JP2010539934A - イントロンrnaを用いたヒト胚性幹様細胞の生成 - Google Patents
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Abstract
Description
2006年に、高橋と山中は人工多能性幹(iPS)細胞を新たに導入した(Cell 126: 663-676)。マウス線維芽細胞への4つの転写因子遺伝子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)の遺伝子導入による送達を用いて、インビトロで体細胞性線維芽細胞を胚性幹(ES)様多能性細胞に再プログラミングして形質転換させることに成功した。2007年には、これらのiPS細胞の行動特性に関する特性がマウス胚性幹(mES)細胞と同様なことが確認されている(Okitaら, (2007) Nature 448: 313-317; Wernigら, (2007) Nature 448: 318-324)。一方、Yuらは、Oct4、Sox2、Nanog、及びLIN28という4つの他の導入遺伝子を用いて、同様な方法でヒト線維芽細胞からより新しいiPS細胞株を開発している(Yuら, (2007) Science 318: 1917-1920)。iPS細胞の利用は、従来のhES細胞の倫理的問題及び混在性問題を解決するだけでなく、体細胞核移植(SCNT)技術と併用すれば、患者に優しい療法を提供する可能性もある(Meissnerら, (2006) Nature 439: 212-215)。このようなiPS細胞に基づくSCNT療法は、遺伝子導入マウスモデルにおける鎌状赤血球貧血治療の成功で証明された(Hannaら, (2007) Science 318: 1920-1923)。しかし、まだiPS細胞の適用は完全には進んでいない。iPS細胞の生成過程には2つの問題が生じる。その1つはレトロウイルス導入遺伝子の使用であり、もう1つは癌遺伝子(例えばc-Myc)の使用である。レトロウイルス感染は、標的体細胞に4つの完全長遺伝子を同時且つ遺伝子導入による送達する唯一の有効な手段であるが、形質移入細胞のゲノム内へのレトロウイルスベクターのランダムな挿入は、他の非標的遺伝子にも影響し、予測しない結果を引き起こす可能性がある。これは送達された1つ以上の遺伝子が癌遺伝子の場合に特に危険である。
インビボでの遺伝子サイレンシングメカニズムに向けた細胞内のRNAスプライシング及びプロセシングを引き起こす方策を、本発明のPol-II転写による組換え遺伝子ベクター、すなわちSpRNAi-RGFPを用いて試験した。上記SpRNAi-RGFPには、miRNA及びヘアピン状shRNAのような、イントロン遺伝子サイレンシングエフェクター発現用の人工のスプライシング可能なイントロン(SpRNAi)が含まれる(図3A及びB)。実施例1及び2に示すように、いくつかの合成DNA配列を順次連結させることで、遺伝子工学的にSpRNAiを赤方偏移蛍光タンパク質遺伝子(RGFP)に組み込む。SpRNAiは、スプライセオソーム、エキソソーム、及びNMDシステムの構成要素のような細胞内RNAのスプライシング及びプロセシングメカニズムによって放出され、その後成熟miRNA又はshRNA遺伝子サイレンシングエフェクターの生成によって、イントロンRNA媒介性の遺伝子サイレンシングを引き起こせる前駆体miRNA又はshRNA挿入配列を含む。本発明者らはここで、組換え遺伝子転写産物又は構造体の細胞内RNAスプライシング及びプロセシングによる標的遺伝子のサイレンシング誘導モデルを示すが、同じ原理を、I型RNAポリメラーゼ(Pol-I)によって主に転写されるリボソームRNA前駆体(pre-rRNA)のRNAプロセシングを通して機能する遺伝子サイレンシングエフェクターの設計及び作製にも使用できる。SpRNAiの運搬及び生成に使用できる他のRNA転写産物には、hnRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、ウイルスRNA、及びこれらの前駆体と誘導体が含まれる。
上記及び前述の実験によって、インビボで標的遺伝子の発現をサイレンシングさせるために、イントロンmiRNAが有効な手段及び方法を提供する事実が立証される。本発明者らは、まずイントロンmiRNA媒介性の遺伝子サイレンシングの有効性を評価し、ついで最適な遺伝子サイレンシング効果を誘導できるイントロンpre-miRNA挿入配列の最良の構造設計を決定する。これらの研究によって、RNAi関連の遺伝子サイレンシングメカニズムの細胞内集合であるRNA誘導性遺伝子サイレンシング複合体(RISC)のための成熟miRNA鎖の選択において、強力な構造的選択性が存在することが分かった。RISCは、標的遺伝子転写産物の分解、又はRNA干渉(RNAi)もしくは転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)メカニズムによる標的遺伝子転写産物の翻訳抑制のいずれかを誘導するタンパク質-RNA複合体である。
上記の試験に基づき、本発明者らは、試験したhpESC、PC3、及びColo細胞において発生及び分化に関連する標的遺伝子を形質移入によってサイレンシングさせるために、手動連結したmir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d pre-miRNAクラスター挿入配列、又は手動再設計したmir-302 pre-miRNA挿入配列(例えば、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3' (SEQ.ID.N0.9)を含むヘアピン状配列)のいずれかと合わせた最適なSpRNAi-RGFP構造体を設計して試験した。mir-302a、mir-302b、mir-302c、及びmir-302dの成熟配列はそれぞれ、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3'(SEQ.ID.NO.10)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3'(SEQ.ID.NO.11)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3'(SEQ.ID.NO.12)、及び5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3'(SEQ.ID.NO.13)である。これらのmir-302相同配列は、最初の17ヌクレオチドにおいて5’末端領域の高度な保存を共有しており(100%相同)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3'(SEQ.ID.NO.3)と同じである。これらのmir-302相同配列において、チミン(T)はウラシル(U)と置換して使用できる。
