JP2010525022A - プロテインキナーゼの阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
サイクリン依存性プロテインキナーゼ(「CDK」)は、細胞周期の制御及び転写調節等の、細胞内での複数の役割を担う十分に保存された酵素のファミリーを構成する(Science 1996, Vol. 274:1643-1677;Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 1997, 13:261-291)。CDK1、2、3、4、及び6等の、ファミリーのいくつかのメンバーは、G1の静止期(細胞***の新たな一区切りのための有糸***とDNA複製の開始との間のギャップ)からS期(活発なDNA合成の期間)への進行、又はG2期から、活発な有糸***及び細胞***が生じるM期への進行など、細胞周期の異なる相間の移行を制御する。CDK7、8、及び9を含むこのファミリーのタンパク質の他のメンバーは、転写周期における重要な点を制御するのに対し、CDK5は、神経細胞及び分泌細胞の機能における役割を担う。CDK複合体は、制御サイクリンサブユニット(例えば、サイクリンA、B1、B2、D1、D2、D3、及びE)と触媒キナーゼサブユニット(例えば、cdc2(CDK1)、CDK2、CDK4、CDK5、及びCDK6)との結合を通じて形成される。名称が含意するように、CDKは、CDKの標的基質をリン酸化するために、サイクリンサブユニットへの絶対的な依存性を示し、異なるキナーゼ/サイクリン対は、細胞周期の特定の部分を通じて進行を制御するよう機能する。
50を超える薬理学的CDK阻害剤が記載されており、そのうちのいくつかは、強力な抗腫瘍活性を有する(Current Opinion in Pharmacology, 2003(3): 362-370)。公知のCDK阻害剤についての包括的な総説は、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42(19):2122-2138において見出され得る。
結論として、疼痛治療、特に慢性の炎症性疼痛及び神経因性疼痛に関する安全でかつ効果的な方法について、まだ対処されていない高い需要がある。
(前記式中、
R1が、-NR5R6、-R8、-C1-4アルキル-OH、又は-C2-4-アルキレン-O-C1-4アルキルの群から選択され;
式中、
R5及びR6が互いに独立して、水素、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル若しくはC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキレン、C4-7アリール-C0-4アルキレン、又はC4-7ヘテロアリール-C0-4アルキレン、或いは
式中、R5及びR6が結合するN原子とともに該R5及びR6がまた、5〜8員のヘテロシクロアルキル又は5〜6員のヘテロアリールを形成し得、
式中、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はアルキルがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O-及び-NR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R8が、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C2-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル又はC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキルであり;
Xが、分岐鎖アルキレンを含むC1-4アルキレン、好ましくはメチレンであり、式中、該C1-4アルキレンが、R5R6、又はR8へ結合して、5〜6員の複素環を形成でき;
式中、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はアリールがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O及び-NR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R2が、ハロの群から独立して選択される0〜2個の置換基であり得;
R3が、水素、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C3-7シクロアルキル、C1-4アルキル-シクロアルキル、C1-4アルキル-ヘテロシクロアルキル、-O-ヘテロシクロアルキル、C1-4アルコキシ、C1-4アルケニルオキシ、-OCF3、C2-4アルカノイル、C1-4アルキルスルホニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)スルホンアミド、アミノカルボニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)アミノカルボニル、アリール-C1-4アルコキシ、ヘテロアリール-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルキル、ヘテロアリール-C1-4-アルキル、C1-4アルキルオキシメチル、ヒドロキシ-C1-4アルキルオキシメチル、シアノ、-COOH及びC1-C4アルキルカルボニルからなる群から独立して選択される1〜3個の置換基であり得、この中で、上述の置換基が、C1-4-アルキル、ヒドロキシル-C0-4-アルキル、C1-4-アルコキシ、アミノカルボニル、ハロ及びNR5R6の群から選択されるラジカルによってさらに置換でき;
R4が、水素、C1-4アルキル又は-NR'R"から選択され、式中R'及びR"が各々、水素、及びC1-4アルキルから独立して選択される。
ヘテロシクロアルキルという用語は、酸素、硫黄又は窒素から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を含有する5〜10員の単環式又は二環式環系を含むことを意味し、好ましくはピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ピペリジニル、ピペラジジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル又はモルフォリニルを含む群から選択される。
ヘテロアリールという用語は、酸素、硫黄又は窒素から独立して選択される1〜3個のヘテロ原子を含有する、部分的に又は完全に不飽和の5〜10員の単環式又は二環式の環系を示し、好ましくはピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジル、ピリダジニル、ピラジジル、3-メチルピリジル、ベンゾチエニル、4-エチルベンゾチエニル、3,4-ジエチルフラニル、ピロリル、テトラヒドロキノリル、キノリル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキシゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリルからなる群から選択される。
(式中、
R3aが、水素、C1-4アルコキシ、C2-4アルケニルオキシ、アリール-C1-4アルコキシ、及びヘテロアリール-C1-4アルコキシの群から選択され;
R3bが、水素、C1-4アルコキシ、C2-4アルケニルオキシ及びC0-4アルキルNR5R6の群から選択され;
R3cが、水素及びハロの群から選択され;
但し、R3a及びR3bが、同時に水素であることはできず;
及び式中、R1、R2、R5、R6及びXが、上述に定義されるものと同一の意味を有する。)。
R1が、NH2-、N-メチル-、N-プロピル-、N-イソプロピル-、N-シクロプロピル-、N-シクロペンチル-、N,N-ジエチル-の群から選択され、
Xが、メチレンであり;
R2が、水素であり、
R3aが、水素、メトキシ-、エトキシ-、イソプロピルオキシ-、及びベンジルオキシ-の群から選択され;
R3bが、水素、メトキシ-、3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル-、3-ジエチルアミノメチル-、3-ピペリジン-1-イルメチル-、3-モルフォリン-4-イルメチル-、4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル-、及び[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-の群から選択され;
R3cが、水素又はハロであり;
但し、R3a及びR3bが、同時に水素であることはできない、
ことが特に好ましい。
C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-プロピル-メタンスルホンアミド(化合物1);
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物2);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-シクロペンチル-メタンスルホンアミド(化合物3);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-イソプロピル-メタンスルホンアミド(化合物4);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-シクロプロピル-メタンスルホンアミド(化合物5);
