop s UV světlem. Saponinem permeabilizované buňky, ošetřené kapsidami parvoviru B 19, ukázaly fluorescenci na buněčných φφ ΦΦ ·· ···In this section, the inventors describe how they have prepared modified B19 capsids having different proportions of VP1 and VP2 proteins, or only VP2, that can be used in long-term treatments to inhibit the growth of hematopoietic cells. In an attempt to identify the parvovirus B19 capsid regions involved in suppressing cell growth, the inventors have discovered that upon binding of the P antigen the capsid fuses with cells having the P antigen and internalization occurs. In an experiment that provided evidence of internalization of parvovirus B19 capsid, the inventors incubated fetal liver cells with parvovirus B19 capsids and capsid-treated cells were fixed on BioRad slides, labeled with anti-B19 monoclonal antibody (Mab8292) and detected with a fluorescent secondary antibody. Thus, fetal liver cells were washed with PBS and a suspension of 2x10 ⁶ / ml was prepared. The fraction of the suspension was incubated with native B19 casids (0.35 µg capsid / ml cell suspension) at 37 ° C for 1 hour. Approximately 20 μΐ droplets (approximately 40,000 cells) of the cell / capsid suspension were then plated onto two BioRad slides, 10 wells per slide. In two wells on each slide, non-capsid treated cells were used as a control. Furthermore, cells on one of the two BioRad® slides were permeabilized with saponin, allowing antibody penetration. Subsequently, the primary anti-B19 monoclonal IgG antibody was added, after binding and removal of the primary antibody by washing with PBS, a secondary fluorescent anti-IgG antibody was added, bound and unbound secondary was removed by washing with PBS. A UV light microscope was used for the analysis. Saponin permeabilized cells treated with parvovirus B19 capsids showed fluorescence on cellular φφ ΦΦ ·· ···

Φ φ φ Φ Φ · Φ · ··· φφφ · · ··· · ·· • · · φ*·· Φ ·Φ • ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ *· »···· membránách a uvnitř buněk. Oproti tomu kontroly buněk, které nebyly permeabilizovány saponinem, ukázaly fluorescenci pouze na buněčném povrchu. Tyto výsledky poskytly důkaz, že potlačení růstu buněk, zprostředkované kapsidami parvoviru B 19, může zahrnovat více než proteinové sekvence, které kódují receptor pro P antigen.Φ φ φ Φ Φ · · · · memb memb memb memb memb memb memb memb memb memb memb memb memb memb · · · memb memb memb memb · · memb · memb ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ · · ΦΦΦ ΦΦΦ · ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦ · · ΦΦΦ · · · · In contrast, controls of cells that were not permeabilized with saponin showed fluorescence only on the cell surface. These results provided evidence that the inhibition of cell growth mediated by parvovirus B19 capsids may involve more than protein sequences that encode the receptor for the P antigen.

Ačkoliv části vynálezu mohou obsahovat kapsidy parvoviru B 19 bez modifikací, přirozené B 19 VLPs (např. kapsidy mající 95 % VP 2 a 5 % VP 1) vyvolávají imunitní odpověď, která je činí méně vhodné pro některá léčebná použití (např. použití při dlouhodobých léčebných postupech). Jiní připravili, při zkoušení vyvinout parvovirovou očkovací látku, modifikované kapsidy parvoviru B 19, které mají 25 % VP 1 a 75 % VP 2, ale tato modifikovaná VPL indukuje zvýšenou neutralizační odpověď in vivo. (viz patent US č. 5 508 186, Young et al ). Takto modifikované kapsidy parvoviru B 19 nejsou vhodné pro dlouhodobé léčebné postupy, protože pacientova imunitní odpověď může rychle odstranit VPLs z pacientova těla, takže se sníží účinná dávka. Dále kvůli rozšíření protilátek k parvoviru v populaci blížící se k 50 % je upřednostňováno, aby léčebné postupy používali činidla, které vyvolávají minimální imunitní odpověď. Díky jedinečné oblasti VP 1, která, jak se jeví, hraje nedílnou roli v imunitní odpovědi na kapsidu parvoviru B 19 (viz Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott - Raven Publishers, Philadelphia, Pa, p. 2207 (1996)), mohou být připraveny modifikované kapsidy, které obsahují méně VP 1, než bylo nalezeno v přírodních kapsidách, a mohou být účinnějšími léky pro dlouhodobé použití. To znamená, že některé části vynálezu obsahují kapsidy parvoviru B 19, které obsahují množství VP 1, které je nižší nebo rovno 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1,0 %, 1,1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,4 %, 1,5 %, 1,6 %, 1,7 %, 1,8 %, 1,9 %,Although parts of the invention may contain parvovirus B19 capsids without modification, natural B19 VLPs (e.g., capsids having 95% VP 2 and 5% VP 1) elicit an immune response that renders them less suitable for some therapeutic uses (e.g., long term use). treatment procedures). Others have prepared, in an attempt to develop a parvovirus vaccine, modified parvovirus B19 capsids having 25% VP 1 and 75% VP 2, but this modified VPL induces an increased neutralization response in vivo. (see U.S. Patent No. 5,508,186 to Young et al.). Such modified capsules of parvovirus B19 are not suitable for long-term treatments because the patient's immune response can rapidly remove VPLs from the patient's body, thus reducing the effective dose. Further, due to the spread of antibodies to parvovirus in a population close to 50%, it is preferred that the treatments use agents that elicit a minimal immune response. Due to the unique VP 1 region, which appears to play an integral role in the immune response to the parvovirus B19 capsid (see Fields et al., Virology vol. 2, 3rd edition, Lipponcott - Raven Publishers, Philadelphia, Pa, p. 2207 (1996)), modified capsids can be prepared that contain less VP1 than found in natural capsids and can be more effective drugs for long-term use. That is, some parts of the invention contain parvovirus B19 capsids that contain an amount of VP 1 of less than or equal to 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0 , 6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1 6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%,

2,0 %, 2,1 %, 2,2 %, 2,3 %, 2,4 %, 2,5 %, 2,6 %, 2,7 %, 2,8 %, 2,9 %, 3,0 %, 3,1 %, 3,2 %, 3,3 %, 3,4 %, 3,5 %, 3,6 %, 3,7 %, 3,8 %, 3,9 %, 4,0 %, 4,1 %, 4,2 %, 4,3 %, 4,4 %,2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%,

4,5 %, 4,6 %, 4,7 %, 4,8 %, 4,9 % a 5,0 % celkového množství VP 1 a VP 2. Kapsidy parvoviru B 19 (samotné VP 1 a VP 1/2) byly získány od Klause Heddmana z Helsinské university, Finsko.4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9% and 5.0% of the total amount of VP 1 and VP 2, respectively. Parvovirus B19 capsids (VP 1 and VP 1/2 alone) ) were obtained from Klaus Heddman of the University of Helsinki, Finland.

Dále rekombinantní VP 2 spontánně tvoří kapsidové struktury, které jsou podobné struktuře VP 1 / VP 2 bez VP 1. (viz patent US č. 5 508 186, Young et al.). Kapsidy VP 2 mají pouze menší neutralizační oblasti a tak mohou být velmi účinnými léky pro dlouhodobé léčebné postupy. Využitím testů tvorby kolonií, popsaných výše, vynálezci určili, že VP 2 kapsidy mohou potlačovat růst krvetvorných buněk, (viz obrázek 3). Jak je uvedeno výše, jaterní buňky lidského plodu byly inkubovány v přítomnosti VP 2 kapsid a byl proveden test tvorby kolonií po 11 dnech. Positivní kontrola v pokusu byl přirozený B 19 VPL, tedy kapsidy parvoviru B 19, které měly 95 % VP 2 a 5 % VP 1 (VP 1 / 2).Further, the recombinant VP 2 spontaneously forms capsid structures that are similar to the VP 1 / VP 2 structure without VP 1 (see U.S. Patent No. 5,508,186 to Young et al.). VP 2 capsids have only smaller neutralization areas and thus can be very effective drugs for long-term treatments. Using the colony formation tests described above, the inventors determined that VP 2 capsids can suppress the growth of hematopoietic stem cells (see Figure 3). As mentioned above, human fetal liver cells were incubated in the presence of VP 2 capsids and a colony formation assay was performed after 11 days. Positive control in the experiment was native B19 VPL, i.e. parvovirus B19 capsids having 95% VP 2 and 5% VP 1 (VP 1/2).

Výsledky, ukázané na obrázku 3, dokazují, že VP 2 kapsidy potlačují růst krvetvorných buněk při koncentraci nižší než 3 pg / ml a významě potlačují jejich výskyt při 30 pg / / ml. Části vynálezu, vhodné pro dlouhodobou léčbu, mohou také obsahovat fragmenty VP 2, které jsou spojeny s potlačením růstu buněk (např. vazebné místo P antigenu nebo oblasti VP 2, zahrnuté při fúzi/internalizaci nebo obou). Jak bude podrobněji diskutováno níže, techniky v proteinovém inženýrství, počítačové modelování, mapování epitopu a „charakterizační testy kapsidového činidla“ zde popsaný, mohou být použity k rychlému určení peptidů VP 2 nebo VP 1 nebo obou, které účinně potlačují buněčný růst bez vyvolání silné imunitní odpovědi.The results shown in Figure 3 demonstrate that VP 2 capsids suppress the growth of hematopoietic cells at a concentration of less than 3 pg / ml and significantly suppress their occurrence at 30 pg / ml. Parts of the invention suitable for long-term treatment may also include fragments of VP 2 that are associated with suppressing cell growth (eg, the P antigen binding site or the VP 2 region involved in fusion / internalization, or both). As discussed in more detail below, protein engineering techniques, computer modeling, epitope mapping, and "capsid agent characterization assays" described herein can be used to rapidly identify VP 2 or VP 1 peptides or both that effectively suppress cell growth without eliciting a strong immune answers.

Výrazem „charakterizační testy kapsidového činidla“ jsou míněny testy, které analyzují schopnost „kapsidového činidla“ potlačovat růst buněk, které mají P antigen. Příklady kapsidových činidel zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, kapsidy B 19 VLP nebo VP 1 / / 2 nebo VP 1 nebo VP 2 nebo modifikované nebo nemodifikované fragmenty peptidů VP 1 nebo VP 2 nebo obou nebo syntetické molekuly, které mají sekvence VP 1 nebo VP 2 nebo obě, nebo peptidomimetické látky, které se podobají VP 1 nebo VP 2 nebo oblastem obou nebo oběma těmto molekulám. Příklady charakterizačních testů kapsidového činidla zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, testy tvorby kolonií, neutralizační testy, testy navázání nebo fúze proteinů, testy internalizace, transkripční nebo translační testy a testy, které měří fosforylaci proteinů nebo mobilizaci vápníku v buňce po kontaktu s kapsidovým činidlem, (viz také pat. US č. 5 508 186, Young et al., zde výslovně zahrnutého v odkazu, který popisuje některé charakterizační testy kapsidového činidla). V další části vynálezci zveřejňují objev, že kapsidy parvoviru B 19 mohou potlačovat jiný typ buňky, který má P antigen - endotelovou buňku.By the term "capsid agent characterization tests" is meant tests that analyze the ability of the "capsid agent" to inhibit the growth of cells having P antigen. Examples of capsid agents include, but are not limited to, capsid B19 VLPs or VP1 / 2 or VP1 or VP2, or modified or unmodified fragments of the VP1 or VP2 peptides, or both, or synthetic molecules having the sequences of VP1 or VP1 or VP2. VP 2 or both, or peptidomimetic agents that resemble VP 1 or VP 2 or regions of both or both of these molecules. Examples of capsid agent characterization assays include, but are not limited to, colony formation assays, neutralization assays, protein binding or fusion assays, internalization assays, transcription or translation assays, and assays that measure protein phosphorylation or calcium mobilization in a cell upon contact with a capsid agent (See also U.S. Patent No. 5,508,186 to Young et al., specifically incorporated herein by reference, which describes some characterization assays for a capsid agent). In another section, the inventors disclose that parvovirus B19 capsids can suppress another cell type having a P antigen - an endothelial cell.

Příklad 3 : Kapsidy parvoviru B 19 potlačují růst jiných buněk, které exprimují P antigen, zahrnující, ale nejsou na ně omezeny, endotelové buňkyExample 3: Parvovirus B19 capsids inhibit the growth of other cells that express P antigen, including, but not limited to, endothelial cells

Výsledky z první sady pokusů poskytly důkaz, že kapsidy parvoviru B 19 a VP 2 kapsidy účinně potlačují růst množství různých krvetvorných buněk, které mají P antigen (zahrnujících krvetvorné buňky různých druhů). V druhé sadě pokusů vynálezci objevili, že kapsidy rekombinantního parvoviru B 19 potlačují růst jiného typu buněk, ··· · · · ·· ·· · · ···· · · které mají P antigen. Přesněji vynálezci objevili, že kapsidy parvoviru B 19 mohou potlačovat růst endotelových buněk, jak je patrné ze snížení proliferace a migrace endotelových buněk. Popis těchto pokusů je uveden níže.The results from the first set of experiments provided evidence that parvovirus B19 capsules and VP2 capsids effectively suppressed the growth of a number of different hematopoietic cells having P antigen (including hematopoietic cells of different species). In a second set of experiments, the inventors have discovered that recombinant parvovirus B19 capsids suppress the growth of another type of cell having a P antigen. More specifically, the inventors have discovered that parvovirus B19 capsids can suppress endothelial cell growth, as evidenced by reduced endothelial cell proliferation and migration. A description of these experiments is given below.

K určení, zda kapsidy parvoviru B 19 mohou potlačovat proliferaci endotelových buněk, byly provedeny testy v první řadě na lidských endotelových buňkách z pupeční žíly, umístěných při hustotě l,5x!0⁴ buněk na jamku na 24 jamkové destičce, které byly inkubovány s kapsidami parvoviru B 19 v přítomnosti 0,5 % séra z plodu telete + 10,0 ng / ml základního fibroplastového růstového faktoru. Různé připravené kapsidy B 19 (např. VP 1 / 2 nebo kapsid, připravených pouze s VP 1 nebo VP 2) byly přidány do každé jamky následující den a buňky s kapsidami byly inkubovány dalších 72 hodin. Buněčná proliferace byla pak určena použitím testu barvením krystalovou violetí.Barva pak byla odstraněna pořádným promytím destilovanou vodou. Krystalová violeť, spojená z buňkami, pak byla rozpuštěna 10 % octovou kyselinou a určena absorbancí při 540 nm na odečítací ELISA destičce.To determine if parvovirus B19 capsids can suppress endothelial cell proliferation, tests were performed primarily on human umbilical vein endothelial cells, placed at a density of 1.5x10 ⁴ cells per well on a 24-well plate that were incubated with capsids. parvovirus B 19 in the presence of 0.5% calf fetal serum + 10.0 ng / ml basic fibroplastic growth factor. Various prepared B19 capsids (eg VP 1/2 or capsids prepared with VP 1 or VP 2 only) were added to each well the following day and the cells with the capsids were incubated for an additional 72 hours. Cell proliferation was then determined using a crystal violet staining assay. The color was then removed by thorough washing with distilled water. The cellulosic crystal violet was then dissolved with 10% acetic acid and determined by absorbance at 540 nm on a reading ELISA plate.