mir-302形質移入細胞の胚性幹(ES)様特性をさらに調べるために、本発明者らはこれらの胚様体の形成、ESマーカー遺伝子の発現、ゲノムの脱メチル化、及び細胞移動の減少を評価した。極めて高い細胞培養飽和密度(>85〜95%)で、mir-302形質移入細胞は、胚様体(EB)さらには天然のヒトES細胞に由来するEBを思わせる密集したコロニーを形成する傾向を示した(図6A)。しかしながら、ホルモン又は成長因子による適切な誘導がないと、これらのEB様体は崩壊し、継代培養中に神経様の始原細胞に分化する(最下部右図)。これらのES及びES様細胞種の遺伝的特性を試験するために、本発明者らはさらにこれらのESマーカー遺伝子の発現を評価した。例えば、図6Bに示すように、導入遺伝子mir-302を形質移入したColo細胞(Colo+mir-302)は、Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及びさらにはSox2のような標準ES細胞マーカーの全種類を強力に示しているが、Colo細胞、及び空のSpRNAi-RGFPベクター(Colo+ベクター)、mir-gfp miRNAを発現するベクター(Colo+mir-gfp)、又は天然のmir-434-5p miRNAを発現するベクター(Colo+mir-434-5p)を形質移入させた対照Colo細胞では、ES細胞マーカーは検出されない。mir-434-5pとmir-302sは相同な標的遺伝子配列を全く共有していない。Colo細胞は分化したヒト黒色腫細胞株なので、この結果は、SpRNAi-RGFP媒介性のmir-302形質移入によって、Colo細胞を胚性幹細胞と極めて似ているES様状態に再プログラミングできることを示している。
形質移入細胞における導入遺伝子mir-302発現を確認するために、本発明者らはマイクロRNA(miRNA)マイクロアレイ分析を実施している。細胞飽和密度70%において、各細胞株からの短鎖RNAをmirVana(登録商標) miRNA単離キット(Ambion, Inc., Austin, TX)を用いて、製造元の指示に従い単離する。単離した短鎖RNAの純度及び量を1%ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動(Bio-Rad, Hercules, CA)、さらに分光光度計測定を用いて評価した後、miRNAのマイクロアレイ分析のためにLC Sciences社(San Diego, CA)に送付する。Cy3及びCy5強調画像では、信号強度がレベル1からレベル65,535に上昇するのに合わせて、色が青から緑、黄、そして赤へと変化する。Cy5/Cy3比の画像では、Cy3濃度がCy5濃度より高い場合は緑色となり、Cy3濃度がCy5濃度と等しい場合は黄色、そしてCy5濃度がCy3濃度より高い場合は赤色となる。図7Aに示すように、Cy3は未処理細胞(すなわちColo)を指すが、Cy5は導入遺伝子mir-302形質移入細胞(すなわちColo+mir-302)を指す。Cy5/Cy3比画像では(最右)、SpRNAi-RGFP媒介性のmir-302形質移入後に、天然のmir-302ファミリーの各要素(白丸)が全て高度に発現している。mir-302ファミリーの各要素及び本発明者らが再設計したmir-302因子は約91%以上相同なので、この結果は、再設計mir-302因子がmir-302として機能し、天然のmir-302sの代わりとなれることを示している。図7Bは、Colo+mir-302細胞において発現に差があるmiRNAの詳細な一覧を示す。
ES細胞マーカー及び導入遺伝子mir-302sの同時発現の相関を確かめた後に、本発明者らは遺伝子マイクロアレイ分析を行い、mir-302形質移入前後の細胞、さらにmir-302形質移入細胞と他のヒト胚性幹(hES)細胞とを比べて、ゲノム全体の遺伝子発現プロファイルをスクリーニングする。Affymetrix社の遺伝子マイクロアレイ(GeneChip U133A&Bアレイ:Santa Clara, CA)を用いて、Colo細胞とColo+mir-302細胞、さらにColo+mir-302とHuEC8及びH9等の他のhES細胞とを比べ、32,668以上のヒト遺伝子発現パターンの変化を評価する。各被験培養細胞からの総RNAをRNeasyスピンカラム(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離する。バックグラウンドにおいて変動する標的を明らかにするために、本発明者らは、まず同じColo+mir-302試料を用いて2回マイクロアレイ分析を実施し、一方の分析でわずかに差が示された200の遺伝子を選択して、さらに比較した。図8Aに示すように、これらの選択遺伝子(白点)の発現変化は、もう一方のColo+mir-302の分析よりも全て1倍未満であり、バックグラウンドの変動が極めて限られていることを示している。これらの1倍の変化閾値で予め選択した遺伝子の分散パターンに基づき、比較する2つの遺伝子転写産物ライブラリー間の相関係数(CC)を算出することができる。CC比を求め、比較試料間の32,668個のヒト遺伝子発現パターンの類似率(%)を示す。このようなCC比によって、図8Aの結果に示すように、Colo+mir-302細胞の遺伝子発現パターンは、hESであるHuEC8及びH9細胞のパターンと極めて高度に類似しているが(それぞれ88%と86%)、Colo細胞とColo+mir-302細胞とでは低いCC比(53%)しか示されていない。これは、SpRNAi-RGFP媒介性のmir-302形質移入によって、最高15,354個の細胞内遺伝子の発現パターンが変化することを示しており、このことが癌性Colo細胞をES様Colo+mir-302細胞に再プログラミングする過程に関与している可能性を示す。
定義では、多能性幹細胞は胚性の外胚葉、中胚葉、及び/又は内胚葉に由来する組織細胞と同様な様々な細胞種に分化できる。例えば、インビトロでの無フィーダー細胞条件下でのホルモン及び/又は成長因子による処理を用いて、本発明者らはColo+mir-302細胞を図9A〜Cに示すような3種類の細胞に分化誘導することに成功した。まず、無フィーダー細胞培養皿において、Colo+mir-302細胞を天然のアンドロゲンであるジヒドロテストステロン(DHT 50 ng/ml)で6時間処理し、ついでこの処理細胞(105個)を6週齢の雌の免疫不全SCID/beigeマウスの子宮にインビボ移植したところ、1週間後、移植部位に精原細胞様細胞の嚢胞が生成している(図9A中央)。次に、Colo+mir-302細胞を形質転換成長因子β1(TGF-β1 100 ng/ml)で12時間処理し、この処理細胞を6週齢の雌免疫不全SCID/beigeマウスの子宮に移植すると、この細胞は線維芽細胞様細胞に分化し、たった1週間で子宮内の大部分を占領するほどのコラーゲンを分泌し始めている(図9B)。最後に、Colo+mir-302細胞を骨形成タンパク質4(BMP4 100 ng/ml)で12時間処理し、この処理細胞を6週齢の免疫不全SCID/beigeマウスの肝臓に異種移植すると、この細胞はわずかな石灰化沈殿で囲む軟骨細胞様細胞に分化している(図9C)。胸腺欠損ヌードマウスの使用は、移植療法を模倣するインビボ環境を提供する。これらの知見は強力な証拠を提示し、本発明のmir-302形質移入法を用いて、インビトロの無フィーダー細胞条件下で複数の組織細胞種に誘導できる新たなES様細胞株の生成に本発明者らが成功したことを示している。従って、本発明は分化した体細胞をES様多能性細胞に再プログラミング及び形質転換させるだけでなく、無フィーダー細胞培養条件において、幹細胞の多能性と更新特性を維持することができる。
