JP2010535036A - ヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進するための方法を提供する。詳細には、本発明は膵臓内胚葉、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞を形成するための改良された方法を提供する。本発明は更に、フィーダー細胞層を使用することなく多能性幹細胞の分化を促進する方法を提供する。
1型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞即ち、β細胞の供給源の開発に注目が集まっている。1つの方法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞への分化能を維持する一方で、今日の臨床的要求に応えるように拡張することが可能な多能性細胞系を樹立するための条件を開発することが依然、大きく求められている。本発明者等は、ヒト胚性幹細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる効率を高めることを目的として代替的な手法を取ったものである。
一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞を分化させるための方法において、
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法を提供する。
a.血清の非存在下、アクチビンAを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンA及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンA及び異なる濃度の血清と培養するか、
b.血清の非存在下、アクチビンAを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンA及び別の濃度の血清と培養するか、
c.血清の非存在下、アクチビンA及びWntリガンドを含む培地中で多能性幹細胞を培養し、次いでWntリガンドを除去して細胞をアクチビンA及び血清と培養するか、
d.多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、この多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドと培養するか、
e.多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第1の培地中でアクチビンA及びWntリガンドと培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第2の培地中でアクチビンAと培養するか、
f.多能性幹細胞を、細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養し、次いでこの多能性幹細胞を、血清を含む第1の培地中でアクチビンA及びWntリガンドと培養し、次いでこの多能性幹細胞を、異なる濃度の血清を含む第2の培地中でアクチビンA及びWntリガンドと培養する。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理し、次いで繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で細胞を培養するか、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理するか、
c.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸で処理し、次いでレチノイン酸を除去した後、細胞を少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、DAPT及びエキセンジン4を含む培地中で培養し、次いでDAPT及びエキセンジン4を含む培地を除去した後、細胞をエキセンジン1、IGF−1及びHGFを含む培地中で培養するか、
b.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン4を含む培地中で培養し、次いでエキセンジン4を含む培地を除去した後、細胞をエキセンジン1、IGF−1及びHGFを含む培地中で培養するか、
c.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、DAPT及びエキセンジン4を含む培地中で培養するか、
d.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン4を含む培地中で培養するか、
e.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理するか、
f.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMのグルコース及びエキセンジン4を含む培地中で培養する。
a.多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、β細胞系統の細胞に分化させる工程と、
e.前記β細胞系統の細胞を前記患者に移植する工程と、を含む、方法を提供する。
幹細胞とは、1個の細胞レベルで自己再生し、かつ、自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような前駆細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、複数の胚細胞層(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から異なる細胞系の機能性細胞へとインビトロで分化する能力、並びに、移植後に複数の胚細胞層の組織を生ずる能力、及び胚盤胞への注入後にすべての組織とまではいかないにしてもほぼ大部分の組織に分化する能力によっても特徴付けられる。
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原(SSEA)3及び4の1つ以上、及びTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現しうる(Thomson et al., Science 282:1145, 1998)。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現が消失し(存在する場合)、SSEA−1の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、次いで製造業者(ベクターラボラトリーズ、カリフォルニア州バーリンゲーム所在)によって述べられるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞は、RT−PCRによって検出されるOct−4及びTERTを通常更に発現している。
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではないが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば、胚盤胞等)、胚性組織、胎児組織等の、妊娠後に形成される組織に由来する多能性幹細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例としては、例えば、ヒト胚性幹細胞系H1、H7及びH9(WiCell)等のヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の株化細胞系がある。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も好適である。例えば、BG01v(ブレサジェン社(BresaGen)、ジョージア州アテネ所在)等の変異型ヒト胚性幹細胞系も好適である。
一実施形態では、通常、多能性幹細胞を、様々な点で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持する培養システム中で培養する。分化をともなわない無フィーダー細胞培養中での多能性幹細胞の増殖は、別の細胞種と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー細胞培養中での多能性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。
本発明における使用に適した多能性幹細胞としては例えば、胚性幹細胞系H9(NIHコード:WA09)、ヒト胚性幹細胞系H1(NIHコード:WA01)、ヒト胚性幹細胞系H7(NIHコード:WA07)、及びヒト胚性幹細胞系SA002(セラーティス社(Cellartis)、スウェーデン)が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、即ち、ABCG2、クリプト(cripto)、CD9、FoxD3、コネキシン43、コネキシン45、Oct4、Sox2、ナノグ(Nanog)、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、Tra1−81の内の少なくとも1つを発現する細胞も本発明における使用に適している。