Na obrázcích 4 až 7 jsou ukázány výsledky testů proliferace endotelových buněk. „Osa x „ těchto obrázků má vzrůstající koncentraci kontrolního antigenu KYVTGIN (SEQ. ID. NO. 1) (obrázek 4), kapsid parvoviru B 19 (samotné VP 1) (obrázek 5), kapsid parvoviru B 19 (VP 1/2) (obrázek 6) a kapsid parvoviru B 19 (samotné VP 2) (obrázek 7). Zleva doprava tak sloupce znázorňují absorbancí při 540 nm s 0 pg / ml, 0,01 pg / / ml, 0,1 pg / ml, 1,0 pg 7 ml a 10,0 pg / ml. „Osa y“ ukazuje standardní hodnoty absorbance při 540 nm. Standardní odchylka byla v rozmezí 10 %. Jak je ukázáno na obrázku 7, VP 2 kapsidy účinně potlačují proliferaci endotelových buněk při koncentraci nižší než 1,0 pg / ml a významně potlačení bylo pozorováno při koncentraci 10,0 pg/ml.Figures 4 to 7 show the results of endothelial cell proliferation assays. The "x-axis" of these figures has increasing concentrations of the control antigen KYVTGIN (SEQ. ID. NO. 1) (Figure 4), parvovirus B 19 capsid (VP 1 alone) (Figure 5), parvovirus B 19 capsid (VP 1/2) (Figure 6) and parvovirus B19 capsid (VP 2 alone) (Figure 7). Thus, from left to right, the bars show the absorbance at 540 nm with 0 pg / ml, 0.01 pg / ml, 0.1 pg / ml, 1.0 pg 7 ml and 10.0 pg / ml. The "y-axis" shows the standard absorbance values at 540 nm. The standard deviation was in the range of 10%. As shown in Figure 7, VP 2 capsids efficiently suppress endothelial cell proliferation at a concentration of less than 1.0 pg / ml, and significant suppression was observed at a concentration of 10.0 pg / ml.

Vliv přípravků kapsid parvoviru B 19 na buněčnou migraci byl také určen. Testy migrace byly provedeny použitím modifikovaného Boydenova komorového testu (Neuroprobe, lne ). Základní fibroplastový růstový faktor (40 pg / ml) byl přidán na stimulaci migrace HUVEC buněk přes kolagenem 1 potaženým filtrem s 8 pm velkými póry. Buňky byly inkubovány 60 min s různými přípravky kapsid B 19 (např. VP 1/2 nebo kapsidy, připravené pouze s VP 1 nebo VP 2) před provedením migračního testu. K provedení migračního testu byla Boydenova komora inkubována 4,5 h při 37 °C v atmosféře s 10 % CO2. Filtry byly následně odstraněny a byly fixovány v 3,7% formaldehydu. Buněčná migrace byla visualizována ponecháním filtrů přes noc v Gillově hematoxylinu („GilFs Hematoxylin“). Počet migrujících buněk byl hodnocen • · • · · ·The effect of parvovirus B19 capsid preparations on cell migration has also been determined. Migration tests were performed using a modified Boyden Ventricular Test (Neuroprobe, Inc). Basic fibroplastic growth factor (40 pg / ml) was added to stimulate the migration of HUVEC cells through collagen 1 coated filter with 8 µm large pores. Cells were incubated for 60 min with various capsid B 19 preparations (eg VP 1/2 or capsids prepared with VP 1 or VP 2 only) before performing the migration test. To perform the migration test, the Boyden chamber was incubated for 4.5 h at 37 ° C in an atmosphere of 10% CO 2. The filters were then removed and fixed in 3.7% formaldehyde. Cell migration was visualized by leaving filters overnight in Gill's hematoxylin ("GilFs Hematoxylin"). The number of migrating cells was evaluated

...... ·· ·· ·· počítáním obarvených buněk na migrační straně filtru za velmi silného zvětšení, (viz obrázek 8). Jak je ukázáno na obrázku 8, VP 2 kapsidy při koncentraci nižší než 1 pg / / ml účinně potlačovaly migraci endotelových buněk. Dále potlačení migrace endotelových buněk zprostředkované kapsidami VP 2 bylo významně silnější než to, které bylo pozorované s buď přirozenými kapsidami (VP 1 / 2) nebo kapsidami, které mají pouze VP 1....... by counting stained cells on the migration side of the filter at very high magnification (see Figure 8). As shown in Figure 8, VP 2 capsids at a concentration of less than 1 µg / ml effectively suppressed endothelial cell migration. Furthermore, suppression of VP 2 capsid mediated migration of endothelial cells was significantly more potent than that observed with either natural capsids (VP 1/2) or capsids having VP 1 only.

Výsledky z pokusů, popsaných výše, poskytly důkaz, že kapsidy parvoviru B 19, modifikované kapsidy parvoviru B 19 a VP 2 kapsidy mohou být připraveny a použity k účinnému potlačení růstu a/nebo migrace buněk, které mají P antigen, takových jako buněk krvetvorného původu a endotelových buněk. Pokusy, popsané výše, také ukázaly, že proteinové sekvence kapsidy B 19, které se váží na P antigen a/nebo jsou zahrnuty při fúzi nebo internalizaci částice, mohou být zahrnuty při potlačení buněčného růstu nebo buněčné migrace. Zatímco tyto části jsou vhodné pro mnoho léčebných přihlášek vynálezu, léky, obsahující fragmenty VP 1 nebo VP 2 nebo obou nebo syntetické molekuly, mohou být připraveny k více účinné vazbě, fúzi a internalizaci buňkami, které mají P antigen. V části, uvedené níže, vynálezci uvádějí přípravu a charakterizaci více kapsidových prostředků, které potlačují buněčný růst a buněčnou migraci.The results from the experiments described above have provided evidence that parvovirus B19 capsids, modified parvovirus B19 capsids and VP2 capsids can be prepared and used to effectively suppress the growth and / or migration of cells having P antigen, such as cells of hematopoietic origin and endothelial cells. The experiments described above have also shown that protein sequences of capsid B19 that bind to the P antigen and / or are involved in particle fusion or internalization can be involved in suppressing cell growth or cell migration. While these portions are suitable for many therapeutic applications of the invention, drugs containing fragments of VP 1 or VP 2 or both or synthetic molecules can be prepared for more efficient binding, fusion and internalization by cells having a P antigen. In the section below, the present inventors disclose the preparation and characterization of multiple capsid formulations that suppress cell growth and cell migration.

Příklad 4 : B 19 kapsidová činidla, která potlačují růst a migraci buněk, které mají P antigen.Example 4: B19 capsid agents that suppress the growth and migration of cells having P antigen.

V této části vynálezci popisují některé techniky, které mohou být použity k přípravě, konstrukci a charakterizaci kapsidová činidla, zahrnující, ale ne jenom, kapsidy parvoviru B 19, modifikované kapsidy parvoviru B 19, VP 2 kapsidy a peptidy nebo peptidomimetické látky, které mají sekvence, které odpovídají oblastem buď VP 1 nebo VP 2 nebo obou. Strukturální gen VP 1 a VP 2 byl sekvenován jako celek a tato sekvence může být získána z NCBI databázového zdroje pod přístupovým číslem U38506.1 nebo pod přístupovým číslem AAB47788 nebo číslem v databázi medline 97081188 nebo jako publikovaný Erdmanem et al., J. Gen. Virol., 77 : 2767 (1996), všechny odkazy a sekvence zde jsou tímto výslovně zahrnuty odkazem. VP 1 nebo VP 2 nebo jejich fragmenty nebo obou, použité v částech vynálezu, odpovídají sekvencím, zahrnutým při potlačení buněčného růstu a buněčné migrace. Vhodné peptidy podle vynálezu mohou obsahovat mezi třemi aminokyselinami a 780 aminokyselinami VP 1 a VP 2 strukturálního proteinu, ale mají alespoň některou část molekuly, která je zahrnuta při potlačení růstu a/nebo migrace buněk, které mají P antigen. Jinými slovy, upřednostňované části vynálezu mohou zahrnovat alespoň tři aminokyseliny, čtyři aminokyseliny, pět aminokyselin, šest aminokyselin, sedm aminokyselin, osm, devět, deset, jedenáct, dvanáct, třináct, Čtrnáct, patnáct, šestnáct, sedmnáct, osmnáct, devatenáct, dvacet, dvacet jedna, dvacet dva, dvacet tři, dvacet čtyři, dvacet pět, dvacet šest, dvacet sedm, dvacet osm, dvacet devět, třicet, třicet jedna, třicet dva, třicet tři, třicet čtyři, třicet pět, třicet šest, třicet sedm, třicet osm, třicet devět nebo čtyřicet nebo padesát nebo šedesát nebo sedmdesát nebo osmdesát nebo devadesát nebo sto aminokyselin VP 1 a VP 2 strukturálního genu. Vhodné části mohou obsahovat alespoň 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,In this section, the inventors describe some techniques that can be used to prepare, construct, and characterize capsid agents, including, but not limited to, parvovirus B19 capsids, modified parvovirus B19 capsids, VP 2 capsids, and peptides or peptidomimetic substances having sequences that correspond to either VP 1 or VP 2 or both. The VP 1 and VP 2 structural gene was sequenced as a whole and can be obtained from the NCBI database source under accession number U38506.1 or accession number AAB47788 or medline number 97081188 or published by Erdman et al., J. Gen. Virol., 77: 2767 (1996), all references and sequences herein are hereby expressly incorporated by reference. VP 1 or VP 2 or fragments thereof, or both, used in parts of the invention correspond to sequences involved in suppressing cell growth and cell migration. Suitable peptides of the invention may comprise between three amino acids and 780 amino acids of the VP1 and VP2 structural protein, but have at least some of the molecule involved in inhibiting the growth and / or migration of cells having a P antigen. In other words, preferred portions of the invention may include at least three amino acids, four amino acids, five amino acids, six amino acids, seven amino acids, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, twenty-one, twenty-two, twenty-three, twenty-four, twenty-six, twenty-seven, twenty-eight, twenty-nine, thirty-one, thirty-two, thirty-three, thirty-four, thirty-five, thirty-six, thirty-seven, thirty eight, thirty-nine or forty or fifty or sixty or seventy or eighty or ninety or one hundred amino acids of the VP 1 and VP 2 structural gene. Suitable portions may comprise at least 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,

280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450,280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450

460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620,460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620

630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770 nebo 780 aminokyselin VP 1 a VP 2 strukturálního genu.630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, or 780 amino acids of the VP 1 and VP 2 structural gene.

Peptidy a fragmenty nebo látky od nich odvozené, které jsou zahrnuty při potlačení růstu a migrace buněk, které mají P antigen, obsahují, ale nejsou na ně omezeny, takové oblasti VP 1 a VP 2 strukturálního genu, které byly nalezeny v přírodě. Dále pozměněné sekvence, ve kterých funkční ekvivalentní aminokyselinové zbytky jsou substituovány zbytky v sekvenci tvořící tichou změnu, mohou být také přítomny v těchto kapsidových činidlech. Proto jedna nebo více aminokyselinových zbytků v sekvenci VP 1 a VP 2 strukturního genu může být substituováno jinou aminokyselinou podobné polarity, což je funkční ekvivalent, mající za následek tichou záměnu. Substituenty pro aminokyselinu v sekvenci mohou být vybrány z dalších členů třídy, do které aminokyselina patří. Například nepolární (hydrofobní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryprofan a methionin. Nerozvětvené polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Kladně nabité (basické) aminokyseliny zahrnují arginin, lysin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnují aspartátovou kyselinu a glutamovou kyseliny. Aromatické aminokyseliny zahrnují fenylalanin, tryptofan a tyrosin. Peptidy, popsané výše, jsou přednostně analyzovány při testech k určení, zda si fragment uchoval schopnost potlačovat růst a/nebo migraci buněk, které mají P antigen.Peptides and fragments or substances derived therefrom which are involved in suppressing the growth and migration of cells having a P antigen include, but are not limited to, those VP1 and VP2 regions of the structural gene that have been found in nature. Further, altered sequences in which functional equivalent amino acid residues are substituted by residues in the silent alteration sequence may also be present in these capsid agents. Therefore, one or more amino acid residues in the sequence VP1 and VP2 of the structural gene may be substituted by another amino acid of similar polarity, which is a functional equivalent, resulting in a silent replacement. The amino acid substituents in the sequence may be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, trypropane, and methionine. Non-branched polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acids. Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine. The peptides described above are preferably analyzed in assays to determine whether the fragment retained the ability to inhibit the growth and / or migration of cells having a P antigen.