本発明の理解を深めるために、以下のように多くの用語を定義する。
ヌクレオチド:糖部分(五炭糖)、リン酸及び窒素複素環塩基からなるDNA又はRNAの単量体単位である。その塩基はグリコシド結合した炭素(五炭糖の1’炭素)によって糖部分と結合するが、この塩基と糖の組み合わせはヌクレオシドである。五炭糖の3'又は5'の位置に少なくとも1つリン酸基が結合しているヌクレオシドがヌクレオチドである。
ヌクレオチド類似体:A、T、G、C、又はUとは構造的に異なるが、核酸分子中で通常のヌクレオチドと十分に置換できるほど類似しているプリン又はピリミジンヌクレオチドである。
遺伝子:RNA及び/又はポリペプチド(タンパク質)のためのヌクレオチド配列コードをもつ核酸である。遺伝子はRNA又はDNAのいずれかである。
エクソン:タンパク質読み枠をコードする遺伝子転写配列の一部分又は複数の部分である。
センス:相同なmRNAと配列順及び組成が同じ核酸分子である。センス構造は「+」、「s」、又は「センス」シンボルで示す。
保存:ヌクレオチド配列を非無作為に予め選択した(参照した)配列と正確に相補的な配列にハイブリダイゼーションする場合、このヌクレオチド配列はこの予め選択した配列に関して保存されていることになる。
相補的ヌクレオチド配列:1本鎖のDNA又はRNA分子におけるヌクレオチド配列で、もう一方の1本鎖の配列と十分に相補的なために、結果的に水素結合によって、2本鎖間で特異的にハイブリダイゼーションする。
プロモーター:ポリメラーゼ分子により認識され、おそらく結合することで合成を開始させる核酸である。本発明用のプロモーターには、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサー、及び所望のポリメラーゼによって合成を開始できるこれらに類似したあらゆる配列が可能である。
B. 成分
イントロンRNA媒介性の遺伝子サイレンシングを誘導する組換え核酸成分は、
a) 複数のエクソンと並び、細胞内RNAスプライシング及び/又はプロセシング機構によってエクソンから切り離される、少なくとも1つのイントロンと、
b) 所望の機能をもつ遺伝子を形成させるように連結できる、複数のエクソンと
を含む。
a) ほ乳類細胞において組換え核酸成分のRNA一次転写産物を発現させるために、前記組換え核酸成分を発現可能ベクターに組み込むために用いる、少なくとも1つの制限/クローニング部位と、
b) 前記組換え核酸成分の正確なサイズのRNA転写産物を作るために用いる、複数の転写及び翻訳終結部位と
を含む。
a) 少なくとも1つの標的遺伝子と相補的又は相同な遺伝子サイレンシングエフェクター挿入配列と、
b) 5’供与スプライス部位と、
c) 3’受容スプライス部位と、
d) スプライセオソーム認識用の分岐点モチーフと、
e) スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジントラクトと、
f) 上記主要構成要素の結合のための複数のリンカーと
を含む。
ほ乳類細胞でイントロンmir-302媒介性の遺伝子サイレンシングを誘導する遺伝子導入法は、
a) エクソンと並んでmir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターをコードし、mir-302媒介性の遺伝子サイレンシングを実行するためにエクソンと切り離される、少なくとも1つのイントロンを含む組換え核酸成分を構築する段階と、
b) 前記組換え核酸成分を発現可能ベクターにクローニングする段階と、
c) 前記組換え核酸成分の複数のRNA一次転写産物を生成するために、また、mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターの配列と相同又は相補的な配列を含む遺伝子に対してmir-302媒介性の遺伝子サイレンシング効果を提供するように、細胞のスプライセオソームがRNA一次転写産物からイントロンを切り出すために、複数のほ乳類細胞へ前記ベクターを導入する段階と
を含む。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を例証するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
SpRNAi含有組換え遺伝子(SpRNAi-RGFP)の構築
センス、アンチセンス、又はヘアピン状のEGFP挿入配列のいずれかを含む、3種類のSpRNAiイントロン生成に用いる合成核酸配列としては、N1センス:5'-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3'(SEQ.ID.NO.14)、N1アンチセンス:5'-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC-3'(SEQ.ID.NO.15)、N2センス:5'-GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3'(SEQ.ID.NO.16)、N2アンチセンス:5'-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGC GATCGGATCC TCTTAC-3'(SEQ.ID.N0.17)、N3センス:5'-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3'(SEQ.ID.NO.18)、N3アンチセンス:5'-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3'(SEQ.ID.NO.19)、N4センス:5'-CGCGTTACTA ACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.20)、N4アンチセンス:5'-GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTT AGTAA-3'(SEQ.ID.N0.21)。SEQ.ID.NO.14からSEQIDN0.21まで列挙した全配列は、その5’末端がリン酸化されている。加えて、赤色蛍光RGFP遺伝子(SEQ.ID.NO.22)における208番目のヌクレオチド(nt)部位で、制限酵素DraIIによる開裂によって2つのエクソン断片が生成し、その5’断片はさらにT4 DNAポリメラーゼによって平滑末端化した。上記RGFPは、新たな赤方偏移蛍光色素タンパク質遺伝子で、シライトイソギンチャク(Heteractis crispa:BD Biosciences, CA)からのHcRed1色素タンパク質の69番目のアミノ酸(a.a.)に追加のアスパラギン酸を挿入することで生成し、そのタンパク質は凝集が少なく、570nmの波長でほぼ2倍の強度の遠赤色蛍光を放射する。本発明者らはpHcRed1-N1/1プラスミド(BD Biosciences, CA)を制限酵素XhoI及びXbaIで切断し、ついで2%アガロースゲル電気泳動及び抽出(ゲル抽出キット:Qiagen, CA)によって、完全長769bpのRGFP遺伝子断片及び3,934bpの空プラスミドを別々に単離した。