{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物6);
C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-メチル-メタンスルホンアミド(化合物7);
{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物8);
{4-[6-(2,3-ジメトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物9);
N,N-ジエチル-C-{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物10);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-メチル-メタンスルホンアミド(化合物11);
{4-[6-(3-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物12)
{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物13)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物14)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-イソプロポキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物15)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(4-フルオロ-2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物16)
(4-{6-[3-(3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物17)
{4-[6-(3-ジエチルアミノメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物18)
{4-[6-(3-ピペリジン-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物19)
{4-[6-(3-モルフォリン-4-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物20)
(4-{6-[3-(4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物21)
{4-[6-(3-[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物22)
N-シクロペンチル-C-(4-{6-[3-(3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル)-フェニル]-ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物23)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-ジエチルアミノメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物24)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-ピペリジン-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物25)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-モルフォリン-4-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物26)
N-シクロペンチル-C-(4-{6-[3-(4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物27)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物28)。
本発明によって提供されるCDK5の阻害剤は、一般式I記載の化合物:
(前記式中、
R1が、-NR5R6、-R8、-C1-4アルキル-OH、又は-C2-4-アルキレン-O-C1-4アルキルの群から選択され;
式中、
R5及びR6が互いに独立して、水素、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル若しくはC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキレン、C4-7アリール-C0-4アルキレン、又はC4-7ヘテロアリール-C0-4アルキレン、或いは
式中、R5及びR6が結合するN原子とともに該R5及びR6がまた、5〜8員のヘテロシクロアルキル又は5〜6員のヘテロアリールを形成し得、
式中、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はアルキルがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O-及び-NR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R8が、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C2-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル又はC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキルであり;
Xが、分岐鎖アルキレンを含むC1-4アルキレン、好ましくはメチレンであり、式中、該C1-4アルキレンが、R5R6、又はR8へ結合して、5〜6員の複素環を形成でき;
式中、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はアルキルがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O-及び-NR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R2が、ハロの群から独立して選択される0〜2個の置換基であり得;
R3が、水素、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C3-7シクロアルキル、C1-4アルキル-シクロアルキル、C1-4アルキル-ヘテロシクロアルキル、-O-ヘテロシクロアルキル、C1-4アルコキシ、C1-4アルケニルオキシ、-OCF3、C2-4アルカノイル、C1-4アルキルスルホニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)スルホンアミド、アミノカルボニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)アミノカルボニル、アリール-C1-4アルコキシ、ヘテロアリール-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルキル、ヘテロアリール-C1-4-アルキル、C1-4アルキルオキシメチル、ヒドロキシ-C1-4アルキルオキシメチル、シアノ、-COOH及びC1-C4アルキルカルボニルからなる群から独立して選択される1〜3個の置換基であり得、この中で、上述の置換基は、C1-4-アルキル、ヒドロキシル-C0-4-アルキル、C1-4-アルコキシ、アミノカルボニル、ハロ及びNR5R6の群から選択されるラジカルによってさらに置換でき;
R4が、水素、C1-4アルキル又は-NR'R"から選択され、式中R'及びR"が各々、水素、及びC1-4アルキルから独立して選択される。
本発明はさらに、CDK5の活性を調節でき、それによりCDK5関連障害を寛解できる薬物を開発するために合理的な薬物設計を実行するための方法を提供する。
本発明は、CDK5と関連した障害、疾患及び/又は容態の症状を呈する患者又は対象における該症状を寛解できる本発明の薬剤(又は薬物又は化合物)を投与する方法を提供する。ある実施態様において、本発明は、CDK5関連障害の症状を呈する患者又は対象における該症状を寛解できる、本明細書に開示される方法によって同定される薬剤を投与する方法を提供する。
本明細書で使用されるように、阻害する化合物の「有効量」は、本明細書に開示されるもの等の分析方法を使用する研究からのデータに基づいて、当業者によって決定できる量である。本明細書で使用されるように、「CDK5」、「Cdk5」又は「cdk5」という用語は、神経細胞サイクリン依存性様タンパク質(Nclk)及びタウタンパク質キナーゼII(TPKII)としても公知である「サイクリン依存性キナーゼ5」と同じ意味で使用される。Cdk5は、サイクリン依存性キナーゼの一員であるが、非典型的に、Cdk5は、サイクリンよりもむしろ神経細胞サイクリン依存性様キナーゼ5関連タンパク質(Nck5a)と呼ばれる非サイクリン補因子を採用する。
式I記載のCDK阻害剤の投与が痛覚鈍麻効果を有することが判明している。