Peptidy pro použití v aspektech vynálezu mohou také být modifikovány, např. peptidy mohou mít substituenty obvykle se v peptidu nevyskytující nebo peptidy mohou mít substituenty, které se obvykle v peptidu vyskytují, ale jsou inkorporovány do oblastí, které nejsou obvyklé. Tyto peptidy mohou být například acetylovány, acylovány nebo ···· · · · ··· • · 9 ♦ · ··· · · ······ ·· ·· ·· · substituovány aminoskupinami. Substituenty, které mohou být obsaženy v peptidu tak, že jej modifikují, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, H, alkyl, aryl, alkenyl, alkyl, aromát, ether, ester, nesubstituovaný nebo substituovaný amin, amid, halogen nebo nesubstituovaný nebo substituovaný sulfonyl nebo 5 nebo 6 četný alifatický nebo aromatický kruh. Dále VP 1 nebo VP 2 nebo fragmenty obou jednotlivě nebo obou mohou být odvozeny v tom, že odvozený polypeptid může být připraven tak, aby zahrnoval aminokyselinové sekvence, které ovlivňují funkci a stabilitu molekuly. Například peptidy, které jsou zahrnuty při potlačení růstu a migrace buněk, které mají P antigen, mohou být připraveny s jedním nebo více cysteinovými zbytky tak, že podporují vytvoření více stabilních derivátů díky vytvoření sulfidových vazeb, (viz např. pat. US č. 4 908 773). Počítačové grafické programy a testy zde popsané mohou být využity k identifikaci cysteinem spojených míst, které poskytují vyšší stabilitu, ale nesnižují schopnost potlačovat růst nebo migraci buněk, které mají P antigen. (viz např. Perry, L. J., & Wetzel, R„ Science, 226:555-557 /1984); Pabo, C. O., et al., Biochemistry, 25:5987-5991 (1986); Bott, R., et al., Evropská patentová přihláška ser. č. 130 756; Perry, L. I, & Wetzel, R., Biochemistry, 25:733-739 (1986); Wetzel, R. B., Evropská patentová přihláška ser. č. 155 832).Peptides for use in aspects of the invention may also be modified, eg, peptides may have substituents not normally found in the peptide or peptides may have substituents that typically occur in the peptide but are incorporated into regions that are not conventional. For example, these peptides may be acetylated, acylated, or substituted with amino groups. Substituents that may be included in the peptide to modify it include, but are not limited to, H, alkyl, aryl, alkenyl, alkyl, aromatic, ether, ester, unsubstituted or substituted amine, amide, halogen, or unsubstituted or substituted sulfonyl or 5 or 6 numerous aliphatic or aromatic rings. Further, VP 1 or VP 2 or fragments of either individually or both may be derived in that the derived polypeptide may be prepared to include amino acid sequences that affect the function and stability of the molecule. For example, peptides that are involved in suppressing the growth and migration of cells having a P antigen may be prepared with one or more cysteine residues so as to promote the formation of more stable derivatives through the formation of sulfide bonds (see, e.g., U.S. Pat. No. 4). 908 773). The computer graphics programs and assays described herein can be used to identify cysteine-linked sites that provide greater stability but do not reduce the ability to suppress the growth or migration of cells having P antigen. (see, e.g., Perry, L. J., & Wetzel, R. Science, 226: 555-557 / 1984); Pabo, C.O., et al., Biochemistry, 25: 5987-5991 (1986); Bott, R., et al., European Patent Application Ser. No. 130,756; Perry, L.I. & Wetzel, R., Biochemistry, 25: 733-739 (1986); Wetzel, R. B., European Patent Application Ser. No. 155,832).

Další deriváty, které jsou částmi vynálezu, zahrnují peptidomimetické látky, které se podobají oblastem VP 1, VP 2 nebo oběma Syntetické peptidy mohou být připraveny tak, že odpovídají těmto molekulám, využitím obvyklých syntetických způsobů, použitím L-aminokyselin, D-aminokyselin nebo různé kombinace aminokyselin dvou různých konfigurací. Syntetické látky, které napodobují konformaci a vhodné znaky jednotlivých peptidů, ale vyhýbají se nevhodným znakům, např. flexibilitě (ztrátě konformace) a porušení vazeb, jsou známy jako „peptidomimetické látky“, (viz např. Spatola, A. F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides, and Proteins (Weistein, B, Ed ), Vol. 7, pp. 267-357, Marcel Dekker, New York (1983), který popisuje použití methylenthiobioisosteru (CH2S) jako náhradu amidu v enkefalinových analozích; a Szelke et al., In peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth Američan Peptide Symposium, (Hrubý and Rich, Eds.); pp. 579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1983), který popisuje reninové inhibitory, které mají oba methylenamino (CH₂NH) a hydroxyethylen (CHOHCH2) bioisostery v Leu - Val amidové vazbě v 6 až 13 oktapeptidu, odvozeného od angiotensinogenu). V oboru je známo množství způsobů a technik pro konstrukci a přípravu peptidomimetických látek, z nichž nějaký může být použit, (viz např, Farmer, P, S., Drug Design, (Ariens, E, J.Other derivatives that form part of the invention include peptidomimetic agents that resemble the VP1, VP2, or both regions. Synthetic peptides may be prepared to correspond to these molecules, using conventional synthetic methods, using L-amino acids, D-amino acids, or various a combination of amino acids of two different configurations. Synthetic agents that mimic the conformation and appropriate traits of individual peptides but avoid inappropriate traits, such as flexibility (loss of conformation) and bond disruption, are known as "peptidomimetics" (see, eg, Spatola, AF Chemistry and Biochemistry of Amino Acids) Peptides, and Proteins (Weistein, B, Ed), Vol. 7, pp. 267-357, Marcel Dekker, New York (1983), which describes the use of methylene thiobioisoster (CH2S) as an amide replacement in enkephalin analogues, and Szelke et al. In Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, (Rough and Rich, Eds.), Pp. 579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1983), which describes renin inhibitors, having both the methyleneamino (CH ₂ NH) and hydroxy (CHOHCH2) bioisosteres Leu - Val amide bond in the 6-13 octapeptide derived from angiotensinogen). A number of methods and techniques are known in the art for the construction and preparation of peptidomimetic substances, some of which may be used (see, eg, Farmer, P, S., Drug Design, (Ariens, E, J.

ed.), Vol. 10, pp. 119-143 (Academie Press, New York, London, Toronto, Sydney and San Francisco) (1980); Farmer, et al., in TIPS, 9/82, pp. 362-365; Verber et al., in TINS, 9/85, pp. 392-396; Kaltenbronn et al., in J. Med. Chem. 33: 838-845 (1990); a Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides, and Proteins, Vol. 7, pp. 267-357, Chapter 5, „Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Anály sis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints, and Relations“ (B. Weisten, ed.; Marceli Dkker: New York, pub.) (1983); Kemp, D. S., „Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of beta-sheets and alphahelices in Peptides“, Tibech, Vol. 8, PP. 249-255 (1990). Další uvedené mohou být nalezeny v patentu US č. 5 288 707; 5 552 534; 5 811 515; 5 817 626; 5 817 879; 5 821 231 a 5 874 529, zde zahrnuté odkazem. Proto peptidomimetické látky podle vynálezu mohou mít struktury, které se podobají alespoň tri aminokyseliny, čtyři aminokyseliny, pět aminokyselin, šest aminokyselin, sedm aminokyselin, osm, devět, deset, jedenáct, dvanáct, třináct, čtrnáct, patnáct, šestnáct, sedmnáct, osmnáct, devatenáct, dvacet, dvacet jedna, dvacet dva, dvacet tři, dvacet čtyři, dvacet pět, dvacet šest, dvacet sedm, dvacet osm,-dvacet devět, třicet, třicet jedna, třicet dva, třicet tři, třicet čtyři, třicet pět, třicet šest, třicet sedm, třicet osm, třicet devět nebo čtyřicet nebo padesát nebo šedesát nebo sedmdesát nebo osmdesát nebo devadesát, sto, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,ed.), Vol. 10, s. 119-143 (Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney and San Francisco) (1980); Farmer, et al., In TIPS, 9/82, pp. 362-365; Verber et al., In TINS, 9/85, pp. 392-396; Kaltenbronn et al., In J. Med. Chem. 33: 838-845 (1990); and Spatola, A.F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides, and Proteins, Vol. 7, s. 267-357, Chapter 5, “Peptide Backbone Modifications: A Structure-Activity Annals of Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints, and Relationships ”(B. Weisten, ed .; Marceli Dkker, New York, pub.) (1983); Kemp, D. S., "Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of Beta-Sheets and Alphahelices in Peptides", Tibech, Vol. 8, PP. 249-255 (1990). Others can be found in U.S. Patent No. 5,288,707; 5,552,534; 5,811,515; 5,817,626; 5,817,879; 5,821,231 and 5,874,529, incorporated herein by reference. Therefore, the peptidomimetic compounds of the invention may have structures that resemble at least three amino acids, four amino acids, five amino acids, six amino acids, seven amino acids, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, twenty-one, twenty-two, twenty-four, twenty-five, twenty-six, twenty-seven, twenty-eight, twenty-nine, thirty, thirty-one, thirty-two, thirty-three, thirty-four, thirty-five, thirty six, thirty-seven, thirty-eight, thirty-nine, or forty or sixty or seventy or eighty or ninety, hundred, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,

180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330,340,180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330,340,

350, 360, 370, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510,520,350, 360, 370, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510,520,

530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680,690,530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680,690,

700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770 nebo 780 aminokyselin VP 1 a VP 2 strukturálního proteinu tak dlouhého, jako některá oblast molekuly, potlačující růst nebo migraci buňky, která má P antigen.700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770 or 780 amino acids of the VP1 and VP2 structural protein as long as any region of the molecule that inhibits the growth or migration of a cell having a P antigen.

Obvyklé techniky v molekulární biologii, jako jsou ty popsané v patentu US č. 5 508 189, zde zřetelně celého zahrnutého odkazem, mohou být použity pro přípravu množství typů kapsidových činidel. Výraz „kapsidová činidla“ se mohou vztahovat na kapsidy, obsahující VP1, VP 2, VP 1 / 2 v různých poměrech, fragmenty VP 1 nebo VP 2 nebo jednotlivých nebo obou, fúzních proteinů, které mají sekvence, které odpovídají VP 1 nebo VP 2 nebo oběma, a modifikované nebo nemodifikované proteiny nebo peptidy nebo peptidomimetické látky, které odpovídají sekvencím VP 1 a VP 2 strukturálního genu, které jsou zahrnuty při potlačení růstu a/nebo migrace buněk, které mají P antigen.Conventional techniques in molecular biology, such as those described in U.S. Patent No. 5,508,189, herein incorporated by reference in its entirety, may be used to prepare a variety of capsid agent types. The term "capsid agents" may refer to capsids containing VP1, VP2, VP1 / 2 in various proportions, fragments of VP1 or VP2 or individual or both, fusion proteins having sequences that correspond to VP1 or VP2. or both, and modified or unmodified proteins or peptides or peptidomimetic agents that correspond to the VP1 and VP2 sequences of the structural gene that are involved in suppressing the growth and / or migration of cells having a P antigen.

• · • ♦ · · • · • ·• • • • •

Přístupem, popsaným v patentu US č. 5 508 186, může být kapsidové činidlo připraveno následovně. Plasmidy mohou být sestaveny tak, aby obsahovaly celou délku kteréhokoliv z VP 1 nebo VP 2 nebo obou. K sestavení plasmidu pVP 1/941 cDNA, kódující VP 1 gen, může být získána z pYT103c, skoro celé délky molekulárního klonu parvoviru B 19 (Cotmore et al. Science 226:1161 (1984); Ozawa et al. J. Virol. 62:2884 (1988)) vystřižením restrikčními enzymy Hind III (který stříhá v restrikčním místě 45) a EcoRI (který stříhá v restrikčním místě 95), následované reakcí s nespecifickou fazolovou nukleázou k doplnění jednovláknových konců. Výsledný DNA fragment je pak vložen do BamHI místa (připraven tupý konec Klenovovým fragmentem DNA polymerázy) bakulovirového transferového vektoru pVL941, vektoru odvozeného delecí polyhedrinového genu AcMNPV (Autographa california jaderný polyhedrózní virus), následována klonováním do pUC8 plasmidu (Summers et al. Tex. Agric. Exp. Stn. 1555 (1987)). Sestavení pVP2/941 je provedeno inzercí Pstl-EcoRI vystřiženého fragmentu pYT103c (restrikční místa 58 až 95; EcoRI místo má tupý konec) a syntetického DNA fragmentu 20 nukleotidů, odpovídajícíhoSstl-Pstl oblasti (zase s Sstl s tupým zakončením) do BamHI místa pVL941. Dále polymerázová řetězová reakce (PCR) může být použita ke klonování VP 1 nebo VP 2 genu nebo jejich částí z celé délky klonů, jak je popsáno Erdmanem et al., J. Gen Virol. 77:2767 (1996), zde celého zahrnutého odkazem Pro usnadnění klonování mohou -primery být konstruovány ke vzniku obvyklých míst pro restrikční stříhání, jak je známo v oboru.By the approach described in U.S. Patent No. 5,508,186, the capsid agent can be prepared as follows. The plasmids may be engineered to contain the full length of either VP 1 or VP 2 or both. To construct plasmid pVP 1/941 cDNA encoding the VP1 gene can be obtained from pYT103c, an almost full-length molecular clone of parvovirus B19 (Cotmore et al. Science 226: 1161 (1984); Ozawa et al. J. Virol. 62 : 2884 (1988)) by cutting with the restriction enzymes Hind III (which cuts at restriction site 45) and EcoRI (which cuts at restriction site 95), followed by reaction with non-specific bean nuclease to complement the single-stranded ends. The resulting DNA fragment is then inserted into the BamHI site (blunt-ended by the Klenov DNA polymerase fragment) of the baculovirus transfer vector pVL941, a vector derived from the deletion of the polyhedrin gene AcMNPV (Autographa california nuclear polyhedrosis virus), followed by cloning into pUC8 plasmid (Summers et al. Exp. Stn. 1555 (1987)). The assembly of pVP2 / 941 is done by inserting the PstI-EcoRI cut fragment pYT103c (restriction sites 58-95; the EcoRI site has a blunt end) and a synthetic DNA fragment of 20 nucleotides corresponding to the StI-PstI region (again with the blunt-ended SstI) into the BamHI site of pVL941. Further, the polymerase chain reaction (PCR) can be used to clone the VP 1 or VP 2 gene or parts thereof over the full length of the clones, as described by Erdman et al., J. Gen Virol. 77: 2767 (1996), incorporated herein by reference. To facilitate cloning, primers can be constructed to provide conventional restriction shear sites, as is known in the art.