多能性幹細胞を、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
a.細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上に多能性幹細胞を播種する工程と、
b.前記多能性幹細胞を、アクチビンA及びWntリガンドと培養する工程と、を含む、方法を提供する。
本発明の一態様では、多能性細胞を、細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上で培養して分化させる。細胞外基質は、マウスの肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜の調製物(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences)よりMATRIGELの商品名で販売されている)であってよい。また、細胞外基質は、増殖因子を低減させたMATRIGELであってもよい。また、細胞外基質はフィブロネクチンであってもよい。代替的な一実施形態では、多能性幹細胞を、ヒト血清でコーティングされた組織培養基質上で培養して分化させる。
1個の培地を使用する場合、培地は、例えば(国際特許出願公開第2006020919号に開示されるような)インスリン及びIGF等の特定の因子を、多能性幹細胞が胚体内胚葉に分化できるように充分に低い濃度で含有しなければならない。これは血清濃度を低下させるか、あるいはインスリン及びIGFを含まない合成培地を使用することによって実現することが可能である。合成培地の例はワイルズ(Wiles)等によって開示されている(Wiles et al. Exp Cell Res. 1999 Feb 25; 247(1): 241-8)。
多能性幹細胞の胚体内胚葉系統細胞への分化は、2個の培地を使用して多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドと培養することによって実現することが可能である。即ち、多能性幹細胞の分化は以下のようにして実現することが可能である。
a.細胞外基質でコーティングされた組織培養基質上に多能性幹細胞を播種し、
b.前記多能性幹細胞を第1の培地中でアクチビンA及びWntリガンドと培養し、
c.前記多能性幹細胞を第2の培地中でアクチビンAと培養する。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が形成されたことは、特定のプロトコールを行う前後にマーカーの存在について試験を行うことによって判定することができる。多能性幹細胞は通常、こうしたマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がマーカーを発現し始めることで検出される。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において提案されるいずれかの方法によって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞をレチノイン酸及び少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
a.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞をレチノイン酸で処理する工程と、
c.レチノイン酸を取り除き、その後、細胞を少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理する工程と、を含む、方法を提供する。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内胚葉系統に特徴的な更なるマーカーも次々に特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーとしては、例えば、Hlxb9、PTF−1a、PDX−1、HNF−6、HNF−1β等、1以上の転写因子の発現が挙げられる。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で前記細胞を処理する工程と、を含む、方法を提供する。
a.膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
b.グルコースを約10mM〜約20mMの濃度で含む培地中で、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることが可能な因子で前記細胞を処理する工程と、を含む、方法を提供する。
膵臓内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内分泌系統に特徴的な更なるマーカーも次々に特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が膵臓内分泌系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーとしては、例えば、NGN−3、ニューロD(NeuroD)、Islet−1等、1以上の転写因子の発現が挙げられる。
一態様において、本発明は、1型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、その多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。
ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系H1、H7及びH9をウィセル・リサーチ・インスティテュート社(WiCell Research Institute, Inc.)(ウイスコンシン州マディソン所在)より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、20%ノックアウト血清リプレースメント、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM βメルカプトエタノール、2mM L−グルタミンと4ng/mlヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(すべてインビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO)より入手)を添加したDMEM/F12(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))からなるES細胞培地中、マウス胚繊維芽(MEF)フィーダー細胞上で細胞を培養した。MEF細胞はE13〜13.5のマウス胚から誘導されたものをチャールズリバー社(Charles River)より購入した。MEF細胞は、10%FBS(ハイクローン社(Hyclone))、2mMグルタミン、及び100mM MEM非必須アミノ酸を添加したDMEM培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したMEF細胞培養を、10μg/mlマイトマイシンC(シグマ社(Sigma)ミズーリ州セントルイス所在)で3時間処理して細胞***を停止させた後、トリプシン処理し、0.1%ウシゼラチンコートディッシュに2×104/cm2で播いた。継代数2〜4からのMEF細胞をフィーダー層として使用した。MEF細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、5%CO2雰囲気中37℃で培養した。コンフルエンスに達した時点(播種後約5〜7日後)で、ヒト胚性幹細胞を1mg/ml IV型コラゲナーゼ(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))で5〜10分間処理した後、5mlピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を900rpmで5分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して新鮮な培地に1:3〜1:4の細胞比で再び播いた。
胚体内胚葉細胞の形成
胚体内胚葉のマーカーの発現に対するアクチビンAの影響を調べた。アクチビンA(100ng/ml)をマウス胚繊維芽細胞上で培養したヒト胚性幹細胞の集団に添加した。細胞をアクチビンAの存在下で継続的に培養し、示した時間において採取した。胚体内胚葉マーカーの発現レベルをPCR(図1)、FACS(表IIに結果をまとめる)、及び免疫組織化学法(図2)によって調べた。
膵臓内胚葉細胞の形成