このように、好ましい実施態様において、本発明は、式I記載の有効量のCDK5の阻害剤を投与することを含む、いずれかの種類の疼痛を治療する方法に関する。特に、式Iの化合物は、慢性、神経因性及び/又は炎症性疼痛の治療に使用され得る。具体的な好ましい実施態様において、いずれかの種類の疼痛の治療における使用のための式Iの化合物は、他のCDKに対するよりもCDKに対する高い選択性を示す。
本明細書で使用される「疼痛」という用語は一般的に、いずれかの種類の疼痛に関し、急性疼痛、慢性疼痛、炎症性及び神経因性疼痛等の様々な種類の疼痛を広範に包含する。本発明の好ましい実施態様において、「疼痛」は、神経因性疼痛及び関連容態を含む。疼痛は、慢性であり得、アロディニア(通常無害の刺激に由来する疼痛の知覚)、痛覚過敏(付与されたいずれかの疼痛刺激に対する過度の反応)及び受容野(すなわち、刺激が適用される場合に「痛い」領域)の拡大、幻肢痛又は炎症性疼痛であり得る。
好ましい実施態様において、「疼痛」は、頭痛(例えば、片頭痛障害、偶発性及び慢性緊張型頭痛、緊張型様頭痛、群発頭痛、及び慢性発作性片側頭痛)、腰痛、癌性疼痛、骨関節炎疼痛及び神経因性疼痛を含む慢性疼痛の種類に関するが、それらに限定されるわけではない。
驚くべきことに、本明細書に開示される式I記載のCDK阻害剤が、インビトロ及びインビボでの炎症アッセイにおいて抗炎症効果を発揮することを示すことができた。このように、好ましい実施態様において、本発明は、式I記載のサイクリン依存性キナーゼの有効量の阻害剤を投与することを含む炎症性疾患を治療する方法に関する。具体的な好ましい実施態様において、炎症性疾患の治療における使用のための式Iの化合物は、他のCDKに対するよりもCDK5に対する高い選択性を示す。
また、式I記載の化合物は、例えば自己免疫疾患等の免疫学的疾患の治療及び/又は予防において有用であると考えられる。従って、本発明は、免疫学的疾患の治療及び/又は予防のための方法を必要とする対象への、式I記載の有効量の少なくとも1つのCDK5阻害剤の投与を含む該方法を提供する。本明細書で使用される「免疫学的疾患」という用語は、アレルギー、喘息、移植片対宿主病、免疫不全症及び自己免疫疾患を含むがそれらに限定されない疾患に関する。特に、免疫学的疾患には、糖尿病、リウマチ性疾患、エイズ、慢性肉芽腫性疾患、移植された臓器及び組織の拒絶、鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、骨粗鬆症、潰瘍性大腸炎、クローン病、副鼻腔炎、エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、重症筋無力症、脱毛症、反復性感染症、アトピー性皮膚炎、湿疹及び重度のアナフィラキシー反応が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに、「免疫学的疾患」にはまた、接触アレルギー、食物アレルギー又は薬剤アレルギー等のアレルギーが含まれる。
式Iの化合物は、細胞周期の制御に関与する鍵分子を表すサイクリン依存性キナーゼの阻害剤である。細胞周期の制御障害は、腫瘍細胞の主要な特徴の1つである。このように、該化合物は、異常に***する細胞における細胞周期の調節を抑止し又は回復させる上で有用であることを立証すると期待される。このように、式I記載の化合物が、癌等の増殖性疾患の治療及び/又は予防において有用であることが期待される。従って、本発明は、式I記載のサイクリン依存性キナーゼの有効量の少なくとも1つの阻害剤を投与することを含む増殖性疾患の治療及び/又は予防のための方法を提供する。
さらに、本発明は、式I記載のサイクリン依存性キナーゼの有効量の少なくとも1つの阻害剤を投与することを含む心血管疾患の治療及び/又は予防に関する。心血管疾患の分野が、CDK阻害剤について起こり得る臨床的適用を構成することが報告されている(Pharmacol Ther 1999, 82(2-3):279-284)。
CDK阻害剤は、神経保護効果を発揮することが記載されている。特に、CDK阻害剤が、アルツハイマー病等の神経変性疾患における神経細胞の死滅を予防することが報告されている(Biochem Biophys Res Commun 2002 (297):1154-1158;Trends Pharmacol Sci 2002 (23):417-425;Pharmacol Ther 1999, 82(2-3):279-284)。
本発明の好ましい実施態様には、医薬として許容し得る少なくとも1つの(すなわち非毒性の)担体、賦形剤及び/又は希釈剤とともに、活性成分としての式I記載の少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含む組成物の投与が含まれる。好ましくは、組成物は、活性成分として式I記載の少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含み、この中で、該少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、他のCDKに対するよりもCDK5に対する高い選択性を有する。
さらにまた、鎮痛薬としての抗痙攣薬(例えば、ガバペンチン)、GABABアゴニスト(例えば、L-バクロフェン)、オピオイド、バニロイド受容体アンタゴニスト及びカンナビノイド(CB)受容体アゴニスト、例えばCB1受容体アゴニストの使用は、本発明の方法及び組成物において好ましい。
本発明の医薬組成物は、従来の固体又は液体の担体又は希釈剤及び医薬として調製される従来のアジュバントにおいて、公知の方法で適切な薬用量レベルで調製できる。好ましい調製物は、経口適用に適している。これらの投与形態には、例えば、丸剤、錠剤、フィルム錠、コート錠、カプセル、粉末及び沈着物が含まれる。
また、甘味料及び調味料並びに保存料は、適宜含まれ得る。崩壊剤、希釈剤、潤滑剤、結合剤等は、以下により詳細に論議される。
坐剤を調製するために、ココアバターのような脂肪酸グリセリドの混合物等の低融点蝋がまず融解され、次に、活性成分が、例えば撹拌によってその中に均質に分散する。次に、融解された均質な混合物が、便利な大きさの鋳型へ注入され、冷却され、それにより凝固する。
また、使用直前に経口又は非経口のいずれかの投与のための液状調製物へ変換されるよう企図された固体状調製物が含まれる。これらの液状には、溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。
該組成物における滑走剤の量は、最終組成物の約0.1〜約5重量%、好ましくは約0.5〜約2重量%の範囲とし得る。
本発明は、下記の制限的でない実施例によってさらに説明される。
すべての試薬をACROS Organics、Aldrich、Lancaster、Maybridge及びBoron Molecularから購入した。化合物についての液体クロマトグラフィー/質量分析を、APCIイオン化を備えたSurveyor MSQ(Thermo Finnigan, USA)で実施した。1H NMRスペクトルを「MERCURY plus 400 MHz」分光計(Varian)で記録した。化学シフト値をテトラメチルシラン(TMS)に対するppmで付与し、残留溶媒水素イオン共鳴を内部標準とする。Sanyo Gallenkamp装置で融点を決定した。
塩化(3-ニトロフェニル)メタンスルホニル(2.36g、10mmol)をベンゼン(30mL)に溶解した後、この溶液に40%ジメチルアミン水溶液(12.6mL、0.1mol)を添加し、反応混合物を室温で2時間激しく撹拌した。ベンゼン層を分離し、水性層をCH2Cl2(2×25mL)で抽出した。組み合わせた有機層を飽和NaHCO3水溶液(30mL)、水(30mL)で洗浄し、溶媒を減圧下で除去すると、(3-ニトロフェニル)-N,N-ジメチルメタンスルホンアミド2.32g(95%)を結晶として得た。
(3-ニトロフェニル)-N,N-ジメチルメタンスルホンアミド(2.32g、9.5mmol)をメタノール中のラネーニッケル(0.5g)上で50℃及び70psiで4時間水素化した後、触媒を濾過し、温メタノールで洗浄し、組み合わせた濾液を蒸発させて、(3-アミノフェニル)-N,N-ジメチルメタンスルホンアミド1.95g(96%)を得た。
ジメトキシエタン(120mL)及び水(18mL)の混合物における4,6-ジクロロピリミジン(6.0g、40mmol)及び2-メトキシフェニルボロン酸(4.41g、29mmol)の溶液に、NaHCO3(6.72g、80mmol)及び(PPh3)2PdCl2(0.84g)を添加し、反応混合物を8時間還流し、減圧下で濃縮した。結果として生じる残渣をCH2Cl2(100mL)中に溶解し、溶液を水で洗浄し、無水K2CO3上で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。得られた粗生成物をシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィー(溶離剤CH2Cl2)によって精製し、ヘキサンから再結晶した。4-クロロ-6-(2-メトキシフェニル)-ピリミジンの収量4.78g(75%)。
DMFA(3mL)における(3-アミノフェニル)-N,N-ジメチルメタンスルホンアミド(0.107g、0.50mmol)及び4-クロロ-6-(2-メトキシフェニル)-ピリミジン(0.110g、0.10mmol)の混合物を、反応完了まで80℃で撹拌した(薄層クロマトグラフィー対照)後、真空濃縮し、残渣をイソプロパノールから再結晶させて、C-{3-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N,N-ジメチル-メタンスルホンアミド(参考化合物1)を得た。
