JP2010540449A - 脈管形成の阻害 - Google Patents
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Abstract
Description
Bv8およびEG-VEGFは2つの非常に関連した分泌タンパク質であり、プロキネチシン-1および-2と称され、構造的に、コリパーゼホールドと称される5つのジスルフィド架橋モチーフによって定められるペプチドの大きなクラスに属する(DeCouter, J. et al., Nature 420, 860-867 (2002);LeCouter, J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 2685-2690 (2003);Li, M. et al., Mol Pharmacol 59, 692-698 (2001))。Bv8は初めに、カエルボンビナ・バリーゲートの皮膚から分泌されたタンパク質として同定された(Mollay, C. et al., Eur J Pharmacol 374, 189-196 (1999))。Bv8のクローニングおよび発現は、2003年3月13日に公開の国際公開03/020892において記述される。Bv8およびEG-VEGFは、2つの非常に関連したGプロテイン結合レセプター(GPCR)、EG-VEGF/PKR-1(R1)およびEG-VEGF/PKR-2(R2)を結合する(Masuda, Y et al., Biochem Biophys Res Commun 293, 496-402 (2002);Lin, D.C. et al., J Biol Chem 277, 19276-19280 (2002))。EG-VEGFおよびBv8は特定の内皮細胞種のための選択的な***促進因子としての特徴を有した(上掲のLeCouter, J. et al., (2001) and (2003))。他の活性は、痛覚(上掲のMollay, C. et al.)、胃腸管運動性(上掲のLi, M. et al.)、概日性運動リズムの調節(Cheng, M.Y., et al., Nature 417, 405-410 (2002))および嗅球神経形成(Matsumoto, S., et al., Proc Natl Acad Sci USA 103, 4140-4145 (2006))を含む、このファミリーによるものであった。さらに、Bv8又はEG-VEGFはインビトロで顆粒球および単核球性コロニーの産生を刺激した(上掲のLeCouter, J. et al., (2003);Dorsch, M. et al., J. Leukoc Biol 78(2), 426-34 (2005))。Bv8は、マクロファージの化学誘引物質としての特徴を有していた(LeCouter et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 16813-16919 (2004))。
病的状態における血管形成の一次調節因子としての血管内皮増殖因子(VEGF)を認識することでVEGF活性をブロックする多くの試みがなされている。阻害性抗VEGFレセプター抗体、可溶性レセプターコンストラクト、アンチセンス方策、VEGFに対するRNAアプタマーおよび低分子量VEGFレセプターチロシンキナーゼ(RTK)インヒビターはすべてVEGFシグナル伝達に干渉するために提案されている。例としてSiemeister et al. Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998)を参照。抗VEGF中和抗体は、ヌードマウスにおいて様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制すること(Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995);Borgstr?m et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996);及びMelnyk et al. Cancer Res. 56: 921-924 (1996))、更に、虚血性網膜疾患のモデルにおいて眼内血管形成を阻害すること(Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996))が示されている。実際、ヒト化抗VEGF抗体であるベバシズマブ(AVASTIN(登録商標)、Genentech, South San Francisco, CA)は、結腸又は直腸の転移性カルチノーマを有する患者の第一又は第二治療のための静脈内5-フルオロウラシルベースの(5−FU)化学療法との併用が、そして、切除不能な局所的に進行した再発性又は転移性の非扁平上皮非小細胞肺癌(NSCLC)患者の第一治療のためのカルボプラチンおよびパクリタキセルとの併用が米国FDAによって承認されている。例としてFerrara et al., Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004)を参照。
一態様では、本発明は、既に血管内皮増殖因子(VEGF)アンタゴニストにて治療された腫瘍を有する哺乳類の被検体(例えばヒト被検体)にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む、腫瘍の治療方法に関する。ヒト被検体は、VEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であってよいが、抵抗性であることが必要ではない。
一実施態様では、VEGFアンタゴニストは抗VEGF抗体ないしはその断片であり、この抗VEGF抗体は、例えばベバシズマブないしはその断片又は変異体であってもよい。
他の実施態様では、Bv8アンタゴニストは抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしはその断片であり、このBv8レセプターはPKR−1/EG−VEGFR1又はPKR−2/EG−VEGFR2であってもよい。抗体が結合するBv8は、治療される哺乳動物の天然配列のBv8ポリペプチドである。同様に、抗体が結合するBv8レセプターは、治療される哺乳動物の天然配列のBv8レセプターである。
抗体又は抗体断片は、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。
特定の実施態様では、抗VEGF抗体はベバシズマブないしはその断片又は変異体である。
他の実施態様では、Bv8アンタゴニストおよび場合によってVEGFアンタゴニストの投与に加えて、ヒト患者などの哺乳類の被検体は、一又は複数の更なる骨髄系細胞低減剤、例えばGr1アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、MCP−1アンタゴニストおよび/またはMIP−1αアンタゴニストによって治療される。
さらに他の実施態様では、ヒト被検体などの治療される哺乳類の被検体は、化学療法および/または放射線療法を受け、この化学療法は、例えば、細胞障害性剤の投与を含んでもよい。好ましくは、付加的な治療は、標的とされる特定の腫瘍の治療についての「標準的な治療」として知られている治療である。
腫瘍は、限定するものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫および白血病を含むカルチノーマなどの任意の種類の良性又は癌性の腫瘍であってよい。本明細書中で好適な癌は、大腸癌、直腸癌、肺癌および乳癌、特に大腸又は直腸の転移性カルチノーマ、又は非扁平上皮非小細胞肺癌(NSCLC)である。
特定の実施態様では、上記の方法はさらに、治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び/又は骨髄のCD11b+Gr1+細胞の数及び/又は頻度を決定することによって、治療の有効性をモニタリングする工程を含む。
(a) 腫瘍を有する哺乳類の被検体、例えばヒトに、Bv8アンタゴニストの有効量を投与する、
(b) 治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び/又は骨髄のCD11b+Gr1+細胞の数及び/又は頻度を決定することによって、該治療の有効性をモニタリングし、このとき数又は頻度の減少が治療が有効であることを示す、
ことを含む方法に関する。
更なる態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳類の被検体における炎症細胞が媒介する血管形成の阻害方法であって、被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
アンタゴニストは、例えば、抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしはその断片であってよく、それはキメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。抗体が結合するBv8は、治療される哺乳動物の天然配列のBv8ポリペプチドである。同様に、抗体が結合するBv8レセプターは、治療される哺乳動物の天然配列のBv8レセプターである。
この方法はさらに、治療前の数又は頻度と比較して、ヒトなどの哺乳類の被検体から得た生体試料における、循環及び/又は骨髄のCD11b+Gr1+細胞の数及び/又は頻度を決定することによって、治療の有効性をモニタリングする工程を含む。
他の実施態様では、方法はさらに、血管形成の更なるインヒビター、例えば血管形成因子に対する抗体の投与を含んでもよい。
血管形成因子の例には、限定するものではないが、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン、肝細胞増殖因子(HGF)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)が含まれる。
なお更なる態様では、本発明は、Bv8アンタゴニスト単独、又はG−CSFアンタゴニストと組み合わせて投与することによって刺激される好中球動員の阻害に関する。
本発明はさらに、Bv8アンタゴニストによる骨髄系統の細胞のBv8媒介性移動の阻害に関する。
本発明はさらに、Bv8アンタゴニストを投与することによって、腫瘍発達および/または成長を阻害するための、CD11b+Gr1+骨髄系細胞の枯渇に関する。
特定の実施態様では、G−CSFアンタゴニストは、抗G−CSF抗体又は抗体断片である。抗体又は抗体断片は、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。場合によって、G−CSFアンタゴニストは、Bv8アンタゴニストおよび/またはVEGFアンタゴニスト、例えば抗Bv8抗体および/または抗VEGF抗体と組み合わせて投与される。
他の実施態様では、G−CSFアンタゴニストは、異なる抗腫瘍剤および/または治療投薬計画、例えば化学療法および/または放射線療法と組み合わせて投与される。
さらに他の態様では、本発明は、ヒト被検体における好中球移動の阻害方法であって、被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
更なる態様では、本発明は、抗血管形成療法から利益を得る非腫瘍性状態の治療方法であって、既に非腫瘍性状態と診断されて、血管内皮増殖因子(VEGF)アンタゴニストにて治療されたヒト被検体に、Bv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法に関する。
一実施態様では、非腫瘍性状態は、VEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である。
非腫瘍性状態は、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞の浮腫、糖尿病性及び他の増殖性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管形成性緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶反応、網膜/脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)、眼性血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中/非開放性頭部損傷/外傷と関係するもの)、滑液の炎症、RAのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(OA)、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第3区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織塊成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液および胸水からなる群から選択されうる。
特定の実施態様では、中和抗体は、マウス抗Bv8抗体3F1又は2B9として、同じエピトープ、又は基本的に同じエピトープに結合する。前記の通り、抗体は、抗体断片であってもよいし、キメラでも、ヒト化でも、ヒトでもよい。
詳細に本発明を記述する前に、本発明が特定の組成物又は生物系に限定されるものではなく、当然のことながら変化しうることは理解されるであろう。また、本明細書において用いられる用語は実施態様のみを記述するためのものであって、限定するためのものでないことも理解されるであろう。本明細書中及び添付の特許請求の範囲に用いられる単数形「a」、「an」及び「the」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。ゆえに、例えば、「分子」を指す言葉は、場合によって2以上の該分子の組み合わせなどを含む。
「Bv8」、「Bv8ホモログ」、「プロキネチシン-2(別名「PK2」、「KAL4」及び「MIT1」)なる用語は、交換可能に本明細書中で用いられ、本明細書中で定義される天然配列、Bv8ポリペプチド、Bv8変異体およびキメラBv8を指す。
Bv8核酸は上述したようなBv8ポリペプチドをコードするRNA又はDNAであるか、あるいはこのようなDNA又はRNAにハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに安定に結合したままであって約10ヌクレオチド長より長い。ストリンジェントな条件は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.15MのNaCl/0.015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(NaDodSO4)を用いるもの、又は(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(vol/vol)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファーを750mMのNaCl、75mMクエン酸ナトリウムと共に用いるものである。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作用可能に結合している。Bv8核酸は特定の宿主生物において発現されうるようにベクター中において他の核酸配列と作用可能に結合されうる。これは当該分野においてよく知られた方法によってなされうる。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード化配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合しているDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って、合成のオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したBv8を含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはBv8の生物学的活性を阻害しないように充分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、該タグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり特異的である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8−50のアミノ酸残基(好ましくは約9−30の残基)を有する。好ましいものは、ニッケルに結合し、タグ付加タンパク質を、記載されているように(例としてLindsay等 Neuron 17:571-574 (1996)を参照)、Ni-NTAクロマトグラフィーで分離することを可能にするポリ-ヒスチジン配列である。
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の全重量基準で少なくとも約90重量%、好ましくは少なくとも約95重量%、より好ましくは少なくとも約90重量%、更により好ましくは少なくとも約95重量%のタンパク質を含む組成物(composition:構成物)を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の全重量に対して少なくとも約99重量%のタンパク質を含む組成物を意味する。
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
特に、Bv8アンタゴニストは、限定するものではないが、天然配列のBv8ポリペプチドに特異的に結合する抗体及び抗体断片、又は天然配列のBv8レセプター(PKR−1/EG−VEGFR1又はPKR−2/EG−VEGFR2)ポリペプチドを含む。Bv8ポリペプチドのアンタゴニストの同定方法は、候補アンタゴニスト分子とBv8ポリペプチドとを接触させ、骨髄系細胞動員を調節するおよび/または腫瘍血管形成を促進するBv8の能力における検出可能な変化を測定することを含んでもよい。
「Bv8レセプター」はBv8が結合し、Bv8の生物学的性質を媒介する分子である。それ故に、「Bv8レセプター」なる用語は、PKR1/EG−VEGFレセプター-1及びPKR2/EG−VEGFレセプター-2を意味するものを含む(LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690;Lin等, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280;Masuda等, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402)。