ヒト胚性幹細胞の膵臓内胚葉への分化を誘導することが知られている増殖因子を細胞培養に添加した。具体的には、膵臓内胚葉の形成を誘導することが知られているアクチビンA、bFGF、及びレチノイン酸を細胞培養に添加した。
膵臓内分泌細胞の形成
ヒト胚性幹細胞の培養を実施例1に述べた方法に従って3〜4日間未分化条件に維持した。細胞が50〜60%コンフルエンスに達した後、100ng/mlのアクチビンAを含む、FBSを含まないDMEM/F12に培地を換え、この培地中で細胞を1日間培養した。1日間の培養の後、培地を除去し、100ng/mlのアクチビンAを加えた0.5%FBSを含む培地と交換し、細胞を1日間培養した。この2回目の1日の培養の後、培地を除去し、100ng/mlのアクチビンAを加えた2%FBSを含む培地と交換し、細胞を1日間培養した。この時間間隔後、実施例2に概略を述べたように細胞をレチノイン酸とFGFの組み合わせで6日間処理し、その後、培地を除去し、10μMのγ−セクレターゼ阻害剤L−685,458を含む、2%FBSを含んだDMEM/F12からなる培地と交換し、3日間培養した。細胞を収穫し、mRNAの試料を収集して分析に供した。アクチビンA単独で5日間処理した細胞からなるコントロール培養も含めた。
Nkx2.2を発現する膵臓内分泌細胞の形成
実施例2に概略を述べた方法に従って得られた胚体内胚葉細胞を以下のように処理した。即ち、50ng/mlアクチビンA、50ng/ml塩基性FGF及び1μMのレチノイン酸を加えた2%FBS含有DMEM/F12からなる基本培地中で細胞を3〜5日間培養した。1μMのレチノイン酸を単独で又はbFGFとともに含む基本培地中で細胞を更に3〜5日間引き続き培養した。方向付けされた細胞の分化の評価を助けるため、このプロセスに沿った異なる時点で細胞からRNA試料を採取した。更に、この分化プロトコールの全体を通じて培地及び各因子を定期的に除去して補充した。アクチビンAの添加により、アクチビンAを加えない試料と比較してNkx2.2の発現は約35倍に増大した。培養の最初の3日間にアクチビンAで処理した試料では、Pdx1の発現はアクチビンAを含まない試料と同等のレベルに維持された(図11)。以上を考え合わせると、これらのデータは、膵臓内分泌マーカーであるNkx2.2の発現は、レチノイン酸及びbFGFによる処理の最初の3日間にアクチビンAを添加することによって更に促進されることを示唆するものである。
膵臓内胚葉細胞の培養における継代及び増殖
本実施例では、本願でヒト胚性幹細胞より誘導された膵臓内胚葉細胞を細胞培養中で維持し、更に分化させることなく継代することが可能であることを実証する。膵臓内胚葉細胞を低血清DMEM/F12中、100ng/mlのアクチビンAの存在下で分化させた。低血清DMEM/F12は、1日目には0%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)、2日目には0.5%(v/v)のFBS、その後は毎日2%(v/v)のFBSを含有するものを使用した。4日間分化させた後、細胞を2%(v/v)FBS、1μMのレチノイン酸、及び50ng/mlのbFGFを含む低血清DMEM/F12中で、全体で6日間更に培養した。6日間の分化の後、細胞を、2%(v/v)FBSを含む低血清DMEM/F12中、50ng/mlのFGF10の存在下で、全体で6日間、培養中で維持した。6日間の培養期間中、膵臓内胚葉細胞を2回継代した。細胞集団の倍加時間はこの6日間の培養期間で約36〜48時間であった。培養の0、3及び6日目において、Q−PCRを用いて膵臓内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。図12は、50ng/mlのFGF10の存在下で増殖させた細胞が、誘導後の6日間の培養期間中、膵臓内胚葉マーカーであるPdx1の発現を維持したことを示している。
ヒト胚性幹細胞からの肝細胞の誘導
ヒト胚性幹細胞の培養を実施例1で述べた方法に従って未分化培養条件に2〜3日間維持した。細胞が70〜80%コンフルエンスに達した後、100ng/mlのアクチビンAを含む2%FBS含有DMEM/F12に培地を換え、アクチビンAの存在下で細胞を7日間培養した。7日間のアクチビンA処理の後、細胞を図13に示す各条件で5日間処理した。この後、細胞を採取し、mRNAの試料を収集して分析に供した。
H9ヒト胚性幹細胞系の特徴付け
未分化のES細胞が発現する幾つかのマーカーの発現を評価することにより、H9細胞の性質を経時的に監視した(Carpenter et al., 2001; Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998a)。H9細胞では、段階特異的胚抗原の交互発現が見られた(表III)。H9細胞は、いずれも未分化のヒト胚性幹細胞に特徴的なSSEA−3、SSEA−4、Tra−1−60、Tra−1−81、AP及びCD9抗原に対して強力な免疫応答性を示す。
蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
接着した細胞をTrypLE(商標)Express溶液(インビトロジェン社(Invitrogen)カリフォルニア州所在)と5分間インキュベートすることによって培養皿から剥がした。剥がした細胞をヒト胚性幹細胞培地に再懸濁し、遠心して回収した後、洗浄し、この細胞を2%BSA、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBSからなる染色緩衝液(シグマ社(Sigma)ミズーリ州)に再懸濁した。必要に応じて、0.1%γグロブリン(シグマ社(Sigma))溶液を用いて15分間、細胞のFc受容体をブロックした。一定分量(約105個の細胞)を表Iに示されるようなフィコエリスリン(PE)若しくはアロフィコシアニン(APC)を結合したモノクローナル抗体(106個の細胞毎に5μLの抗体)、又は非結合一次抗体とインキュベートした。コントロールには、適当なアイソタイプ一致抗体、非染色細胞、及び二次結合抗体のみで染色した細胞を含めた。抗体とのインキュベートをすべて、4℃で30分間行い、その後、細胞を染色緩衝液で洗った。非結合一次抗体で染色した試料を、PE又はAPC結合標識二次抗体と更に30分間、4℃でインキュベートした。使用した二次抗体の一覧については表Iを参照されたい。洗った細胞はペレットとし、染色緩衝液に再懸濁した。細胞表面の分子をFACS Array(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences))装置を使用し、少なくとも10,000のイベントを収集して特定した。
免疫細胞化学法
0.1%Matrigel(BD社)でコーティングした培養皿に播種した細胞を室温で20分間、4%パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を室温で1時間、PBS/0.1%BSA/10%正常ニワトリ血清/0.5%TritonX−100でブロックした後、PBS/0.1%BSA/10%正常ニワトリ血清中、4℃で一次抗体と一晩インキュベートした。一次抗体及びその実用希釈率を表IBに示す。PBS/0.1%BSA中で3回洗った後、PBS中に1:100の希釈率で希釈した蛍光二次抗体と細胞を室温で1時間インキュベートして結合させた。コントロール試料として、一次抗体を省略するか、一次抗体と同じ濃度の、対応する一致したネガティブコントロールとしての免疫グロブリンで一次抗体を置き換えた反応を含めた。染色した試料はすすいだ。ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)を含むPROLONG(登録商標)(インビトロジェン社(Invitrogen)カリフォルニア州所在)を、核を対比染色し、蛍光退色防止剤として機能するように各試料に1滴ずつ加えた。ニコンコンフォーカルEclipseC−1倒立顕微鏡(ニコン社、日本)及び10〜60倍の対物レンズを使用して画像を得た。
未分化細胞のPCR分析
RNAの抽出、精製及びcDNAの合成:エタノール含有高塩濃度緩衝液の存在下でシリカゲル膜(Rneasy Mini Kit、キアゲン社(Qiagen)カリフォルニア州所在)に結合させた後、洗浄して夾雑物を除去することによりRNA試料を精製した。TURBO DNA−Free Kit(アンビオン社(Ambion, Inc.))を使用してRNAを更に精製し、高品質RNAを水で溶出した。収率及び純度を分光光度計のA260及びA280の指示値によって評価した。ABI(ABI、カリフォルニア州所在)製高容量cDNA Archive Kitを使用して精製したRNAからcDNAコピーを作製した。
核型の分析
H9細胞の核型を、標準的なGバンディング核型分析法によって調べた。全部で100個の中期染色体展開像を評価した(アプライドジェネティクスラボラトリー社(Applied Genetics Laboratories, Inc.))。分析した100個の細胞で染色体異常は見られなかった。細胞遺伝子分析により、常染色体の数は正常であり、染色体数(modal chromosome number)は46本であることが示された。図15は、ヒト胚性幹細胞系H9から得られる典型的な核型を示したものである。