収量:0.101g(51%)
融点187.5〜188.8℃
塩化(3-ニトロフェニル)メタンスルホニル(0.6 g、2.55mmol)をアセトニトリル(10mL)に溶解した後、この溶液にプロピルアミン(0.247mL、3mmol)及びトリエチルアミン(1mL)を添加し、反応混合物を室温で3時間激しく撹拌した。得られた混合物を冷水(30mL)で希釈すると、沈殿物を形成するに至り、それを濾過し、水(2×10mL)で洗浄し、乾燥させた。(3-ニトロフェニル)-N-プロピルメタンスルホンアミドの収量0.63g(95%)。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物1に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
収量:0.193 g(79%)
融点114.7〜116.0℃
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-エトキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物1に関するものと同一の手法。
参考化合物2に関するものと同一の手法。
収量:0.115 g(54%)
融点234.1〜235.0
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-エトキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物1に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
収量:0.165 g(73%)
融点189.0〜190.0℃
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
収量:0.140 g(55%)
融点210.1〜211.0℃
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物1に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
収量:0.131 g(54%)
融点168.8〜169.5℃
参考化合物2に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物1に関するものと同一の手法。
参考化合物1に関するものと同一の手法。
収量:0.129 g(53%)
融点178.0〜178.8℃
3-メトキシプロピルアミン(0.184mL、1.80mmol)及びトリエチルアミン(0.3mL)を、アセトニトリル(10mL)における塩化(3-ニトロフェニル)メタンスルホニル(0.35g、1.50mmol)の溶液に添加した。結果として生じる溶液を室温で3時間激しく撹拌した後、沈殿物の形成に至る冷水(30mL)で希釈した。沈殿物を濾過し、水(2×10mL)で洗浄し、乾燥させた。N-(3-メトキシ-プロピル)-C-(3-ニトロ-フェニル)-メタンスルホンアミドの収量0.31g(72%)。
N-(3-メトキシ-プロピル)-C-(3-ニトロ-フェニル)-メタンスルホンアミド(0.31g、1.08mmol)を、メタノール中のラネーニッケル(0.05g)上で50℃及び70psiで4時間水素化した。次に、触媒を濾過し、温メタノールで洗浄し、組み合わせた濾液を蒸発させてと、C-(3-アミノ-フェニル)-N-(3-メトキシ-プロピル)-メタンスルホンアミド0.14g(50%)を得た。
4,6-ジクロロピリミジン(6.0g、40mmol)及び2-メトキシフェニルボロン酸(4.41g、29mmol)をジメトキシエタン(120mL)及び水(18mL)の溶液に添加した後、NaHCO3(6.72g、80mmol)及び(PPh3)2PdCl2(0.84g)を添加した。この結果へ反応混合物を8時間還流した後、減圧下で溶媒を除去した。残渣をCH2Cl2(100mL)に溶解し、結果として生じる溶液を水で洗浄し、無水K2CO3上で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー(溶離剤CH2Cl2)によって精製し、ヘキサンから再結晶して、4-クロロ-6-(2-メトキシフェニル)-ピリミジン(4.78g;75%)を得た。
DMFA(3mL)におけるC-(3-アミノ-フェニル)-N-(3-メトキシ-プロピル)-メタンスルホンアミド(0.129g、0.50mmol)及び4-クロロ-6-(2-メトキシフェニル)-ピリミジン(0.110g、0.10mmol)の混合物を80℃で反応完了まで撹拌した(薄層クロマトグラフィー対照)後、真空下で蒸発させた。結果として生じる残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製させて、C-{3-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-(3-メトキシ-プロピル)-メタンスルホンアミドを得た。
収量:0.140 g(63%)
融点:149.2〜150.8℃
40%メチルアミン水溶液(10mL、0.1mol)をベンゼン(30mL)における塩化(3-ニトロフェニル)メタンスルホニル(2.36g、10mmol)の激しく撹拌した溶液に添加し、室温で2時間撹拌させた。ベンゼン層を分離し、水性層をCH2Cl2(2×25mL)で抽出した。組み合わせた有機層を飽和NaHCO3水溶液(30mL)、水(30mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で濾過し、濾過し、溶媒を減圧下で除去すると、(3-ニトロフェニル)-N-メチルメタンスルホンアミド2.07 g(90%)を結晶として得た。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-エトキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
収量:0.209 g(76%)
融点:155.9〜156.5℃
塩化(4-ニトロフェニル)メタンスルホニル(1.0 g、4.3mmol)をアセトニトリル(10mL)に溶解した後、この溶液に炭酸アンモニウムで飽和した濃縮アンモニア水溶液(10mL)を添加し、反応混合物を室温で1時間激しく撹拌した。次に、アセトニトリルを減圧下で除去し、残渣を沈殿形成に至る冷水(10mL)で希釈した。沈殿を濾過し、水(2×5mL)、エーテルで洗浄し、乾燥させた。(4-ニトロフェニル)メタンスルホニルアミドの収量0.6 g(65%)。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-エトキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
DMFA(3mL)中(4-アミノフェニル)メタンスルホニルアミド(0.093g、0.50mmol)及び4-クロロ-6-(2-エトキシフェニル)-ピリミジン(0.117g、0.50mmol)の混合物を80℃で反応完了まで撹拌した(薄層クロマトグラフィー対照)。次に、反応混合物を真空濃縮し、残渣をイソプロパノールから再結晶させて、{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物6)を得た。
収量:0.140 g(73%)
融点:213.5〜215.1℃
参考化合物4に関するものと同一の手法。
b.(4-アミノフェニル)-N-メチルメタンスルホンアミドの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
d.C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-メチル-メタンスルホンアミド(化合物7)の合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
収量:0.099 g(59%)
融点:218〜219℃
化合物6に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
化合物6に関するものと同一の手法。
収量:0.180 g(81%)
融点:213.7〜215.9℃
化合物6に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2,3-ジメトキシ-フェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
化合物6に関するものと同一の手法。
収量:0.170 g(85%)
融点:247.8〜250.5℃
参考化合物3に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-メトキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
収量:0.070 g(33%)
融点:233.9〜235.8℃
参考化合物4に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
c.4-クロロ-6-(2-ベンジルオキシフェニル)-ピリミジンの合成
参考化合物3に関するものと同一の手法。