本明細書中で用いる「VEGF」又は「VEGF-A」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、天然配列の165アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した121-、145-、183-、189-、及び206-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型、並びにその変異体を意味する。VEGF-Aは、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及びPlGFを含む遺伝子ファミリの一部である。VEGF-Aは、VEGFR-1(Flt-1)及びVEGFR-2(Flk-1/KDR)の2つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合する。この後者はVEGF-Aの血管内皮細胞***促進シグナルの主な伝達物質である。また、「VEGF」又は「VEGF-A」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のVEGFも意味する。特定の種由来のVEGFは、ヒトVEGFはhVEGF、マウスVEGFはmVEGFなどの用語で表されることが多い。また、「VEGF」なる用語は、165アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸8〜109、又は1〜109を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。そのようなVEGF型を指すときは、本明細書では、例えば、「VEGF(8−109)」、「VEGF(1−109)」又は「VEGF165」と表す。「切断した(切断型の)」天然のVEGFのアミノ酸位置は、天然のVEGF配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然VEGFのアミノ酸位置17(メチオニン)は、天然のVEGF中の位置17(メチオニン)でもある。切断型の天然VEGFは天然配列のVEGFに匹敵するKDR及びFlt−1レセプター結合親和性を有する。
「造血幹/始原細胞(前駆細胞)」又は「原始的造血細胞」は、より関係しているか、又は成熟した血液細胞種を形成するように分化することができるものである。「リンパ系の血液細胞系統」は、リンパ球(B細胞又はT細胞)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞である。同様に「リンパ球新生」はリンパ球の形成である。「赤血球血液細胞系統」は、赤血球(erythrocytes、red blood cells)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞であり、「赤血球新生」は赤血球の形成である。
本明細書中の目的のために、「骨髄血液細胞系統」なる表現は、上記のリンパ系及び赤血球血液細胞系統以外の、すべての造血始原細胞を包含し、「骨髄造血」は血液細胞(リンパ球及び赤血球以外の)の形成を伴う。
骨髄細胞群は、Gr1+/CD11b+(又はCD11b+Gr1+)又はGr1+/Mac-1+である骨髄免疫細胞が豊富でありうる。これらの細胞は、マクロファージ系統の骨髄性細胞用のマーカーであるCD11bと、顆粒球用のマーカーであるGr1を発現する。Gr1+/CD11b+は、例えばGr1+に対する抗体による免疫吸着パニングによって選択されてもよい。
本明細書中で用いられる「Gr1アンタゴニスト」なる用語は、Gr1に結合して、Gr1の生物学的な活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。Gr1アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、Gr1アンタゴニストは、抗体、特にヒトのGr1を結合する抗Gr1抗体である。
本明細書中で用いられる「CD18アンタゴニスト」なる用語は、CD18(好ましくはヒトのCD18)に結合して、CD18の生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にCD18サブユニットを発現する細胞(例えば好中球)が持つ内皮へ結合する能力を(部分的にないしは完全に)ブロックするであろう。CD18アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、CD18アンタゴニストは抗体である。
抗CD18抗体の例には、MHM23 (Hildreth等, Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983));M18/2(IgG2a;Sanches-Madrid等, J. Exp. Med.158: 586-602 (1983));H52(アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)寄託HB 10160);Mas191c及びlOT18 (Vermot Desroches等, Scand. J. Immunol. 33:277-286 (1991));及び、NA-8(国際公開第94/12214号)が含まれる。一実施態様では、抗体は、MHM23又はH52が結合するCD18エピトープに結合するものである。本発明の一実施態様では、抗体はCD18ポリペプチドに対して高親和性を有する。ある実施態様では、抗体は、CD11bと結合するCD18の細胞外ドメインの領域に結合してもよいし、抗体は、a及びP鎖を解離してもよい(例えば、抗体は、MHM23抗体の場合のようにCD11bとCD18との複合体を解離してもよい)。
本明細書中で用いられる「MCP-1アンタゴニスト」なる用語は、MCP-1に結合して、MCP-1の生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。MCP-1アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、MCP-1アンタゴニストは、抗体、特にヒトのMCP-1を結合する抗MCP-1抗体である。
本明細書中で用いられる「MIP-1αアンタゴニスト」なる用語は、MIP-1αに結合して、MIP-1αの生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。MIP-1αアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、MIP-1αアンタゴニストは、抗体、特にヒトのMIP-1αを結合する抗MIP-1α抗体である。
「DRCGP」は、抗VEGF耐性腫瘍のCD11b+Gr1+細胞において下方制御されるタンパク質を指す。DRCGPには、限定するものではないが、THBS1、Crea7、アクアポリン-1、溶質キャリアファミリタンパク質(SCF38)、アポリポタンパクE(APOE)、脂肪酸結合タンパク質(FABP)、NCAM-140、フィブロネクチンIII型、WIP、CD74、ICAM-2、Jagged1、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFb IEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-セレクチン、IL-15、サイトカインシグナル伝達4のサプレッサー、Cytor4及びCX3CR1が含まれる。ある実施態様では、DRCGPはTHBS1及び/又はCrea7を指す。
「DRRTP」は、抗VEGF耐性腫瘍において下方制御されるタンパク質を指す。URRTPには、限定するものではないが、IL10-R2、Erb-2.1、カベオリン3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecam1、Tlr3、TGF-B、FIZZ1、Wfs1、TP14A、EMAP、SULF-2、細胞外基質2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-α、エフリンB1、SPARC-様1及びセマフォリンAが含まれる。ある実施態様では、DRRTPはIL10-R2、THBSP-4及び/又はJAM-2を指す。
「生物学的試料(生体試料)」なる用語は、任意の動物からの身体試料を指すが、好ましくは哺乳動物からのもの、より好ましくはヒトからのものである。このような試料は、血液、血清、血漿、骨髄、硝子体体液、リンパ体液、関節液、濾胞液、***、羊水、乳汁、全血液、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液および組織培養液のような体液、並びにホモジナイズした組織のような組織抽出物、及び細胞抽出物を含む。本明細書において好適な生体試料は、血清、血漿、尿又は骨髄試料である。
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は3又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には3又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列IgM又はIgA抗体ではない。
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)VL、CL、VH及びCH1ドメインを持つFab断片;(ii)CH1ドメインのC末端に一又は複数のシステイン残基を持つFab断片であるFab'断片;(iii)VH及びCH1ドメインを持つFd断片;(iv)CH1ドメインのC末端に一又は複数のシステイン残基とVH及びCH1ドメインを持つFd'断片;(v)抗体の単一アームのVL及びVHドメインを持つFv断片;(vi)VHドメインからなるdAb断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989));(vii)単離されたCDR領域;(viii)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって結合された2つのFab'断片を含む二価断片であるF(ab')2断片;(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Fv;scFv)(Bird等, Science 242:423-426 (1988);及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988));(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第404097号;国際公開第93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照);(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995);及び米国特許第5641870号)が含まれる。
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975);Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988);Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)、ファージディスプレイ法(例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991);Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004);Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004);Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照)、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術(例えば、WO1998/24893; WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993);Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;及び同第5,661,016号;Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992);Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994);Morrison, Nature, 368:812-813 (1994);Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996);及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995))が含まれる。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「HVR」又は「HV」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び/又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は6つのHVRを含み;VHに3つ(H1、H2、H3)、VLに3つ(L1、L2、L3)である。天然の抗体では、H3及びL3は6つのHVRのうちで最も高い多様性を示す、特にH3は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45;Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448;Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
ループ カバット AbM Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
「フレームワーク」又は「FR」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基1−107と重鎖の残基1−113)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「EU番号付けシステム」又は「EUインデックス」を用いる(EUインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、EU番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第60/640323号、EU番号付けについての図を参照)。
「Fc領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。Fc領域は天然配列Fc領域又は変異形Fc領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトIgG重鎖Fc領域はおよそCys226の位置又はおよそPro230からの位置のアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムによれば残基447)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのK447残基が除去された抗体群、K447残基が除去されていない抗体群、及びK447残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのFc領域は一般に、CH2ドメインとCH3ドメインの2つの定常ドメインを含み、場合によってCH4ドメインを含む。
本明細書中の「Fc領域鎖」は、Fc領域の2つのポリペプチド鎖の1つを意味する。
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」(「Cg2」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで延びている。CH2ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、2つのN結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の2つのCH2ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、CH2ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、CH2ドメインは天然配列のCH2ドメイン又は変異体CH2ドメインとすることができる。
「CH3ドメイン」は、Fc領域におけるC末端からCH2ドメインまでの範囲(つまり、IgGの約341位のアミノ酸から約447位のアミノ酸)を含む。ここでは、CH3領域は、天然配列のCH3ドメインか、又は変異体CH3ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたCH3ドメイン:出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第5821333号参照)とすることができる。このような変異体CH3ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の少なくとも1つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、C1q結合、補体依存性細胞障害作用(CDC)、Fcレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ADCC)、食作用、細胞表面レセプター(例えばB細胞レセプター; BCR)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のFc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトFc領域は、天然配列のヒトIgG1Fc領域(非A-及びA-アロタイプ);天然配列のヒトIgG2Fc領域;天然配列のヒトIgG3Fc領域;及び天然配列のヒトIgG4Fc領域;並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「親抗体」又は「野生型」抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列の変更が無いアミノ酸配列を含む抗体である。ゆえに、一般に親抗体は、本明細書中で開示する抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一の高頻度可変領域を有する。親抗体は、天然の配列(すなわち、天然に生じる)抗体(天然に生じる対立変異体を含む)、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾(例えば挿入、欠失及び/又は他の変更)を有してもよい。開示内容全体を通して、「野生型」、「WT」、「wt」、及び「親」ないしは「親の」抗体は交換可能に用いられる。