発現可能ベクターへのSpRNAi含有遺伝子のクローニング
組換えSpRNAi-RGFP遺伝子にはその5’及び3’末端にそれぞれXhoI及びXbaI制限部位があるので、XhoI及びXbaI制限部位に比較的付着できる末端をもつベクターに挿入して簡単にクローニングできる。本発明者らは、SpRNAi-RGFP遺伝子を直線化した3,934 bpの空のpHcRed1-N1/1プラスミドと1:16(w/w)の比で混合し、この混合物を65℃から15℃に50分間かけて冷却し、その後T4リガーゼと添付の緩衝液を適宜混合物に添加して、12℃で12時間ライゲーションさせた。これによってSpRNAi-RGFP発現ベクターが形成されるが、これは50 μg/mlのカナマイシン(Sigma Chemical, St. Louis, MO)を含んだ大腸菌(E. coli)DH5a LB培地で増殖できる。陽性クローンを、EGFP特異的プライマーSEQ.ID.NO.23及びSEQ.ID.NO.24を用いて94℃1分間、ついで68℃2分間による30サイクルのPCRで確認し、さらに配列を決定した。ウイルスベクターでのクローニングは、XhoI/XbaI直線化pLNCX2レトロウイルスベクター(BD)を代わりに用いる以外、同じライゲーション手順で実施できた。SpRNAiイントロン内の挿入配列はその5’及び3’末端にそれぞれPvuI及びMluI制限部位が並んでいるので、本発明者らは抗EGFP shRNA挿入配列を除去し、別のPvuI及びMluIクローニング部位に付着する末端をもつ再設計mir-302挿入配列と置換することができた。再設計したmir-302挿入配列には、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3'(SEQ.ID.NO.9)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3'(SEQ.ID.NO.10)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3'(SEQ.ID.NO.11)、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3'(SEQ.ID.NO.12)、又は5'-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3' (SEQ.ID.NO.13)と類似した、5'-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3'(SEQ.ID.NO.3)相同領域が含まれる。
このように得られたmir-302 pre-miRNAクラスター及びmir-302s発現ベクターは、pHcRedl1-N1/1プラスミドによるベクター用の50 μg/mlカナマイシン、又はpLNCX2レトロウイルスベクター用の100 μg/mlのアンピシリンのいずれかを含む大腸菌DH5a LB培地において増殖できた。増殖したSpRNAi-RGFP発現ベクターは、ミニプレップ又はマキシプレッププラスミド抽出キット(Qiagen, CA)を用いて、製造元の指示に従い単離、精製できた。pLNCX2ベクターで本発明者らは、感染能はあるが複製能がないウイルスを作製するために、パッケージング細胞株GP2-293(Clontech, CA)を用いてもよい。4 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、100 μg/ml硫酸ストレプトマイシン、及び50 μg/mlネオマイシン(Sigma Chemical, MO)を添加し、さらに活性炭処理済み10%ウシ胎児血清(FBS)を追加した1×DMEM培地において、形質移入したGP2-293細胞を5% CO2、37℃で増殖させた。GP2-293細胞によって産生される形質移入前のウイルス力価が少なくとも106 cfu/mlであることを測定した。
インビトロ遺伝子導入による形質移入
レトロウイルスベクターによるhpESC及びPC3細胞培養系への形質移入では、本発明者らはまず、pVSV-G同時形質移入GP2-293細胞(Clontech, CA)において、抗EGFP mir-gfp又はmir-302ファミリークラスターpre-miRNA挿入配列のいずれかを含むSpRNAi-RGFP発現pLNCX2レトロウイルスベクターを培養した。5%CO2、37℃で36時間インキュベーションした後、GP2-293細胞の培養液(各10 ml)をろ過し(0.25 μm)、それぞれ直接hpESC及びPC3細胞培養系に移した。培地には極めて高い力価の設計レトロウイルスベクターが含まれるので、このベクター感染によって全ての被験細胞に遺伝子導入すると、24時間以内にイントロン挿入配列及びRGFPを発現し始めた。手動再設計したmir-302 pre-miRNAのColo細胞への導入遺伝子送達では、本発明者らはまず、実施例2からの設計mir-302 pre-miRNA挿入配列を含むように調製したSpRNAi-RGFP導入遺伝子(各細胞培養系の10 ml培地に対して60 μg)と、FuGene試薬(Roche, IN)を製造元の指示に従い混合した。次に、この混合液をColo細胞培養に24時間適用した。この導入遺伝子にはヒトゲノムの特定の非コード領域に相同なトランスポゾン様配列が含まれているので、遺伝子導入によって形質移入した陽性細胞をさらに継代培養するために、抗RGFPモノクローナル抗体(Clontech, CA)を用いたフローサイトメトリーにで選別した。
ノーザンブロット分析
RNA(総RNA量20 μg又はポリ[A+]RNA2 μg)を1%ホルムアルデヒド・アガロースゲル上で分画し、ナイロンメンブラン(Schleicher & Schuell, Keene, NH)上に移した。RGFPの5’エクソンと設計pre-miRNA挿入配列との間に並んだ75 bpのジャンクション配列に相補的な合成プローブを、[32P]-dATP(> 3000 Ci/mM:Amersham International, Arlington Heights, IL)の存在下において、Prime-It IIキット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いたランダムプライマー伸長によって標識し、10 bpカットオフMicro Bio-Spinクロマトグラフィーカラム(Bio-Rad, Hercules, CA)で精製した。ハイブリダイゼーションは、調製直後の50%脱イオンホルムアミド(pH 7.0)、5×Denhardt's溶液、0.5% SDS、4×SSPE、及び250 mg/mlのサケ***変性DNA断片の混合液中で実施された(42℃で18時間)。オートラジオグラフィーの前に、メンブランを2×SSC、0.1%SDS(25℃で15分間)で2回、0.2×SSC、0.1%SDS(37℃で45分間)で1回、連続的に洗浄した。