参考化合物3に関するものと同一の手法。
収量:0.164 g(70%)
融点:無定形挙動、85℃超で軟化
I.炎症性及び神経因性疼痛の分析のための行動動物モデル
炎症性及び神経因性疼痛の分析のためのいくつかの動物モデルは公知である。該モデルは、例えば神経病変の誘発(例えば、坐骨神経部分損傷、SNI)後又は侵害刺激に対する実験動物の曝露(例えば、ホルマリン又はカラゲナンの注射)後、該介入によって誘発されるような疼痛の徴候は、例えばフォン・フレイ毛髪を使用する機械的刺激に対する(又は、レーザー源若しくは舐める行動を使用する熱刺激に対する)足引っ込め閾値等の行動の定量可能な構成要素によって測定される。これらの反応は、ヒトにおける機械的アロディニア及び熱アロディニア(機械的刺激に対する過敏症)又は痛覚過敏と等価であるものとして解釈される。坐骨神経部分損傷モデル(SNIモデル、Decosterd及びWoolf(2000)によって開発、図1参照)は、臨床的に関連する神経病変の誘発及び外科的介入後の行動実験(例えば、フォン・フレイアッセイ)によって特徴付けられる。該モデルは、腓腹神経を無傷のままにしておき坐骨神経の2つの分岐(すなわち、脛骨神経及び総腓骨神経)の結紮及び切断からなる共通神経損傷モデルを構成する。SNIモデルは、臨床的な神経因性疼痛の特徴を密接に模倣する機械的感度及び冷却感度における早期の(24時間未満)、長期の及び実質的な変化を結果的に生じる。これらの種類の神経損傷を有する動物は、神経因性疼痛患者によって報告されるものと同様の異常な疼痛感覚及び機械的刺激に対する過敏症(アロディニア)を発生することが示されている。或いは、マウスにおけるホルマリンアッセイは、炎症性及び神経因性疼痛における侵害受容の妥当なかつ信頼性のある行動モデルである。該アッセイは、多様なクラスの鎮痛薬に対して感受性がある(Hunskaar S及びHole Kの文献(Pain. 1987 Jul;30(1):103-14))。侵害刺激は、左後足の背側面の皮膚の下(左後足への皮下又は足底間)での10μLの希釈したホルマリン(塩類溶液中で2%)の注射液からなる。反応は、注射された足を舐めること及び畏縮させることである。カラゲナンアッセイについて、マウスの単一の後足(同側足)への(塩類溶液中の)1%カラゲナン25μLの皮下注射が適用される。その後の炎症は結果的に、足の長期に持続する発汗及び(機械的刺激及び熱刺激に対する)過敏症を生じる。カラゲナンアッセイは、検査化合物の抗炎症性活性を予測するために使用される標準的な実験室アッセイである。足の浮腫測定及びハーグリーブスアッセイ(Hargreaves Assay)(光源を介する熱刺激による足の引っ込め)は、読み出しに使用される。本発明に関して、炎症性及び神経因性疼痛の発生に及ぼす式I記載のCDK5阻害化合物の投与の効果は、SNIモデルにおいて、カラゲナンにおいて及びホルマリンアッセイにおいてアッセイされ得る。
A.坐骨神経部分損傷(SNI)−慢性神経因性疼痛のモデル
先に概略したように、坐骨神経部分損傷(SNI)モデル(図1参照)は、腓腹神経を無傷のままにしておく実験動物の坐骨神経の3つの末端分岐のうちの2つ(脛骨神経及び総腓骨神経)の病変を包含する。SNIは、損傷を受けていない腓腹神経の皮膚の縄張りにおける機械的アロディニア及び熱アロディニアを結果的に生じる(Decosterd及びWoolfの文献(Pain 2000; 87:149-158)、(2) Tsujinoらの文献(Mol. Cel. Neurosci. 2000; 15:170-182))。
野生型マウス(C3HeB/FeJ系)(齢、性別及び体重は対形成)を、外科的準備の前に4μL/gで1:1:2の比でHypnorm(0.315mg/mLクエン酸フェンタニル+10mg/mLフルアニソン;Janssen)/Hypnovel(5mg/mLミダゾラム;Roche Applied Sciences)/水で麻酔した。
手術からの回復及び創傷治癒後、SNIマウスはCDK阻害化合物の経口注入を受容した。
2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)400μLに溶解したCDK阻害剤30mg/kgを、フォン・フレイ測定(機械的アロディニア)の30分前に経口適用を介して投与した。ネガティブコントロールとして、同量(400μL)の2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)媒体を、フォン・フレイ測定の30分前に単回経口適用によって投与した。
機械的アロディニアの発生に及ぼすSNIマウスへのCDK阻害剤の投与の効果を、以下に記載のとおり、フォン・フレイアッセイにおいて分析した。
SNI及びその後の本発明の化合物の投与を経験するマウスを、フォン・フレイアッセイにおける神経損傷後及び投与後の機械的アロディニアの徴候について検査した(Decosterd及びWoolfの文献(Pain 2000; 87:149-158))。本アッセイは、通常では痛くない刺激が不快な又は痛いものとして動物によって認識される機械的閾値を決定する。SNI同側及びSNI反対側の基線を個々に確立した。
直径約9.5cm、高さ14cmで先に向けての4つの通気孔及びプレキシガラス蓋のついたプレキシガラスシリンダーにマウスを配置した。シリンダーを高架のメッシュ表面(7×7平方mm)の上に配置した。検査前日、マウスを検査シリンダーに1〜2時間順応させた。検査当日、マウスをシリンダーに約1時間順化させ、この中で、順化時間は、マウスの系及びマウスが以前検査された回数等の因子に依存する。一般的に、検査は、マウスが一旦落ち着いて新たな環境を探検するのを停止したら開始し得る。
上述のとおり、CDK阻害化合物をSNIマウスへ投与した。上述のとおり、術後107日目に動物の同側及び反対側の足でフォン・フレイ測定を実施した。薬理学的処置をせずに、SNIマウスは、SNI手術後に安定したアロディニアを示す。化合物で処置された動物は、機械的刺激に対する低い感度(低いアロディニア)を示す閾値の有意な増大を示す。低いアロディニアの観察は、CDK阻害化合物が、慢性神経因性疼痛のモデルにおける痛覚鈍麻薬として効果的であることを意味する。
ホルマリンアッセイ−炎症過程/炎症性及び慢性神経因性疼痛のモデル
マウスにおけるホルマリンアッセイは、侵害受容の妥当かつ信頼性のある行動モデルであり、多様なクラスの鎮痛薬に対して感受性がある(Hunskaar S及びHole Kの文献(Pain. 1987 Jul;30(1):103-14))。侵害受容刺激は、10μLの希釈したホルマリン(2%塩類溶液)の左後足への皮下又は足底内注射である。反応は、注射された足を舐めること及び畏縮させることである。反応は、炎症過程の異なる部分を反映する2つの相(Abbottら1995)、すなわち早期/急性相である注射0〜5分後、及び後期/慢性相である注射5〜30分後を示す。下記のプロトコールは、実験を実施するための可能な1つの方法を記載する:
本アッセイにおいて、齢、性別及び体重の対形成した野生型マウス(C3HeB/FeJ)を使用する。ホルマリン注射の前に、動物を各群10匹の実験群へ無作為にさらに分ける。ホルマリン注射の30分前に、2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)400μLに溶解した適量のCDK阻害剤は、腹腔内注射により投与できる。同様に、2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)400μLにおけるIkキナーゼ(IKK)阻害剤(30mg/kg)(ポジティブコントロール)、又は媒体単独(2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)400μL)(ネガティブコントロール)は、ホルマリン注射の30分前に腹腔内注射によって投与できる。ホルマリン注射に向けて、移動による注射の妨害を回避するために、マウスをペーパータオルで保持する。注射した後足を親指と人差し指との間に保持し、ハミルトンシリンジを使用してホルマリン(2%)10μLを2つの***間で後足足底へと皮下注射する。ホルマリン及び阻害剤で処置したマウスの行動を以下に記載のとおり分析する。
ホルマリン処置したマウスの行動、すなわち舐めること及び畏縮を、規定された時間にわたって自動追跡システム(Ethovision 3.0 Color Pro, Noldus, Wageningen, Netherlands)によってモニターする:ホルマリン注射5分後に測定を開始し、ホルマリン注射30分後に終了する。この時間枠は、痛覚過敏であるホルマリン誘発性侵害受容(疼痛)の位相IIにわたる。注射した後足(黄色色素)(Lumogenyellow; BASF Pigment, Cologne, Germany)及び反対側の足(青色色素)(Lumogenviolet; Kremer Pigmente, Aichstetten, Germany)をそれぞれ局所的に標識するために、2つの異なる染色色素を使用する。舐める行動を決定するために、マウスをCCDカメラでモニターする。モニタリング及び録画後、EthoVisionソフトウェア(Ethovision 3.0 Color Pro, Noldus, Wageningen, Netherlands)を使用して、又は手動分析によってビデオを分析する。蛍光点の大きさ及び蛍光強度を測定し、舐めること及び噛みつくことを通じての蛍光点の大きさの減少を算出した。処置された足と処置されていない足の点の大きさの減少の比較により、全体的な舐める時間の強度を自動的に算出した。アッセイの読み出しの別の変形として、個々の動物の舐める行動をビデオファイルに基づいて手動で追跡した。ホルマリン注射後30分間にわたって舐める時間を記録し、3つの異なる舐める区域(背面、足底、つま先)についてさらに分けた。全体的な舐める時間は各動物及び各実験群について算出でき、化合物の効能の決定のためのパラメータとして使用できる。結果として、ホルマリン注射前に媒体処置を受容するマウス(ネガティブコントロール)は、ホルマリン処置した足での長い舐める時間及び蛍光点の大きさの有意な減少を示すことが発見された。検査化合物/ホルマリン処置したマウスに関するホルマリン処置した足の舐める時間の減少の観察及び結果として蛍光点の大きさの有意な減少がなかったことは、疼痛及び炎症の緩和の表示である。