ここで用いる「抗体変異体」又は「変異抗体」は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましくは、抗体変異体は、天然に見られないアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを含む。このような変異体は、必然的に親抗体と100%未満の配列同一性又は類似性がある。好適な実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、およそ75%から100%未満、より好ましくはおよそ80%から100%未満、より好ましくはおよそ85%から100%未満、より好ましくはおよそ90%から100%未満、最も好ましくはおよそ95%から100%未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。抗体変異体は一般に、一又は複数の高頻度可変領域内又は該領域に隣接して一又は複数のアミノ酸変更を有するものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、C1q結合及び補体依存性細胞障害(CDC);Fcレセプター結合性;抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC);貪食作用;細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター)のダウンレギュレーション;及びB細胞活性化が含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のFcRsを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実行する。ADCCを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞障害性T細胞及び好中球が含まれるが、PBMCとNK細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はPBMCから単離してもよい。
また、「Fcレセプター」又は「FcR」なる用語には、母性IgGの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターFcRnも含まれる。FcRnへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997);Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997);Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004);国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
インビボでのヒトFcRnへの結合とヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Fc領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報2000/42072(Presta) にFcRへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDR及び/又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994);Schier他、Gene, 169:147-155 (1995);Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995);Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995);及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「二量体化ドメイン」は少なくとも2つのアミノ酸残基(一般にはシステイン残基)又は少なくとも2つのペプチド又はポリペプチド(これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる)の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び/又は非共有的結合(一又は複数)によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Fc領域;ヒンジ領域;CH3ドメイン;CH4ドメイン;CH1-CL対;出典明示によりここに取り込まれる米国特許第5821333号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び/又は「***(protruberance)」を持つ「インターフェース」;ロイシンジッパー(例えば、jun/fosロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照;又は酵母GCN4ロイシンジッパー);イソロイシンジッパー;レセプター二量体対(例えばインターロイキン-8レセプター(IL-8R);及びインテグリンヘテロ二量体、例えばLFA-1及びGPIIIb/IIIa)、又はその二量体化領域(一又は複数);二量体リガンドポリペプチド(例えば、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、インターロイキン-8(IL-8)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGFメンバー、及び脳由来神経栄養因子(BDNF);Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域(一又は複数);ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対;ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基(例えば約1、2又は3から約10のシステイン残基)を有するペプチド又はポリペプチドの対(以下、「合成ヒンジ」);及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはFc領域又はヒンジ領域である。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
「Bv8アンタゴニスト抗体」とは、先に定めたような、Bv8アンタゴニストであり、したがってBv8の能力を部分的ないしは完全にブロック、阻害又は中和して、骨髄系動員を調節する及び/又は腫瘍発達の間の血管形成を促進する抗体を意味する。
「Bv8イムノアドヘシン」なる用語は、「Bv8免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、それぞれBv8分子(天然又は変異体)の少なくとも一部を免疫グロブリン配列と組合わせるキメラ分子を意味する。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなければならないものではない。イムノアドヘシンはヒト抗体の多くの貴重な化学的及び生物学的性質を有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン(Fc)配列に結合した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、対象の結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。かかるイムノアドヘシンは患者には最小に免疫原性であり、慢性的な又は繰り返しの使用に対して安全である。
イムノアドヘシン構造の二つの腕が異なる特異性を持つ場合、このイムノアドヘシンは二重特異的抗体に倣って「二重特異的イムノアドヘシン」と呼ばれる。Dietsch等, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)は、アドヘシン分子の細胞外ドメイン、E-セレクチン及びP-セレクチンを組み合わせた、このような二重特異的イムノアドヘシンを記載しており、そのセレクチンの各々は天然では異なる細胞型中で発現される。結合実験により、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それ由来の単一特異的イムノアドヘシンと比較して骨髄細胞株に結合する向上した能力を有していることが示された。
治療目的たる「哺乳動物」は、ヒト、他の高等霊長類、齧歯類、家庭及び酪農用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等々を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び/又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、S期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばG1停止又はM期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またG1停止させるこれらの薬剤は、S期停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びアラ-Cである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出すことができる。
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばVEGFに対する抗体、VEGFレセプターに対する抗体、VEGFレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えばPTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(リンゴ酸スニチニブ)、AMG706)である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991);Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表3);Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999);Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表2);及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表1)を参照。
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「NSAID」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて(と併用して)」の投与は、同時(一時)及び任意の順序での連続投与を含む。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物(Bv8ポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
「置換」アミノ酸残基は、アミノ酸配列内の他のアミノ酸残基を置き換える、又は置換するアミノ酸残基を指す。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基でも天然に生じないアミノ酸残基であってもよい。
「アミノ酸挿入」とは、既定のアミノ酸配列の中に一又は複数のアミノ酸を取り込ませることを指す。アミノ酸挿入は、ペプチド結合によって結合された2以上のアミノ酸残基を含むペプチドが既定のアミノ酸配列内に導入される場合に「ペプチド挿入」を含みうる。アミノ酸挿入がペプチドの挿入を伴う場合、挿入されたペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有するようにランダム突然変異誘発によって生成されてもよい。「高頻度可変領域に隣接する」アミノ酸変更とは、高頻度可変領域のN末端及び/又はC末端での一又は複数のアミノ酸残基の導入ないしは置換を指し、この挿入ないしは置換アミノ酸残基(一又は複数)の少なくとも一により、対象の高頻度可変領域のN末端又はC末端のアミノ酸残基とペプチド結合が形成される。
「非天然に生じる(天然に生じない)アミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができるアミノ酸残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載のものなどの他のアミノ酸残基アナログが含まれる。非天然のアミノ酸残基を産生するためには、Noren 等 Science 244:182 (1989)および上掲のEllman 等の方法を利用することができる。要するに、これらの方法はインビトロにおけるRNAの転写及び翻訳に先立って非天然に生じるアミノ酸残基にてサプレッサーtRNAを化学的に活性化することを伴う。
「繊維状ファージ」なる用語は、その表面上に異種性のポリペプチドをディスプレイすることが可能なウイルス粒子を指し、f1、fd、Pf1およびM13が挙げられるが、これらに限定されるものではない。繊維状ファージは、テトラサイクリン(例えば「fd tet」)などの選択可能なマーカーを含みうる。様々な繊維状ファージディスプレイシステムは当業者に周知である(例えば、Zacher et al. Gene 9: 127-140 (1980)(Smith et al. Science 228: 1315-1317 (1985);及びParmley and Smith Gene 73: 305-318 (1988)を参照)。
「パニング」なる用語は、標的に対して高親和性および特異性を有する、抗体などの化合物保持するファージの同定および単離におけるスクリーニング工程の複数のラウンドを指すために用いる。
「干渉RNA(RNAi)」なる用語は、特定のmRNAの触媒的分解をもたらす二本鎖RNAを指すために本明細書において用い、したがって特定の遺伝子の発現を阻害/低減するために用いられうる。
「有効量」は、有益な又は所望の治療的(防止的なものを含む)結果を生じさせるために十分な量である。有効量は、一又は複数の投与で投与されてもよい。
本発明は、抗VEGF抗体などの少なくとも一のVEGFアンタゴニストの投与を含む治療に対する耐性を腫瘍に引き起こす細胞及び分子の事象においてBv8が重要な役割を果たすという認識に少なくともある程度基づく。本発明はさらに、Bv8発現がきわめてG−CSFに反応し、ゆえに、好中球分化および産生の調節に関与する主要な恒常性メカニズムと関連しているという認識に基づく。
出典明記によって本明細書中に特別に援用される、2007年3月28日に出願の同時継続出願番号11/692681号には、造血性骨髄由来細胞の動員と抗VEGF治療に対する腫瘍耐性の発達との間の相関性が記述されている。免疫系は、赤血球、リンパ球および骨髄系統の細胞を含む造血性細胞を含む。これらすべての細胞型は同じ多能性幹細胞に由来する。成人では、幹細胞が***してまれにより多くの幹細胞(自己複製)および様々な関連の前駆細胞を生産している骨髄において、造血が生じる。特定の調節因子に反応して造血性細胞を生産するのは関連の前駆細胞である。これらの調節因子は、主に周囲の間質細胞によって産生され、他の組織に存在するもので、例えば、コロニー刺激因子(CSF)、エリスロポイエチン(EPO)、インターロイキン3(IL3)、顆粒球/マクロファージCSF(GM-CSF)、顆粒球CSF(G−CSF)、マクロファージCSF(M-CSF)およびSTEEL因子を含む。癌患者の免疫系における変化は、癌に対する成功裏な攻撃を増加させる免疫系の能力を不能または低減することに寄与し、それによって腫瘍成長を進行させることが示唆されている。例としてGabrilovich et al., Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cancer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function, Clinical Cancer Research 5:2963-2970 (1999)を参照。腫瘍によって生産される因子は、異常な骨髄造血を引き起こすこともあるし、腫瘍に対する免疫応答を抑制することもありうる。例としてKusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。