SDS-PAGE及びウェスタンブロット分析
標的タンパク質の免疫ブロットのために、増殖培地除去後に単離細胞を氷冷PBSですすぎ、ついでプロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、TLCK、TAME、及びPMSFを追加したCelLytic-M溶解/抽出試薬(Sigma, MO)で、製造元の推奨事項に従い処理した。細胞を室温で振盪器を用いて15分間インキュベーションし、マイクロチューブに剥がし入れ、細胞片塊を得るために12,000×gで5分間遠心分離した。タンパク質含有細胞ライセートを収集し、使用まで-70℃で保存した。E-maxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)のSOFTmaxソフトウェアパッケージを用いてタンパク質を定量した。各30 μgの細胞ライセートを50 mM DTT含有(還元)又は不含(非還元)のSDS-PAGE試料用緩衝液に添加し、沸騰水浴中で3分間加熱してから、8%ポリアクリルアミドゲルに添加した。一方、比較対照レーンには、2〜3 μlの分子量マーカー(Bio-Rad)を添加した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Molecular Cloning, 3rd EDに記載された標準プロトコルに従って行った。タンパク質成分分画をニトロセルロース膜上に電気ブロットし、室温で1〜2時間Odysseyブロッキング試薬(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NB)でブロッキングした。次に、本発明者らは、EGFP(1:5,000; JL-8, BD)、RGFP(1:10,000; BD)、Oct3/4 (1:500; Santa Crutz)、SSEA-3(1:500; Santa Crutz)、SSEA-4(1:500; Santa Crutz)、Sox2(1:1000; Santa Crutz)、又はKlf4 (1:200; Santa Crutz)のいずれかに対する一次抗体を4℃で一晩用いてタンパク質発現を評価した。タンパク質ブロットを次にTBS-Tで3回すすぎ、Alexa Fluor 680反応色素(1:2,000; Molecular Probes)を結合した二次抗体のヤギ抗マウスIgGに室温で1時間暴露した。TBS-Tでさらに3回すすいだ後、Li-Cor Odyssey Infrared Imager及びOdyssey Software v. 10(Li-Cor)によってスキャニング及び画像解析を完了させた。
ゼブラフィッシュにおけるイントロンRNA媒介性の遺伝子サイレンシング
形質移入中、Tg(アクチン-GAL4:UAS-gfp)系統のゼブラフィッシュの幼生を、魚箱内で10 mlの0.2×血清無添加RPMI 1640培地で飼育した。1 mlの1×血清無添加RPMI 1640培地中に60 μlのFuGeneリポソーム形質移入試薬(Roche Biochemicals, Indianapolis, IN)を緩やかに溶解して、形質移入用事前混合液を調製した。実施例1と2に記載したように、次に抗EGFP pre-miRNA挿入配列含有のSpRNAi-RGFPベクター又は不含のSpRNAi-RGFPベクター(各20 μg)を事前混合液と混合し、氷上に30分間静置してから、箱中のTg(アクチン-GAL4:UAS-gfp)幼生魚に直接適用した。12時間間隔で、合わせて3回(総量60 μg)投与した。最初の形質移入から60時間後に試料を採取した。
フローサイトメトリー分析
細胞は、予め冷却した70%メタノールPBS溶液1 ml中に-20℃で1時間再浮遊されることで、トリプシン処理されて細胞塊を集めて固定された。細胞塊を得た後、1 mlのPBSで1回洗浄した。再び細胞塊を得た後、1 mg/mlのヨウ化プロピジウムと0.5 mg/ml RNaseからなるPBS溶液1 mlに37℃で30分間再浮遊させた。次に、約15,000個の細胞をBD FACSCalibur(San Jose, CA)で分析した。細胞ダブレットはプロッティングのパルス幅対パルス面積の曲線を描き、単一細胞をゲーティングすることによって除外された。収集したデータを「Watson Pragmatic」アルゴリズムを用いたソフトウェアパッケージFlowjoを使用して解析した。
DNAメチル化分析
まず、DNA単離キット(Roche, IN)を用いて細胞ゲノムを単離した。被験細胞を10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、10 mM EDTA、及び0.2 mg/mlプロテイナーゼKで、55℃、3時間インキュベーションした後、ゲノムDNA試料をエタノールで沈殿させて調製した。その後、単離ゲノムをそれぞれCCGG切断制限酵素HpaII(10 U)を用い、37℃で4時間消化した。得られたDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動で分析した。Oct3/4プロモーター領域におけるメチル化部位を決定するために、本発明者らはさらに単離ゲノムDNAを重亜硫酸塩(Cp Genome DNA修飾キット:Chemicon, CA)で処理し、ついで2種類の順方向プライマー5'-GAGGAGTTGA GGGTACTGTG-3'及び5'-GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3'と、1種類の逆方向プライマー5'-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3'を用いたポリメラーゼ連鎖反応(長鎖鋳型PCR伸長キット:Roche, IN)によって、Oct3/4の5’上流プロモーター領域を単離した。最初に細胞ゲノム(100 ng)を1×PCR緩衝液中でプライマー(総量150 pmol)と混合し、94℃で4分間加熱した直後氷上で冷却した。その後、以下のように、25サイクルのPCRを実施した。92℃で1分間、55℃で1分間、そして70℃で5分間である。得られたPCR産物をPCR精製キット(Qiagen, CA)で収集し、AclI (AACGTT)、BmgBI (CACGTC)、PmlI (CACGTG)、SnaBI (TACGTA)及びHpyCH4IV (ACGT)を等量(各5U)ずつ含む複数のACGT切断制限酵素で消化した。このように得られたDNA断片を3%アガロースゲル電気泳動で分析した。
マイクロRNAのマイクロアレイ分析