Rekombinantní plasmidy, kódující VP 1, VP 2, VP 1/2 nebo jejich fragmenty, jsou pak transfekovány do hmyzích buněk k produkci rekombinantních bakulovirů. Proto 8 pg rekombinantního plasmidu je kotransfekováno do Sf9 buněk s 2 pg přirozeného typu AcMNPV použitím precipitace pomocí fosforečnanu vápenatého. Sf9 buněčná linie (Sbírka kultur amerických typů, Rockville Md.), která byla získána z ovarií Spodoptera frugiperda (fall army worm), byla udržována v Graceově mediu pro hmyzí tkáňové kultury, obsahujícím 10 % teplem inaktivovaného séra z hovězího plodu, 2,5 pg / ml fungizonu, 50 pg / ml gentamicinu, 3,33 pg / ml hydrolyzátu mléčného albuminu a 3,33 pg / ml kvasničného extraktu (kompletně získaného od Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg Md.), při 100% pokojovém vzduchu, 95% vlhkosti při 27°C. 6 dnů po transfekci jsou dceřinné viry odebrány a znovu zavedeny do čerstvých Sf9 buněk. Rekombinantní viry jsou rozpoznány vizuálně absencí okluzních tělísek v jádře buněk (okluzívně pozitivní fenotyp je výsledkem syntézy velkých množství polyhedrinového proteinu). Rekombinantní viry mohou projít třemi cykly plakové • · · · ··· · · · • · · · ♦ · · · · · purifikace než jsou VLP složky připraveny a isolovány nebo purifikovány. Specifickým záměrem jsou purifikované složky, obsahující 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 25 % nebo více (váhových %) aktivní přísady.Recombinant plasmids encoding VP 1, VP 2, VP 1/2 or fragments thereof are then transfected into insect cells to produce recombinant baculoviruses. Therefore, 8 µg of the recombinant plasmid is cotransfected into Sf9 cells with 2 µg of the wild-type AcMNPV using calcium phosphate precipitation. The Sf9 cell line (Collection of American Type Cultures, Rockville Md.), Which was obtained from ovarian Spodoptera frugiperda (fall army worm), was maintained in Grace's insect tissue culture medium containing 10% heat-inactivated bovine serum, 2.5 pg / ml fungizone, 50 pg / ml gentamicin, 3.33 pg / ml milk albumin hydrolyzate, and 3.33 pg / ml yeast extract (completely obtained from Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg Md.), at 100% ambient air, 95 % humidity at 27 ° C. Six days after transfection, daughter viruses are harvested and reintroduced into fresh Sf9 cells. Recombinant viruses are recognized visually by the absence of occlusive bodies in the nucleus of the cells (the occlusive positive phenotype is the result of the synthesis of large amounts of polyhedrin protein). Recombinant viruses can undergo three cycles of plaque purification before the VLP components are prepared and isolated or purified. A specific purpose is purified components containing 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 25% or more by weight of the active ingredient.

Výraz „izolovaný“ vyžaduje, aby látka byla odstraněna z původního prostředí (např. přirozeného prostředí, jestliže se přirozeně vyskytuje). Například přirozeně se vyskytující protein, přítomný v živých buňkách, není izolován, ale stejný protein, oddělený z některých nebo všech koexistujících látek v přirozeném systému, je izolován. Výraz „purifikovaný“ nevyžaduje absolutní čistotu; spíše je zamýšlen jako relativní definice. Například proteiny jsou obvykle purifikovány do elektroforetické homogenity, které se detekuje Coomassie barvením, a jsou vhodné při různých testech přes přítomnost kontaminace. Přednostně jsou charakterizační testy kapsidové činidla provedeny na izolovaných nebo purifikovaných kapsidových činidlech, zahrnující, ale nejsou na ně omezeny, testy popsané v patentu US č. 5 508 186 (např. DNA, RNA a proteinová analýza, imunobloty, imunofluorescence, analýza sedimentace, elektronová mikroskopie, imunoelektronová mikroskopie a charakterizační testy kapsidové činidla, popsané dříve.The term 'isolated' requires the substance to be removed from its original environment (eg, the natural environment if it occurs naturally). For example, the naturally occurring protein present in living cells is not isolated, but the same protein, separated from some or all of the coexisting substances in the natural system, is isolated. The term 'purified' does not require absolute purity; rather, it is intended as a relative definition. For example, proteins are usually purified to electrophoretic homogeneity as detected by Coomassie staining and are useful in various assays despite the presence of contamination. Preferably, the capsid agent characterization assays are performed on isolated or purified capsid agents, including, but not limited to, those described in US Patent No. 5,508,186 (eg, DNA, RNA and protein analysis, immunoblots, immunofluorescence, sedimentation analysis, electron microscopy, immunoelectron microscopy and capsid reagent characterization assays described previously.

V některých částech, zejména pro přihlášky, které zahrnují dlouhodobé podávání kapsidových Činidel, je žádoucí připravit lék, který u pacienta nevyvolává významnou imunitní odpověď' Obecné schéma pro přípravu kapsidových činidel, které neindukují imunitní odpověď, zahrnuje navržení činidla, konstrukci činidla, analýzu schopnosti činidla potlačovat buněčný růst a/nebo buněčnou migraci a analýzu imunitní odpovědi, vyvolané činidlem. Mnoho imunogenických oblastí kapsidy parvoviru B 19 je známých a díky obvyklým technikám v molekulární biologii tyto imunogenické oblasti mohou být deletovány, mutagenizovány nebo modifikovány a nově navržené syntetické kapsidové proteiny mohou být analyzovány v jednom nebo více charakterizačních testech kapsidové činidla (např. test tvorby kolonií a neutralizační test s použitím sér, získaných od asymptomatických jedinců). K identifikaci imunogenických oblastí kapsidy parvoviru B 19 a přípravě neimunogenických VLPs, které potlačují buněčný růst a/nebo buněčnou migraci, může být použito mnoho způsobů a příklad, uvedený níže, je uveden jako jeden možný přístup.In some sections, particularly for applications involving long-term administration of capsid agents, it is desirable to prepare a drug that does not elicit a significant immune response in a patient. A general scheme for preparing non-immune response capsid agents includes reagent design, reagent design, reagent capability analysis suppress cell growth and / or cell migration and analyze the immune response elicited by the agent. Many immunogenic regions of the parvovirus B19 capsid are known and, due to conventional techniques in molecular biology, these immunogenic regions can be deleted, mutagenized or modified, and newly designed synthetic capsid proteins can be analyzed in one or more capsid reagent characterization tests (eg, colony formation assay and neutralization test using sera obtained from asymptomatic individuals). Many methods can be used to identify immunogenic regions of the parvovirus B19 capsid and prepare non-immunogenic VLPs that suppress cell growth and / or cell migration, and the example below is presented as one possible approach.

Test expresních konstruktů může být navržen, připraven a analyzován následovně. Tento proces se může opakovat, takže je získáno několik tříd VLPs a léků, které mají tyto kapsidové činidla, lišící se podle jejich schopnosti potlačovat buněčný růst, buněčnou migraci a indukovat imunitní odpověď u pacienta. Proto podle jednoho ···· ♦······ • · · · * 4*9 · ·· • 9 · · · · · · · · ·· • · · · · · · · ·φ ···· 9· ·· ·· ····· přístupu VP 2 strukturální gen může být klonován z klinických izolátů použitím PCR s primery, navrženými z publikované sekvence VP 2. VP 2 gen je následně subklonován do BlueScript (Pharmacia) pro mutagenezi a pVL1393 (Stratagene) pro expresi v Sf9 buňkách. Mutace, které odpovídají imunogenickým oblastem VP 2 (např. aminokyseliny 253 až 272, 309 až 330, 328 až 344, 359 až 382, 449 až 468 a 491 až 515), jsou zavedeny do VP 2 genu použitím kitu pro Amersham Sculptor in vitro mutagenezi. Odborník v oboru uzná, že zkrácení karboxylů, zkrácení aminů, vnitřní zkrácení a cílená lokální mutageneze VP 1 a VP 2 strukturálního proteinu může být provedena několika přístupy. Přednostně je připraveno několik různých klonů, které mají jednu nebo více delecí, popsaných výše. Vznik vhodné mutace je potvrzeno sekvenací a mutovaný gen je pak subklonován do pVL1393 pro expresi v Sf9 buňkách. SF9 buňky jsou pak transfekovány použitím kitu BaculoGold Transfection (Pharmingen). Transfekce mohou být provedeny podle instrukcí pro přípravu s následujícími modifikacemi. Přibližně 8 x 10⁸ Sf9 buněk jsou transfekovány ve 100 mM misce se 4 pg BaculoGold DNA a 6 pg testované DNA. Po 6 dnech jsou buňky odebrány a testovány na produkci VLP.The expression construct assay can be designed, prepared and analyzed as follows. This process may be repeated to yield several classes of VLPs and drugs having these capsid agents, varying in their ability to inhibit cell growth, cell migration, and induce an immune response in a patient. Therefore, according to one ···· ♦ ······ · · · 4 * 9 · ·· · 9 · · · · · · · · · φ ··· The approach for the VP 2 structural gene can be cloned from clinical isolates using PCR with primers designed from the published VP 2 sequence. The VP 2 gene is subsequently subcloned into BlueScript (Pharmacia) for mutagenesis and pVL1393 (Stratagene) for expression in Sf9 cells. Mutations that correspond to the immunogenic regions of VP 2 (eg, amino acids 253 to 272, 309 to 330, 328 to 344, 359 to 382, 449 to 468, and 491 to 515) are introduced into the VP 2 gene using the Amersham Sculptor kit in vitro mutagenesis. One of skill in the art will recognize that carboxyl truncation, amine truncation, internal truncation, and targeted local mutagenesis of the VP1 and VP2 structural protein can be accomplished by several approaches. Preferably, several different clones having one or more of the deletions described above are prepared. The generation of the appropriate mutation is confirmed by sequencing and the mutated gene is then subcloned into pVL1393 for expression in Sf9 cells. SF9 cells are then transfected using the BaculoGold Transfection kit (Pharmingen). Transfections can be performed according to the preparation instructions with the following modifications. Approximately 8 x 10 ⁸ Sf9 cells are transfected in a 100 mM dish with 4 µg BaculoGold DNA and 6 µg test DNA. After 6 days, cells are harvested and assayed for VLP production.

Poté jsou buňky odebrány smytím, následovaným centrifugací za nízkých otáček. Buňky jsou pak resuspendovány ve 300 ml lyzačního pufru (1 M NaCl, 0,2 M Tris pH 7,6) a homogenizovány 30 na ledu použitím Polytronu PT 1200 B s probou PT-DA 1205/2-A (Brinkman) ve zkumavce Falcon 1259. Vzorky jsou stočeny při 2500 rpm 3 minuty do peleta zbytků a zkumavky jsou promyty přídavkem 150 ml lyzačního pufru. Supernatanty jsou spojeny v 1,5 ml mikrozkumavce a jsou znovu stočeny 5 minut v mikrozkumavce Eppendorf (Brinkman). Spojené supernatanty mohou být uchovávány při 4 °C.Then the cells are harvested by washing followed by low speed centrifugation. The cells are then resuspended in 300 ml lysis buffer (1 M NaCl, 0.2 M Tris pH 7.6) and homogenized 30 on ice using Polytron PT 1200 B with PT-DA 1205/2-A Probe (Brinkman) in a Falcon tube. 1259. The samples are centrifuged at 2500 rpm for 3 minutes into the pellet residue and the tubes are washed by adding 150 ml lysis buffer. The supernatants are pooled in a 1.5 ml microtube and centrifuged for 5 minutes in an Eppendorf microtube (Brinkman). The combined supernatants can be stored at 4 ° C.

ELISA testy pak mohou být provedeny na izolovaných VLPs následovně. Přibližně 5 ml extraktu je zředěno na 50 ml 1% BSA vPBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok; 20 mM NaPO4, pH 7,0, 150 mM NaCl) a je umístěn na polystyrénovou desku. Deska je inkubována přes noc při 4 °C. Extrakty jsou odstraněny a deska je blokována 5% práškovým mlékem v PBS. Všechny další promývací kroky jsou provedeny s 1% BSA v PBS. Deska je inkubována při pokojové teplotě s primární protilátkou 1 hodinu (např. séra získaná od asymptomatických jedinců). Po odmytí nenavázané protilátky jsou desky inkubovány 1 hodinu se sekundární protilátkou. Sekundární protilátka, peroxidázou značená kozí protimyší IgG (g), může být koupena od Kirkegaard & Perry Laboratories, lne. a může být použita v ředění 10³ v 1% BSA v PBS. Po konečnémELISA assays can then be performed on isolated VLPs as follows. Approximately 5 ml of extract is diluted to 50 ml of 1% BSA in PBS (phosphate buffered saline; 20 mM NaPO4, pH 7.0, 150 mM NaCl) and placed on a polystyrene plate. The plate is incubated overnight at 4 ° C. The extracts are removed and the plate is blocked with 5% milk powder in PBS. All further wash steps are performed with 1% BSA in PBS. The plate is incubated at room temperature with the primary antibody for 1 hour (eg, sera obtained from asymptomatic individuals). After washing off unbound antibody, the plates are incubated for 1 hour with the secondary antibody. A secondary antibody, peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (g), can be purchased from Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. and can be used at 10 ³ dilution in 1% BSA in PBS. After the final

9 9 9 · 9 9>999 9 9 9 9> 99

9 9 9999 999 9 9900 99

99 9 9 9 · 99999 9 9 9 · 999

9999 ·· 99 99 99999 promytí je proveden alkalický fosfátový test a je změřena absorbance při 405 nm. Nejvíce úspěšná kapsidová činidla tohoto testu budou ty, které nebudou detekovány. To znamená, že vhodné mutantní kapsid VP 2 jsou ty, které ztratily epitopy, rozpoznávané protilátkami, přítomnými v sérech, a tak nejsou detekovány ELISou. Provedením těchto experimentů s několika skupinami sér, získanými od různých jedinců, a monoklonálními protilátkami, které neutralizují potlačení tvorby kolonií nebo buněčnou migraci, může odborník rychle identifikovat oblasti VP 2, které jsou imunogenické, a mutantní kapsid VP 2, které se nejlépe vyhnou imunitní odpovědi.9999 ·· 99 99 99999 wash, an alkaline phosphate test is performed and the absorbance at 405 nm is measured. The most successful capsid reagents of this assay will be those that will not be detected. Thus, suitable mutant VP 2 capsid are those that have lost epitopes recognized by antibodies present in the sera and thus are not detected by ELISA. By conducting these experiments with several groups of sera obtained from different individuals and monoclonal antibodies that neutralize suppression of colony formation or cell migration, one of skill can quickly identify regions of VP 2 that are immunogenic and mutant VP 2 capsid that best evade the immune response. .