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上でのヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系H1、H7及びH9をウィセル・リサーチ・インスティテュート社(WiCell Research Institute, Inc.)(ウイスコンシン州マディソン所在)より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、20%ノックアウト血清リプレースメント、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM βメルカプトエタノール、2mM L−グルタミンと4ng/mlヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加したDMEM/F12(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))からなるES細胞培地中、マウス胚繊維芽(MEF)フィーダー細胞上で細胞を培養した。MEF細胞はE13〜13.5のマウス胚から誘導されたものをチャールズリバー社(Charles River)より購入した。MEF細胞は、10%FBS(ハイクローン社(Hyclone))、2mMグルタミン、及び100mM MEM非必須アミノ酸を添加したDMEM培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したMEF細胞培養を、10μg/mlマイトマイシンC(シグマ社(Sigma)ミズーリ州セントルイス所在)で3時間処理して細胞***を停止させた後、トリプシン処理し、0.1%ウシゼラチンコートディッシュに2×104/cm2で播いた。継代数2〜4からのMEF細胞をフィーダー層として使用した。MEF細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、5%CO2雰囲気中37℃で培養した。コンフルエンスに達した時点(播種後約5〜7日後)で、ヒト胚性幹細胞を1mg/ml IV型コラゲナーゼ(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))で5〜10分間処理した後、5mlのガラス製ピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を900rpmで5分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して希釈率が1:30の増殖因子低減MATRIGEL(商標)(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences))でコーティングしたプレート上に1:3〜1:4の細胞比で再播種した。この後、細胞を、8ng/mlのbFGF及びコラゲナーゼを添加したMEF馴化培地中で培養し、MATRIGELでコーティングしたプレート上で少なくとも5代にわたって継代した。MATRIGEL(商標)上で培養した細胞を、IV型コラゲナーゼ(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))、ディスパーゼ(BDバイオサイエンス社(BD Biosciences))、又はリベラーゼ酵素(ロシュ社(Roche)、インディアナ州)を用いて日常的に継代した。
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
Nature Biotechnology 23,1534〜1541(Dec 2005)に既に記載されているようにして胚性幹細胞を胚体内胚葉に分化させた。簡単に述べると、約60〜70%コンフルエンスのH9培養を、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。H9細胞は希釈率1:30〜1:10の増殖因子低減MATRIGELでコーティングしたプレート上又は希釈率1:30〜1:10の通常のMATRIGEL上で培養した。各プレートは室温で1時間、MATRIGELでコーティングした。
胚体内胚葉形成後のヒト胚性幹細胞における遺伝子発現の変化のマイクロアレイによる分析
RNeasy mini kit(キアゲン社(Qiagen))を使用して以下のヒト胚性幹細胞の培養から全RNAを単離した。即ち、MATRIGELコーティングしたプレート上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P83細胞、及び、MEF細胞上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P44細胞。各群のコントロールには、MATRIGELでコーティングした培養皿に播種し、MEF馴化培地中で培養した細胞、又はMEF上に播種し、ES培地中で培養した細胞を含めた。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
Nature Biotechnology 23,1534〜1541(Dec 2005)に既に記載されているようにして胚性幹細胞を胚体内胚葉に分化させた。簡単に述べると、約60〜70%コンフルエンスに達した増殖因子低減MATRIGEL(商標)(希釈率1:30)培養上に播いたH9、H7又はH1細胞を、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。以下のすべての実施例において、特に断らないかぎり、この処理レジメンを胚体内胚葉(DE)プロトコールと称する。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Wntリガンドの役割
H7P44及びH9P46胚性幹細胞を、MATRIGEL(商標)(希釈度1:10)でコーティングした培養皿上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。培養の一部のものには、20ng/mlのWnt−3a(カタログNo.1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)、20ng/mlのWnt−5a(カタログNo.654−WN−010、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)、25ng/mlのWnt−7a(カタログNo.3008−WN−025、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)、又は25ng/mlのWnt−5b(カタログNo.3006−WN−025、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)を5日間の処理期間の全体を通じて加えた。図24は、高濃度の(A)AA、又は(B)AA+20ng/mlのWnt−3aの存在下でのH9P46胚体内胚葉培養の位相差顕微鏡画像を示したものである。図25は、MATRIGEL(商標)(希釈率1:30)上で培養し、DEプロトコール+Wnt−3a(図25、パネルb及びd)、及び−Wnt−3a(図25、パネルa及びc)に供したH7P44及びH9P46細胞系について、FACSにより調べた5日目のCXCR4の発現を示したものである。Wnt−3aがDE培養中に存在する場合、低血清及び高濃度のAAで処理したDE培養と比較して、CXCR4(CD184)の著明な発現が見られた。図26は、低血清+AA±Wntリガンドで処理した、A)H7及びB)H9の培養についてリアルタイムPCRのデータを示したものである。いずれのH細胞系においても、Wnt−3aを添加することにより、胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションが認められた。これに対し、Wnt−5a、Wnt−5b及びWnt−7aは、胚体内胚葉マーカーの発現にほとんど影響を及ぼさなかった。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Wnt−3aの有効量
H9P46胚性幹細胞を、MATRIGEL(商標)(希釈度1:10)でコーティングした培養皿上で培養し、0.5%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)及び10〜50ng/mlのWnt−3a(R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)、及び10〜50ng/mlのWnt−3aを添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。コントロール培養はWnt−3aで処理しなかった。図27において、パネルa)はWnt−3aの非存在下、b)10ng/mlのWnt−3a、c)20ng/mlのWnt−3a、及びd)50ng/mlのWnt−3aの存在下における5日目のFACSによるCXCR4の発現を示したものである。Wnt−3aの非存在下ではCXCR4の発現は極めて低かった。これに対し、10〜50ng/mlのWnt−3aを添加することにより、CXCR4陽性細胞の数が顕著に増加した。更に、10ng/mlのWnt−3aの添加は、50ng/mlのWnt−3aの添加と同様に効果的であった。リアルタイムPCRの結果によってもこの知見が確認された(図28、パネルa)。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−GSK−3B阻害剤の影響