マウスにおけるカラゲナンアッセイ−炎症及び炎症性疼痛のモデル
カラゲナン誘発性の足の浮腫のモデルは、個々の化合物の抗炎症活性及び炎症誘発性疼痛知覚の低下を予測するために使用される標準的な実験室アッセイである。下記のプロトコールは、実験を実施するための可能な1つの方法を記載する。基本的な測定は、浮腫並びに、カラゲナン等の刺激物に応答した機械的及び熱による過敏症の測定において構成する。炎症及び結果として生じる炎症性疼痛は、1%カラゲナン(塩類溶液)25μLのマウス後足(同側足)への皮下注射によって誘発される。各群10匹のマウスは、カラゲナン注射の30分前の腹腔内注射による式I記載の化合物(30mg/体重kg)、媒体(2%ヒドロクスプロリルセルロース;0.25%乳酸(85%溶液)400μL)及び塩類溶液(生理NaCl)の投与を受容する。反対側の足は、カラゲナン注射を受容しない。
カラゲナン注射によって誘発される足の浮腫を、注射した(同側の)足の中足領域で背面から足底まで測定した大きな足のサイズによって検出する。同側及び反対側の足の大きさは、炎症についての代理マーカーとして機能し、カラゲナン注射後のいくつかの時点:注射前(-1)、注射2時間後(2)、3時間後(3)、4時間後(4)、5時間後(5)、6時間後(6)、24時間後(24)に測定される。
ラットにおけるカラゲナンアッセイ−炎症及び炎症性疼痛のモデル
下記は、ラットにおいてカラゲナンアッセイを実施する可能な1つの方法を示す。該アッセイは、炎症性疼痛を有するラットにおける鎮痛/抗炎症活性を検出し、Winterらの文献(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 111, 544-547, 1962)によって記載されるプロトコールに従う。ラット(200〜250g)の右後足の下位表面にカラゲナンの懸濁液を注射する(1足につき0.05mL生理塩類溶液における0.75mg)。2時間後、両足の触覚刺激及び熱刺激へ連続的に、ラットを供する。触覚刺激のために、格子床上の反転したアクリル製プラスチック箱(18×11.5×13cm)の下に動物を配置する。次に、力を増大させながら、電子フォン・フレイプローブ(Bioseb, Model 1610)の先端をまず、炎症を生じていない足へ、次に炎症を生じた足へ適用し、足の引っ込めを誘発させるのに必要な力を自動的に記録する。この手法を3回実施し、1足あたりの平均の力を算出する。熱刺激のために、装置(Ugo Basile, 参考文献: 7371)は、高架のガラス床上に配置された個々のアクリル製プラスチック箱(17×11×13cm)からなる。ラットを箱の中に配置し、10分間自由に慣れさせる。次に、携帯赤外線源(96±10mW/cm2)をまず炎症を生じていない後足の下に、次に炎症を生じた後足の下に焦点合わせし、足引っ込め潜時を自動的に記録する。組織障害を防止するために、熱源を45秒後に自動的にオフにする。行動測定後、足の浸漬によって誘発される水置換(mL)を示すデジタル体積記録計(Letica, Model 7500)を使用して、各後足の体積を測定することによって、足の浮腫を評価する。各群につき10匹のラットを研究する。検査を盲検で実施する。本明細書に呈される式I記載のCDK5阻害剤等の検査物質は、検査60分前に経口投与される2用量(10及び30mg/kg)で評価され、媒体対照群と比較されるであろう。同一実験条件下で投与されるモルヒネ(128mg/kg経口投与)及びアセチルサリチル酸(512mg/kg経口投与)は、基準物質として使用されるであろう。それゆえ、実験には6群が含まれるであろう。対応のないスチューデントのt検定を使用して、処置された群を媒体対照と比較することによって、データが分析されるであろう。本明細書に開示されるCDK5阻害剤及びカラゲナンを使用して、又はナプロキセン及びカラゲナンを使用して、又は溶媒及びカラゲナンを使用してそれぞれ処置されたマウスを、ハーグリーブスアッセイに供する。CDK5阻害剤及びカラゲナンを使用して処置されたマウスは、ネガティブコントロールマウスと比較してより長い潜時を示すべきである。この観察は、本明細書に開示されるようにCDK5阻害剤の痛覚鈍麻効果を示すであろう。
A.インビトロでのキナーゼ阻害アッセイ
インビトロでの酵素キナーゼ阻害アッセイにおけるサイクリン依存性キナーゼCDK2/CycA、CDK4/CycD1、CDK5/p35NCK、CDK6/CycD1及びCDK9/CycTについて、化合物1〜28番のIC50特性を決定した。CDK9阻害に関する化合物の特異的選択性及び効力を評価するために、これらのアッセイにおいて得られるIC50値を使用した。これらのアッセイにおいて得られた結果を使用して、CDK5に対する特異性を示す化合物を選択した。特に、該アッセイはまた、CDK5特異的化合物を、他のCDKに関しても、すなわちCDK2、4、6、及び9のいくつか又はすべてに関して有意な阻害効力を有する他の化合物と識別するよう企図された。この分離は、細胞周期と関連性のあるCDK2、4、6、及び9の阻害の際に生じ得る有害な(細胞***抑制/細胞毒性)効果を回避するために必須である。さらに、これらのデータを使用して、効力及び選択性に関して新たな及びさらに改良された構造/化合物の設計を支持する構造活性関係性(SAR)を確立した。
100%DMSOにおける1×10-02Mストック溶液として化合物を使用し、各100μLを3つの96ウェルV字型マイクロタイタープレートの2列目に分注した(以下、該プレートを「マスタープレート」と呼ぶ。)。その後、100%DMSOを溶媒として使用する連続半対数希釈へマスタープレートの2列目における1×10-02Mストック溶液を供し、結果的に10個の異なる濃度を生じ、希釈終点は、12列目における3×10-07M/100%DMSOであった。1列目及び7列目に対照として100%DMSOを充填した。その後、96チャネルピペッターを使用して、連続希釈したコピープレートの各ウェルの2×5μLを「化合物希釈プレート」の2つの同一セットに分注した。キナーゼ阻害アッセイ当日、45μLのH2Oを1セットの化合物希釈プレートの各ウェルに添加した。沈殿を最小化するために、アッセイプレートへ化合物溶液を転移させるほんの数分前に、H2Oをプレートに添加した。プレートを入念に振盪し、結果的に半対数工程で1×10-03M/10%DMSO〜3×10-08M/10%DMSOの濃度の「化合物希釈プレート/10%DMSO」を生じた。「アッセイプレート」への5μLの化合物溶液の転移のために、これらのプレートを使用した。作業当日の終了時に、化合物希釈プレートを廃棄した。アッセイ(以下参照)のために、化合物希釈プレートの各ウェルから5μL溶液をアッセイプレートに転移させた。アッセイの最終容積は50μLであった。1×10-04M〜3×10-09Mの範囲の10個の最終アッセイ濃度で、すべての化合物を検査した。反応混合物における最終DMSO濃度は、すべての場合において1%であった。
阻害特性の決定のために、下記の5個のプロテインキナーゼを使用した:CDK2/CycA、CDK4/CycD1、CDK5/p35NCK、CDK6/CycD1及びCDK9/CycT。バキュロウイルス発現系によって、ヒト組換えGST融合タンパク質又はHisタグつきタンパク質として、該プロテインキナーゼをSf9昆虫細胞において発現させた。GSH-アガロース(Sigma)又はNi-NTH-アガロース(Qiagen)のいずれかを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、キナーゼを精製した。各キナーゼの純度をSDS-PAGE/銀染色によって決定し、キナーゼ特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析によって又は質量分析によって、各キナーゼの同一性を確認した。
50μL反応容積におけるPerkin Elmer/NEN(Boston, MA, USA)製の96ウェルFlashPlates(商標)において、すべてのキナーゼアッセイを実施した。反応混合物を下記の順序で4工程においてピペッティングした:
・アッセイ緩衝液20μL(標準緩衝液)
・(H2Oにおける)ATP溶液5μL
・(10%DMSOにおける)検査化合物5μL
・基質10μL/酵素溶液10μL(あらかじめ混合)
すべての酵素についてのアッセイは、60mM HEPES-NaOH(pH7.5)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3μMオルトバナジン酸ナトリウム2mM DTT、50μg/mL PEG20000、2μM[γ-33P]-ATP(ウェルあたり約5×1005cpm)を含有した。ウェルあたり下記の量の酵素及び基質を使用した:
各アッセイプレートの1列目(n=8)における計数の中央値を「低コントロール」と定義した。この値は、プロテインキナーゼの不在下だが基質の存在下でのプレートに対する放射能の非特異的結合を反映する。各アッセイプレートの7列目(n=8)における計数の中央値を「高コントロール」、すなわちいずれかの阻害剤の不在下での完全な活性とみなした。高コントロールと低コントロールとの間の差異を100%活性と呼んだ。データ評価の一部として、高コントロール値から、及び対応するプレートの80個すべての「化合物値」から、具体的なプレート由来の低コントロール値を減算した。下記の式を使用することによって、具体的なプレートの各ウェルについての残効性(%)を算出した:
残効性(%)=100×[(化合物のcpm−低コントロール)/(高コントロール−低コントロール)]
Quattro Workflow V2.0.1.3(Quattro Research GmbH, Munich, Germany; www.quattro-research.com)を使用して、各濃度についての残効性及び化合物のIC50値を算出した。使用したモデルは、「シグモイド反応(可変傾斜)」であり、パラメータの「上部」は100%に、「下部」は0%に固定した。化合物1〜28番についてのIC50がすべて、1nM〜10μMの範囲内に見出されることができることがわかる。
序論
異常なタウリン酸化及び脱制御されたCDK5/p35活性は、互いに密接に連関し、アルツハイマー病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患の顕著な特徴を提示する。ヒト神経芽腫細胞系SH-SY5Yは、インビトロでのモデルとしてCDK5の機能及びCDK5特異的阻害剤の効能を研究するために利用できる。SH-SY5Y細胞は、CDK5を含むいくつかのキナーゼによってリン酸化されることが公知の多様なリン酸化部位を有するタウタンパク質を発現する。SH-SY5Y細胞は、10μMの全トランスレチノイン酸に3日間、その後50ng/mLのヒト組換え脳由来神経栄養因子に3〜5日間曝露することによって、神経様細胞へと分化でき、それによりタウタンパク質を含む神経細胞マーカーを上方制御する。さらに、CDK5及びp35タンパク質レベルは、分化中に増大した。RA-BDNFにより分化した細胞はそれゆえ、タウリン酸化を研究し、潜在的なCDK5阻害剤をスクリーニングするための適切なモデルとして機能できる(Jmsらの文献(2004. BBRC 319;993-1000))。
15%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEMにおいて、SH-SY5Y神経芽腫細胞(ATCC, CRL-2266)を37℃及び5%CO2で増殖させる。分化のために、正常増殖培地において2×105個/6ウェルの密度で細胞を播種し、付着させるために一晩インキュベートする。正常増殖培地を、10μM全トランスレチノイン酸(RA、DMSOに溶解;Sigma-Aldrich, R2625)を補充し抗生物質を含まない増殖培地と置換し、さらに3日間インキュベートすることによって、分化を誘導する。その後、50ng/mLヒト組換え脳由来神経栄養因子(BDNF、滅菌ddH2Oに溶解;Sigma-Aldrich, B3795)を補充した無血清かつ抗生物質を含まない培地へ培地を交換し、細胞をさらに3〜5日間インキュベートして分化を完了させる。
或いは、SH-SY5Y細胞の代わりに、10μM BrdUで3日間分化させたヒトIMR-32神経細胞又は50ng/mLヒト組換え神経増殖因子(NGF)で3日間分化させたラットPC12神経芽腫細胞は、多様なリン酸化部位でのタウリン酸化を研究するために使用できる。
分化が完了した後、培地を、CDK阻害化合物並びにポジティブ及びネガティブコントロール等の基準化合物を有する無血清増殖培地と置換し、DMSOに溶解した各々を0.1〜100μMの範囲の濃度で添加する(ウェルにおけるDMSOの終濃度は0.1%にすべきである。)。細胞を化合物とともに90〜120分間インキュベートする。掻爬することによって細胞を回収し、PBSで2回洗浄し、溶解緩衝液(BioSource, FNN0011)において溶解する。溶解した細胞を-20℃で保存し、又はウェスタンブロット若しくはELISAアッセイのために即時使用して全タウ及びpS396又はpT231タウを決定する。
製造元の説明書に従って市販のELISAキット(BioSource: ヒト全タウ: KHB0042; ヒトpS396タウ: KHB7031; ヒトpT231タウ: KHB7051)を使用することによって、又は全抗体及びリン特異的抗体(抗体: 全タウ: Santa Cruz, sc-21796; pS396タウ: Santa Cruz, sc-12414; pT231タウ, AT180: Pierce Endogen, MN1040; pS202タウ: AT8: Pierce Endogen, MN1020)によるウェスタンブロット探索を使用することによって、細胞培養可溶化液内の全タウ、pS396タウ及びpT231タウの濃度を測定する。
CDK5阻害化合物をDMSOに溶解し、RA及びBDNFにより分化したSH-SY5Y細胞へ、二つ組又は三つ組で投与した。検査化合物又は基準化合物(例えば、GSK3β阻害剤であるLiCl又はCDK阻害剤であるロスコビチン)との90〜120分のインキュベーション後、上述のとおり、ウェスタンブロット又はELISA分析のために細胞を回収した。化合物8番で処置した細胞は、セリン396におけるタウリン酸化に及ぼす化合物8番の有意な阻害効果を示した。基準化合物であるLiCl及びロスコビチンと比較して、この化合物は、S396でのタウリン酸化の同様の又はより良好な阻害を呈した。
代替的なアッセイ:ヒトSH-SY5Y細胞(RA及びBDNFを使用して分化)、ヒトIMR-32神経細胞(BrdUを使用して分化)及びマウスC2C12筋芽細胞(2%ウマ血清及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEMを2〜5日間使用して筋管へ分化)は、CDK5の公知の基質である転写因子MEF2Dを発現する。CDK5/p35はリン酸化し、それによりMEF2D転写活性を阻害する。それゆえ、CDK5の阻害は、MEF2D転写活性を低下させるであろう。(例えば、リポーター遺伝子アッセイ、活性ELISA(Panomics, TransBinding MEF2 Assayキット, EK1081)を使用して又はpMEF2D及び全MEF2D抗体を使用するウェスタンブロットにおいて)MEF2D活性を読み出す細胞アッセイは、CDK5活性を測定するための有用な道具であろう。CDK5/p35の別の公知の基質であるStat3の転写活性を使用する同様の読み出しが使用できる(Fuらの文献(2004. PNAS, vol 101(17);6728-6733))。
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Claims (10)
- 一般式Iの化合物:
(式中、
R1が、-NR5R6、-R8、-C1-4アルキル-OH、又はC2-4-アルキレン-O-C1-4アルキルの群から選択され;
式中、
R5及びR6が互いに独立して、水素、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル若しくはC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキレン、C4-7アリール-C0-4アルキレン、若しくはC4-7ヘテロアリール-C0-4アルキレン、又は
式中、また、R5及びR6が結合するN原子とともに該R5及びR6が、5〜8員のヘテロシクロアルキル又は5〜6員のヘテロアリールを形成し得、
式中、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はアルキルがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O-及びNR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R8が、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、ヒドロキシ-C2-4アルキル、C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル-C1-4アルキル又はC4-7へテロシクロアルキル-C0-4アルキルであり;
Xが、分岐鎖アルキレンを含むC1-4アルキレン、好ましくはメチレンであり、この中で、該C1-4アルキレンが、R5R6、又はR8へ結合して、5〜6員の複素環を形成でき;
この中で、該シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル又はアルキルがさらに、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキル-O-C1-4アルキレン、C1-4アルキル-O及びNR5R6からなる群から選択される最大2個のラジカルによって任意に置換され;
R2が、ハロの群から独立して選択される0〜2個の置換基であり得;