Dále mutovantní kapsidy VP 2, které úspěšně nejsou detekovány metodou ELISA, popsanou výše, jsou analyzovány na schopnost potlačit buněčný růst a buněčnou migraci použitím charakterizačních testů kapsidového činidla. Stanovením schopnosti každé mutace kapsidy VP 2 potlačovat buněčný růst a buněčnou migraci a koordinací této informace s imunogenickými výsledky z ELISA analýz může být připraven „profil kapsidového činidla“. „Profil kapsidového činidla“ může obsahovat symbol nebo ikonu, která znázorňuje mutantní kapsidový protein nebo mutantní VLP, sekvenační informaci (např. lokalizaci mutací nebo modifikací), určení třídy kapsidového činidla (např. informaci, sledující vztah k jiným kapsidovým Činidlům), informace pro použití (např. indikace nemocí nebo léčebné informace nebo klinické nebo biotechnologické použití) a informace o účinnosti z charakterizačních testů kapsidového činidla (např. hodnoty, získané z testů tvorby kolonií, neutralizačních testů, fuzní/internalizační testy, vazebné testy, fosforylační testy, testy buněčné migrace, proliferační testy a výsledky, získané z imunogenických analýz, zahrnující ELISA testy).Furthermore, mutant VP 2 capsids that are not successfully detected by the ELISA method described above are analyzed for their ability to inhibit cell growth and cell migration using capsid reagent characterization assays. By determining the ability of each VP 2 capsid mutation to inhibit cell growth and cell migration and by coordinating this information with immunogenic results from ELISA assays, a "capsid reagent profile" can be prepared. A "capsid agent profile" may include a symbol or icon that depicts a mutant capsid protein or mutant VLP, sequencing information (eg, localization of mutations or modifications), determining the capsid agent class (eg, information relating to other capsid agents), information for use (eg disease indication or therapeutic information or clinical or biotechnological use) and efficacy information from capsid reagent characterization tests (eg values obtained from colony formation assays, neutralization assays, fusion / internalization assays, binding assays, phosphorylation assays, assays cell migration, proliferation assays and results obtained from immunogenic assays (including ELISA assays).

Profily kapsidových činidel mohou být zaznamenány na media, která mohou být zpracována počítačem, uložena v databázi, v hardwaru, softwaru nebo paměti, přístupné vyhledávacím přístrojům, a mohou být srovnány s jinými nebo spojeny se stavem nemoci nebo „profilem stavu nemoci“, který je informací, vztahující se k nemoci, podmínkám nebo známkám nemoci. Tyto profily kapsidového činidla a profily stavu nemocí mohou být použity výzkumníky pro návrh rozumného léku nebo biochemické analýzy nebo lékaři nebo klinickými lékaři, kteří si přejí najít vhodný lékařský prostředek, který udržuje v rovnováze optimální hladinu potlačení buněčného růstu a buněčné migrace s imunitní odpovědí pacienta ve vztahu k vhodnému trváni léčby.Capsule reagent profiles can be recorded on media that can be processed by a computer, stored in a database, in hardware, software, or memory accessible to search engines, and can be compared to others or associated with a disease state or "disease state profile" that is information relating to the disease, conditions or signs of the disease. These capsid agent profiles and disease state profiles can be used by researchers to design a sensible drug or biochemical analysis, or by doctors or clinicians wishing to find a suitable medical device that balances optimal levels of suppression of cell growth and cell migration with the patient's immune response. in relation to the appropriate duration of treatment.

V některých částech vynálezu jsou kapsidová činidla umístěna na podklad, takže tvoří multímerní kapsidová činidlo. Zatímco monomerní činidlo (to je činidlo, které obsahuje samostatnou molekulu, nesoucí tak pouze jednu vazebnou doménu) může úspěšně *· 99 99 9999In some parts of the invention, the capsid agents are placed on the substrate to form a multimeric capsid agent. While a monomeric agent (that is, an agent that contains a single molecule bearing so only one binding domain) can successfully * 99 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 999 999 9 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 99

9999 99 99 9999 dosáhnout vhodné odpovědi, multimerní činidlo (to je činidlo, které obsahuje několikanásobné molekuly, které tak mají více domén) často může vyvolat větší odpověď. Může být poznamenáno, že výraz „multimerní“ se vztahuje k přítomnosti více než jedné molekuly na podkladě, například několik jednotlivých molekul VP 2, připojených na podklad, čímž se odlišuje od výrazu „multimerizovaný“, které se vztahuje na činidlo, které má více než jednu molekulu spojené do jediné samostatné molekuly sloučeniny, která je připojena na podklad. Multimerní forma kapsidových činidel, zde popsaná, může být výhodná pro mnoho biotechnologických nebo klinických použití kvůli schopnosti získat Činidlo s vysokou afinitou k buňkám , které mají P antigen.9999 99 99 9999 To achieve a suitable response, a multimeric agent (that is, an agent that contains multiple molecules that thus have multiple domains) can often elicit a larger response. It may be noted that the term "multimeric" refers to the presence of more than one molecule on the support, for example several individual VP 2 molecules attached to the support, thus distinguishing it from the term "multimerized" which refers to an agent having more than one molecule linked to a single discrete molecule of the compound that is attached to the support. The multimeric form of the capsid agents described herein may be advantageous for many biotechnological or clinical uses due to the ability to obtain the Agent with high affinity for cells having a P antigen.

Multimerní kapsidové činidlo může být získáno spojením proteinu, například VP 2 nebo jeho fragmentu, na makromolekulární podklad. „Podkladem“ může být také označen nosič, pryskyřice nebo makromolekulární struktura, použitá k připojení nebo imobilizaci proteinu. Makromolekulární podklad může mít hydrofóbní povrch, který interaguje s oblastmi kapsidového činidla hydrofóbními nekovalentními interakcemi. Hydrofóbní povrch podkladu může být například polymer, jako je plastická hmota nebo jiný polymer, ve kterém hydrofóbní skupiny byly spojeny, jako je polystyren, polyethylen, PTFE nebo polyvinyl. Volitelně kapsidová činidla mohou být kovalentně navázány na nosiče, zahrnující proteiny a oligo/polysacharidy (např. celulózu, škrob, glykogen, chitosan nebo aminovanou sefarózu). V těchto následujících Částech reaktivní skupina kapsidového činidla, jako je hydroxy nebo amino, přítomná v peptidu, může být použita k připojení reaktivní skupiny na nosič, takže se vytvoří kovalentní vazba. Části také mohou obsahovat podklad s nabitým povrchem, který interaguje s kapsidovým činidlem. Další části se týkají podkladu, který má jiné reaktivní skupiny, které jsou chemicky aktivovány, takže váží kapsidové činidlo. Například může být použita bromkyanem aktivovaná matrice, epoxidem aktivovaná matrice, thio a thiopropyl gely, nitrofenyl chloromravečnanové a N-hydroxysukcinimid chloromravečnanové spojení nebo oxiranové akrylové podklady. (SIGMA).The multimeric capsid agent may be obtained by linking a protein, for example VP 2 or a fragment thereof, to a macromolecular support. A "support" can also be a carrier, resin or macromolecular structure used to attach or immobilize a protein. The macromolecular support may have a hydrophobic surface that interacts with the capsid agent regions by hydrophobic non-covalent interactions. For example, the hydrophobic surface of the support may be a polymer, such as a plastic or other polymer in which hydrophobic groups have been bonded, such as polystyrene, polyethylene, PTFE, or polyvinyl. Optionally, the capsid agents may be covalently attached to carriers, including proteins and oligo / polysaccharides (eg, cellulose, starch, glycogen, chitosan, or aminated sepharose). In these following sections, a reactive group of a capsid reagent, such as hydroxy or amino, present in the peptide can be used to attach the reactive group to the carrier so as to form a covalent bond. The portions may also comprise a charged surface support that interacts with the capsid agent. Other parts relate to a support having other reactive groups that are chemically activated to bind the capsid reagent. For example, a cyanogen-activated matrix, an epoxy-activated matrix, thio and thiopropyl gels, nitrophenyl chloroformate and N-hydroxysuccinimide chloroformate linkage or oxirane acrylic substrates may be used. (SIGMA).

Dále může podklad obsahovat anorganické nosiče, jako je oxidokřemičitý materiál (např. silikagel, zeolit, křemelina nebo aminované sklo), na které se kapsidové činidlo kovalentně naváže přes hydroxy, karboxy nebo aminoskupinu peptidu a reaktivní skupinu na nosiči. Ve vhodném kontextu se tak „podklad“ může vztahovat ke stěnám nebo jamkám reakční misky, zkumavkám, katétrům, stentům, balónkům, protetickým látkám, lékařským prostředkům, polystyrénovým korálkům, magnetickým korálkům, ·· ♦· ·· ·· ·· • · · * · · ···· ♦ · · · · ···· · • ·♦ ··♦· ·· ······ ·· «·· · « nitrocelulózovým proužkům, membránám, mikročásticím, jako jsou latexové částice, ovčím (nebo jiným zvířecím) červeným krvinkám, umělým buňkám Duracyte® a dalším. Anorganické nosiče, jako je oxidokřemičitý materiál (např. silikagel, zeolit, křemelina nebo aminované sklo), na které se kapsidové činidlo kovalentně naváže přes hydroxy, karboxy nebo aminoskupinu peptidů a reaktivní skupinu na nosiči, jsou také podstatou vynálezu. Nosiče pro použití v těle (např. pro profylaktické nebo léčebné použití) jsou přednostně fyziologické, netoxické a nevyvolávající imunitní reakci. Takové nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, poly-L-lysin, poly-D, L-alanin a Chromosorb® (Johns - Manville Products, Denver Co.).Further, the support may comprise inorganic carriers such as silica-based material (e.g., silica gel, zeolite, diatomaceous earth or aminated glass) to which the capsid agent is covalently bonded via the hydroxy, carboxy or amino group of the peptide and the reactive group on the carrier. Thus, in a suitable context, the " substrate " may refer to the walls or wells of the reaction dish, test tubes, catheters, stents, balloons, prosthetic agents, medical devices, polystyrene beads, magnetic beads, and the like. * Nitrocellulose strips, membranes, microparticles such as latex particles * nitrocellulose strips, membranes, microparticles such as latex particles , sheep (or other animal) red blood cells, Duracyte® artificial cells, and others. Inorganic carriers such as silica-based material (e.g., silica gel, zeolite, diatomaceous earth or aminated glass) to which the capsid agent is covalently bonded via the hydroxy, carboxy or amino group of the peptides and the reactive group on the carrier are also within the scope of the invention. Carriers for use in the body (eg, for prophylactic or therapeutic use) are preferably physiological, non-toxic and non-immune. Such carriers include, but are not limited to, poly-L-lysine, poly-D, L-alanine, and Chromosorb® (Johns - Manville Products, Denver Co.).

V jiných částech linkery, jako λ linkery nebo biotin - avidin (nebo streptavidin), vhodné délky jsou vloženy mezi kapsidové činidlo a podklad, což podporuje vyšší flexibilitu a tak se překoná sterická zábrana, která je představována podkladem. Určení vhodné délky linkeru, takže umožňuje optimální interakci, je provedeno screeningem kapsidových činidel, které mají různou délku linkeru, při charakterizačních testech kapsidového činidla, zde popsaných.In other parts, linkers such as λ linkers or biotin-avidin (or streptavidin) of appropriate length are interposed between the capsid agent and the substrate, which promotes greater flexibility and thus overcomes the steric hindrance represented by the substrate. Determination of the appropriate linker length so as to allow optimal interaction is accomplished by screening capsid agents having different linker lengths in the capsid agent characterization assays described herein.

V jiných částech multimerní podklady, probrané výše, mají připojené multimerizované kapsidové činidla, takže tvoří „multimerizovaný - multimerní podklad“. Zabudování multimerizovaného kapsidového činidla je uskutečněno vytvořením expresního konstruktu, který má dvě nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících například VP 2 nebo jeho fragmenty, spojených dohromady. Expresní fuzní protein je jedno ztělesnění multimerizovaného kapsidového činidla a je pak připojen na podklad. Podklad, který má mnoho takových multimerizovaných činidel, je nazýván multimerizovaný - multimerní podklad. Linkery nebo spacery mezi doménami, které tvoří multimerizované činidlo, a podklad mohou být zabudovány do některých částí a optimální umístění linkeru může být určeno použitím charakterizačních testů kapsidového činidla.In other parts, the multimeric substrates discussed above have attached multimerized capsid reagents to form a "multimerized - multimeric substrate". The incorporation of the multimerized capsid reagent is accomplished by providing an expression construct having two or more nucleotide sequences encoding, for example, VP 2 or fragments thereof linked together. The expression fusion protein is one embodiment of a multimerized capsid reagent and is then attached to the support. A support having many such multimerized agents is called a multimerized - multimeric support. Linkers or spacers between the domains that make up the multimerized agent and the substrate can be incorporated into some parts, and the optimal location of the linker can be determined using capsid agent characterization assays.

V některých částech jsou kapsidová činidla umístěny na protetické prostředky, které jsou implantovány pacientovi. S mnoha typy protetických látek, například stent a chlopní, je vhodné limitované vrůstání do tkáně, což stabilizuje implantát. Poškození okolní tkáně v průběhu implantace má ale za následek značné zvýšení buněčné proliferace, která může způsobit fibrotické zbytnění nebo restenózu a, po čase, zúžení stentu nebo repozici chlopně. Dřívější technické prostředky hledaly překonání tohoto problému v použití radioaktivity, ale léčebný úspěch a kapacita pro systemické vystavení radioaktivním látkám, které se uvolňují z prostředku, takto uskutečněných • « • · · ·In some parts, capsid agents are placed on prosthetic devices which are implanted in a patient. With many types of prosthetic agents, such as stents and valves, limited ingrowth into tissue is appropriate, which stabilizes the implant. However, damage to surrounding tissue during implantation results in a significant increase in cell proliferation, which may cause fibrotic overgrowth or restenosis and, over time, stent narrowing or valve reposition. Earlier technical devices sought to overcome this problem in the use of radioactivity, but the therapeutic success and capacity for systemic exposure to radioactive substances released from the device thus accomplished.

OQ · ·· «··· «OQ · ·· «···«

Z. O ···· ·· ·· _M přístupů byl nižší než vhodný. Podobně časté techniky, jako balónová angioplastika, mají za následek restenózu, způsobenou infiltrací endotelových buněk.Z. O ···· ·· ·· _M approaches were lower than appropriate. Similarly common techniques, such as balloon angioplasty, result in restenosis due to endothelial cell infiltration.