Wnt−3aの影響がWnt経路を介したものであることを確認するため、GSK−3阻害剤を使用してβカテニン等のWntの下流の標的分子を活性化した。H9P46〜P48胚性幹細胞をMATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:10)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)、及び10〜1000nMのGSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)カリフォルニア州所在)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)、及び0〜1000nMのGSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)カリフォルニア州所在)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。コントロール培養は、低血清及び高用量のアクチビンA±Wnt−3aで処理した。図29において、パネルaはWnt−3aもGSK−3B阻害剤も加えない場合、b)+20ng/mlのWnt−3a、c)+1000ng/mlのGSK−3B阻害剤IX、d)+500ng/mlのGSK−3B阻害剤IX、e)+100ng/mlのGSK−3B阻害剤IX、f)+10ng/mlのGSK−3B阻害剤IX、g)+100ng/mlのGSK−3B阻害剤IXを1〜2日目、及びh)+10ng/mlのGSK−3B阻害剤IXを1〜2日目に加えた場合の5日目のFACSによるCXCR4の発現を示したものである。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−GSK−3B阻害剤又はWnt−3aの存在下におけるアクチビンAの有効量
H9P49及びH1P46胚性幹細胞をMATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:10)上で培養し、0.5%FBS、10〜100ng/mlアクチビンA(AA)、及び100nMのGSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)又は20ng/mlのWnt−3aを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS、10〜100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。コントロール培養は、低血清及び100ng/mlのアクチビンAで処理した。図31は、a)10ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3aを最初の2日間、b)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3Aを最初の2日間、c)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び100nMのGSK−3B阻害剤IXを最初の2日間、d)10ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び100nMのGSK−3B阻害剤IXを最初の2日間、e)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3Aを最初の2日間、並びに、f)10ng/mlのアクチビンA及び20ng/mlのWnt−3Aを最初の2日間加えた場合の、5日目のH9P49及びH1P46におけるFACSによるCXCR4の発現を示したものである。図31のパネルa〜dはH9P49細胞のものであり、パネルE〜FはH1P46細胞のものである。図32は、10、50、又は100ng/mlのアクチビンA及び20ng/mlのWnt−3aで処理したH9P49細胞における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示したものであり、パネルaはAFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B、及びPOU5F(Oct−4)の発現を示し、パネルbはSOX−17及びGATA4の発現を示す。50ng/mlのAA+20ng/mlのWnt−3A又は100nMのGSK−3B阻害剤IXを使用することによって胚体内胚葉マーカーが著明に発現するようである。アクチビンAを低用量で使用すると胚体外内胚葉が形成される。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Wnt−3aとGSK−3B阻害剤の組み合わせ
H9P53胚性幹細胞をMATRIGEL(商標)でコーティングした培養皿(希釈率1:30)上で培養し、0.5%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)、及び100nMのGSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)を添加し、更に20ng/mlのWnt−3aを加える(+)か、加えない(−)DMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS、10〜100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。これと並行して、H9P53培地を、25ng/mlのBMP−4(カタログNo.314−BP−010、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)±20ng/mlのWnt−3A±100ng/mlのアクチビンAで処理した。コントロール培養は、低血清及び100ng/mlのアクチビンAで処理した。図33は、a)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3aを最初の2日間及び25ng/mlのBMP−4を3〜5日目、b)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3aを最初の2日間、c)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び100nMのGSK−3B阻害剤IXを最初の2日間、d)20ng/mlのWnt−3a及び25ng/mlのBMP−4を5日間全体、e)100ng/mlのアクチビンAを5日間全体、及び20ng/mlのWnt−3a及び100nMのGSK−3B阻害剤IXを最初の2日間、並びに、f)100ng/mlのアクチビンA及び25ng/mlのBMP−4を5日間全体にわたって加えた場合の、5日目のFACSによるCXCR4の発現を示したものである。図34は、10又は100ng/mlのアクチビンA及び20ng/mlのWnt−3a又は100nMのGSK−3B阻害剤で処理した、継代数46のヒト胚性幹細胞系H1の培養についてリアルタイムPCRで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。パネル(a):AFP、Bry、CXCR4、GSC、及びPOU5F(Oct−4)の発現、並びに、パネル(b):SOX−17、HNF−3B及びGATA4の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。図35は、50又は100ng/mlのアクチビンA及び10又は100nMのGSK−3B阻害剤で処理した、継代数49のヒト胚性幹細胞系H9の培養についてリアルタイムPCRで調べた胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。パネル(a):AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B及びPOU5F(Oct−4)の発現、並びに、パネル(b):SOX−17及びGATA4の発現。結果は非処理細胞に対する増加倍率として表わす。図36は、アクチビンA、Wnt−3a、GSK−3阻害剤、及びBMP−4の組み合わせで処理したH9P53培養における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示す。A)AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF−3B及びSOX7の発現、並びに、B)SOX−17、HNF−3B及びGATA4の発現。DEプロトコールにBMP−4を加えることにより、中胚葉マーカーであるBRYの形成が誘導されるようであるが、Wnt−3AとGSK−4B阻害剤の組み合わせでは、アクチビンAの存在下で各物質を添加した場合と比較して、胚体内胚葉マーカーの顕著なアップレギュレーションは認められなかった。