接着レセプター分子のCD11/CD18ファミリーは、4つの非常に関連した細胞表面糖タンパク質、LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)、p150.95(CD11c/CD18)及び(CD11d/CD18)を含む。これらのヘテロ二量体の各々は、固有のα-鎖(CD11a、b、c又はd)および変化しないβ-鎖(CD18)を有する。白血球上に位置するCD18インテグリンは、脈管内皮および他の細胞で発現される細胞間接着分子-1(ICAM-1)と結合し、それによって、白血球接着および経内皮移動を媒介しうる。LFA-1は、マクロファージのサブセットを除くすべての成熟白血球の表面上に存在し、主要なリンパ系のインテグリンと考えられる。Mac−1、p150.95およびCD11d/CD18の発現は主に、骨髄系統の細胞(好中球、単球、マクロファージおよびマスト細胞を含む)に限定される。また、CD11b+Gr1+は、骨髄系細胞上にも見られるマーカーである。成熟骨髄系細胞と未成熟骨髄系細胞とのバランスが癌の指標であり、進行性腫瘍成長ではそのバランスが未成熟骨髄系細胞へと移行し、樹状細胞の機能が減少することが示されている。例としてKusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。例えば腫瘍保持マウスにおいて未成熟骨髄系細胞を分化させることによってバランスを変化させると、癌ワクチンの効果が改善された。Kusmartsev et al., All-trans-Retinoic Acid Eliminates Immature Myeloid Cells from Tumor-bearing Mice and Improves the Effect of Vaccination. Cancer Research 63:4441-4449 (2003)を参照。また、癌患者では、循環中のVEGFのレベルが未成熟骨髄系細胞の数の増加と相関していたことが観察された。Almand et al., Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer. Clin. Cancer Res. 6: 1755 (2000)を参照。
本明細書において開示される実験データは、Bv8が腫瘍発達を支配する骨髄のCD11b+Gr1+細胞の動員を制御して、更に局所的に腫瘍血管形成を促進することを示す。したがって、Bv8は、VEGFアンタゴニストによる治療に耐性がある腫瘍の治療のための有望な標的である。
また、本明細書において開示されるデータは、Bv8発現はきわめてG−CSFに応答し、ゆえに、好中球分化および産生の調節に関与する主要な恒常性メカニズムと関連していることも示す。非腫瘍タイプの炎症細胞媒介性の血管形成の病因においてBv8が広く役割を果たすので、Bv8は、一般に、望ましくない炎症細胞媒介性の血管形成の阻害のための標的であることが期待される。
本発明の結合および活性のアッセイによって同定される抗体は、組換えDNA技術の技術を含む公知の方法によって製造されうる。
i) 抗原調製
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、SOCl2、又はR及びR1が異なるアルキル基であるR1N=C=NRへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート100μg又は5μg(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント3容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。1ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の1/5ないし1/10のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。7ないし14日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び/又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、DNAを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、DNAは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(CH及びCL)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第4816567号;Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993);Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993);及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991);Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、F(ab')2は、F(ab')2分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーGCN4を用いて形成される。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Fv断片(scFv)である。国際公開93/16185号を参照のこと。
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常2つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、BsAb)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。BsAbの例には、Bv8に対する一アームと、VEGF又はEG−VEGFに対する他のアームとを有するものが含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は10個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第93/08829号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される3つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、3つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも2つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、2又は3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
国際公開第96/27011号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に変換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再変換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、よって2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ADCC)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばDNA又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Fcドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Fcドメインの一又は二のループ由来の3以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはFc領域の(例えばIgGの)CH2ドメインから得られ、抗体のCH1、CH3、又はVH領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Fc領域のCH2ドメインから得られ、抗体断片のCL領域又はVL領域、又はその両方に転移する。
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はNないしC末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第5534615号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第4640835号;第4496689号;第4301144号;第4670417号;第4791192号又は第4179337号に記載された方法で結合させることを含む。
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないがAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、In111及びLuの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、MRIとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-2,6-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(MX-DTPA)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992);米国特許第5208020号)。
別法として、抗VEGF及び/又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えばラジオヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と核酸溶解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼなどのDNAエンドヌクレアーゼ)との間で形成される。
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。1分子の毒素/抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均3−4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5208020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5208020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば2003年12月11日公開の国際公開第03/102157号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
例えばCDRH1、CDRH2及びCDRH3の溶媒接近可能な及び/又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。CDRL1、CDRL2及びCDRL3に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体4D5配列、又はヒト化抗体4D5配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはDVKコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基95−100aを置換することによりつくられ、ここでDVKコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(DVK)7を含む。ある実施態様では、ライブラリはDVKとNNKの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基95−100aを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(DVK)6(NNK)を含む。他の実施態様では、ライブラリはDVKとNNKの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基95−100aを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(DVK)5(NNK)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(NNK)6を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
多様性をCDRH1及びCDRH2においてまた生じさせることができる。CDR-H1及びH2多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。H1/H2領域における多様性の制限は約104から105倍縮重を減少させ、より多くのH3多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。CDRH3において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばDVK又はNVTを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
ある実施態様では、CDRH3領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約7から19アミノ酸の範囲のCDRH3領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
CDRH3での変異を持つライブラリを、例えばCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及び/又はCDRH2のような他のCDRの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、CDRH3ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置28、29、30、31、及び/又は32に変異アミノ酸を持つヒト化4D5抗体配列の形態において作りだしたCDRL3ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、CDRH3に対する変異のライブラリは変異CDRH1及び/又はCDRH2重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、CDRH1ライブラリは位置28、30、31、32及び33に変異アミノ酸を持つヒト化抗体4D5配列を用いてつくり出される。CDRH2ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置50、52、53、54、56及び58に変異アミノ酸を持つヒト化抗体4D5の配列を用いてつくり出すことができる。
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び/又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ10倍良好な、好ましくは少なくともおよそ20倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ50倍良好な、時には少なくともおよそ100倍又は200倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗Bv8抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ10倍強力な、好ましくは少なくともおよそ20倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ50倍強力な、時には少なくともおよそ100倍又は200倍強力な、Bv8に対する結合親和性を有することが好ましい。
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986));CDRと相互作用し/そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));及び/又はVL−VH界面に関与するもの(欧州特許第239400号B1)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約1から約5のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるala変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro;及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の2又はそれ以上が置換され、例えば約2から約10の高頻度可変領域置換である。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び/又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
抗体がFc領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のFc領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第2003/0157108号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のFc領域に接着した炭水化物内のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を二分する抗体は、国際公報第03/011878号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第6602684号、Umana 等に参照されている。抗体のFc領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第97/30087号、Patel 等に報告される。また、抗体のFc領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第98/58964号(Raju, S.)及び国際公報第99/22764号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第2005/0123546号(Umana 等)を参照。