ヒトPC3及びColo細胞株をアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC:Rockville, MD)より得た。また、hpESC細胞は本発明者の腕から採取した皮膚をトリプシンで解離して調製した。細胞飽和密度70%で、各細胞株からの短鎖RNAをmirVana(登録商標)miRNA単離キット(Ambion, Inc., Austin, TX)を用い、製造元の指示に従い単離した。単離した短鎖RNAの純度及び量を1%ホルムアルデヒド・アガロースゲル電気泳動と分光光度計測定(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて評価し、ついでmiRNAのマイクロアレイ分析のためにLC Sciences社(San Diego, CA)に送付した。各マイクロアレイチップをCy3又はCy5のいずれかで標識した単一試料、もしくはCy3及びCy5でそれぞれ標識した1対の試料とハイブリダイゼーションさせた。バックグラウンドを差し引き、正規化した。二重分析用にp値を算出し、3倍より大きい差で発現した転写産物の一覧を作成した。
遺伝子のマイクロアレイ分析
マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション用の標識プローブの調製のために、5'-GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGAGGCGG-(dT)24-3’のような修飾オリゴ(dT)24-T7プロモータープライマーを用いて、Superscript Choiceシステムキット(Gibco/BRL, Gaifhersburg, MD)によって、製造元のプロトコルに従い、抽出した全RNA(2 μg)を2本鎖cDNAに変換した。2本鎖cDNAをフェノール/クロロホルム抽出法で精製し、エタノールで沈殿させ、そしてジエチルピロカーボネート(DEPC)処理済みddH2Oに濃度0.5 pg/μlで再浮遊させた。全有機物抽出用にPhase-Lock Gel(5'Prime→3'Prime:Inc., Boulder, CO)を用いて、回収率を上げた。T7 RNAポリメラーゼと1 μgのcDNA、7.5 mM非標識ATPとGTP、5 mM非標識UTPとCTP、さらに2 mMビオチン標識CTPとUTP(ビオチン-11-CTP、ビオチン-16-UTP:Enzo Diagnostics)を用いてインビトロ転写し、37℃で4時間反応させてから、RNeasyスピンカラム(Qiagen, CA)によってcRNAを精製した。試料を1%アガロースゲル上で分離し、サイズ範囲を調べた後、40 mM Tris-酢酸(pH 8,0)、100 mM KOAc/30 mM MgOAc中で、94℃で、35分間加熱し、μg単位のcRNAを平均サイズ50塩基に無作為に断片化した。
細胞分化分析
全細胞株を10%の活性炭処理済みウシ胎児血清(FBS)を添加したフェノールレッド無添加DMEM培地で増殖させた。70%の細胞飽和密度において、50 ng/ml DHT、100 ng/ml TGF-β1、及び/又は100 ng/ml BMP4等の各種ホルモン又は成長因子を細胞培養の培地にそれぞれ添加した。6〜12時間のインキュベーションの後、各処理済み細胞をトリプシン処理し、1×PBS溶液200 μlの4つのアリコートに分注し、すぐに6週齢の胸腺欠損免疫不全SCID/beigeヌードマウスの頸部皮膚、尾部静脈、子宮、及び肝臓にインビボ移植した。
統計解析
結果は平均±SEで示した。一元配置分散分析(ANOVA)によってデータを統計解析した。主効果が有意な場合、Dunnett’sポストホック検定を用いて、対照群と有意に異なる群を同定した。2つの処理群間の一対比較には、両側スチューデントt検定を用いた。2群以上の処理群に関する実験では、ANOVAを行った後ポストホック多重範囲検定を行った。確率p<0.05を有意とみなした。両側検定から全p値を決定した。
以下の参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み込まれる。
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29. Thomsonによる米国特許第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号、及び第7,220,584号
30. Gearhartによる米国特許第6,090,622号、第6,245,566号、及び第6,331,406号
31. Reubinoffによる米国特許第6,875,607号
本明細書に記載された実施例及び実施形態は単に例証目的のためであり、これらの範囲内での様々な改良又は変更が当業者によって提出され、これらは添付の請求項に記載される本発明の精神及び範囲内に含まれることが当然である。本明細書で引用した全ての刊行物及び特許は、全ての目的に関してその全体の参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (61)
- ほ乳類細胞でイントロンmir-302媒介性の遺伝子サイレンシング効果を誘導する遺伝子導入法であって、
(a)エクソンと並んでmir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターをコードし、mir-302媒介性の遺伝子サイレンシングを誘導するためにエクソンと切り離される、少なくとも1つのイントロンを含む組換え核酸成分を構築する段階と、
(b)前記組換え核酸成分を発現可能ベクターにクローニングする段階と、
(c)前記組換え核酸成分の複数のRNA一次転写産物を生成し、また、mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターの配列と相補的な配列を含む遺伝子に対してmir-302媒介性の遺伝子サイレンシング効果を提供するように、RNA一次転写産物から前記イントロンを切り出し、結果的に複数の幹細胞様多能性細胞に再プログラミングされる、複数のほ乳類細胞へ前記発現可能ベクターを導入する段階と
を含む遺伝子導入法。 - 前記ほ乳類細胞はヒト細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ほ乳類細胞は体細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ほ乳類細胞は癌性細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンのmir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは合成DNA配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロン又はエクソン配列、もしくはその両者の核酸構成要素を合成する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組換え核酸成分は組換え細胞遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記組換え核酸成分はGFP遺伝子、ウイルス遺伝子、ほ乳類遺伝子、