R3が、水素、ハロ、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C3-7シクロアルキル、C1-4アルキル-シクロアルキル、C1-4アルキル-ヘテロシクロアルキル、-O-ヘテロシクロアルキル、C1-4アルコキシ、C1-4アルケニルオキシ、-OCF3、C2-4アルカノイル、C1-4アルキルスルホニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)スルホンアミド、アミノカルボニル、モノ-及びジ-(C1-C4アルキル)アミノカルボニル、アリール-C1-4アルコキシ、ヘテロアリール-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルコキシ、ヘテロシクロアルキル-C1-4アルキル、ヘテロアリール-C1-4-アルキル、C1-4アルキルオキシメチル、ヒドロキシ-C1-4アルキルオキシメチル、シアノ、-COOH及びC1-C4アルコキシカルボニルからなる群から独立して選択される1〜3個の置換基であり得、この中で、上述の置換基は、C1-4-アルキル、ヒドロキシル-C0-4-アルキル、C1-4-アルコキシ、アミノカルボニル、ハロ及びNR5R6の群から選択されるラジカルによってさらに置換でき;
R4が、水素、C1-4アルキル又はNR'R"から選択され、式中R'及びR"が各々、水素、及びC1-4アルキルから独立して選択される。)。 - 一般式Iaの化合物である請求項1記載の化合物;
(式中、
R3aが、水素、C1-4アルコキシ、C1-4アルケニルオキシ、アリール-C1-4アルコキシ、及びヘテロアリール-C1-4アルコキシの群から選択され;
R3bが、水素、C1-4アルコキシ、C1-4アルケニルオキシ及びC0-4アルキルNR5R6の群から選択され;
R3cが、水素及びハロの群から選択され;
但し、R3a及びR3bが、同時に水素であることはできず;
並びに式中、R1、R2、R5、R6及びXが、上述に定義されるものと同一の意味を有する。)。 - 請求項2記載の化合物、及びそのN酸化物誘導体、プロドラッグ誘導体、保護された誘導体、個々の異性体及びその異性体の混合物;並びにこれらの化合物の医薬として許容し得る塩及び溶媒和化合物(例えば、水和物):
(式中、
R1が、NH2-、N-メチル-、N-プロピル-、N-イソプロピル-、N-シクロプロピル-、N-シクロペンチル-、N,N-ジエチル-の群から選択され、
Xが、メチレンであり;
R2が、水素であり;
R3aが、水素、メトキシ-、エトキシ-、イソプロピルオキシ-、及びベンジルオキシ-の群から選択され;
R3bが、水素、メトキシ-、3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル-、3-ジエチルアミノメチル-、3-ピペリジン-1-イルメチル-、3-モルフォリン-4-イルメチル-、4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル-、及び[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-の群から選択され;
R3cが、水素又はハロであり;
但し、R3a及びR3bは、同時に水素であることはできない。)。 - 下記の群から選ばれる請求項3記載の化合物:
C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-プロピル-メタンスルホンアミド(化合物1);
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物2);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-シクロペンチル-メタンスルホンアミド(化合物3);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-イソプロピル-メタンスルホンアミド(化合物4);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-シクロプロピル-メタンスルホンアミド(化合物5);
{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物6);
C-{4-[6-(2-エトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-メチル-メタンスルホンアミド(化合物7);
{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物8);
{4-[6-(2,3-ジメトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物9);
N,N-ジエチル-C-{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物10);
C-{4-[6-(2-ベンジルオキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-N-メチル-メタンスルホンアミド(化合物11);
{4-[6-(3-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物12)
{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物13)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物14)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(2-イソプロポキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物15)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(4-フルオロ-2-メトキシ-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物16)
(4-{6-[3-(3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物17)
{4-[6-(3-ジエチルアミノメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物18)
{4-[6-(3-ピペリジン-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物19)
{4-[6-(3-モルフォリン-4-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物20)
(4-{6-[3-(4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物21)
{4-[6-(3-[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物22)
N-シクロペンチル-C-(4-{6-[3-(3-ヒドロキシメチル-ピペリジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物23)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-ジエチルアミノメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物24)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-ピペリジン-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物25)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-モルフォリン-4-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物26)
N-シクロペンチル-C-(4-{6-[3-(4-メチル-ピペラジン-1-イルメチル)-フェニル]−ピリミジン-4-イルアミノ}-フェニル)-メタンスルホンアミド(化合物27)
N-シクロペンチル-C-{4-[6-(3-[1,2,4]トリアゾール-1-イルメチル-フェニル)-ピリミジン-4-イルアミノ]-フェニル}-メタンスルホンアミド(化合物28)。 - 医療的使用のための、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
- 医薬として許容し得る担体とともに請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物を含有する医薬調製物。
- いずれかの種類の疼痛、炎症性障害、免疫学的疾患、増殖性疾患、感染性疾患、心血管疾患及び神経変性疾患の群から選択される疾患の治療のための方法であって、治療的有効量の請求項1〜4記載の化合物の少なくとも1つを投与することを含む、前記方法。
- いずれかの種類の疼痛が、慢性疼痛、炎症性及び/又は神経因性疼痛を含む、請求項7記載の方法。
- いずれかの種類の疼痛、炎症性障害、免疫学的疾患、増殖性疾患、感染性疾患、心血管疾患及び神経変性疾患を治療するための医薬組成物を製造するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物の使用。
- いずれかの種類の疼痛が、慢性疼痛、炎症性及び/又は神経因性疼痛を含む、請求項9記載の使用。
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