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするDNAは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第5534615号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開された DD266710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌294(ATCC31446)であるが、他の大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)及び大腸菌W3110(ATCC27325)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL-1変異体とボンビクス・モリ NPVのBm-5株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンFc領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ3に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
本発明のBv8アンタゴニストは、単独で又は、血管形成、特に炎症細胞依存性血管形成および/または腫瘍形成の阻害のための他の治療薬(一又は複数)と組み合わせて、使われてもよい。
本発明の治療方法のための一次標的は、VEGFアンタゴニスト、特に抗VEGF抗体による治療に抵抗力があることを示すか又はそのことが既知である腫瘍である。
本発明の方法によって治療されるための疾患及び疾病の例は、腫瘍性疾患、例えば、「癌」及び「癌性」なる用語の下に本明細書中で記載されるものを含む。
本発明のアンタゴニストによる治療に敏感に反応する非腫瘍性状態は、限定するものではないが、例として、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、未熟児の網膜症を含む他の増殖性及び糖尿病性の網膜症、後水晶体繊維増殖症、血管形成緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶、網膜/脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)、眼性血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中/非開放性頭部損傷/外傷と関係するもの)、滑液炎症、RAのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(OA)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第3区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織質量成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係しているものなど)および胸水を含む。
一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の状態は、VEGFアンタゴニスト治療に抵抗力がある、異常であるか望ましくない血管形成と関係している病理学的疾患に特徴を有する。本発明のアンタゴニストは、同じ組成物で又は異なる組成物として、目的のために有効である他の薬剤と連続して、又は組み合わせて投与されうる。あるいは、又は、さらに、本発明の複数のアンタゴニスト、薬剤および/またはアゴニストが投与されてもよい。
アンタゴニストおよび/または薬剤の投与は、例えば単一の組成物として、または、同じか異なる投与ルートを使用した2以上の異なる組成物として、同時に行われてもよい。あるいは、又は、さらに、投与はいずれの順序で連続して行われてよい。ある実施態様では、2以上の組成物の投与の間に分から日、週、月の間隔が存在してもよい。例えば、VEGFアンタゴニストが第一に投与され、その後、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤、例えば骨髄系細胞減少薬剤(VEGFアンタゴニスト以外のもの)が投与されてよい。しかしながら、本発明の異なるアンタゴニスト又は薬剤の同時投与又は投与が第一に考慮される。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
本発明のある態様では、本発明のBv8アンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は2以上の異なる抗原を結合する2以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
さらに、本発明のBv8アンタゴニストは、ホルモン剤、放射線剤及び化学療法剤と組み合わせて投与され、これによって癌細胞を一又は複数の薬剤に対して再感作してもよい。この一又は複数の薬剤は転移の阻害を含め、癌の治療又は管理をするために次いで投与されうる(又は投与され続ける)。
VEGFアンタゴニストによる治療に対する腫瘍感度は、URCGP、DRCGP、URRTP又はDRRTPをコードする核酸に相同な一又は複数の核酸配列を発現することが可能な細胞を含む被検体から一又は複数の試験細胞集団を提供することによって評価されてもよい。配列の発現は参照細胞集団と比較される。参照細胞集団中の細胞のVEGFアンタゴニスト感受性状態が知られている限り、いずれの参照細胞集団が使われてもよい。比較は、同時又は時間的に異なる時に測定される試験及び参照試料について行われてよい。後者の例は収集された発現情報、例えば配列データベースの使用であり、この配列データベースは感受性の状態が既知である細胞における既知の配列の発現レベルについての情報を集めたものである。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、CD11b+Gr1+骨髄系細胞について濃縮されている。本発明の特定の実施態様では、参照細胞集団は、腫瘍細胞について濃縮されている。
単独又は他の治療薬と組み合わせた本発明のBv8アンタゴニスト、例えば抗Bv8抗体は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び/又は皮下投与などにより投与される。
ある実施態様では、本発明の治療はBv8アンタゴニストとVEGFアンタゴニスト及び/又は一又は複数の骨髄系細胞減少剤ないし化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、本明細書中のBv8アンタゴニストと投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び/又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、VEGFアンタゴニストは、Bv8アンタゴニストの投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び/又はVEGFアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、VEGFアンタゴニストと一又は複数の他の治療剤、例えばBv8アンタゴニスト及び場合によって骨髄系細胞減少剤、化学療法剤及び/又は抗癌剤の量である。
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(Genentech)などの抗VEGF抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。
材料と方法
TaqmanTMによる遺伝子発現解析
RNeasy Mini Kit(登録商標)(Qiagen)を使用して組織又は細胞由来のRNAを調製した。一反応当たり50ngの全RNAをリアルタイムPCR(TaqmanTM)分析に使用した。マウス/ヒトBv8及びEG−VEGF/Bv8レセプター1(PKR−1/EG−VEGFR1、R−1)に対して、精巣RNA(BD Biosciences)をコントロールとした。マウス/ヒトEG−VEGF/Bv8レセプター2(PKR−2/EG−VEGFR2、R2)に対して、視床下部又は全脳(BD Biosciences)をコントロール組織とした。反応は、7500リアル(Perkin Elmer)タイムPCRシステム(Applied Biosystems)の9600Emulationモードで操作し、標準曲線を用いた絶対的定量化をSequence Detection System(SDS)ソフトウェアと共に使用した。各遺伝子の発現レベルを、同じ試料中のハウスキーピング遺伝子RPL19に対して更に定量した。腫瘍関連内皮細胞中でのVEGFR−1、VEGFR−2、EG−VEGF/Bv8 R1及びEG−VEGF/Bv8 R2の発現を確認するために、Titan One TubeTMRT−PCRシステム(Roche)を使用して標準的なRT−PCRを実施し、最終産物の正しいサイズを2%アガロースゲル(Invitrogen)でチェックした。TaqmanTMプライマーの配列は次の通りである:
マウスBv8順方向:GCA TGA CAG GAG TCA TCA TTT T(配列番号7)、逆方向:AAA TGG CAG GAT ATC AGG AAA(配列番号8)、プローブ:AAA CTT TAT TTG TAA CCC AAA GGT CTA ATG TAA ATG GA(配列番号9);
ヒトBv8順方向:ATG GCA CGG AAG CTA GGA(配列番号10)、逆方向:GCA GAG CTG AAG TCC TCT TGA(配列番号11)、プローブ:TGC TGC TGG ACC CTT CCT AAA CCT(配列番号12);
マウスBv8 R1順方向:CAG CGC ACA TGA AGA CTT G(配列番号13)、逆方向:GTC ATC TTC GGT TTC CTG AGT(配列番号14)、プローブ:TCC AGG CAG CAC CCC TGA TG(配列番号15);
マウスBv8 R2順方向:GAA CTC CAC GTG AGC GCA(配列番号16)、逆方向:GGG TCC CAT GTT GAT GAT GC(配列番号17)、プローブ:CTC CCT GAT ACA CAC CAG CCC ACC TG(配列番号18);
ヒトBv8 R1順方向:CTG GAA GGC TTC TTA CAA TGG(配列番号19)、逆方向:GGC ATC CCA ATT GTC TTG A(配列番号20)、プローブ:TCC AGG TCT GCA CTG GAC TTA CCG(配列番号21);
ヒトBv8 R2順方向:TCA CCA TCG TTC GTG ACT TC(配列番号22)、逆方向:AGA AGG CAG TGA GGT AGT GCT T(配列番号23)、プローブ:TCC TTC ACG AAC ACA GTG GGG AA(配列番号24);
マウスRPL19順方向:AGG TCA AAG GGA ATG TGT TCA AA(配列番号25)、逆方向:CCT TGT CTG CCT TCA GCT TGT(配列番号26)、プローブ:ACA AGC GCA TCC TCA TGG AGC ACA TC(配列番号27);
ヒトRPL19順方向:CGC AAG CGC CGT GAA(配列番号28)、逆方向:GGT CTC TTC CTC CTT GGA TAA AGT C(配列番号29)、プローブ:CCA GGC CAA GAA GGA GGA GAT CAT CA(配列番号30);
BM単核細胞(BMMNCs)、PB及び腫瘍細胞を、数種の腫瘍型を移植したマウスから収集した。赤血球細胞を、Ack(Cambrax, MA)溶解バッファーを使用して溶解した後、APCに結合させたラット抗マウスCD11b(Myletnyi Biotech, CA)及びPEに結合させたラット抗マウスGr1(BD Biosciences, CA)を用いて染色した。死滅細胞を排除するために、FACSCalibur機でのデータ獲得前に7AAD(アミノアクチノマイシンD; BD Biosciences CA)を全試料に加えた。
BMMNCを未処置のベージュヌードマウスから単離し、CD11b+Gr1+集団を、製造者によって提供されたプロトコルに従ってCD11bマイクロビーズ(Miltenyi Biotech、CA)を使用して選別した。選別した細胞のアリコートを抗CD11bAPC及び抗Gr1−PEで染色してCD11b+Gr1+細胞の純度(100%)を確保した。遊走アッセイでは、2.0×105細胞をトランスウェル(Corning Incorporated, NY)のトップチャンバーに蒔いた。ボトムチャンバーは600mLの培地(別個のウェルにヒトBv8、コントロール抗体、及びマウス組換えVEGFを含むBIT(Stem Cell Technologies, BC, Canada)が補填されたIMDM(Gibco BRL, CA))を含んでいた。細胞を37℃、5%CO2中で9時間インキュベートし、CD11b+Gr1+細胞の遊走を、ボトムチャンバー中の細胞を計数することによって評価した。
組換えマウスMCP−1、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、bFGF、VEGF、GM−CSF、G−CSF、SDF−1及びTNFαをR&D Systems(Minneapolis, MN)から購入した。組換えマウスKC、IFNg、Bv8(プロキネチシン−2)、IL−4、IL−10、IL−13、TGF−bはPeproTech Inc.(Rocky Hill, New Jersey)から購入した。全てのサイトカインは、50ng/mlで試験したVEGF及びBv8を除いて、10ng/mlで使用した。1:3希釈の条件培地を使用した(最終FBS濃度は0.17%であった)。データは全細胞数に対して正規化した。10%のFBSを含むDMEMを用いてマウス脚骨からBM細胞をフラッシングした。細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、0.2%のBSAを含むHBSS培地(低エンドトキシン、Serologicals Corp.Norcross, GA)に再懸濁させた。二百万の細胞を、5%のCO2インキュベーター中において37℃で4時間、様々なサイトカインと共に24ウェルプレートでインキュベートした。ついで、細胞をエッペンドルフ管に移し、遠心分離し、RNA溶解バッファー(Qiagen, Valencia, CA)によって溶解させた。Bv8の発現を内部コントロール遺伝子としてRPL19(リボソームタンパク質L19)を用いてTaqmanTMによって評価した。ある場合には、CD11b+Gr1+又はCD11b−Gr1−BM細胞を、FACS分取法を使用して得た。
腫瘍環境によって誘導されるBv8遺伝子発現に対する抗G−CSF抗体の効果を試験するために、Balbc/ヌードマウスから単離したBMMNCを、24−36時間の間マウスに移植されているHM7腫瘍の可溶化物か又はコントロールバッファーで4時間処理した。腫瘍可溶化物を、BMMNCに加える前に、様々な濃度のヤギ抗G−CSF中和ポリクローナルIgG(AF−414−NA、R&D Systems)又はコントロールヤギIgG(R&D Systems)と共に45分間プレインキュベートした。マウス及びヒトG−CSFをブロックする抗G−CSF IgGの能力を実証した。ついで、BMMNC中のBv8の発現を、TaqmanTM分析を使用して評価した。9匹の動物を研究に使用し、データを3回の独立した実験から分析した。
A673、HM7、HPAC及びCalu6細胞を、それらが〜90%の培養密度に達するまで、増殖培地で培養した。ついで、増殖培地を、0.5%のFBS含有DMEM:F12(50:50)培地に変えた。5×105/mlの密度で指数関数的に増殖しているTIB42細胞を、0.5%FBS含有DMEM:F12培地に切り替えた。3日間のインキュベーション後、条件培地を集めた。細胞生存率及び全細胞数を、Vi−CellTMXR細胞生存率アナライザー(Beckman Coulter)を用いて測定した。
A673、HM7、HPAC及びCalu6細胞をトリプシン処理し、96ウェルブラックViewplate(Packard Bioscience Company, Meriden, CT)中に播種する前に0.5%のFBSを含む培地で洗浄した。細胞を3日間、様々な量のBv8(PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ)と共にインキュベートした。10%FBS含有培地はポジティブコントロールとした。細胞増殖は、細胞増殖ELISAキット(Roche)を使用してBrdU取り込みによって評価した。
8週齢のBalb/cマウスに毎日連続して8日間、10mgの組換えヒトG−CSF(Neupogen, Amgen)を皮下注射した。コントロール動物にはPBSを与えた。実験の終わりに、分析のためにBM、全血及び脾臓試料を採取した。一グループの動物はG−CSF中断後2日間維持した。自動化高分解能フローサイトメトリーベースの血液アナライザー(CellDyn 3000)を使用して、好中球の計数を行った。血清及びBMのBv8レベルはELISAによって測定した。
CD11b+Gr1+細胞のG−CSF誘導動員におけるBv8の役割を決定するために、Balb/cヌードマウスに12時間あけて2用量の抗Bv8抗体(5+5mg/kg)を投与し、ついでMabの二回目の投薬から4時間後にマウスG−CSF(R&D Systems;2μg/マウス)を投与した。ポジティブコントロールとして、我々はラット抗マウスG−CSF Mab(Mab414、R&D Systems;10μg/マウス)を使用し、抗Bv8と同じ間隔で投与し、ついでマウスG−CSFを投与した。6時間後、マウスから血を採り、記載されたようにして、CD11b+Gr1+細胞の頻度を決定した。腫瘍のない状態でのBv8発現の調節におけるG−CSFの役割を決定するために、Balb/cヌードマウスに連続して8日間、毎日、コントロールラットIgG(Genentech)又はラット抗G−CSF Mab(Mab414、R&D Systems、10μg/マウス)の腹腔内注射した。動物を安楽死させ、全タンパク質をBMMNCから抽出した。Bv8レベルは、記載されたようにしてELISAによって測定した。腫瘍中でのBv8発現の調節におけるG−CSFの重要性を評価するために、上述のようにBalb/cヌードマウスを10μgのラット抗G−CSF Mab又はラットIgGで前処理し、続いて12時間後にHM7細胞(マウス当たり5×106)を移植した。コントロールには空のマトリゲルTMを移植した。ついで、動物に抗体を2日間毎日投与した。マトリゲルTM又は腫瘍の移植から48時間後に、マウスを安楽死させ、BMMNC中のBv8レベルを上述のようにして測定した。