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン、及びこれらの組み合わせに由来する組換え遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンはDNA制限処理及びライゲーション、相同組換え、導入遺伝子の組み込み、トランスポゾンの挿入、ジャンピング遺伝子の組み込み、レトロウイルスの感染、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子工学手法によって構築される、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロンはmir-302様遺伝子サイレンシングエフェクター、分岐点モチーフ、ポリピリミジントラクト、供与スプライス部位、及び受容スプライス部位をコードするイントロン挿入配列の構成要素を含む核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記イントロン挿入配列はSEQ.ID.NO.1又はSEQ.ID.NO.2のいずれかに相同なステムループ構造を含むヘアピン状核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記イントロン挿入配列は、SEQ.ID.NO.3と相同又は/及び相補的な核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記イントロン挿入配列はSEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、及びSEQ.ID.NO.13からなる群から選ばれる核酸配列を含むヘアピン状マイクロRNA前駆体(pre-miRNA)の配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記イントロン挿入配列は、開裂部位AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BgUI、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも1つの制限/クローニング部位によって、前記イントロンに組み込まれる、請求項10に記載の方法。
- 前記分岐点は、SEQ.ID.NO.6配列を含む、又は、これに相同な核酸配列内に位置するアデノシン(A)ヌクレオチドである、請求項10に記載の方法。
- 前記分岐点は、5'-TACTAAC-3'に相同なオリゴヌクレオチドモチーフを少なくとも1つ含む核酸配列内に位置するアデノシン(A)ヌクレオチドである、請求項10に記載の方法。
- 前記ポリピリミジントラクトは、SEQ.ID.NO.7又はSEQ.ID.NO.8の配列を含む、もしくは、これらに相同なT又はCが高含量の核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記供与スプライス部位は、SEQ.ID.NO.4配列を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記供与スプライス部位は、5'-GTAAG-3'を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記受容スプライス部位は、SEQ.ID.NO.5配列を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記受容スプライス部位は、5'-CTGCAG-3'を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項10に記載の方法。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.3と相同又は/及び相補的な配列を含む核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、及び/又はSEQ.ID.NO.13を含む核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.9を含む核酸配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記発現可能ベクターは、DNA導入遺伝子、プラスミド、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ジャンピング遺伝子、ウイルスベクター、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 前記ベクターの内容物は、ウイルス又はII型RNAポリメラーゼ(Pol-II)プロモーターもしくはこれらの両者、Kozak翻訳開始共通配列、ポリアデニル化シグナル、及び複数の制限/クローニング部位からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記制限/クローニング部位は、制限酵素AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BgUI、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるエンドヌクレアーゼのためのオリゴヌクレオチド開裂ドメインである、請求項26に記載の方法。
- 前記ベクターにはさらに、pUC複製起点、複製可能な原核細胞で抗生物質耐性遺伝子を少なくとも1つ発現するSV40初期プロモーター、及びほ乳類細胞の選択的SV40複製起点を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記抗生物質耐性遺伝子は、ペニシリンG、アンピシリン、ネオマイシン、パロマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、スペクトロマイシン、フォフォマイシン、テトラサイクリン、リファピシン、アムホテリシンB、ゲンタマイシン、クロランフェニコール、セファロチン、タイロシン、G418、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項28に記載の方法。
- 前記ベクターは、リポソーム形質移入、化学的形質移入、DNA組換えによる遺伝子導入、ウイルス感染、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入、マイクロインジェクション、電気穿孔法、遺伝子銃による貫入、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる遺伝子送達法によって、前記ほ乳類細胞に導入される、請求項1に記載の方法。
- 前記組換え核酸成分のRNA一次転写産物は、II型(Pol-II)、III型(Pol-III)、I型(Pol-I)、及びウイルス性のRNAポリメラーゼによる転写機構からなる群から選ばれる転写機構によって生成される、請求項1に記載の方法。