MEF上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−低血清中でのWnt−3a、アクチビンA、Wnt−5a、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、IL−4及びSDF−1の組み合わせ
H9P44細胞を、マイトマイシン処理したマウス胚繊維芽細胞(MEF)で予めコーティングした6穴プレート上に播種した。20%ノックアウト血清リプレースメント、100nM MEM非必須アミノ酸、0.5mM βメルカプトエタノール、2mM L−グルタミン(すべてインビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO)より入手)、及び8ng/mlヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(R&Dシステムズ社(R&D Systems))を添加したDMEM/F12(インビトロジェン/ギブコ社(Invitrogen/GIBCO))からなるES細胞培地中で70〜80%コンフルエンスに達するまで細胞を培養した。
0日目:0%のFBSをDMEM/F12に加えた。
1日目:0.5%のFBSをDMEM/F12に加えた。
2日目:2%のFBSをDMEM/F12に加えた。
3日目:細胞を採取してFACS分析及びRT−PCRに供した。
1.コントロール:増殖因子を添加しなかった。
2.アクチビンA(100ng/ml)
3.アクチビンA(100ng/ml)+Wnt−3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)
4.アクチビンA(100ng/ml)+Wnt−3a(10ng/ml)+Wnt5a(10ng/ml)+BMP2(100ng/ml)
5.アクチビンA(100ng/ml)+BMP−4(100ng/ml)
6.アクチビンA(100ng/ml)+BMP−6(100ng/ml)
7.アクチビンA(100ng/ml)+BMP−7(100ng/ml)
8.アクチビンA(100ng/ml)+BMP−4(100ng/ml)+BMP−6(100ng/ml)+BMP−7(100ng/ml)
9.IL−4(10ng/ml)
10.SDF1a(20ng/ml)
11.アクチビンA(100ng/ml)+IL−4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)
12.BMP2(100ng/ml)+BMP−4(100ng.ml)+BMP−6(100ng/ml)+BMP−7(100ng/ml)
13.アクチビンA(100ng/ml)BMP−2(100ng/ml)+BMP−4(100ng.ml)+BMP−6(100ng/ml)+BMP−7(100ng/ml)
14.アクチビンA(100ng/ml)+IL−4(10ng/ml)
15.アクチビンA(100ng/ml)+(SDF1a(20ng/ml)
16.アクチビンA(100ng/ml)+Wnt−3a(10ng/ml)+Wnt−5a(10ng/ml)+Wnt−7a(10ng/ml)
17.アクチビンA(100ng/ml)+IL−4(10ng/ml)+SDF1a(20ng/ml)+BMP−4(100ng/ml)
DEプロトコール処理の3日目に細胞を採取した。分析に際しては、処理細胞の一定分量をRT−PCR用のRNAの調製に使用し、残りの細胞をFACS分析に使用した。CXCR4の出現頻度(%)を図37に示す。上記の増殖因子の添加により、CXCR4の発現は、低血清中での100ng/mlのAAによる処理以上には促進されなかった。
MATRIGEL又はヒトフィブロネクチンでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
異なる濃度のMATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養した後、MEF上で培養したヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−Wnt−3aの役割
少なくとも5代にわたってMATRIGEL(商標)上で培養したヒト胚性幹細胞系H9から得た細胞をES培地中でMEFフィーダー上に播いた。細胞が約60〜70%コンフルエンスに達した時点で、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露し、その後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。更なる処理群として、20ng/mlのWnt−3aで5日間すべて、及び10〜100ng/mlのアクチビンAで処理した群を置いた。
細胞外基質でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の、Wnt阻害剤DKK−1による処理後の胚体内胚葉への分化
Wnt−3aの添加によって分化の増大がもたらされるか否かを調べるため、Wnt−3シグナル伝達の阻害剤を培養に加えた。約60〜70%コンフルエンスのH9培養を、0.5%FBS、20ng/mlのWnt3a、100ng/mlのDikkopf−1(DKK−1)及び100ng/mlのアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlのアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。H9細胞は希釈率1:30の増殖因子低減MATRIGELでコーティングしたプレート上で培養した。各プレートはMATRIGELで1時間、室温でコーティングした。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養し、低血清及びアクチビンA±Wnt−3aで分化させたH9胚性幹細胞におけるDEマーカーの免疫蛍光染色
5日目のH9細胞のDE培養を、実施例10に従ってSOX−17、HNF−3B、GATA−4、N−カドヘリン及びE−カドヘリンについて染色した。すべての核をDAPIで対比染色した。20ng/mlのWnt−3aにより、Wnt−3aの非存在下で分化させた培養と比較して大幅に多数の核がSOX−17、HNF−3β及びGATA−4について陽性に染色された。更に、Wnt−3aの添加により、E−カドヘリンの発現が著しく消失し、N−カドヘリンの発現が昂進した(図43、パネルa及び図43、パネルb)。
MEF又はMATRIGEL上での胚体内胚葉形成後の胚性幹細胞における遺伝子発現の変化のマイクロアレイによる分析
RNeasy mini kit(キアゲン社(Qiagen))を使用して以下の胚性幹細胞の培養から全RNAを単離した。即ち、A)MATRIGEL(商標)コーティングしたプレート(希釈率1:30)上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P33細胞、B)MEF細胞上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンAを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P44細胞、及びC)MATRIGEL(商標名)コーティングしたプレート(希釈率1:30)上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlアクチビンA及び20ng/mlのWnt−3aを添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理したH9P48細胞。各群のコントロールには、MATRIGELコーティングした培養皿に播種し、MEF馴化培地中で培養した細胞、又はMEF上に播種し、ES培地中で培養した細胞を含めた。すべての群で3つの生物学的複製物を用い、各生物学的複製物を2個の別々の遺伝子チップ上で繰り返し用いた。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたSA002 ES細胞系の胚体内胚葉への分化
8ng/mlのbFGFを添加したMEF−CM中、MATRIGELコーティングしたプレート(希釈率1:30)上で少なくとも3代にわたって予め培養したSA002 P38細胞(セラーティス社(Cellartis)スウェーデン)を、0.5%FBS、及び100ng/mlアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)±20ng/mlのWnt−3a又は100nMのGSK−3BIX阻害剤を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。リアルタイムPCRの結果を図44のパネルa及びbに示す。H1、H7及びH9細胞系と同様、SA002細胞系も、DEマーカーの顕著な発現にはWnt−3Aの添加をやはり必要とした。図45にCXCR4の発現を示す。a)AAで処理、b)AA+Wnt−3a、c)AA+GSK−3B阻害剤。