組換えヒトBv8タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を産生した。二つの独立したアッセイを使用して抗体をスクリーニングした。一つのアッセイは、記載されているような(LeCouter等,2003, 上掲)、ウシ副腎皮質由来内皮細胞の増殖を誘導するBv8タンパク質の能力に基づくものであった。第二のアッセイは、そのレセプターのそれぞれを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞においてシグナル伝達カスケードを誘導するBv8の能力に依存している。簡潔に述べると、NFATプロモーター(Invitrogen)下でベータラクタマーゼ遺伝子を安定に発現するCHO細胞を、10%の仔ウシ血清を補填したDMEM中で増殖させた。pMSCV−ハイグロマイシン中のヒトPKR1又はPKR2 cDNA(Masuda, Y.等,上掲及びLin, D.C.等,上掲)を形質導入した。導入遺伝子を発現する細胞を2週間の間、500mg/mlハイグロマイシン中で選択した。続いて、レスポンダー細胞を、製造者によって示唆されたようにhBv8での16時間の刺激後にFRETベースの蛍光基質CCF4を切断するその能力のためにFACS分取によって単離した。Bv8誘導ベータラクタマーゼ発現をブロックするその能力について中和抗体を同定した。CHO−NFATベータラクタマーゼPKR1又はPKR2は、様々な濃度の精製されたマウスモノクローナル抗Bv8抗体の存在下又は不在下で16時間、100−200ng/mlのhBv8によって刺激した。刺激後、細胞を1時間CCF4と共にインキュベートし、96ウェルプレートリーダーEnvisionTM(Perkin Helmer)を用いて蛍光を測定した。
ヒト腫瘍細胞株Calu−6、A−673、JURKAT、HPAC及びHM7並びにマウスリンパ腫株EL4及びTIB42を、10%v/vのFBS、1%v/vのペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL−Gln及び1μg/mlのFungizoneTM(Invitrogen, CA)を補填したハムのF12、低グルコースDMEM1:1において増殖させた。細胞を95%空気/5%CO2の雰囲気下、37℃でインキュベートした。マウス異種移植実験では、腫瘍細胞を1×108細胞/mlの濃度で懸濁させ、Balb−c又はベージュヌードXID免疫不全マウス(Harlan Sprague Dawley, IN)の何れかの背側腹部に皮下注射した(100ml/マウス)。腫瘍細胞接種後24又は48時間の時点で、抗Bv8 mAb 2B9及び3F1の腹腔内投与を、10mg/kg(5mg/kgの各Mab)(n=10)の全用量で開始した。コントロールとして、我々は抗ブタクサMab及び抗VEGF Mab G6.31又はB20(Liang, W.C.等,J Biol Chem 281, 951-961(2006))を用いた。その後、マウスを毎週2回処理した。腫瘍体積を、楕円体体積式(6×L×W×H、ここで、L=長さ、W=幅、及びH=高さ)(Tomayko, M.M.及びReynolds, C.P., Cancer Chemother Pharmacol 24, 148-154(1989))を使用して二日毎に計算した。グループ間の差の統計的解析のために、一方向ANOVAの後にTukey HSDペアワイズ解析を、JMPソフトウェア(SAS Institute Inc.)を使用して実施した。<0.005のp値を有意と考えた。
腫瘍を、パラフィン包埋前に24時間かけて中性緩衝ホルマリンに固定した。H&E染色と免疫組織化学検査を過去に記載されているようにして(ref)実施した。簡潔に述べると、ラット抗マウスPLVAPモノクローナルMECA−32(BD-Pharmingen)を用いた免疫組織化学染色を、99℃とついで室温でそれぞれ20分間、標的抗原回収液(DAKO)を使用して実施した。一次抗体を、ビオチン化二次抗体(Vector)及びVectastain ABC EliteTM試薬を使用して順次検出した。反応産物は金属増強DAB(Pierce Chemical, IL)を使用して生成させた。切片をヘマトキシリンで軽く対比染色し、脱水し、カバーガラスをした。
LacZ及びmVEGF164をコードするアデノウイルスベクターは過去に記載されている(LeCouter等, 2001, 上掲)。アデノウイルスmBv8を、AdEasy XLTMアデノウイルスベクター系(Stratagene)を使用して生成した。アデノウイルスmBv8を、AdEasy XLTMアデノウイルスベクター系(Stratagene)を使用して生成した。そのC末端に6xHisタグを有するmBV8のcDNA(配列番号36)をpShuttle−CMVベクターのXhoI及びHind III部位間にクローニングした。得られたpShuttle−CMV−mBV8プラスミドを、アデノウイルスバックボーンで事前に形質転換された電気穿孔コンピテント株であるBJ5183−AD−1中でpAdEasy−1TMを用いて組換えた。ついで、組換えアデノウイルスBv8プラスミドを、ウイルス粒子のパッケージングのためにAD−293細胞中に形質移入した。アデノウイルスストックをCsCl勾配によって精製した。Adeno−X rapidTM力価キット(Clontech)を使用してアデノウイルスの力価を測定した。
腫瘍関連内皮細胞(TAEC)を、本質的に過去に記載されたようにして(Hida 等,Cancer Res 64:8249-8255(2004))、磁気ビーズ選別システム(Miltenyi Biotech)を使用して単離した。簡潔に述べると、TIB42マウスリンパ腫細胞を雌のベージュヌードマウスの背側腹部に注射した。腫瘍が〜1000mm3の直径に達したときに、それを切除し、刻み、ついでコラゲナーゼII(Worthington Biochemical Corporation)で消化させた。ついで、細胞懸濁液を、100μmから40μmのメッシュを使用して濾過した。最後に、CD31+細胞を、製造者の指示に従ってFITC−CD31抗体(BD Biosciences)を使用して選別した。EGM−2MV培地(Cambrex)の存在下でゼラチン被覆プレートにCD31+細胞を播種した。培養の24時間後、CD31+非接着細胞を、PBSで数回洗浄することによって除去した。
TIB42−TAEC細胞を、0.5%のBSAを補填した基本培地中で6時間飢えさせた。ついで、細胞をヒト組換えBv8(200ng/ml;PeproTech)、完全培地(CM)、VEGF(100ng/ml;PeproTech)又はBSA(0.5%)で刺激した。標示された時点で細胞抽出物を集めた。TIB42−TAEC細胞からの抽出物のウェスタンブロット分析を、PhosphoPlus p44/42 MAPKTM抗体キット(Cell signaling)を使用して実施した。この結果の一貫性及び再現性を評価するために、各条件を二回試験し、実験を三回実施して、同様の結果を得た。
HM7腫瘍を持つ動物に、二酸化炭素の吸入による安楽死の10分前に50ulの腹腔内注射を行った。胸腔を開け、心臓尖部に切開をし、ポリエチレンカニューレ(内径0.58mm、外径0.96mm)を左心室に通し、5−0の絹の縫合を用いて上行大動脈に取り付けた。0.9%の生理食塩水中の0.1mMのニトロプルシドナトリウムの17ml溶液を6ml/分の流量で灌流して、最大の血管拡張状態を提供し血液を除去した。市販されているクロム酸鉛ラテックスであるMICROFIL(登録商標)(Carver, MA)を製造者によって推奨されたようにして調製し、17mlについて2ml/分の流量で灌流した。対象の組織の切開前に、注入したラテックス混合物を室温で60分間重合させた。切開した腫瘍を10%の中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
ついで、腫瘍を、μCT40TM(SCANCO Medical, Basserdorf, Switzerland)X線マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)システムを用いて画像化した。腫瘍は背景培地として大豆油を用いて画像化した。マイクロCT画像を、45kVのエネルギーレベル、177mAの電流及び300ミリ秒の積分時間でX線管を操作することによって画像を生成した。軸方向の画像を16μmの等方性分解能で得られた。
4日間毎日、Balb/cマウス(n=20)にヒトG−CSF(10μg/日、Amgen)を皮下注射し、mGM−CSF(0.5μg/日、PeproTech)を腹腔内注射して、CD11b+gr1+集団を拡大させた。5日目に、BM細胞を単離し、細胞ペレットを2mlの0.5%Triton X−100TMに再懸濁させた。ついで、細胞可溶化物を25ゲージ針に4回強制的に通し、塩濃度を50mMのNaClに調節した。粗抽出物を、20mMのTris pH7.2、50mMのNaClで事前に平衡にしたヘパリン−セファロース(登録商標)カラム(Hi−Trap、1ml)に充填した。20mM Tris、pH7.2中50mMから1MのNaClと、続く1Mから2MのNaClの二段階の線形勾配を使用してカラムを溶出させた。流量は1ml/分であった。280nmでの吸光度をモニターした。1mlの画分を集め、ELISAとウェスタンブロットを使用してmBv8についてアッセイした。ウェスタンブロット分析では、100μlの画分を、Microcon YM−3(登録商標)スピンカラム(MILLIPORE)を使用して4倍に濃縮した後、4−20%のSDS−PAGE(Invitrogen)に充填した。ブロッキングバッファー(PBST、PBS中の0.1%Tween20及び5%脱脂粉乳)中10μg/mlの全濃度でmBv8に対する3種のハムスター抗体(2D3、3B8及び4E10)の組合せを使用してブロットを一晩染色した。3回の洗浄後、ブロットを西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ハムスターIgG(ImmunoResearch Laboratories)と共にインキュベートし、ついで増強ルミネッセンスプラスWestern blotting Detection SystemTM(GE Healthcare Bio-Science)を使用して展開した。
MaxiSorp(登録商標)96ウェルマイクロウェルプレート(Nalge NuncInternational, Rochester, NY)に、4℃で一晩、50mMの炭酸塩バッファー、pH9.6中の1.0mg/mlの3F1抗体(マウスBv8にも結合するマウス抗ヒトBV8抗体)を被覆した。プレートを、0.05%のポリソルベート20を含むPBSで洗浄し、室温で1時間、PBS中の0.5%のウシ血清アルブミン、10ppmのProclin300(登録商標)(Supelco, Bellefonte, PA)でブロックした。プレートを洗浄後、0.5%のウシ血清アルブミン、0.05%のポリソルベート20、10ppmのProclin300(登録商標)(Supelco, Bellefonte, PA)及び0.35NのNaClを含むPBS(サンプルバッファー)中のマウスBV8標準(2倍連続希釈での0.039−2.50、Genentech)及び試料(最小1:10希釈)をプレートに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした。未結合抗体を洗浄工程によって除いた。プレートに結合した抗体は、ビオチン化4E10抗体(ハムスター抗マウスBV8抗体、Genentech)と、ついで基質としてストレプトアビジン−HRP(GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)と3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加えることによって検出した。1Mのリン酸を加えることによって反応を停止させた。450nmでの吸光度をTitertekTMスタッカーリーダー(ICN, Costa Mesa, CA)で読み取った。4パラメーター回帰曲線適合化プログラム(Genentech)を使用して標準の滴定曲線を適合化させた。標準曲線の範囲に入るデータポイントを、試料中のマウスBV8濃度を計算するために使用した。
BM中でのBv8の発現が遠い部位の腫瘍増殖によって影響されるかどうかを決定するために、A673及びHM7腫瘍細胞を免疫不全マウスに移植した。図1aに示されているように、双方の腫瘍の移植は空のマトリゲルTM移植と比較してELISAによってBM中のBv8レベルに有意な増加を生じさせた。
BM中で生産されるBv8タンパク質を特徴付け、ELISAを検証するために、マウス骨髄単核細胞(BMMNC)可溶化物にヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを施した。追加の(以下S)図1aに示されているように、Bv8はカラムに強く結合し、〜0.4MのNaClの存在下で単一ピークとして溶出された。これは、免疫反応性画分に予想される〜9kDaのバンドの存在を裏付けたウェスタンブロット分析によって確認した(S図1b)。
BMMNCは、主として骨髄及びリンパ球系統の細胞の幾つかのサブセットからなる。BMMNCのどのサブセットがBv8に富んでいるかを解明するために、A673、Calu−6、HM7、HPAC及びJurkatを含む幾つかの腫瘍細胞株をマウスに移植した。TaqmanTM解析は、CD11b−Gr1−細胞(殆どが非骨髄サブセット)と比較して、Bv8がCD11b+Gr1+骨髄細胞(主に好中球からなるが、マクロファージ系統の細胞も含む(Yang等, Cancer Cell 6:409-421(2004); Dahl等, Nat Immunol 4:1029-1036(2003);Lagasse及びWeissman, J Immunol Methods 197:139-150(1996))において高度に発現されたことを示していた(図1b)。
BMMNCの異なったサブセットの分析は、G−CSFが、精製されたCD11b+Gr1+細胞においてバックグラウンドの100倍を超えるBv8のアップレギュレーションを生じることを明らかにした(図1d)。大幅に低いBv8のG−CSF媒介アップレギュレーションが全BM又はCD11b−Gr1画分において検出された。意外にも、GM−CSFはBv8の発現に効果を有しておらず(図1c&d)、よってこの因子の高度に選択的な性質を強調している。興味深いことに、IL−6及びSDF−1は、非選別BM細胞で試験したときは有意な刺激を示さなかったが、精製されたCD11b+Gr1+細胞で試験したときはBv8の有意な2−3倍のアップレギュレーションを生じた(図1c&d)。
正常な造血におけるBv8の役割を解明するために、抗Bv8又は抗ブタクサ(以下、コントロール)抗体を非腫瘍担持マウスにおいて試験した。抗Bv8もコントロールもBalb/cヌードマウスにおいて正常な造血及び血液学的パラメータに対して有意な効果を示さなかった(S図4)。これらのデータは、定常状態の生理学的条件下では、Bv8は造血の調節に非常に限られた役割を果たしていることを示唆している。
材料と方法
新鮮な骨髄採取物からの全ヒト骨髄細胞の単離
新鮮な骨髄試料をALLCELLS(Emeryville, CA)から得た。その骨髄を最初に10%FBS含有DMEMで希釈し、ついで40μmの細胞ストレーナー(BD Biosciences, Bedford, MA)に通して組織片を除去した。細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、赤血球細胞を、氷冷の0.2%NaClの存在下で30秒間溶解させた後、氷冷の1.6%NaClを加えた。
単離手順は過去に記載された通りである(Kulczycki A, Jr.J Immunol 133:849-854(1984))が、些細な変更を行った。簡潔に述べると、新鮮にヘパリン処理された健康なヒト血液(Health Services, Genentech Inc.)をCAPPEL LSMリンパ球分離培地(MP Biomedicals, Solon, Ohio)に適用した。ブレーキなしで3000rpmで15分間遠心分離した後、血漿を除き、単球を静止期に集めた。Monocyte単離キットII(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)及びFACS選別法を使用して単球を更に精製した。細胞集団の純度はCD14+CD16−発現によってFACSで評価した。カラムに結合する細胞を集めることによってリンパ球を収集し、その純度を、Tリンパ球ではCD3の発現により、Bリンパ球についてはCD19の発現により、検査した。好中球は、赤血球細胞の直ぐ上の層を注意して除去し、ついで0.9%NaClで調製したHBSS(Ca2+及びMg2+のない)及び6%デキストラン500(GE Healthcare Bio-sciences AB, Sweden)を添加することによって収集した。赤血球細胞を室温で30−60分静置させた後、上清中の好中球を除去した。残留している赤血球細胞は、その>9−%が除去されるまで、更に除去した。細胞の純度は、CD15+CD16+集団としてFACS分析によって評価した。末梢血からの3種の集団全て(好中球、単球及びリンパ球)は、FACS及び形態分析により>95%の純度であった。細胞をついで0.2%のBSAを含むHBSS(低エンドトキシン、Serologicals, Corp.Norcross, GA)で使用前に一回洗浄した。
RNeasyTMミニキット(Qiagen)を使用してRNAを調製した。一反応当たり50ngの全RNAをリアルタイムPCR(Taqman)分析に使用した。ヒトBv8に対して、精巣RNA(BD Biosciences)をコントロールとした。反応は、7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)の9600Emulationモードで操作し、標準曲線を用いた絶対的定量化をSequence Detection System(SDS)ソフトウェアと共に使用した。各遺伝子の発現レベルを、同じ試料中のハウスキーピング遺伝子RPL19に対して更に定量した。Taqmanプライマーの配列は次の通りである:ヒトBv8順方向:ATG GCA CGG AAG CTA GGA(配列番号10)、逆方向:GCA GAG CTG AAG TCC TCT TGA(配列番号11)、プローブ:TGC TGC TGG ACC CTT CCT AAA CCT(配列番号12); ヒトRPL19順方向:CGC AAG CGC CGT GAA(配列番号28)、逆方向:GGT CTC TTC CTC CTT GGA TAA AGT C(配列番号29)、プローブ:CCA GGC CAA GAA GGA GGA GAT CAT CA(配列番号30).ヒト特異的VEGF順方向:AAT GAC GAG GGC CTG GAG T(配列番号31)、逆方向:TTG ATC CGC ATA ATC TGC ATG(配列番号32)、プローブ:TGT GCC CAC TGA GGA GTC CAA CAT CA(配列番号33)。