- 前記組換え核酸成分のRNA一次転写産物は、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、pre-microRNA、viral RNA、及びこれらのRNA前駆体さらに誘導体からなる群から選ばれるリボヌクレオチド配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、RNAスプライシング、エキソソーム消化、ナンセンス変異依存分解(NMD)プロセシング、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるイントロン切り出しメカニズムによって前記イントロンから放出される、請求項1に記載の方法。
- 前記mir-302媒介性の遺伝子サイレンシング効果は、細胞内転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、RNA干渉、及び/又はナンセンス変異依存分解メカニズムによって引き起こされる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は、mir-302マイクロRNAを発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は、胚性幹細胞マーカーOct3/4、SSEA-3、及びSSEA-4を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は、無フィーダー細胞培養条件下で培養できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は、10%活性炭処理済みFBSを添加したDMEMで培養できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は生殖系列様細胞に分化できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は精原細胞様細胞に分化できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は線維芽細胞様細胞に分化できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は軟骨細胞様細胞に分化できる、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は胚様体様コロニーを形成できる、請求項1に記載の方法。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、及びmir-520ファミリーの要素といくつかの相同標的遺伝子を共有する、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞様多能性細胞は、マーカーとしてmir-302マイクロRNAを用いて選択的に単離できる、請求項1に記載の方法。
- mir-302媒介効果を誘導するための組換え核酸成分であって、
ほ乳類分化細胞を胚性幹様多能性細胞に再プログラミングするmir-302媒介効果を誘導するために、所望の機能をもつ遺伝子を形成するために連結されるエクソンと切り離される前記エクソンと並んで、mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターをコードする少なくとも1つのイントロンを含む組換え核酸成分。 - 前記イントロンは、
(a)mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターをコードするイントロン挿入配列と、
(b)供与及び受容のスプライス部位と、
(c)分岐点モチーフと、
(d)少なくとも1つのポリピリミジントラクトと
を含む請求項46に記載の組換え核酸成分。 - 前記イントロン挿入配列は、SEQ.ID.NO.1又はSEQ.ID.NO.2のいずれかと相同なステムループ構造を含むヘアピン状核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記イントロン挿入配列は、SEQ.ID.NO.3と相同又は/及び相補的な配列を含む核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記イントロン挿入配列は、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、及びSEQ.ID.NO.13からなる群から選ばれる核酸配列を含むヘアピン状マイクロRNA前駆体(pre-miRNA)の配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記イントロン挿入配列は、少なくとも1つの制限/クローニング部位によって前記イントロンに組み込まれる、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記分岐点は、SEQ.ID.NO.6配列を含む、又は、これに相同な核酸配列内に位置するアデノシン(A)ヌクレオチドである、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記分岐点は、5'-TACTAAC-3'に相同なオリゴヌクレオチドモチーフを少なくとも1つ含む核酸配列内に位置するアデノシン(A)ヌクレオチドである、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記ポリピリミジントラクトは、SEQ.ID.NO.7又はSEQ.ID.NO.8配列を含む、又は、これらに相同なT又はCが高含量の核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記供与スプライス部位は、SEQ.ID.NO.4配列を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記供与スプライス部位は、5'-GTAAG-3'を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記受容スプライス部位は、SEQ.ID.NO.5配列を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記受容スプライス部位は、5'-CTGCAG-3'を含む、又は、これに相同な核酸配列である、請求項47に記載の組換え核酸成分。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.3と相同又は/及び相補的な配列を含む核酸配列である、請求項46に記載の組換え核酸成分。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.N0.12、及び/又はSEQ.ID.N0.13を含む核酸配列である、請求項46に記載の組換え核酸成分。
- 前記mir-302様遺伝子サイレンシングエフェクターは、SEQ.ID.NO.9を含む核酸配列である、請求項46に記載の組換え核酸成分。
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