Navázáním kapsidových činidel na lékařské protetické látky, jako je stent nebo chlopně, nebo protlačením kapsidových činidel přes porézní katétry (např. balónové katétry, jak jsou použity v angioplastice) může být účinně potlačena endotelová buněčná migrace, proliferace, fibriotické zbytnění, zarůstání tkáně a restenóza. Dále zpomalení vrůstání tkáně může být dosaženo použitím kapsidových činidel, které jsou odstraněny imunitním systémem po zánětu, spojeného s lékařským postupem, který ho potlačí. Použitím postupů, popsaných výše, kapsidová činidla mohou být připojena k různým typům protetických látek, např. stentu nebo chlopní, přes hydrofóbní interakce nebo kovalentní vazby. Dále katétry v dřívější technice mohou být přizpůsobeny pro dodání kapsidových činidel do místa angioplastiky. Analýzou profilů kapsidových činidel může lékař vybrat vhodnou kapsidovým činidlem potaženou protetickou látku pro implantaci nebo vhodné kapsidové činidlo pro dodání, závislou na vhodném čase buněčného potlačení nebo zpomalení zarůstání tkáně. Lokalizované dodání kapsidových činidel jinými způsoby je také promyšleno. Tak například růst vaskulárních endotelových buněk může být potlačen implantací kontrolovaným uvolněním prostředku v okolí stentu, transplantované tkáně, chlopně nebo jiné protetické látky, nebo podáním léku do místa infúzní pumpou nebo jiným vhodným prostředkem Navíc k potažení lékařských prostředků a přípravků pro katétrové podání mohou být kapsidová činidla, zde popsaná, připravena jako léky a použita k léčbě nebo prevenci lidských nemocí nebo stavů, spojených s proliferací nebo migrací buněk, které mají P antigen Část, uvedená níže, rozebírá mnoho způsobů přípravy kapsidových činidel jako léků a určení vhodné dávky.By attaching capsid agents to medical prosthetic agents such as a stent or valve, or by pushing capsid agents through porous catheters (eg, balloon catheters, as used in angioplasty), endothelial cell migration, proliferation, fibriotic overgrowth, tissue ingrowth and restenosis can be effectively suppressed. . Further, retarding tissue ingrowth can be achieved by using capsid agents that are removed by the immune system following inflammation associated with a medical procedure to suppress it. Using the procedures described above, capsid agents can be attached to various types of prosthetic agents, eg, a stent or valve, via hydrophobic interactions or covalent bonds. Further, catheters in the prior art may be adapted to deliver capsid agents to the site of angioplasty. By analyzing capsid agent profiles, the physician may select a suitable capsid agent coated prosthetic for implantation or a suitable capsid agent for delivery, depending on the appropriate time of cell suppression or retardation of tissue ingrowth. Localized delivery of capsid agents by other means is also contemplated. For example, vascular endothelial cell growth may be inhibited by implantation by controlled release of the device around a stent, transplanted tissue, valve or other prosthetic agent, or by administering the drug to a site by an infusion pump or other suitable device. The agents described herein are formulated as medicaments and used to treat or prevent human diseases or conditions associated with the proliferation or migration of cells having a P antigen. The section below discusses many methods of preparing capsid agents as medicaments and determining the appropriate dosage.

Příklad 5 : Příprava a dávkování léčebných a profylaktických činidelExample 5: Preparation and dosing of therapeutic and prophylactic agents

Kapsidová činidla podle vynálezu (např. VP 1, VP 1 / 2 , VP 2 nebo jejich fragmenty) jsou vhodné pro léčbu pacientů jako preventivní opatření k vyhnutí se nemoci nebo stavu nebo jako lék k léčbě pacientů, postižených nemocí. Tyto farmakologicky aktivní látky mohou být zpracovány v souladu s obvyklými způsoby přírodní farmacie k přípravě lékařských činidel pro podávání pacientům, např. savcům, zahrnujících člověka. Aktivní přísady mohou být zahrnuty do léčebného výrobku s a bez modifikací. Dále léky nebo léčebné činidla, které dodávají farmakologicky aktivní sloučeniny podle vynálezu různými cestami, jsou aspekty vynálezu. Například bez omezení DNA, RNA a viriální vektory, které mají sekvence, kódující kapsidová činidla, jsou použityThe capsid agents of the invention (eg VP 1, VP 1/2, VP 2 or fragments thereof) are suitable for treating patients as a preventive measure to avoid a disease or condition, or as a medicament for treating patients affected by the disease. These pharmacologically active agents may be formulated in accordance with conventional methods of natural pharmacy to prepare medical agents for administration to patients, e.g., mammals, including humans. The active ingredients may be included in the medical product with and without modification. Further, the drugs or therapeutic agents that deliver the pharmacologically active compounds of the invention in various ways are aspects of the invention. For example, without limitation, DNA, RNA, and viral vectors having sequences encoding capsid agents are used

ΦΦ <♦ * · · Φ ΦΦ9ΦΦ <♦ * · · Φ9

9 9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 9 9 9 999

9 9 ♦ Φ · · · Φ 999 9 Φ Φ · · Φ 99

9 9 9 9 ·· Φ Φ · ·· φ Φ Φ · Φ 9 Φ 9 999 9 9 9 · 99 · 99 Φ 9 Φ 9 99

9999 99 99 99 99 Φ»Φ s podstatou vynálezu. Nukleové kyseliny, kódující kapsidová činidla, mohou být podávány samotné nebo ve spojení s ostatními aktivními přísadami.9999 99 99 99 99 Φ »Φ with the essence of the invention. Nucleic acids encoding capsid agents may be administered alone or in conjunction with other active ingredients.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny s přísadou obvyklého masťového základu, tj. farmaceuticky přijatelné organické a anorganické látky nosičů, vhodné pro parenterální, enterální (např. orální) nebo zevní použití, které nereagují škodlivě s farmakologicky aktivními přísadami podle vynálezu. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, vodu, solné roztoky, alkoholy, arabskou gumu, rostlinné oleje, benzylalkoholy, polyethylenglykoly, želatinu, uhlovodíky, jako je laktosa, amylosa nebo škrob, stearan hořečnatý, mastek, kyselina křemičitá, viskózní parafín, parfémovaný olej, monoglyceridy a diglyceridy mastných kyselin, pentaerythritestery mastných kyselin, hydroxymethylcelulóza, polyvinilpyrrolidon atd. Mnoho více vhodných pojiv je popsáno v Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company, pages 1405-1412 a 1461-1487(1975) a v The National Formulary XIV, 14th Edition, Washinton, Američan Pharmaceutical Association (1975), zde zahrnuté odkazem. Farmaceutické prostředky mohou být sterilizovány a, jestliže je to vhodné, smíchány s pomocnými Činidly, např. mazadly, konzervačními přísadami, stabilizátory, smáčedly, emulgátory, solemi pro ovlivnění osmotického tlaku, pufry, barvícími, chuťovými a/nebo aromatickými látkami a podobnými, které škodlivě nereagují s aktivními látkami.The compounds of the invention may be prepared with the addition of a conventional excipient, i.e., pharmaceutically acceptable organic and inorganic carrier materials, suitable for parenteral, enteral (e.g., oral) or topical use, which do not react harmfully with the pharmacologically active ingredients of the invention. Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, water, saline, alcohols, gum arabic, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols, gelatin, hydrocarbons such as lactose, amylose or starch, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, perfumed oil, fatty acid monoglycerides and diglycerides, fatty acid pentaerythritesters, hydroxymethylcellulose, polyvinilpyrrolidone, etc. Many more suitable binders are described in Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton: Mack Publishing Company, pages 1405-1412 and 1461-1487 (1975). and in The National Formulary XIV, 14th Edition, Washinton, American Pharmaceutical Association (1975), incorporated herein by reference. The pharmaceutical compositions may be sterilized and, if appropriate, admixed with adjuvants such as lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for affecting the osmotic pressure, buffers, coloring, flavoring and / or aromatic substances and the like which do not react harmfully with active substances.

Účinná dávka a způsob podávání jednotlivých léčebných složení se může lišit podle konkrétního pacienta a typu a fáze nemoci, stejně jako ostatních faktorů, známých odborníkům v oboru. Léčebná účinnost a toxicita takových látek může být určena standardními lékařskými postupy na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. ED50 (dávka léčebně účinná u 50 % populace). Makakové a paviáni jsou vhodné pokusné modely, jak bylo popsáno dříve. Data, získaná z testů na buněčných kulturách a studie na zvířatech, jsou použita při určení rozmezí dávky pro použití u lidí. Dávka takových látek leží přednostně v rozmezí rozsahu koncentrací, které zahrnují ED50 s žádnou toxicitou. Dávka se liší v tomto rozmezí v závislosti na typu kapsidového činidla, připravené podobě dávky, citlivosti pacienta a způsobu podání.The effective dose and mode of administration of the individual therapeutic compositions may vary according to the particular patient and the type and phase of the disease, as well as other factors known to those skilled in the art. The therapeutic efficacy and toxicity of such agents can be determined by standard medical procedures on cell cultures or experimental animals, eg, ED50 (dose therapeutically effective in 50% of the population). Macaques and baboons are suitable experimental models as described previously. Data obtained from cell culture assays and animal studies are used to determine the dosage range for use in humans. The dose of such agents preferably lies within a range of concentrations that include the ED50 with no toxicity. The dose varies within this range depending on the type of capsid agent, the dosage form prepared, the sensitivity of the patient and the route of administration.

Normální dávkové množství se může měnit od přibližně 1 do 100 000 pg, až do totální dávky přibližně 10 gramů, v závislosti na způsobu podání. Vhodné dávky zahrnují 250 pg, 500 pg, 1 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, • * · · »·· 9··The normal dosage amount may vary from about 1 to 100,000 pg, up to a total dose of about 10 grams, depending on the route of administration. Suitable doses include 250 µg, 500 µg, 1 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg , 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 9 mg

9 9 9 · t »Λ » ·9 9 9 · t »

900 mg, 1 g, 1,1 g, 1,2 g, 1,3 g, 1,4 g, 1,5 g, 1,6 g, 1,7 g, 1,8 g, 1,9 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g a 10 g. Dále koncentrace kapsidových činidel mohou být poměrně vysoké při zevním podávání činidel. Molární koncentrace kapsidových činidel mohou být použity v některých případech. Vhodné koncentrace pro zevní podání a/nebo pro potažení lékařských zařízení jsou v rozmezí od 100 μΜ do 800 mM. Přednostní koncentrace pro tyto případy jsou v rozmezí od 500 μΜ do 500 mM. Například upřednostňované koncentrace pro použití při zevních použití a/nebo potažení lékařských zařízení zahrnují 500 μΜ, 550 μΜ, 600 μΜ, 650 μΜ, 700 μΜ, 750 μΜ, 800 μΜ, 850 μΜ, 900 μΜ, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM a 500 mM.900 mg, 1 g, 1.1 g, 1.2 g, 1.3 g, 1.4 g, 1.5 g, 1.6 g, 1.7 g, 1.8 g, 1.9 g 2 g, 3 g, 4 g, 5, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g and 10 g. Furthermore, capsid agent concentrations may be relatively high when administered externally. Molar concentrations of capsid agents may be used in some cases. Suitable concentrations for external administration and / or for medical device coatings are in the range of 100 μΜ to 800 mM. Preferred concentrations for these cases range from 500 μΜ to 500 mM. For example, preferred concentrations for external use and / or medical device coating include 500 μΜ, 550 μΜ, 600 μΜ, 650 μΜ, 700 μΜ, 750 μΜ, 800 μΜ, 850 μΜ, 900 μΜ, 1 mM, 5 mM, 10 mM 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM and 500 mM.

V některých částech vynálezu dávka kapsidového činidla přednostně vyvolává tkáňovou nebo krevní koncentraci nebo obě od přibližně 0,1 μΜ do 500 mM. Vhodné dávky vyvolávají tkáňovou nebo krevní koncentraci nebo obě od přibližně 1 do 800 μΜ. Upřednostňované dávky vyvolávají tkáňovou nebo krevní koncentraci od vyšší než přibližně 10 μΜ do přibližně 500 μΜ. Upřednostňované dávky jsou například množství kapsidového činidla, potřebného k dosažení tkáňové nebo krevní koncentrace nebo obou, 10 μΜ,15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, 35 μΜ, 40 μΜ, 45 μΜ, 50 μΜ, 55 μΜ, μΜ, 65 μΜ, 70 μΜ, 75 μΜ, 80 μΜ, 85 μΜ, 90 μΜ, 95 μΜ, 100 μΜ, 110 μΜ,In some parts of the invention, the dose of the capsid agent preferably elicits a tissue or blood concentration, or both, of about 0.1 μΜ to 500 mM. Appropriate doses produce tissue or blood concentrations, or both from about 1 to 800 μΜ. Preferred doses produce tissue or blood concentrations of greater than about 10 μΜ to about 500 μΜ. Preferred doses are, for example, the amount of capsid reagent required to achieve tissue or blood concentrations, or both, 10 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, 35 μΜ, 40 μΜ, 45 μΜ, 50 μΜ, 55 μΜ, μΜ, 65 μΜ, 70 μΜ, 75 μΜ, 80 μΜ, 85 μΜ, 90 μΜ, 95 μΜ, 100 μΜ, 110 μΜ,

120 μΜ, 130 μΜ, 140 μΜ, 145 μΜ, 150 μΜ, 160 μΜ, 170 μΜ, 180 μΜ, 190 μΜ,120 μΜ, 130 μΜ, 140 μΜ, 145 μΜ, 150 μΜ, 160 μΜ, 170 μΜ, 180 μΜ, 190 μΜ,

200 μΜ, 220 μΜ, 240 μΜ, 250 μΜ, 260 μΜ, 280 μΜ, 300 μΜ, 320 μΜ, 340 μΜ,200 μΜ, 220 μΜ, 240 μΜ, 250 μΜ, 260 μΜ, 280 μΜ, 300 μΜ, 320 μΜ, 340 μΜ,

360 μΜ, 380 μΜ, 400 μΜ, 420 μΜ, 440 μΜ, 460 μΜ, 480 μΜ a 500 μΜ. Ačkoliv dávky, které vyvolávají tkáňovou koncentraci vyšší než 800 μΜ nejsou upřednostňovány, mohou být použity podle některých částí vynálezu. Také může být zajištěna stálá infúze kapsidového činidla tak, že se udržuje stálá koncentrace v tkáních, jak je měřeno krevními hladinami.360 μΜ, 380 μΜ, 400 μΜ, 420 μΜ, 440 μΜ, 460 μΜ, 480 μΜ and 500 μΜ. Although doses that produce tissue concentrations greater than 800 μΜ are not preferred, they may be used according to some parts of the invention. Also, a steady-state infusion of the capsid agent can be ensured by maintaining a constant concentration in the tissues as measured by blood levels.