ヒトPKR1/EG−VEGFR1及びPKR2/EG−VEGFR2に対するTaqman試薬はApplied Biosystemsから得られた。
組換えヒトMCP−1、MIP−1α、MIP−1β、MIP−2、bFGF、VEGF、GM−CSF、G−CSF、SDF−1a、M−CSF、エリスロポイエチン(EPO)及びTNFαをR&D Systems(Minneapolis, MN)から購入した。組換えヒトIL−8、IFNg、Bv8(プロキネチシン−2)、IL−4、IL−10、IL−13、TGF−bはPeproTech社(Rocky Hill, New Jersey)から購入した。SCF(幹細胞因子)はInvitrogen Biosource(Carlsbad, CA)からであった。ある場合には、AmgenからのG−CSF(Neupogen/Filgrastim)を使用した。全てのサイトカインは、10ng/mlで使用した。新鮮に精製した細胞を洗浄し、0.2%のBSAを含むHBSS培地(低エンドトキシン、Serologicals Corp.Norcross, GA)に再懸濁させた。二百万の細胞を、5%のCO2インキュベーター中において37℃で4時間、様々なサイトカイン及びケモカインと共に24ウェルプレートでインキュベートした。ついで、細胞をエッペンドルフ管に移し、遠心分離し、RNA溶解バッファー(Qiagen, Valencia, CA)によって溶解させた。Bv8の発現を内部コントロール遺伝子としてRPL19(リボソームタンパク質L19)を用いてTaqmanによって評価した。
500mlの新鮮なヒト血液からの好中球を、上述のようにして単離した。細胞ペレットをプロテイナーゼ阻害剤(Roche)と共に10mlの0.5%トリトンX−100中に懸濁させ、4℃でシェイカーにて10分間溶解させた。ついで、細胞可溶化物を25ゲージ針に2回強制的に通し、塩濃度を50mMのNaCl、20mMのトリスHCl(pH7.3)に調節した。粗抽出物を、20mMのTris pH7.2、50mMのNaCl及び0.5%のトリトンX−100で事前に平衡にしたヘパリン−セファロースカラム(Amersham Biosciences, Sweden)に充填した。0.5%のTriton X−100の存在下で20mM Tris、pH7.3中50mMから20mMのTrisの線形勾配を使用してカラムを溶出させた。流量は1ml/分であった。280nmでの吸光度をモニターした。1mlの画分を集め、ELISAによってヒトBv8についてアッセイした。ピークBv8画分及び幾つかのオフピーク画分をついでプール化し、Microcon Centrifugal Filter Devices、Ultracel YM−3(Millipore, Bedford, MA)を使用して10倍まで濃縮し、その生物学的活性について試験した。
MaxiSorp(登録商標)96ウェルマイクロウェルプレート(Nalge NuncInternational, Rochester, NY)に、4℃で一晩、50mMの炭酸塩バッファー、pH9.6中の1.0μg/mlの3F1マウスモノクローナル抗体(Genentech Inc.)を被覆した。プレートを、0.05%のポリソルベート20を含むPBSで洗浄し、室温で1時間、PBS中の0.5%のウシ血清アルブミン、15ppm(百万分率)のProclin300(Supelco, Bellefonte, PA)でブロックした。プレートを洗浄後、0.5%のウシ血清アルブミン、0.05%のポリソルベート20、15ppmのProclin300(Supelco, Bellefonte, PA)及び0.35NのNaClを含むPBS(サンプルバッファー)中のヒトBv8標準(2倍連続希釈での0.020−2.5ng/ml、PeproTech, Rocky Hill, NJ)及び試料(最小1:10希釈)を連続希釈し各ウェルに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートした後、洗浄工程を続けた。結合したBv8は、二次抗体、ビオチン化ハムスター抗Bv8抗体クローン3B8(Genentech Inc.)と、ついで基質としてストレプトアビジン−HRP(GE Healthcar, Buckinghamshire, United Kingdom)と3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加えることによって検出した。1Mのリン酸を加えることによって反応を停止させた。450nmでの吸光度をThermoMaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)で読み取った。4パラメーター回帰曲線適合化プログラム(Genentech Inc)を使用して標準の滴定曲線を計算した。ヒトBv8濃度は、標準曲線におけるデータ範囲に試料の光学密度値を外挿することによって計算した。Bv8ELISAは、10%の溶解バッファーまで測定することができ、組織可溶化物中の0.20ng/mlと少ないBv8を検出する感度を有していた。ELISAを特に開発し、Bv8に対して最適化したのは、30μg/mlまでのヒトEG−VEGF、VEGF−A、VEGF−C及びG−CSF(R&D Systems, Minneapolis, MN)だけがバックグラウンドシグナルを与え;30μg/mlまでのこれらの分子及び抗VEGF(Genentech Inc.)の存在がサンプルバッファー中100pg/mlのヒトBv8の検出に影響を及ぼさなかったためである。このELISAはマウスBv8もまた検出できたが、7%未満の感度であった。
GeneBLAzer(登録商標)NFAT−CHO細胞をInvitrogen Corporation(Carlsbad, CA)から得た。細胞にPKR1/EG−VEGFR1を安定に形質移入し、10%の透析血清、0.1mMのNEAA、2mMのGlutaMaxTM(Gibco)、1mMのピルビン酸ナトリウム、10μg/mlのZeocin、500μg/mlのハイグロマイシンを含むDMEM(高グルコース)中で増殖させた。5%CO2、37℃で、細胞を96ウェルViewplate(Packard)に1%のDMEM中80ml/ウェル中、2.5×104で一晩かけて播種した。次の日に、細胞を、MilliporeからのMicrocon遠心フィルター装置(Ultracel YM-3)で濃縮した様々なカラム画分で処理した。1%のDMEM中で調製した0.2−0.02ng/mlのhBv8(Peprotech Inc.)をポジティブコントロールとして用いた。1時間後、培地を取り除き、0.1%のBSAを含む80mlのハンクス液及び1mMのCCF4(Invitrogen Corporation)を含む6×の充填バッファーと置き換えた。プレートを暗所で室温で1.5時間インキュベートし、410nmの励起波長と450/520nmの発光波長にてWallacプレートリーダーで読み取った。ネガティブコントロールはリガンドを添加していない細胞であり、コントロールは培地単独であった。CHO細胞を、β−ラクタマーゼ基質CCF4を添加する前に1時間、組換えヒトBv8又はプール化画分で刺激した。カラム画分の特異性を評価するために、抗Bv8抗体2B9及び3F1を20mg/mlで加えた。
末梢白血球細胞は、アフェレーシス収集物(Cellular Therapy and Cell Processing Facilities, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)によるG−CSF処理の4−5日後に正常なドナーから得た。未処置個体からの白血球細胞を同じ手順で集め、不対コントロールとした。ついで、細胞を濃縮し、ヒト血清アルブミンと10%のDMSOを含む凍結保護培地中に再懸濁させた。37℃の水浴での解凍後、細胞生存率は、トリパンブルー排除試験で>95%であった。0.2%のBSAを含むHBSSバッファーで細胞を簡単に洗浄し、RNA抽出又はタンパク質測定のために、RNA溶解バッファー(Qiagen)又はプロテイナーゼ阻害剤含有RIPAバッファー(Roche)の何れかに溶解させた。
106細胞を、5μmの孔径を有するトランスウェルインサート(Corning Incorporated, Lowell, MA)中に入れる前に、0.2%のBSAを含むHBSSで洗浄した。下方のチャンバーに、培地単独又は様々なサイトカインを様々な濃度(最大200ng/ml)で含む培地を添加した。37℃で3時間後、下方チャンバー内の細胞を移し、9mlのZPAK溶液と混合し、Z2Coulter粒子カウント及びサイズアナライザー(Beckman Coulter, Fullerton, CA)でカウントした。
U937、HL−60、THP−1、Hel92.1.7、KG−1、K562、Jurkat細胞をATCC(登録商標)(Manassas, VA)から得た。殆どの細胞は10%のFBSを含有するRPMI中で増殖させた。KG−1細胞は、20%のFBSを含有するIscoveの変法ダルベッコ培地で増殖させた。THP−1細胞では、10%のFBSを含有するRPMIを、ピルビン酸ナトリウム、HEPES及びβ−メルカプトエタノールと共に使用した。調節の研究では、95%より高い生存率の百万の細胞を使用した。調節研究は、0.2%のBSAを含む1mlのHBSS培地中で4時間、正常酸素圧及び低酸素の双方の条件下で実施した。
スチューデントt検定を使用して統計的有意性を計算した。
ヒト骨髄及び様々な血液細胞におけるBv8の調節
G−CSFが、マウス骨髄細胞及び末梢好中球におけるBv8発現の劇的なアップレギュレーション(>30倍)を生じせしめることが過去に報告されている(Shojaei等 Nature 450:825-831(2007)及び実施例1)。
本研究では、G−CSFがまた単離されたヒト末梢好中球及び全骨髄細胞におけるBv8の発現の誘導因子であるかどうかが評価された。10ng/mlのG−CSFが4時間以内にBv8の発現の平均7倍(6−12の範囲)の誘導を生じさせた。マウス好中球と比較して低い倍率の増加は、少なくとも部分的には、ヒト細胞におけるBv8のより高い基礎発現のためでありうる(データは示さず)。時間経過研究は、G−CSFがBv8mRNAを4時間以内に誘導し、効果が24時間まで維持された(データは示さず)ことを示している。我々はヒト骨髄細胞及び好中球におけるBv8の発現の更なるポジティブな調節因子としてGM−CSFを同定した(図14A及びB)。Bv8の発現における有意な〜2.5倍の増加が10ng/mlのGM−CSFで観察された。これは、GM−CSFによるBv8誘導を示さないマウス好中球とは異なる。IL−6、IL−1β、及びEPO(エリスロポイエチン)を含む試験した他のサイトカインは、好中球又は骨髄細胞中でのヒトBv8の発現に対して刺激効果を有していなかった。
結論としては、好中球におけるBv8遺伝子発現に対するG−CSF及びGM−CSFの効果は、M−CSFとSCFの二つの関連するサイトカインが効果を持たないので、全くユニークであった。
PKR1/EG−VEGFR1とPKR2/EG−VEGFR2の双方を発現するマウス好中球とは異なり、単離されたヒト好中球は、PKR2/EG−VEGFR2のみを検出可能なレベルで発現する。インビトロでの4時間のインキュベーション後に、G−CSFではなくGM−CSFがPKR2/EG−VEGFR2発現の有意なアップレギュレーション(平均4倍の誘導)を誘発した(図15A)。ヒト骨髄において、G−CSFとGM−CSFの双方が有意なレベルでPKR2/EG−VEGFR2を調節すると思われる(図15B)。
11名の未処置及び12名のG−CSF処置個体からの末梢血単核細胞をアフェレーシス収集を介して得た。我々はTaqmanによってBv8の遺伝子発現を調べ、またELISAによってBv8タンパク質レベルを測定した。Bv8の発現の約4.5倍の増加とタンパク質レベルの10倍の増加が、未処置ドナーからの単核細胞と比較してG−CSF動員単核細胞において検出された(図16)。同様に、PKR1/EG−VEGFR1ではなくPKR2/EG−VEGFR2が、患者が4−5日間、G−CSFで処置された場合に臨床的に収集された白血球細胞中で検出可能であった。G−CSF処置個体からの単核細胞は、未処置コントロール試料と比較して、PKR2/EG−VEGFR2発現の有意な誘導(〜2倍)を示した(図16B)。
Bv8タンパク質を特徴付けるために、我々は、0.5%のTriton(登録商標)X−100中に末梢ヒト好中球ペレットを溶解させた。ついで、好中球可溶化物に、材料と方法に記載されたようにして、ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを施した。図14Aに示されているように、マウスBv8タンパク質と同様に、Bv8はカラムに結合し、〜0.4MのNaClの存在下で溶出した。ELISAは更に画分9、10及び11におけるBv8の存在を確認した(図17A)。
微量のTriton(登録商標)X−100でさえ増殖アッセイにおいて内皮細胞に有意に細胞毒性であることが見出されているので、我々は、より短い刺激時間を必要とするアッセイにおいて好中球誘導Bv8タンパク質の活性を試験した。我々は、材料と方法に記載されているように、PKR1/EG−VEGFR1が安定して形質移入されたCHO細胞を利用した。予想されたように、組換えヒトBv8(0.2−200ng/ml)は用量依存的な刺激を誘発した(データは示さず)。図17Bに示されるように、免疫反応性Bv8を含むカラム画分は、Triton(登録商標)X−100バッファーコントロールと比較して有意な刺激を示した。しかしながら、免疫反応性Bv8を含まない副画分は刺激効果を示さなかった。また、抗Bv8抗体はプールされたBv8含有画分による刺激をブロックした。200ng/mlまで試験されたVEGF−Aは、反応を誘発せず、効果の特異性を更に確認した。
我々は、Bv8がヒト好中球に対して化学走性を有しうる可能性を試験した。図18に示されるように、Bv8は、最大コントロールの〜3倍の効果で、化学走性の有意な刺激を誘導した。興味深いことに、最大の刺激は非常に低いBv8濃度(〜2pM)で生じた。同様なパターンが6名の独立したドナーで観察された(図18)。SDF−1α、IL−8及びG−CSFのような他の化学走性因子は、好中球遊走を刺激するためにより高い濃度(20nM)を必要とした。VEGF及びMCP−1は試験した全ての濃度で効果を示さなかった(データは示さず)。
Bv8が白血病細胞によって発現されるかどうかを決定するために、我々はヒト細胞株のパネルを試験した。Bv8の発現は、Jurkat及びK562細胞株では検出可能ではなかった(データは示さず)。しかしながら、検出可能なBv8mRNAレベルが、HL−60、KG−1、Hel92.1.7及びU937細胞株で見出された。10ng/mlのG−CSFが、幾つかの細胞株においてBv8の発現の増加(2−3倍)を誘導した(追加の表2)。しかしながら、試験された細胞株の何れにおいてもGM−CSFによる有意な誘導は観察されなかった。G−CSFもGM−CSFも急性前骨髄球性白血病細胞株HL−60中でのBv8の発現に影響しなかった。
好中球及び他の骨髄細胞は自然免疫におけるその役割が最もよく知られており、病原に対する第一線の保護を与える(Bendelac及びFearon, Curr Opin Immunol 9:1-3(1997)。また、様々な急性及び慢性炎症性過程へのこれら細胞の参加はよく確立されている(O'Shea及びMurray, Immunity 28:477-487(2008)。更に、炎症性細胞と癌の間の関連は、元々は19世紀に提案されていたが、最近広い実験的及び臨床的裏付けが得られた(Coussens及びWerb, Nature 420:860-867(2002);Lin及びKarin, J Clin Invest 117:1175-1183(2007)で概説)。様々な炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの分泌腫瘍増殖及び血管新生を直接促進しうる。更に、腫瘍浸潤骨髄細胞は、CD4+及びCD8+細胞を含むT細胞のサブタイプ、よって、CD11b+Gr1+細胞の少なくともサブセットに対する骨髄誘導サプレッサー細胞(MDSC)の種類における免疫応答をダウンレギュレートするその能力によって腫瘍増殖を容易にしうる(Talmadge JE, Clin Cancer Res 3:5243-5248(2007)で概説)。
本発明を特定の実施態様であると考えられるものを参照して説明したが、発明はかかる実施態様に限定されないことが理解されなければならない。それどころか、発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形及び均等物をカバーするものである。
特許請求の範囲を含む本願の全体を通して、「含む(comprising)」なる用語は、更なる記載されていない要素又は方法工程を排除しない包括的でオープンな連結語句として使用される。
Claims (41)
- 腫瘍の治療方法であって、既に血管内皮性増殖因子(VEGF)アンタゴニストにて治療された腫瘍を有するヒト被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法。
- 腫瘍が前記VEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である、請求項1に記載の方法。
- VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体ないしその断片である、請求項1に記載の方法。
- 抗VEGF抗体がベバシズマブないしその断片又は変異体である、請求項3に記載の方法。
- Bv8アンタゴニストが抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしその断片である、請求項1に記載の方法。
- Bv8レセプターがPKR2/EG-VEGFR2である、請求項5に記載の方法。
- 抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしその断片がキメラ、ヒト化、又はヒトである、請求項5に記載の方法。