ヒト血清でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化
継代数55のヒト胚性幹細胞系H1の培養をヒト血清(シグマ社(Sigma)No.H1388、ミズーリ州所在)でコーティングしたプレート上で増殖及び分化させた。0.5mlのヒト血清を組織培養処理した6穴培養皿の各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートし、ヒト胚性幹細胞を加える前に吸引した。細胞が80%コンフルエンスに達した後、以下のように処理した。即ち、10ng/mlのマウス組み換えWnt3a(R&D)又は100nMのGSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)及び100ng/mlのアクチビンA(R&D)を含む0.5%FBS中で2日間処理した。この後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンAで3日間処理した。この後、培養をリアルタイムPCRで分析した(図46、パネルa及びb)。アクチビンAのみで処理した細胞と比較して、アクチビンA+GSK−3B阻害剤又はWnt−3Aで処理した細胞では胚体内胚葉マーカーの著明な発現が認められた。これらの所見は、MATRIGEL(商標)又はヒトフィブロネクチンでコーティングしたプレート上で培養したヒト胚性幹細胞における我々の発見に対応したものである。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化−異なるGSK−3B阻害剤の評価
ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉(DE)の形成における市販の多くのGSK−3B阻害剤の有効性を評価した。以下のGSK−3B阻害剤を100nMで評価した。即ち、GSK−3B阻害剤VIII(カタログNo.361549、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)、GSK−3B阻害剤IX(カタログNo.361550、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)、GSK−3B阻害剤XI(カタログNo.361553、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)、GSK−3B阻害剤XII(カタログNo.361554、カルバイオケム社(Calbiochem)、カリフォルニア州所在)。H1P54 ES細胞を、MATRIGEL(商標名)(希釈度1:30)でコーティングした培養皿上で培養し、0.5%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)±各種GSK−3B阻害剤を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。コントロール培養を低血清及び高用量のAAで処理した。図47のパネルa及びbは、5日目における胚体内胚葉マーカーの遺伝子発現を示したものである。GSK−3B阻害剤IX及びXIは、GSK−3B阻害剤VIII及びXIIと比較してDEの形成を誘導するうえでいずれも有効であった。
無フィーダー条件下で培養されたヒト胚性幹細胞による膵臓内胚葉の形成−レチノイン酸類似体の評価
H9P49胚性幹細胞を、MATRIGEL(商標)(希釈度1:30)でコーティングした培養皿上で培養し、0.5%FBS、20ng/mlのWnt−3a(カタログNo.1324−WN−002、R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)、及び100ng/mlアクチビンA(R&Dシステムズ社(R&D Systems)ミネソタ州所在)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS及び100ng/mlアクチビンA(AA)を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。5日目に細胞を回収してFACS及びリアルタイムPCRによる評価を行った。上記の実施例において示したように、このプロトコールによりCXCR4及びSOX−17のような胚体内胚葉マーカーが顕著にアップレギュレートされた。得られた5日目の胚体内胚葉細胞を以下の培地条件に曝露して膵臓内胚葉の形成を誘導した。即ち、2%FBS及び1μMのオールトランスレチノイン酸(RA)(カタログNo.R2625、シグマ社(Sigma)、ミズーリ州所在)、又は0.1〜10μMのAM−580(4−[(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)カルボキサミド]安息香酸、カタログNo.A8843、シグマ社(Sigma)、ミズーリ州所在)、又は0.1〜1μMのTTNPB(4−[(E)−2−(5,6,7,8−テトラヒドロ−5,5,8,8−テトラメチル−2−ナフタレニル)−1−プロペニル]安息香酸(アロチノイド酸)、カタログNo.T3757、シグマ社(Sigma)、ミズーリ州所在)を添加したDMEM/F12培地中で3日間培養した。AM−580及びTTNPBは、レチノイン酸受容体に対する親和性を有するレチノイン酸類似体である。RA処理の後、2%FBS及び20〜50ng/mlのbFGF(カタログNo.F0291、シグマ社(Sigma)、ミズーリ州所在)を添加したDMEM/F12培地中で更に3日間処理した。細胞を収穫し、mRNAの試料を採取して分析に供した。
ヒト胚性幹細胞におけるサイトカイン発現に対するWnt−3a処理の影響
Wnt−3aによる処理がサイトカイン発現に与える影響についてタンパク質アレイを用いて分析を行った。ヒト胚性幹細胞系H9の細胞を実施例15で述べた方法に従って培養した。継代数54において、0.5%FBSを含むDMEM/F12中、100ng/mlのアクチビンA±10ng/mlのWnt−3aの存在下で細胞を2日間分化させた。この後、100ng/mlのアクチビンA及び2%FBSを含むDMEM/F12中で細胞を更に3日間培養した。5日目の終わりに、CXCR4の発現を各処理群についてFACSにより調べた。アクチビンAのみで処理した細胞ではCXCR4を発現した細胞は1%に過ぎなかった。アクチビンA及びWnt3aで処理した細胞では、73%の細胞がCXCR4の発現について陽性であった。
MATRIGELでコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉への分化:Wnt1の役割
H1P55 ES細胞を、MATRIGEL(商標)(希釈度1:30)でコーティングした培養皿上で培養し、0.5%FBS及び100ng/mlのアクチビンA±10〜20ng/mlのWnt−1(ペプロテック社(PeproTech)、ニュージャージー州所在、カタログNo.120−17)を添加したDMEM/F12培地に2日間曝露した後、2%FBS、100ng/mlアクチビンA(AA)±10又は20ng/mlのWnt−1を添加したDMEM/F12培地で更に3日間処理した。以下のWnt1+AAの組み合わせについて試験を行った。
膵臓内分泌分化に対するグルコースの影響
膵臓内胚葉細胞の膵臓内分泌細胞への分化の効率は、例えば基本培地の選択、又はグルコースの濃度等の多くの因子に依存する。胚性幹細胞から誘導された膵臓内胚葉細胞の膵臓内分泌細胞への分化に対するグルコース濃度の影響を調べた。
(1) 膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成するための方法において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させること、を含む、方法。
(2) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から分化させられる、実施態様1に記載の方法。
(3) 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から誘導される、実施態様1に記載の方法。
(4) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から誘導される、実施態様1に記載の方法。
(5) 前記多能性幹細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させられる前に胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させられる、実施態様2に記載の方法。