Přesná dávka je vybrána konkrétním lékařem podle pacienta, který má být léčen. Dávka a podání jsou přizpůsobeny zajištění dostatečných hladin aktivních podílů nebo k udržení žádoucího účinku. Dodatečné činitele, které mohou být zahrnuty do zprávy, zahrnují sílu nemoci, stav pacienta, věk a váhu pacienta; stravu, čas a frekvenci podávání, lékovou kombinaci(e), reakční citlivosti a toleranci/odpověď na léčbu. Krátce působící lékařské prostředky jsou podávány denně, zatímco dlouho působící lékařskéThe exact dose is selected by the particular physician according to the patient to be treated. Dosage and administration are adjusted to provide sufficient levels of active ingredients or to maintain the desired effect. Additional factors that may be included in the report include the strength of the disease, the patient's condition, the age and weight of the patient; diet, time and frequency of administration, drug combination (s), reaction sensitivity, and tolerance / response to treatment. Short acting medical devices are administered daily, while long acting medical devices

9 ♦ 9 ♦ « · «· • · • · » · »· • • • • 9 9 9 9 9 9 • • • « • « • 9 • 9 ··< ·· < • • 9 9 • • • · • · • * • * • · • · 9 9 9 9 ·♦·· · ♦ ·· • 9 • 9 * · * · 9 · 9 · 99 99 9 · 9 ·

prostředky jsou podávány každý 2, 3 až 4 den každý týden nebo jednou každé dva týdny. V závislosti na poločase a odstraňovači rychlosti jednotlivých složení jsou lékařské prostředky podle vynálezu podávány jednou, dvakrát, třikrát, čtyřikrát, pětkrát, šestkrát, sedmkrát, osmkrát, devětkrát, desetkrát nebo vícekrát za den.the compositions are administered every 2, 3 to 4 days every week or once every two weeks. Depending on the half-life and removal rate of the individual compositions, the medical compositions of the invention are administered once, twice, three times, four times, five times, six times, seven times, eight times, nine times, ten times or more per day.

Způsoby podání léků podle vynálezu zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, kůží, parenterálně, gastrointestinálně, transbronchiálně a transalveolárně. Podávání kůží je provedeno aplikací krému, oplachu, gelu atp., schopného dovolit léčebně aktivní látce proniknout kůží. Parenterální cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, elektrickou nebo přímou injekci, jako je přímá injekce do centrální cévní řečiště, nitrožilně, nitrosvalově, nitropobřišnicově, do kůže nebo podkožní injekcí. Gastrointestinální cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, příjem v potravě a rektálně. Transbronchiální a transalveolární cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, inhalaci, buď ústy nebo nosem.Routes of administration of the drugs of the invention include, but are not limited to, skin, parenteral, gastrointestinal, transbronchial and transalveolar. Administration of the skin is accomplished by application of a cream, rinse, gel, etc., capable of allowing the therapeutically active substance to penetrate the skin. Parenteral routes of administration include, but are not limited to, electrical or direct injection, such as direct injection into the central vasculature, intravenously, intramuscularly, intra-abdominal, skin, or subcutaneous injection. Gastrointestinal routes of administration include, but are not limited to, dietary and rectal intake. Transbronchial and transalveolar routes of administration include, but are not limited to, inhalation, either by mouth or nose.

Prostředky, které mají léčebně aktivní látky podle vynálezu, které jsou vhodné pro podávání kůží, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, lékově přijatelné suspenze, oleje, krémy a masti, používané přímo na kůži nebo zabudovaných do ochranného nosiče jako transdermální prostředek („transdermální náplast“). Příklady vhodných krémů, mastí atd. mohou být nalezeny například v Československém lékopise („Physician's Desk Reference“). Příklady Vhodných prostředků pro podávání kůží jsou popsány například v patentu US č. 4 818 540, publikovaného 4. dubna 1989 Chienem et al., zde zahrnutého odkazem.Compositions having therapeutically active agents of the invention that are suitable for administration to the skin include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable suspensions, oils, creams and ointments, used directly on the skin or incorporated into a protective carrier as a transdermal device ("transdermal patch"). Examples of suitable creams, ointments, etc. can be found, for example, in the "Physician's Desk Reference". Examples of suitable skin delivery compositions are described, for example, in U.S. Patent No. 4,818,540, published April 4, 1989 by Chien et al., Incorporated herein by reference.

Prostředky, které mají léčebně aktivní látky podle vynálezu, které jsou vhodné pro parenterální podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, lékařsky vhodné sterilní isotonické roztoky. Takové roztoky zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, fyziologický roztok a fosfátem pufrovaný fyziologický roztok pro injekční podávání do centrálního cévního řečiště, nitrožilně, nitrosvalově, nitropobřišnicově, do kůže nebo podkožní injekcí.Compositions having therapeutically active agents of the invention that are suitable for parenteral administration include, but are not limited to, medically acceptable sterile isotonic solutions. Such solutions include, but are not limited to, saline and phosphate buffered saline for injection into the central vascular bed, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, into the skin, or by subcutaneous injection.

Prostředky, které mají léčebně aktivní látky podle vynálezu, které jsou vhodné pro transbronchiální a transalveplární podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, různé typy aerosolů pro inhalace. Prostředky, vhodné pro transbronchiální a transalveolární podání jsou také částmi vynálezu. Takové prostředky zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, rozprašovače a odpařovače. Mnoho typů běžně dostupných rozprašovačů a odpařovačů může být snadno přizpůsobeno pro dodání prostředků, které mají léčebně aktivní látky podle vynálezu.Compositions having therapeutically active agents of the invention that are suitable for transbronchial and transalveplar administration include, but are not limited to, various types of aerosols for inhalation. Compositions suitable for transbronchial and transalveolar administration are also part of the invention. Such compositions include, but are not limited to, nebulizers and vaporizers. Many types of commercially available nebulizers and vaporizers can be readily adapted to deliver compositions having the therapeutically active agents of the invention.

·· «· • · · • · ··· • · · ···· ·« · · · • 9 ·· •· · •· •· •· ·· ·· 9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 · · · 9 9 9 9 9 9

Prostředky, které mají léčebně aktivní látky podle vynálezu, které jsou vhodné pro gastrointestinální podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, lékařsky přijatelné prášky, tabletky nebo tekutiny pro užívání léku a čípky pro rektální podání. Díky snadnosti použití gastrointestinální podání, zvláště orální, je upřednostňovanou podstatou vynálezu. Jakmile lék, obsahující kapsidové činidlo, byl získán, může být podáván pacientovi s potřebou léčby nebo prevence nemocí nebo stavů, spojených s proliferací nebo migrací buněk, které mají P antigen.Compositions having therapeutically active agents of the invention that are suitable for gastrointestinal administration include, but are not limited to, medically acceptable powders, tablets or liquids for drug use and suppositories for rectal administration. Because of its ease of use, gastrointestinal administration, particularly oral administration, is a preferred aspect of the invention. Once the capsid agent-containing drug has been obtained, it can be administered to a patient in need of treatment or prevention of diseases or conditions associated with the proliferation or migration of cells having a P antigen.

Aspekty vynálezu také zahrnují povlak lékařského zařízení, jako jsou protetické látky, implantáty a nástroje. Povlaky, vhodné pro použití v lékařských zařízeních, mohou být získány gelem nebo práškem, obsahujícím kapsídová činidla, nebo polymerní povlak, ve kterém jsou kapsidová činidla suspendována. Vhodné polymerní materiály pro povlaky nebo prostředky jsou ty, které jsou fyziologicky přijatelné a skrz které léčebně účinné množství kapsidového činidla může pronikat. Vhodné polymery zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, polyuretan, polymethakrylát, polyamid, polyester, polyethylen, polypropylen, polystyren, polytetrafluoroethylen, polyvinylchlorid, acetylcelulózu, silikonové elastomery, kolagen, hedvábí atd. Takové povlaky jsou popsány například v patentu US č. 4 612 337, zveřejněného 16. září 1986 Foxem et al., který je zde uveden odkazem v plném znění. V části níže vynálezci zveřejňují různé způsoby k léčbě nemocí nebo stavů, spojených s proliferací nebo migrací buněk, které mají P antigen, které zahrnují zajištění léku, který má kapsidové činidlo.Aspects of the invention also include the coating of medical devices such as prosthetic agents, implants and instruments. Coatings suitable for use in medical devices may be obtained with a gel or powder containing the capsid agents, or a polymeric coating in which the capsid agents are suspended. Suitable polymeric materials for coatings or compositions are those that are physiologically acceptable and through which a therapeutically effective amount of the capsid agent can permeate. Suitable polymers include, but are not limited to, polyurethane, polymethacrylate, polyamide, polyester, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, acetylcellulose, silicone elastomers, collagen, silk, etc. Such coatings are described, for example, in U.S. Patent 4,612 337, published September 16, 1986 by Fox et al., Incorporated herein by reference in its entirety. In the section below, the inventors disclose various methods for treating diseases or conditions associated with the proliferation or migration of cells having a β antigen, comprising providing a medicament having a capsid agent.

Příklad 6 : Léčebné a profylaktické přístupyExample 6: Therapeutic and prophylactic approaches

V některých aspektech vynálezu kapsidová činidla, zejména léky, které mají kapsidová činidla, jsou poskytnuta pacientovy s potřebou léčby nebo prevence nemocí nebo stavů, spojených s abnormální buněčnou proliferací a/nebo buněčnou migrací. Způsoby přípravy léků pro potlačení růstu nebo migrace buněk, které mají P antigen, které zahrnují, ale nejsou na ně mezeny, krvetvorné buňky a endotelové buňky, jsou částmi vynálezu. To znamená, že části vynálezu zahrnují použití léků, které obsahují kapsidové činidlo pro potlačení růstu a/nebo migrace buněk, které mají P antigen, jako jsou krvetvorné buňky a endotelové buňky.In some aspects of the invention, capsid agents, particularly drugs having capsid agents, are provided to a patient in need of treatment or prevention of diseases or conditions associated with abnormal cell proliferation and / or cell migration. Methods for preparing drugs for inhibiting the growth or migration of cells having a P antigen, including, but not limited to, hematopoietic cells and endothelial cells, are part of the invention. That is, portions of the invention include the use of medicaments that comprise a capsid agent to inhibit the growth and / or migration of cells having a P antigen, such as hematopoietic cells and endothelial cells.

V jedné části kapsidová činidla mohou být použita k potlačení krvetvorby u pacientů - příjemců před in utero transplantaci kmenových buněk. V dřívější studii tkáňové distribuce kmenových buněk v lidském zárodku bylo odhadnuto, že plodová transplantace s 5 x 10⁷ buněk v druhém čtvrtletí by mohla vyvolat poměr přibližně 1 :In one part, the capsid agents can be used to suppress hematopoiesis in recipient patients prior to utero stem cell transplantation. In an earlier study of human stem cell tissue distribution, it was estimated that fetal transplantation with 5 x 10 ⁷ cells in the second quarter could produce a ratio of approximately 1:

• · ·· · · » · ·· «··· ··· ··· : 1000 až 1 : 10000. Takový nízký poměr neumožňoval zajistit transplantované buňky s kompetitivními kraji díky přirozeným kmenovým buňkám. (Westgren et al., Am J Obstet Gynecol, 176 : 49 (1996)). Ke zlepšení tohoto poměru a úspěšnosti transplantace kmenových buněk mohou být kapsidová činidla podávána před transplantací takže potlačují populaci přirozených kmenových buněk a tím zlepšují transplantaci. Dále léčba dárcovských kmenových buněk anti - P monoklonálními protilátkami před transplantací je může chránit před potlačením kapsidovými činidly a tím zajistit ještě lepší postavení. Tak jedna část zahrnuje lék, obsahující kapsidové činidlo pro léčbu pacienta před transplantací kmenových buněk. Tento způsob léčby může být proveden určením pacienta s potřebou in utero transplantace kmenových buněk a zajištěním léčebně užitečného množství kapsidového činidla, které potlačuje růst krvetvorných buněk.1000 to 1: 10000. Such a low ratio did not make it possible to provide transplanted cells with competitive regions due to natural stem cells. (Westgren et al., Am J. Obstet Gynecol, 176: 49 (1996)). To improve this ratio and the success of stem cell transplantation, capsid agents can be administered prior to transplantation so as to suppress the population of natural stem cells and thereby improve transplantation. Furthermore, treatment of donor stem cells with anti-β monoclonal antibodies prior to transplantation can protect them from suppression by capsid agents, thus providing an even better position. Thus, one portion comprises a medicament comprising a capsid agent for treating a patient prior to stem cell transplantation. This method of treatment can be accomplished by identifying a patient in need of an utero stem cell transplant and providing a therapeutically useful amount of a capsid agent that suppresses the growth of hematopoietic cells.

Podstata vynálezu je v podobném aspektu, způsobu nemyeloablativní úpravy stavu před transplantací kmenových buněk, vzniklých po narození. Nedávno se věnovala velká pozornost způsobům nemyeloablativních úprav stavů, protože takové postupy jsou pro pacienty méně toxické než standardní přístup, který zahrnuje velké dávky chemoradioterapie. (Giralt et al., Blood, 89:4531 (1997); Slavín et al., Blood, 91:756 (1998)). Nicméně dárcovství celého krvetvorného aparátu použitím stávajících technik v nemyeloablativní léčbě nebylo velmi úspěšné. Zajištěním kapsidových činidel před transplantací kmenových buněk, vzniklých po narození, může být poměr buněk dárce k buňkám příjemce příznivě vychýlen a krvetvorný systém dárce se může prosadit bez radiace. Proto způsob nemyeloablativní úpravy stavu může být proveden určením pacienta s potřebou nemyeloablativní úpravy stavu před transplantací kmenových buněk, vzniklých po narození, a podáním uvedenému pacientovi léčebně užitečné množství kapsidového činidla.SUMMARY OF THE INVENTION In a similar aspect, a method of non-myeloablative treatment of a pre-transplant state of a stem cell resulting from birth. Recently, great attention has been paid to methods of non-myeloablative treatment of conditions, as such procedures are less toxic to patients than the standard approach involving large doses of chemoradiotherapy. (Giralt et al., Blood, 89: 4531 (1997); Slavin et al., Blood, 91: 756 (1998)). However, donation of the whole hematopoietic apparatus using existing techniques in non-myeloablative therapy has not been very successful. By providing capsid agents before transplantation of the stem cells generated after birth, the ratio of donor cells to recipient cells can be favorably deflected and the donor hematopoietic system can assert without radiation. Therefore, the method of non-myeloablative condition correction can be accomplished by identifying a patient in need of non-myeloablative condition correction prior to the transplantation of stem cells arising after birth and administering to said patient a therapeutically useful amount of a capsid agent.