- さらに、前記ヒト被検体に抗VEGF抗体を投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 抗VEGF抗体がベバシズマブないしその断片又は変異体である、請求項8に記載の方法。
- さらに、前記ヒト被検体に化学療法又は放射線療法を行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- 化学療法が細胞障害性剤の投与を含む、請求項10に記載の方法。
- 腫瘍が大腸癌、直腸癌又は肺癌である、請求項1に記載の方法。
- 癌が大腸又は直腸の転移性カルチノーマである、請求項12に記載の方法。
- 癌が非扁平上皮性非小細胞肺癌(NSCLC)である、請求項12に記載の方法。
- さらに、治療前の数又は頻度と比較して、ヒト被検体から得た腫瘍細胞又は末梢血の試料においてCD11b+Gr1+細胞の数又は頻度を決定することによって、前記治療の有効性をモニタリングする工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍の治療方法であって、
(a) 腫瘍を有するヒト被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与すること、そして、
(b) 治療前の数又は頻度と比較して、ヒト被検体から得た腫瘍細胞又は末梢血試料においてCD11b+Gr1+細胞の数又は頻度を決定することによって、前記治療の有効性をモニタリングし、このとき数又は頻度の減少が治療が有効であることを示すこと
を含む方法。 - ヒト被検体における炎症細胞媒介性の血管形成の阻害方法であって、該被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法。
- 前記アンタゴニストが抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしその断片である、請求項17に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片がキメラ、ヒト化、又はヒトである、請求項18に記載の方法。
- さらに、更なる血管形成の阻害薬を投与することを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記の更なる血管形成の阻害薬が血管形成因子に対する抗体である、請求項20に記載の方法。
- 前記血管形成因子が、血管内皮性増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン、肝細胞増殖因子(HGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- Bv8アンタゴニストによる治療のための腫瘍保持ヒト被検体の識別方法であって、被検体がVEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性であると決定することを含む方法。
- VEGFアンタゴニストが抗VEGF抗体又はその断片である、請求項21に記載の方法。
- VEGFアンタゴニストがベバシズマブないしはその断片又は変異体である、請求項24に記載の方法。
- 腫瘍の治療方法であって、腫瘍保持ヒト被検体にG−CSFアンタゴニストの有効量を投与することを含む方法。
- G−CSFアンタゴニストが抗G−CSF抗体である、請求項26に記載の方法。
- さらに、更なる抗腫瘍剤の投与を含む、請求項27に記載の方法。
- 更なる抗腫瘍剤が抗Bv8抗体および/または抗VEGF抗体である、請求項28に記載の方法。
- ヒト被検体における好中球移動の阻害方法であって、該被検体にBv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法。
- 前記アンタゴニストが抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしその断片である、請求項30に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片がキメラ、ヒト化又はヒトである、請求項31に記載の方法。
- 抗血管形成療法から利益を得る非腫瘍性状態の治療方法であって、既に該非腫瘍性状態と診断され、血管内皮性増殖因子(VEGF)アンタゴニストにて治療されたヒト被検体に、Bv8アンタゴニストの有効量を投与することを含む方法。
- 前記非腫瘍性状態が前記VEGFアンタゴニストによる治療に抵抗性である、請求項33に記載の方法。
- 前記非腫瘍性状態が、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞からの浮腫、糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、後水晶体線維増殖症、血管形成緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶反応、網膜/脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)、眼血管形成疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺流出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中/閉頭部外傷/外傷と関係するもの)、滑液炎症、RAのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(OA)、難治性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第3区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)のような慢性炎症、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織塊成長、血友病関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー・ウェーバー症候群、化膿肉芽腫後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管性接着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液および胸水からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記非腫瘍性状態が、糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、後水晶体線維増殖症、血管形成緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管形成、角膜移植片血管形成、角膜移植片拒絶反応、網膜/脈絡叢血管形成、アングルの血管形成(ルベオーシス)および眼性血管形成疾患からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗Bv8又は抗Bv8レセプターモノクローナル抗体ないしその断片である、請求項33に記載の方法。
- 抗体又は抗体断片がキメラ、ヒト化又はヒトである、請求項37に記載の方法。
- マウスの抗Bv8抗体3F1又は2B9と同じエピトープを基本的に結合する中和抗Bv8抗体。
- 抗体がキメラ、ヒト化又はヒトである、請求項39に記載の組成物。
- 抗体が抗体断片である、請求項40に記載の組成物。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013500993A (ja) * | 2009-07-31 | 2013-01-10 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Bv8アンタゴニスト又はg−csfアンタゴニストを用いた腫瘍転移の阻害 |
JP2014525412A (ja) * | 2011-08-17 | 2014-09-29 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 難治性腫瘍における血管新生の阻害 |
JP7465210B2 (ja) | 2017-11-29 | 2024-04-10 | シーエスエル リミティド | 虚血-再灌流障害の治療又は予防方法 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ543755A (en) * | 2001-08-29 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Bv8 nucleic acids and polypeptides with mitogenic activity |
EP1615659B1 (en) | 2003-03-12 | 2014-04-16 | Genentech, Inc. | Use of bv8 and/or eg-vegf to promote hematopoiesis |
EP2468864A1 (en) * | 2007-03-02 | 2012-06-27 | Marina Biotech, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting VEGF family gene expression and uses thereof |
US8664365B2 (en) | 2009-10-14 | 2014-03-04 | Kalobios Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies to EphA3 |
MX2012007379A (es) * | 2009-12-23 | 2012-08-31 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-bv8 y usos de los mismos. |
WO2011103389A1 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Cornell University | Method to treat autoimmune demyelinating diseases and other autoimmune or inflammatory diseases |
WO2013082511A1 (en) | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Genentech, Inc. | Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists |
US20150118215A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-04-30 | The General Hospital Corporation | Methods of Inhibiting Cell Proliferation |
TWI498425B (zh) * | 2013-01-08 | 2015-09-01 | Nat Univ Tsing Hua | 層析濾紙型酵素連結免疫吸附分析法 |
WO2014159923A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Health Research, Inc. | Enhancement of vaccines |
US10034922B2 (en) * | 2013-11-22 | 2018-07-31 | Gemvax & Kael Co., Ltd. | Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same |
CN104237223B (zh) * | 2014-10-08 | 2017-04-12 | 江苏奥赛康药业股份有限公司 | 测定铁‑碳水化合物络合物中不稳定铁含量的方法 |
CN104587469A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-05-06 | 马洁 | G-csf拮抗剂在治疗慢性炎症、预防炎症相关肿瘤中的应用 |
EP3384029B1 (en) * | 2015-12-03 | 2022-01-05 | National Health Research Institutes | Heterodimeric vascular endothelial growth factor and use thereof |
WO2018108862A1 (en) * | 2016-12-12 | 2018-06-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antagonist of prokineticin receptor 2 for use as a medicament for treating an eg-vegf-related cancer |
US11524053B2 (en) | 2018-01-26 | 2022-12-13 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for treatment of angiogenic disorders using anti-VEGF agents |
CA3168512A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Napoleone Ferrara | Long-acting vegf inhibitors for intraocular neovascularization |
CN117054649A (zh) * | 2023-08-04 | 2023-11-14 | 广州中医药大学第一附属医院 | 一种慢性萎缩性胃炎向胃癌转化标志物及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005504532A (ja) * | 2001-08-29 | 2005-02-17 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | マイトジェン活性を有するBv8核酸及びポリペプチド |
JP2007520998A (ja) * | 2003-03-12 | 2007-08-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 造血促進のためのbv8及び/又はeg−vegfの使用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE9704545D0 (sv) * | 1997-12-05 | 1997-12-05 | Astra Pharma Prod | Novel compounds |
US7323479B2 (en) * | 2002-05-17 | 2008-01-29 | Celgene Corporation | Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline |
CN1802169A (zh) * | 2003-03-12 | 2006-07-12 | 健泰科生物技术公司 | Bv8和/或EG-VEGF促进造血的用途 |
ME00425B (me) * | 2003-05-30 | 2011-10-10 | Genentech Inc | Liječenje sa anti-vegf antitijelima |
WO2007033140A2 (en) * | 2005-09-13 | 2007-03-22 | Zymogenetics, Inc. | Prok2 antagonists and methods of use |
ITRM20070182A1 (it) | 2007-04-03 | 2008-10-04 | Univ Roma | Antagonisti dei recettori delle prochineticine derivati di essi e loro uso |
-
2008
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005504532A (ja) * | 2001-08-29 | 2005-02-17 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | マイトジェン活性を有するBv8核酸及びポリペプチド |
JP2007520998A (ja) * | 2003-03-12 | 2007-08-02 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 造血促進のためのbv8及び/又はeg−vegfの使用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN5010015657; FERRARA N: 'DISCOVERY AND DEVELOPMENT OF BEVACIZUMAB, AN ANTI-VEGF ANTIBODY FOR TREATING CANCER' NATURE REVIEWS. DRUG DISCOVERY V3 N5, 20040501, P391-400, NATURE PUBLISHING GROUP * |
JPN5010015659; SHOJAEI FARBOD: 'TUMOR REFRACTORINESS TO ANTI-VEGF TREATMENT IS MEDIATED BY CD11B+GR1+ MYELOID CELLS' NATURE BIOTECHNOLOGY V25 N8, 200708, P911-920 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013500993A (ja) * | 2009-07-31 | 2013-01-10 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | Bv8アンタゴニスト又はg−csfアンタゴニストを用いた腫瘍転移の阻害 |
JP2014525412A (ja) * | 2011-08-17 | 2014-09-29 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 難治性腫瘍における血管新生の阻害 |
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