(6) 前記グルコースが約10mMの濃度で使用される、実施態様1に記載の方法。
(7) 前記グルコースが約20mMの濃度で使用される、実施態様1に記載の方法。
(8) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様1に記載の方法。
(9) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約20日間処理する、実施態様1に記載の方法。
(10) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約10日間処理する、実施態様1に記載の方法。
(12) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約4日間処理する、実施態様1に記載の方法。
(13) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間処理する、実施態様1に記載の方法。
(14) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様6に記載の方法。
(15) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様7に記載の方法。
(16) 多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
(17) 前記グルコースが約10mMの濃度で使用される、実施態様16に記載の方法。
(18) 前記グルコースが約20mMの濃度で使用される、実施態様16に記載の方法。
(19) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様16に記載の方法。
(20) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約20日間処理する、実施態様16に記載の方法。
(22) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約10日間処理する、実施態様16に記載の方法。
(23) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約4日間処理する、実施態様16に記載の方法。
(24) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間処理する、実施態様16に記載の方法。
(25) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様21に記載の方法。
(26) 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、実施態様22に記載の方法。
(27) 糖尿病を有する患者に実施態様1に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
(28) 糖尿病を有する患者に実施態様16に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
(29) 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、実施態様16に記載の方法。
(30) 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、実施態様29に記載の方法。
Claims (31)
- 膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成するための方法において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させること、を含む、方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から分化させられる、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から誘導される、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が、多能性幹細胞から誘導される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させられる前に胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させられる、請求項2に記載の方法。
- 前記グルコースが約10mMの濃度で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記グルコースが約20mMの濃度で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約30日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約20日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約10日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約10日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約4日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間処理する、請求項1に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、請求項6に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、請求項7に記載の方法。
- 多能性幹細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法において、
a.前記多能性幹細胞を培養する工程と、
b.前記多能性細胞をアクチビンAで処理することによって、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
c.前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子、又はレチノイン酸及び少なくとも1種類の繊維芽細胞増殖因子で処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
d.前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約10mM〜約20mMの濃度のグルコースを添加した培地中で、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって処理することによって、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。 - 前記グルコースが約10mMの濃度で使用される、請求項16に記載の方法。
- 前記グルコースが約20mMの濃度で使用される、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約30日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約20日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間〜約10日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約10日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約4日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γセクレターゼ阻害剤、又はエキセンジン4、又はエキセンジン4及びHGFによって約2日間処理する、請求項16に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、請求項21に記載の方法。
- 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、グルコースによって約2日間〜約30日間処理する、請求項22に記載の方法。
- 糖尿病を有する患者に請求項1に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
- 糖尿病を有する患者に請求項16に記載の細胞を移植することによって前記患者を治療するための方法。
- 前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項29に記載の方法。
- 前記ヒト胚性幹細胞が、H1及びH9からなる群の細胞系から誘導される、請求項30に記載の方法。
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