Ještě jiný aspekt vynálezu se týká způsobu léčby pacienta, trpícího hematologickými proliferačními poruchami, např. pravou polycytemií. Pravá polycytemie (PCV) je hematologická nemoc, způsobená nekontrolovatelnou proliferací červených krvinek v kostním morku. Buněk jiných linií (leukocytů a trombocytů) se týká také, ty ale nezpůsobují komplikace podobné závažnosti. Nemoc byla pozorována u jedinců ve středním věku a starších (průměrný věk při rozpoznání nemoci je 60 let) a výskyt ve Švédsku je 1,5 případu na 100 000 obyvatel. Do této chvíle není specifická farmakologické léčba a současné přístupy k problému hledají usnadnění příznaků ve ···· ··· ··· ·· · · ···· · · zpomalení postupu nemoci. Střední doba přežití bez léčby je krátká. U mladších jedinců s optimální léčbou může být prodloužen přiměřeně kvalitní život o více jak 20 let.Yet another aspect of the invention relates to a method of treating a patient suffering from haematological proliferative disorders, eg, true polycythemia. True polycythemia (PCV) is a hematological disease caused by the uncontrolled proliferation of red blood cells in the bone marrow. Other cell lines (leukocytes and platelets) are also affected, but they do not cause complications of similar severity. The disease was observed in middle-aged and older individuals (average age at disease recognition is 60 years) and the incidence in Sweden is 1.5 cases per 100,000 population. Until now, there is no specific pharmacological treatment, and current approaches to the problem seek to ease the symptoms in slowing the progression of the disease. The median survival without treatment is short. In younger individuals with optimal treatment, a reasonable quality of life can be extended by more than 20 years.

Podáváním kapsidových činidel pacientům, trpících PCV, může být potlačena proliferace krvetvorných buněk a může být zajištěna účinná léčba této smrtelné nemoci. Dále způsob PCV může být proveden určením pacienta s potřebou léčby PCV a podáváním uvedenému pacientovi léčebně užitečné množství kapsidového činidla. Protože je dlouhodobý léčebný postup předvídán, jsou přednostně použita ty kapsidová činidla, které vyvolávají nejmenší imunitní odpověď.By administering capsid agents to patients suffering from PCV, the proliferation of hematopoietic cells can be suppressed and effective treatment of this fatal disease can be ensured. Further, the PCV method may be performed by identifying a patient in need of PCV treatment and administering to said patient a therapeutically useful amount of a capsid agent. As long-term treatment is predicted, capsid agents that elicit the least immune response are preferably used.

Ještě jiný aspekt vynálezu se týká způsobu léčby pacienta potlačením růstu endotelových buněk. Jak je popsáno výše nevhodný růst endotelových buněk může nastat u uvedeného pacienta jako pooperační trauma, např. po implantaci chlopně, stentu nebo jiných protetických nebo angioplastických prostředcích. Dále nádorový vývoj a metastáze vyžadují růst endotelových buněk a buněčnou migraci. Tak části vynálezu, týkající se léků, které potlačují rakovinu, přesněji angiogenezi a v případech buněčné migrace, spojené s metastázemi.Yet another aspect of the invention relates to a method of treating a patient by suppressing endothelial cell growth. As described above, inappropriate growth of endothelial cells may occur in said patient as a postoperative trauma, e.g. after implantation of a valve, stent or other prosthetic or angioplastic means. Furthermore, tumor development and metastasis require endothelial cell growth and cell migration. Thus, parts of the invention relating to drugs that suppress cancer, more specifically angiogenesis, and in cases of cell migration associated with metastasis.

Angiogeneze se týká vytvoření nových kapilárních krevních cév procesem pučení z preexistujících cév. Angiogeneze nastává v průběhu vývoje, stejně jako při množství fyziologických a patologických situacích, a je nezbytný pro tkáňový růst, hojení ran, ženskou reprodukční funkci a je součástí patologických procesů, jako je vytvoření hemangiomu a oční vaskularizace. Nicméně velká část dlouhotrvajícího zájmu o angiogenezi je z důvodu objevu, že pevné nádory se musí podrobit angiogenezi, aby rostly za kritickou mez. To znamená, že nádory musí získávat endotelové buňky z okolní podpůrné vazivové tkáně k vytvoření jejich vlastního endogenního mikrooběhu.Angiogenesis refers to the formation of new capillary blood vessels by the process of sprouting from pre-existing vessels. Angiogenesis occurs during development, as well as in a number of physiological and pathological situations, and is essential for tissue growth, wound healing, female reproductive function and is part of pathological processes such as hemangioma formation and ocular vascularization. However, much of the long-standing interest in angiogenesis is due to the discovery that solid tumors must undergo angiogenesis to grow beyond the critical limit. That is, tumors must acquire endothelial cells from surrounding supporting connective tissue to create their own endogenous microcirculation.

Podáváním kapsidových činidel pacientům, trpících rakovinou, může být potlačena proliferace a migrace endotelových buněk a tak se může předcházet vzniku nádoru a metastázám. Proto způsob potlačení angiogeneze, vzniku nádoru nebo rakoviny může být proveden určením pacienta s potřebou potlačení angiogeneze, vzniku nádoru nebo rakoviny a podáváním uvedenému pacientovy léčebně užitečné množství kapsidového Činidla. Protože je předvídán dlouhodobý léčebný postup, jsou přednostně použity ty kapsidová činidla, které vyvolávají nejmenší imunitní odpověď.By administering capsid agents to cancer patients, endothelial cell proliferation and migration can be suppressed, thereby preventing tumor formation and metastasis. Therefore, a method of suppressing angiogenesis, tumor formation or cancer can be accomplished by identifying a patient in need of suppressing angiogenesis, tumor formation or cancer and administering to said patient a therapeutically useful amount of a capsid agent. Since a long-term therapeutic approach is foreseen, those capsid agents that elicit the least immune response are preferably used.

Dodatečné části vynálezu zahrnují kity, obsahující kapsidová činidla, a napsané instrukce pro dávkování a podávání pacientovi pro potlačení růstu krvetvorných progenitorových buněk, instrukce pro dávkování a podávání pro potlačení růstu ···· ·· ·· ·· ·· · krvetvorných progenitorových buněk pacientovi před transplantací kmenových buněk uvedenému pacientovi, jako je plod, instrukce pro dávkování a podávání pacientovi pro potlačení růstu endotelových buněk a/nebo instrukce pro dávkování a podávání pacientovi trpícímu hematologickými proliferačními poruchami u P antigen pozitivních buněk, např. pravou polycytemií.Additional portions of the invention include kits comprising capsid agents and written instructions for dosing and administering to a patient to suppress the growth of hematopoietic progenitor cells, dosing and administration instructions for inhibiting the growth of hematopoietic progenitor cells to the patient. prior to stem cell transplantation to said patient, such as a fetus, dosing and administration instructions to the patient for suppressing endothelial cell growth and / or dosing and administration instructions to a patient suffering from haematological proliferative disorders in P antigen positive cells, e.g., true polycythemia.

Ačkoliv vynález byl popsán s odkazem na části a příklady, může být rozuměno, že různé změny mohou být provedeny bez odchýlení se od duchu vynálezu. Dále je vynález omezen pouze následujícími nároky. Všechny odkazy zde uvedené jsou tím výslovně zahrnuty odkazem.Although the invention has been described with reference to parts and examples, it can be understood that various changes may be made without departing from the spirit of the invention. Further, the invention is limited only by the following claims. All references herein are hereby expressly incorporated by reference.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

1. Použití prázdných, neinfekčních, rekombinantních kapsid parvoviru B 19, kapsidových proteinů parvoviru B 19 nebo fragmentů kapsidových proteinů parvoviru B 19 pro přípravu léku pro potlačení růstu nebo migrace buněk, které mají P antigen.Use of empty, non-infectious, recombinant parvovirus B 19 capsids, parvovirus B 19 capsid proteins or parvovirus B 19 capsid protein fragments for the preparation of a medicament for inhibiting the growth or migration of cells having P antigen.

2. Použití podle nároku 1, kde lék je lék pro potlačení růstu krvetvorných buněk, růstu endotelových buněk nebo migrace endotelových buněk.Use according to claim 1, wherein the medicament is a medicament for inhibiting the growth of hematopoietic cells, endothelial cell growth or endothelial cell migration.

3. Použití podle nároku 1, kde lék je lék pro léčbu hemalogických proliferativních poruch, angiogeneze, vzniku a vývoje nádoru nebo růstu endotelových buněk v implantovaném protetickém prostředku.Use according to claim 1, wherein the medicament is a medicament for the treatment of hemalogic proliferative disorders, angiogenesis, tumor formation and development or endothelial cell growth in an implanted prosthetic device.

4. Použití podle nároku 1, kde lék je lék pro léčbu pacienta před transplantací kmenových buněk.The use of claim 1, wherein the medicament is a medicament for treating a patient prior to stem cell transplantation.

5. Použití podle nároku 4, kde pacient je plod.Use according to claim 4, wherein the patient is a fetus.

6. Způsob potlačení růstu nebo migrace buňky, která má P antigen, vyznačující se tím, že obsahuje kroky kontaktu buňky s kapsidovým činidlem, vybraného ze skupiny, která se skládá z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu parvoviru B 19 a fragmentu kapsidového proteinu parvoviru B 19, a změření potlačení buněčného růstu nebo buněčné migrace.6. A method of suppressing the growth or migration of a cell having a P antigen comprising the steps of contacting a cell with a capsid agent selected from the group consisting of a parvovirus B19 capsid, a parvovirus B19 capsid protein and a parvovirus capsid protein fragment. B 19, and measuring suppression of cell growth or cell migration.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že buňka je buňkou krvetvorného původu nebo endotelová buňka.The method of claim 6, wherein the cell is a hematopoietic cell or an endothelial cell.

8. Způsob léčby pacienta před transplantací kmenových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje kroky určení pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje růst krvetvorných buněk a zajišťuje uvedenému pacientovi s potřebou účinné množství kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu parvoviru B 19 a fragmentu kapsidového proteinu parvoviru B 19.8. A method of treating a patient prior to stem cell transplantation comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that inhibits the growth of hematopoietic cells and providing to said patient in need of an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of parvovirus capsid B 19, the parvovirus B 19 capsid protein, and the parvovirus B 19 capsid protein fragment.

• · · · · · · ···· • · · · · ··· ·· · ·· · · · · · ··· · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

37 ···· ·· ·· · ·· ···37 ··················

9. Způsob léčby pacienta s krvetvornou proliferační poruchou, vyznačující se tím, že obsahuje kroky určení pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje krvetvornou proliferační poruchu a zajišťuje uvedenému pacientovi s potřebou účinné množství kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu parvoviru B 19 a fragmentu kapsidového proteinu parvoviru B 19.9. A method of treating a patient with a hematopoietic proliferative disorder comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses a hematopoietic proliferative disorder and providing to said patient in need of an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of parvovirus capsid B 19, the parvovirus B 19 capsid protein, and the parvovirus B 19 capsid protein fragment.

10. Způsob potlačení tkáňového vrůstání do implantovaného protetického prostředku, vyznačující se tím, že obsahuje kroky určení pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje tkáňové vrůstání do implantovaného protetického prostředku a zajišťuje uvedenému pacientovi s potřebou účinné množství kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu parvoviru B 19 a fragmentu kapsidového proteinu parvoviru B 19.10. A method of suppressing tissue ingrowth into an implanted prosthetic device, comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses tissue ingrowth into an implanted prosthetic device and provides to said patient in need of an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of: it consists of a parvovirus B19 capsid, a parvovirus B19 capsid protein and a parvovirus B19 capsid protein fragment.

11. Způsob léčby nebo prevence vzniku a vývoje nádoru, vyznačující se tím, že obsahuje kroky určení pacienta s potřebou kapsidového činidla, které potlačuje růst krvetvorných buněk a zajišťuje uvedenému pacientovi s potřebou účinné množství kapsidového činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z kapsidy parvoviru B 19, kapsidového proteinu parvoviru B 19 a fragmentu kapsidového proteinu parvoviru B 19.11. A method of treating or preventing the development and development of a tumor, comprising the steps of identifying a patient in need of a capsid agent that suppresses the growth of hematopoietic cells and providing said patient in need of an effective amount of a capsid agent selected from the group consisting of capsid parvovirus B 19, the parvovirus B 19 capsid protein, and the parvovirus B 19 capsid protein fragment.

12. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje lék, jak je popsán v nároku 1, pro potlačení růstu nebo migrace buněk, které mají P antigen.A kit comprising a medicament as described in claim 1 for suppressing the growth or migration of cells having a P antigen.

13. Lékařský prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kapsidy parvoviru B 19, kapsidové proteiny parvoviru B 19 nebo fragmenty kapsidových proteinů parvoviru B 19.13. A medical device comprising parvovirus B19 capsids, parvovirus B19 capsid proteins or parvovirus B19 capsid protein fragments.

14. Použití kapsid parvoviru B 19, kapsidových proteinů parvoviru B 19 nebo fragmentů kapsidových proteinů parvoviru B 19 pro přípravu lékařského prostředku pro léčbu pacienta s potřebou kapsidového činidla, který potlačuje růst krvetvorných buněk, před transplantací kmenových buněk.Use of parvovirus B 19 capsids, parvovirus B 19 capsid proteins or parvovirus B 19 capsid protein fragments for the preparation of a medicament for treating a patient in need of a capsid agent that inhibits hematopoietic cell growth prior to stem cell transplantation.

15. Použití kapsid parvoviru B 19, kapsidových proteinů parvoviru B 19 nebo fragmentů kapsidových proteinů parvoviru B 19 pro přípravu lékařského prostředku pro léčbu krvetvorné proliferační poruchy.Use of parvovirus B 19 capsids, parvovirus B 19 capsid proteins or parvovirus B 19 capsid protein fragments for the preparation of a medicament for the treatment of a hematopoietic proliferative disorder.

16. Použití kapsid parvoviru B 19, kapsidových proteinů parvoviru B 19 nebo fragmentů kapsidových proteinů parvoviru B 19 pro přípravu lékařského prostředku pro potlačení tkáňového vrůstání do implantovaných protetických prostředků.Use of parvovirus B 19 capsids, parvovirus B 19 capsid proteins or parvovirus B 19 capsid protein fragments for the preparation of a medical device for suppressing tissue ingrowth into implanted prosthetic devices.

17. Použití kapsid parvoviru B 19, kapsidových proteinů parvoviru B 19 nebo fragmentů kapsidových proteinů parvoviru B 19 pro přípravu lékařského prostředku pro léčbu nebo prevenci vzniku a vývoje nádoru.Use of parvovirus B 19 capsids, parvovirus B 19 capsid proteins or parvovirus B 19 capsid protein fragments for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of tumor development and development.